泰乐菌素提取新工艺.doc

泰乐菌素提取新工艺发明人：周晋武 吕文进 许永兴 胡露华 金康康 摘要：本发明涉及一种泰乐菌素的提取新方法。发明人通过采用二级反萃取方式将泰乐菌素分阶段从有机相转入水相，一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解，然后经阴离子交换树脂中和，脱色，干燥得到产品。本发明具有工艺适应性强，产品效价高、质量稳定等优点。权利要求书：1. 一种泰乐菌素提取工艺，其特征在于通过采用二级反萃取方式将泰乐菌素分阶段从有机相转入水相，一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解，然后经阴离子交换树脂中和，脱色，干燥得到产品。2. 根据权利要求1所述的泰乐菌素的提取方法，其特征在于一级反萃取控制水相pH5.56.0，二级反萃取控制水相pH2.54.0。3. 根据权利要求1所述的泰乐菌素的提取方法，其特征在于反萃取过程在4050下进行。4. 根据权利要求1所述的泰乐菌素的提取方法，其特征在于一级反萃取液用NaOH调pH9.010.0进行沉淀，分离母液后得到泰乐菌素碱。5. 根据权利要求2和权力要求3所述的泰乐菌素的提取方法，其特征在于一级反萃取液得到的泰乐菌素碱能完全被二级反萃取液溶解。合并后的反萃取液pH为pH4.55.0。6. 根据权利要求1所述的泰乐菌素的提取方法，其特征在于合并的反萃取液用阴离子交换树脂中和至pH6.36.7。说明书：技术领域： 本发明属于生物制药提取技术领域，特别涉及一种泰乐菌素的提取方法。技术背景：泰乐菌素(Tylosin)是由弗氏链霉菌分泌的一种大环内酯类动物专用抗生素，又名太乐霉素或泰乐霉素。白色至浅黄色粉末，在甲醇中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中溶解，在水中微溶，在己烷中几乎不溶。其盐类易溶于水，水溶液在25、pH值为5.57.5中可保存3个月不减效。作为治疗药物，泰乐菌素广泛应用于畜禽支原体疾病，细菌性疾病及螺旋体病和寄生虫病的防治，是治疗畜禽支原体病的首选药物，能有效防治畜禽呼吸道和消化道感染。作为饲料添加剂，广泛应用于鸡、猪、牛等动物的饲料中，促进动物生长发育，缩短饲养周期。在生产实践中，常使用酒石酸泰乐菌素和磷酸泰乐菌素，前者主要用作饮水剂，后者主要用作饲料添加剂。泰乐菌素主要由四种具有生物活性的组分A、B、C、D组成，其中A组分的含量最高，在动物体内的活性也最强，根据英国药典(兽药)BP(V)- 2011版的规定，泰乐菌素成品中A组分含量80、总组分（A+B+C+D）95。泰乐菌素各组分除了具有共同的16元环太内酯外，在其侧链的碳霉氨糖上都有一个亚氨基，因而显弱碱性。碱性条件下，以泰乐菌素碱的形式存在，易溶于于有机溶媒；而在酸性条件下与酸结合成盐的形式，易溶于水。根据这一特性，目前泰乐菌素的提取工艺一般采用溶媒萃取法。具体来讲，发酵液经固液分离得到滤液，碱化至pH910后用溶媒萃取到有机相，然后用磷酸或酒石酸反萃取到水相，最后经Ca(OH)2中和除去过量的酸，活性炭脱色，过滤和喷雾干燥得到磷酸泰乐菌素或酒石酸泰乐菌素。上述提取工艺中，通常采用一步反萃取，控制水相pH3.54.0来得到相应的泰勒菌素盐，杂质不能被有效分离。专利CN102584921A公开了一种采用复合溶媒来萃取泰乐菌素的方法，在其实施例中虽然采用了二级反萃取，但采用的是一级反萃取控制水相pH4.0，二级反萃取控制水相pH2.3，目的仅仅是为了提高收率，且后续工艺只是简单将两次反萃取液合并，因而在反萃取过程中杂质也没有得到有效去除，特别是抗菌活性较低的B、C、D组分几乎完全随A组分一起被反萃取到水相。若发酵液中B、C、D组分过高，则上述提取过程很难使最终产品组分合格。另外，通常的提取工艺中利用形成难溶盐的原理，采用Ca(OH)2中和来除去反萃取液中多余的磷酸或酒石酸，Ca(OH)2加量由pH计来反馈。实际生产中发现这一方法存在的不足之处主要有：（1）花费时间长。由于Ca(OH)2本身溶解度低，因而形成沉淀的反应速度慢，达到反应平衡的时间长，比如专利CN102584921A采用的就是分多次缓慢加入Ca(OH)2混悬液，每次间隔40分钟。（2）操作难于控制。由于达到反应平衡的时间长，存在着加入Ca(OH)2混悬液过量的风险，而一旦过量会直接导致产品pH不合格以及收率下降。（3）形成的沉淀容易覆盖pH电极而影响终点判断，这进一步加大了生产风险。（4）难溶盐仍有一定溶解度，溶解于水的部分不能被过滤除去就会随溶液进入到最终产品，会造成产品残渣偏高，效价偏低。发明内容：针对通常的反萃取工艺不能有效去除杂质的问题，本发明提出采用二级反萃取工艺，其中一级反萃取控制水相pH5.56.0，二级反萃取控制水相pH2.54.0。并且一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解。研究发现，在一级反萃取中转入水相的主要是泰乐菌素B、C、D等抗菌活性较低的组分，加碱沉淀后，这些组分主要留在母液当中，因而得到有效去除。针对反萃取液用Ca(OH)2中和出现的一系列问题，本发明提出用阴离子交换树脂中和，然后脱色，干燥得到产品。离子交换树脂是一种具有网状立体结构的、含有高分子活性基团而能与溶液中其他物质进行交换或吸着的聚合物。按照参与交换的离子电性分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。运用阴离子交换树脂中和酸的工作原理就是先用碱把树脂再生成OH型，当反萃取液流经树脂的时候，其中的磷酸根或硫酸根被树脂吸附，而OH则被交换下来与溶液中的H+中和。这样就除去了反萃取液中过量的酸。运用阴离子树脂中和具有反应速度快，溶液澄清易于操作等优点。本发明具有工艺适应性强，产品效价高、质量稳定等优点。 具体实施方式：实施例1：泰乐菌素二级反萃取试验取丁酯萃取液1500ml，一级反萃取加水80ml，然后加入2%酒石酸70ml调水相pH至5.5，静置1小时后分层，下层150ml一级反萃取液取样。上层丁酯相进行二级反萃取：加入水40ml，然后加入2%酒石酸50ml调水相pH至4.0，静置1小时后分层，下层90ml二级反萃取液取样。以上样品稀释相同倍数后HPLC检测各组分浓度，对每种组分，用浓度乘以体积来计算两个阶段反萃取分别转入水相的量（g），如下表：CBDA一级反萃取液0.360.393.19.2二级反萃取液0.110.071.313.6可见，C、B、D组分“富集”于一级反萃取液中。而二级反萃取液中主要是A组分，其含量已经符合标准。如果想提高最终产品中的A组分含量，只需想办法进一步分离除去一级反萃取液中的C、B、D组分。实施例2：泰乐菌素加碱结晶试验 取C、B、D组分偏高的酒石酸泰乐菌素15g，溶解于120ml水，加入5ml10%NaOH调pH9.00，然后50保温1小时，搅拌均匀，抽滤，用50纯化水顶洗得到275ml母液，湿晶体烘干后为10.0g。HPLC检测，各组分归一法含量（%）结果如下：CBDA酒石酸泰乐菌素4.891.495.9485.76泰乐菌素碱4.310.764.7188.08母液6.104.089.0978.45说明经加碱结晶，C、B、D组分主要留在母液，泰乐菌素碱中的A组分显著提高。实施例3：泰乐菌素反萃取液中和对比试验取磷酸泰乐菌素反萃取液200ml两份，一份逐步加入10%Ca(OH)2悬液调pH6.30，然后用滤纸过滤得到中和液，实验用时约110分钟。另一份经填充杭州争光D311树脂的树脂柱中和，得到混合pH6.30的中和液，用时20分钟。两份中和液都取样烘干后测量炽灼残渣，分别为1.87%和0.84%，说明用树脂代替Ca(OH)2来中和反萃取液，能使产品的炽灼残渣降低约1%，从而提高产品效价。实施例4：泰乐菌素提取新工艺实施例萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为9534u/ml，A组分含量为68.4%。每次加入乙酸丁酯0.75L，用10%NaOH调pH9.510，萃取两次，萃取温度3035摄氏度，搅拌萃取时间3060分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价527 u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.42L，效价为18436 u/ml，萃取收率91.5%。二级反萃取：取萃取液1.4L，一级反萃取加入2%酒石酸48ml调水相pH至5.5，静置1小时后分层。下层水相加碱结晶，上层丁酯相进行二级反萃取：加入1%酒石酸86ml调pH至4.0，静置1小时后分层。反萃取结束后检测丁酯相效价461 u/ml。加碱结晶：一级反萃取液48ml加9.5ml10%NaOH调pH10.0，50保温结晶1小时，分离母液后，湿晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液125ml，效价198586 u/ml。母液效价12714u/ml。树脂中和，脱色，干燥：反萃取液经50mlD311树脂中和至pH6.6，加入活性炭1.5g，搅拌脱色30分钟，加入硅藻土1.5g，搅拌5分钟后滤纸过滤，并顶水30ml，得到150ml脱色液，经冷冻干燥得到酒石酸泰乐菌素26.5g，效价908u/mg，A组分90.3%，总组分98.2%实施例5：泰乐菌素提取新工艺实施例萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为10487u/ml，A组分含量为56.2%。每次加入乙酸丁酯0.75L，用10%NaOH调pH10.0，萃取两次，萃取温度3035摄氏度，搅拌萃取时间3060分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价436 u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.41L，效价为20684 u/ml，萃取收率92.7%。二级反萃取：取萃取液1.4L，一级反萃取加入2%酒石酸46ml调水相pH至6.0，静置1小时后分层。下层水相加碱结晶，上层丁酯相进行二级反萃取：加入1%酒石酸120ml调pH至2.5，静置1小时后分层。反萃取结束后检测丁酯相效价407u/ml。加碱结晶：一级反萃取液46ml加9.0ml10%NaOH调pH9.5，50保温结晶1小时，分离母液后，湿晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液155ml，效价178805 u/ml。母液效价14532u/ml。 树脂中和，脱色，干燥：反萃取液经50mlD311树脂中和至pH6.3，加入活性炭1.5g，搅拌脱色30分钟，加入硅藻土1.5g，搅拌5分钟后滤纸过滤，并顶水30ml，得到150ml脱色液，经冷冻干燥得到酒石酸泰乐菌素29.6g，效价903u/mg，A组分90.1%，总组分97.4% 实施例6：泰乐菌素提取对比工艺实施例萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为9534u/ml，A组分含量为68.4%（同实施例4）。每次加入乙酸丁酯0.75L，用10%NaOH调pH9.510，萃取两次，萃取温度3035摄氏度，搅拌萃取时间3060分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价527 u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.42L，效价为18436 u/ml，萃取收率91.5%。反萃取：