（水产养殖专业论文）分化抑制因子3（Id3）的克隆及其在A549细胞中的表达与功能分析.pdf

分化抑制因子3 ( i d 3 ) 的克隆及其在a 5 4 9 细胞中的表达与功能分析中文摘要分化抑制因子( i d ) ，属于螺旋环螺旋( h l h ) 转录因子家族成员之一，对碱性h l h ( b h l h ) 转录因子活性起负调节作用。哺乳动物细胞含四种i d分子( i d l i d 4 ) 。i d 3 蛋白的表达和功能涉及许多复杂的调控机制，i d 3 在不同种类的肿瘤中具有截然不同的表达谱。本课题采用r t - p c r 技术在多种人肿瘤细胞株，包括b u r k i t t sb 淋巴瘤细胞( d a u d i ) 、t 淋巴细胞性自血病细胞( j u r k a t ) 、慢性髓性自血病细胞( k 5 6 2 ) 、组织细胞性淋巴瘤细胞( u 9 3 7 ) 、前列腺癌细胞( p c 3 m ) 、肺癌细胞( a 5 4 9 ) 、胃癌细胞( b g c ) 、卵巢癌细胞( c 0 c 2 ) ，以及4 0 例血液系统恶性肿瘤患者和1 5 例健康人外周血单个核细胞( p b m c ) ，对以上细胞中i d 2 和i d 3m r n a 的表达水平进行检测分析。结果发现，i d 2 在健康人p b m c 和多种肿瘤细胞中均呈普遍高表达趋势；i d 3 在健康人p b m c 中未见表达，在肿瘤细胞中有低度表达，且i d 3 在不同肿瘤细胞中的表达程度具有较大的差异性，p c - 3 m 和a 5 4 9 细胞中i d 3表达量较高，d a u d i 次之，k 5 6 2 最低。另外，i d 2 和i d 3m r n a 在血液病患者p b m c 中也均有不同程度的表达。总体上i d 3 的表达水平普遍明显低于i d 2 的表达。i d 3 可能在肿瘤的发生、发展中扮演某种重要的角色。本实验在成功克隆人i d 3 基因的基础上，构建i d 3 与增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 融合基因真核表达载体i d s p e g f p - n i 。利用脂质体转染技术将空载体p e g f p - n 1 和重组载体i d 3 p e g f p - n 1 转入人肺癌细胞a 5 4 9 ，转染后，激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达e g f p - i d 3 融合蛋白的细胞在4 8 8 n m 激发光下发出强绿色荧光；流式细胞仪分析表明，a 5 4 9 细胞转染p e g f p - n 1 和i d 3 r l e g f p - n 14 8 h 后，e g f p 阳性表达率分别可达6 5 4 2 和6 0 5 0 。转染后细胞i d 3m r n a的表达量可达到转染前的近4 倍；鼠抗人i d 3 单克隆抗体能与i d 3 p e g f p - n 1 转染细胞特异性结合，证明i d 3 蛋白在a 5 4 9 细胞中得到有效表达。通过( 3 4 1 8 筛选，获得稳定表达e g f p 及e g f p i d 3 的a 5 4 9 细胞。流式细胞术检测细胞周期发现，i d 3 p e g f p n 1 转染的a 5 4 9 细胞s 期和g 2 期细胞比例均明显高于p e g f p - n 1 转染细胞组和未转染细胞组，表明i d 3 基因的导入可诱导a 5 4 9 细胞从g 1 期向g 2 期的发展，从而促进细胞增殖。真核表达载体i d 3 p e g f p - n 1 的成功构建及其在a 5 4 9 细胞中的表达及i d 3基因功能的分析，为研究i d 3 蛋自在肿瘤细胞增殖及细胞生长调控中的作用奠定了实验基础。关键词：分化抑制因子3 ；转染；增殖；分化；肿瘤c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n df u n c t i o na n a l y s i so fh u m a ni n h i b i t o ro fd i f f e r e n t i a t i o n3 ( i a 3 ) i na 5 4 9c e l l sa b s t r a c ti d ( i n h i b i t o r so fd i f f e r e n t i a t i o n d n ab m d i n g ) p r o t e i n s ，w h i c hi n h i b i tc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dp r o m o t ec e l lp r o l i f e r a t i o n , a r en e g a t i v er e g u l a t o r so fb a s i ch e l i x l o o p h e l i x ( b h l h ) t y p et r a u s c r i p f i o nf a c t e r t h e r ea r ef o u rr e l a t e dm e m b e r so f t h ei df a m i l yc a l l e di d l ，i d 2 ，i d 3a n di d 4i nm a m m a l i a nc e l l s i d 3w a so r i g i n a l l yi d e n t i f i e da sas e r m - i n d u c i b l ei m m e d i a t ee a r l yg e n ei na ne s t a b l i s h e dm u r i n ef i b r o b l a s t i cc e l ll i n e i ti n v o l v e di nv a r i o u sb i o l o g i e a lp r o c e s s e si n c l u d i n gta n dbc e l ld e v e l o p m e n t , s k e l e t a lm u s c l ed i f f e r e m i a t i o n , v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l lp r o l i f e r a t i o n ，e m b 巧o u l en e u r o g e n e s i s ，o s t e o g e n e s i sa n dt u m o r - i n d u c e da n g i o g e n e s i s e x p r e s s i o na n df u n c t i o no f t h i sp r o t e i ni su n d e rm a n yc o m p l e xl a y e ro fr e g u l a t i o mt h ee x p r e s s i o np a t t e ro f i d 3o v e r l a p sw i t hb u ti sn o ti d e n t i c a lt ot h a to f i d lg e n e i th a sd i f f e r e n te x p r e s s i o n p a t t e r ni nd i f f e r e n tk i n d so f c a n c e r t h et o t a lc e l l u l a rr n aw e r ee x t r a c t e df r o mt h ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a re e l l ( p b m c ) o f t h ep a t i e n t sw i t hh e m a t o l o g i cd i s o r d e r s ，p b m cf r o mh e a l t ha d u l t sa n d8h u m a nt u n l o rc e l ll i n e s ( i n c l u d i n gd a u d i ，j u r k a t ，k 5 6 2 ，u 9 3 7 ，p c - 3 m ，a 5 4 9 ，b g c 、c o c 2 ) t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f l d 2a n di d 3m r n ai np b m ca n dn l m o rc e l l sw e r ed e t e c t e db yr t - p c rt e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o wt h a ti d 2a n di d 3m r n ah a v ed i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e l si nd i f f e r e n tc e l l s i d 2i sw i d e l ye x p r e s s e di nm a n yc e l lt y p e s b o t h nn o r m a la n dm a l i g n a n tc e l l s t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fi d 3m r n ai nb l n l o rc e i l sa n dp b m cf r o mh e m a t o l o g i cd i s o r d e rp a t i e n t sa r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nw h i c hi nh e a l t h ya d u l t sp b m c t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fi d 3m r n ai nd i f f e r e n tt u n l o rc e l l sh a v ee v i d e n td i v e r s i t y i ts e 锄st h a ti d 3m a yp l a ys o m ei m p o r t a n tr o l e si nt h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no ft u m o rc e l l s ，a sw e l la si nt h ed e v e l o p m e n ta n dg r o w t ho f t u m o r s t h eh u m a ni d 3e d n aw a sa m p l i f i e df r o mh u m a np r o s t a t ec e l l sp c 一3 mb yr t - p c rt e c h n i q u ea n dt h e nw a si n s e r t e di n t ot h ep e g f p - n 1v e c t o rt oe o u s t r u c tt h er e c o m b i n a n te i l l c a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ri d 3 p e g f p - n 1 w h i c hw a sc o n f o m a e db yd n as e q u e n c i n g 、e n z y m a t i cd i g e s t i o na n dp e ri d e n t i f i c a t i o n b o t hp e g f p - n 1a n di d 3 p e g f p - n 1w e r et r a n s f e c t e di n t oh u m a nl u n gr k r l l o rc e l l sa 5 4 9b yl i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0 1 2 9 6h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n , t h ec e l l s ，i nw h i c hl d 3 e g f pf u s i o np r o t e i nw a se x p r e s s e d , w e r ed e t e c t e du n d e rf l u o r o s c e n tm i c r o s c o p e f l o wc y t o r a e t r ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a t4 8 ha f t e rt r a n s f e c t i o n , t h ep r o p o r t i o n so fe g f p - p o s i t i v ec e l l so f p e g f p - n 1a n di d 3 p e g f p - n 1t r a n s f e c t e dc e l l sw e r e6 5 4 2 a n d6 0 5 0 t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f i d 3m r n aa f t e ri x a n s f e e t i o na l ea b o u t4t i m e sh i 曲e rt h a nt h el e v e l sb e f o r et r a n s f e c t i o n t h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a la s s a yi n d i c a t e dt h a tt h em o u s ea n t i h u m a ni d 3m c a bc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt ot h ea 5 4 9c e l l st r a n s f e c t e dw i t hi d 3 p e g f p - n 1b u tn o tt h ec e l l st r a n s f e c l z dw i t hp e g f p - n 1 ，s u g g e s t i n gt h a ti d 3w a se x p r e s s e di na 5 4 9c e l l sa f t e rt h ei d 3 p e o f p - n 1t r a n s f e c t i o n 啊1 et r a n s f e c t e dc e l l sw e r ec u l t u r e di nr m i n i1 6 4 0m e d i u mc o n t a i n i n gg 4 1 8a f t e r4 8h o u r so ft r a n s f e c t i o mt h ei d 3 p e g f p - n 1s t a b l yt r a n s f e c t e da 5 4 9c e l ll i n e sw e r ee s t a b h s h e db yg 4 1 8s e l e c t i o n f l o wc y t o r a e t r ya n a l y s i sw a su s e dt oc h e c kc e l lc y c l ep r o g r e s s i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec e l lp r o p o r t i o n si nsp h a s ea n dg 2p h a s ei n c r e a s e di na 5 4 9l r a n s f e e t e dw i t hi d 3 p e g f p - n 1i nc o m p a r i s o nw i t hp e g f p - n 1t r a n s f e c t e da 5 4 9c e l l s t h e s ef r a d i n g ss u g g e s tt h a tt r a n s f e c t i o no fi d 3g e n ei n t oa 5 4 9i n d u c e sc e l lp r o l i f e r a t i o nb yi n c r e a s i n gt h en u m b e ro fc e i l sf r o r ag 1p h a s et og 2p h a s e t h ec o n s t r u c t i o no fi d 3 p e g f p - n 1e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n dt h ee x p r e s s i o no fe g f p - i d 3f u s i o np r o t e i ni na 5 4 9c e l l sp r o v i daf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni d 3a n dg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no ft u l l l o re e l l s k e yw o r d s ：i n h i b i t o r so f d i f f e r e n t i a t i o n 3o d 3 ) ；t r a n s f e c t i o n ；p r o l i f e r a t i o n ；d i f f e r e n t i a t i o n ；t u n l o ri v前言细胞分化抑制因子，又称d n a 结合抑制因子( i n h i b i t o r so fd i f f e r e n t i a t i o n d n ab i n d i n g ，i d ) 是1 9 9 0 年b e n e z r a 等从小鼠肌原细胞中发现的一种基因，其表达产物是i - i l h ( h e l h - l o o p h e l i x ) 蛋白家族成员之一。i d 分子是h l h 蛋白家族中的一类独特的分子。此类蛋白因其本身缺乏d n a 结合必需的碱性氨基酸序列，与b m 结合成二聚体后，可抑制碱性螺旋一环螺旋( b h l 王 )与d n a 及其它组织特异性b h l h 转录因子结合，对b h l h 转录因子活性起负调节作用，从而抑制细胞分化。哺乳动物细胞含四种i d 分子( i d l i d 4 ) 。i d 蛋白含1 1 9 1 9 9 个氨基酸残基，编码基因分别定位于染色体2 0 q l ，2 p 2 5 ，l p 3 6和6 p 2 2 2 1 上。自1 9 9 0 年发现i d 分子以来，有关该分子在细胞增殖与分化、肿瘤发生等方面的作用，特别是对i d l 的表达模式及其调控机制已进行了较广泛的研究。i d 3 ，作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现。该分子参与多种细胞生物学过程，包括淋巴细胞发育、骨骼肌分化、血管平滑肌增殖、胚胎神经形成、骨发生和肿瘤诱导的血管发生等。与i d 家族的其他成员一样，i d 3 的表达在胚胎发育中呈动态调控，在胚胎早期表达较高，随着胚胎发育成熟，表达量逐渐下降。大量研究结果表明，i d l 基因具有“永生化”癌基因的某些特性，i d l 在人体肿瘤标本及体外培养的肿瘤细胞中均呈高表达趋势，将i d l 基因导入胸腺细胞会诱导浸润性胸腺淋巴瘤的发生。用原位杂交和免疫组化技术在多种肿瘤( 神经胶质瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、甲状腺髓质癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞癌等) 中发现i d l 均有高异常表达。用反义寡核苷酸在神经母细胞瘤、胰腺癌和乳腺癌中抑制d l 表达可降低肿瘤细胞的增殖速度。上述研究表明，i d l 基因可能属于细胞核癌基因范畴，或至少是肿瘤形成相关因子之一。但有关i d 家族的其他成员在肿瘤中的表达情况及其在细胞周期调控中的作用还缺乏深入研究，某些研究尚未取得一致的结论。i d 3 在不同组织种类的肿瘤中具有与i d l 截然不同的表达谱。i d 3 在原发性结直肠癌、星形细胞瘤和鳞状细胞癌中呈高表达，而在甲状腺癌、卵巢癌中表达呈下降趋势；在肝v病或肝癌中，其表达模式甚至更加复杂，在正常肝组织中可以检测到i d 3 的表达，其表达水平随着慢性肝炎向肝硬化的转化而提高，i d 3 在分化良好的肝癌细胞中的表达要高于分化不良的肝癌细胞。i d 3 也表达于成熟期组织中，在多种体内以及原代培养和建系细胞中都有表达，但并非酱遍表达，并且不同组织其表达水平变化很大。根据细胞和组织的类型不同，i d 3 的表达可以是是组成性的，或者通过刺激诱导表达。i d 3 的表达水平一般在增殖的或未分化的细胞中比较高，但是在分化终末期的细胞i d 3 表达呈下调。另外，i d 3 的表达水平不是静止不变的，而是随着细胞生长周期和生理状态的变化而变化，并且对细胞外的不同刺激做出不同的应答反应。因此i d 3 的表达可能既受控于通用的调节机制，又呈现一定的细胞类型特异性，从而在调节细胞生长中执行与d l 不同的细胞生物学功能。本课题首先采用r t - p c r 技术在多种人肿瘤细胞，包括b u r k i t t sb 淋巴瘤细胞( d a u d i ) 、t 淋巴细胞性白血病细胞( j u r k a t ) 、慢性髓性白血病细胞( k 5 6 2 ) 、组织细胞性淋巴瘤细胞( u 9 3 7 ) 、前列腺癌细胞( p c 3 m ) 、肺癌细胞( a 5 4 9 ) 、胃癌细胞( b g c ) 、卵巢癌细胞( c o c 2 ) 及4 0 例血液系统恶性肿瘤患者及1 5例健康人外周血单个核细胞( p b m c ) ，对以上细胞中i d 2 和i d 3m r n a 的表达水平进行检测分析。结果发现，i d 2 无论在各种肿瘤细胞系还是在健康人p b m c 均呈普遍表达趋势；i d 3 在健康人p b m c 中基本不表达，在肿瘤细胞中有低度表达，i d 3 在不同肿瘤细胞中的表达水平有较明显的差异性。在所测的几株肿瘤细胞中，p c 3 m 和a 5 4 9 细胞中i d 3 表达量最高，d a u d i 次之，k 5 6 2 表达量最低。总体上i d 3 表达水平普遍明显低于i d 2 的表达。对l l 例自血病；1 4 例多发性骨髓瘤；1 5例淋巴瘤患者和1 5 例健康体检者p b m ci dm r n a 检测结果提示，血液病( 白血病、骨髓瘤和淋巴瘤) 患者与健康人p b m c 中i d 2 均有普遍表达，各组间无显著性差异；i d 3 在健康人p b m c 中几乎不表达或表达甚弱，各组患者i d 3 表达均高于健康人p b m ci d 3 的表达( p o 0 1 ) ；i d 3m r n a 在不同肿瘤细胞中的表达程度要显著低于i d 2m r n a 的表达，但不同组织类型的肿瘤细胞中i d 3 的表达程度有较明显的差异。因此，对i d 3 在不同类型细胞中，以及细胞的不同生长周期、生长环境下的表达状况进行分析，将有助于探讨作为细胞周期调控蛋白的i d 3 分子在某些病理生理状态下的生理、生物学功能及其意义。v i为探讨i d 3 在肿瘤细胞增殖分化调控中的作用，本课题在成功克隆人i d 3基因的基础上，构建i d 3 与增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 融合基因真核表达载体i d 3 p e g f p n 1 。利用脂质体转染技术将空载体p e g f p - n 1 和重组质粒i d 3 p e g f p - n 1 转入a 5 4 9 细胞，转染1 2 h 9 6 h 后，激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达e g f p 和e g f p i d 3 融合蛋白的a 5 4 9 细胞在4 8 8 n m 激发光下发出强绿色荧光，空载体转染的a 5 4 9 细胞中e g f p 蛋白多表达于胞浆，而i d 3 p e g f p - n 1转染的a 5 4 9 细胞e g f p i d 3 则主要表达在核周和核内；流式细胞仪分析结果表明，a 5 4 9 细胞转染p e g f p - n 1 和i d 3 r ) e g f p - n 14 8 h 时转染效率最高，e g f p 阳性细胞率最高分别可达6 5 4 2 和6 0 5 0 。r t - p c r 结果显示，转染后细胞i d 3基因的表达量可达到转染前的3 4 倍；酶免疫细胞化学鉴定结果表明，鼠抗人i d 3 单克隆抗体能与i d 3 r e g f p - n 1 转染细胞特异性结合，在光学显微镜下观察到细胞特异性染色，证明i d 3 基因在a 5 4 9 细胞中有效表达。通过g 4 1 8 筛选，获得稳定表达e g f p 及e g f p i d 3 的a 5 4 9 细胞。流式细胞仪检测细胞周期发现，i d 3 p e g f p n 1 转染的a 5 4 9 细胞s 期细胞比例和g 2 期细胞比例均明显高于p e o f p - n 1 转染细胞组和未转染细胞组，表明i d 3 基因的导入可诱导细胞从g 1期向g 2 期发展，从而促进细胞增殖。真核表达载体i d 3 p e g f p - n 1 的成功构建及其在a 5 4 9 细胞中的表达及功能分析，为研究i d 3 蛋自在肿瘤细胞增殖及细胞生长调控中的作用奠定了实验基础。学位论文独创性声明本人郑重声明1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：冱碰日期：缸礁= 上：! 兰学位论文使用授权声明本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名：日期：汐讶芝璺：礁第一章细胞分化抑制因子3 ( i d 3 ) 研究进展细胞分化抑制因子( i d ) 是螺旋一环。螺旋( h l h ) 转录因子家族成员之，对碱性螺旋环螺旋( b h l h ) 转录因子活性起负调节作用b h l h 转录因子是由一群广泛分布的，或组织特异性的，以同二聚体或异二聚体形式与d n a 结合的蛋白质组成的一个大家族，能活化与细胞分化有关的基因转录。作为h l h 家族成员的i d 分子，因本身缺乏d n a 结合必需的碱性氨基酸序列，与b h l h 结合成异二聚体后，可抑制b h l h 与d n a 及其他组织特异性b h l h 转录因子结合，从而抑制细胞分化。哺乳动物细胞含四种i d 因子，即i d l i d 4 ，含1 1 9 1 9 9 个氨基酸残基；编码基因分别定位于染色体2 0 q l ，2 p 2 5 ，l p 3 6 ，和6 p 2 2 2 1 号上。该分子参与细胞周期调控过程，包括细胞生长、分化、死亡以及胚胎发育等【m j 。自1 9 9 0 年发现i d 分子以来，有关该分子在细胞增殖、分化、肿瘤发生等方面进f行了广泛而深入的研究。1 i d 3 的结构与功能i d 蛋白是一类分子量约1 3 2 0 k d a 的小分子蛋白，这类蛋白有一共同类型的结构域( 图1 - 1 ) ，此结构域长4 0 5 0 个氨基酸残基，其中含两个既亲水又亲脂的伍螺旋，两个a 螺旋被一个不同长度和序列的连接环区分开。高保守螺旋区通过螺旋上疏水基团的相互作用形成同源或异源二聚体，从而发挥转录调控作用。大部分h l h 蛋白有一个与i - i l h 基序相邻的强碱性区域，为d n a 结合所必须，故此类- l h 又称为碱性h l h ( b m 姐) 蛋白。i d 分子是一类特殊的h l h 蛋白，因其本身缺乏d n a 结合必需的碱性氨基酸序列，与b h l h 结合成异二聚体后，抑制b h l h 与d n a 及其他组织特异性b i - i l h 转录因子( 如e 蛋白) 的结合，对b h l h 转录因子活性起负调节作用，影响细胞特异性基因的表达，从而抑制细胞分化【l 。3 1 。i d 3 基因由三个外显子和两个内含子组成，小鼠i d 3 基因的第一个外显子包括5 ，端非编码区( 哪t ) 和前1 0 0 个氨基酸残基编码区，在+ 3 5 7 位置被一个1 0 5 b p 的内含子所分割；第二个外显子含1 9 个氨基酸编码区和2 6 b p 的3 端非编码区，随后的是5 0 6 b p 的第二个内含子和第三个编码另一个约5 0 0 b p u t r 的外显子。人源的和鼠源的i d 3 基因在核苷酸水平有7 5 8 的相似，氨基酸水平有9 5 8 的相似州。h d f o l 。如i “r 1bl zb h l hi e l n ez i p p e rbp 3b h l h d p a s _ _ _ 嘲豳囫固 二印_ _bb h l i ll d h l hf i g 1 s c h e m a t i cs t r u c t u r eo f d i f f e r e n th l hp r o t e i nf a m i l i e s图1 1h l h 蛋自家族结构示意图图注：碱性d n a 结合区( b ) ，亮氨酸拉链( l z ) ，对氨基水杨酸( p a s )近几年的研究表明，i d 蛋白家族除了具备抑制细胞分化，促进细胞增殖这一功能外，还具有更广泛的生物学作用，如调控细胞定向分化和发育、促进胚胎和器官形成、诱导细胞凋亡、维持细胞存活、促进血管形成、肿瘤浸润及发挥癌蛋白功能等【5 - 8 1 。i d 家族中的各i d 分子根据其表达的部位和时期不同而发挥着相同的和各自独特的功能。单一i d 基因缺失性小鼠虽然可以发生某类细胞系的发育缺陷，但可以存活下来，但i d l i d 3 双基因缺失性小鼠会因发生严重的前脑血管缺陷、神经分化异常和心脏畸形而死于胎内【7 1 。i d 3 参与多种细胞生物学过程，包括t 细胞和b 细胞的发育、骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨发生和肿瘤诱导的血管发生等【9 】。i d 3 蛋白的表达和功能涉及许多复杂的调控过程，因此该蛋白有望成为某些治疗手段的靶向物质。2 i d 3 在细胞中的表达模式i d 3 作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现1 3 】。与i d 家族的其他成员一样，i d 3 的表达在胚胎发育过程中呈动态调控状态，在细胞发育过程中，i d 基因大量表达于未分化的、增殖性细胞；随着细胞分化和成熟，i d 基因表达逐渐减少 4 - 6 1 。胚胎发育过程中，i d 3 的组织表达模式与其他i d 基因相似，例如，在胚胎早期，i d l 和i d 3 表达于来源于内细胞团的组织；而i d 2 在2来源于滋养层的组织中表达，此时没有明显的i d 4 的表达【7 - 9 ；在原始消化道，i d l和i d 3 表达于间充质细胞，丽i d 2 在上皮细胞中表达。在胚胎发育后期，i d l 和i d 3 表达于分裂期成神经细胞，而i d 2 和i d 4 表达于成熟的神经元细胞【1 们。一般来说，i d 3 的表达模式更类似于i d l 。成熟b 细胞在静止期时，e 2 a 蛋白及其d n a 结合活性通常较低，在体外受到激活后，e 2 a 蛋白及其d n a 结合活性明显升高【1 1 1 。i d 蛋白的外源性表达能抑制i g 同型转换，对i d 3 转导的b 细胞基因组d n a 分析表明，此类细胞的i g 类别转换重排功能受到抑制【1 2 1 。其成熟b 细胞受到t 细胞依赖性或非t 细胞依赖性的抗原刺激后，免疫反应遭到损害，表现在特异性i g 同种型产生受到抑制，似乎提示i d 3 为培同型转换所必需【1 2 。4 】。i d 3 也表达于成熟期组织中，但并非在所有组织中都有表达，并且不同组织其表达水平变化很大。i d 3 在多种体内以及原代培养和建系细胞中都有表达。根据细胞和组织的类型不同，i d 3 的表达可以是组成性的，或者通过刺激诱导表达【坷。i d 3 的表达水平一般在增殖的或未分化的细胞中比较高，但是在分化终末期的细胞中i d 3 表达呈下调。另外，i d 3 的表达水平不是静止不变的，而是随着细胞的生长周期和生理状态的变化而变化的，并且对细胞外的不同刺激做出不同的应答反应垧。因此i d 3 的表达可能既受控于通用的调节机制，又呈现一定的细胞类型特异性。3 i d 3 在疾病和病理状态下的表达模式i d 3 表达的不确定与多种疾病和病理状态有关，包括癌症、衰老、动脉硬化症、肌肉萎缩和炎症等。在组织创伤后的新生过程中，i d 3 的表达模式也会发生改变。3 1 癌症一般认为，i d 基因家族的成员的行为与致癌基因相似。已在多种癌症中检测到有一个或多个i d 基因的过表达嘲。某些i d 基因的过度表达可以延迟细胞衰老或导致细胞永生化，其中i d l 与肿瘤的发生及其严重程度的关系已得到普遍认可a与i d l 有所不同，i d 3 在不同组织种类的肿瘤中具有截然不同的表达谱。在初级的结肠直肠癌、高度分级的星细胞瘤、低分化的鳞片状的细胞癌中i d 3 过表达【l ”。在某些神经肿瘤中，不仅肿瘤本身而且在肿瘤周围的血管组织中能够发现i d 3 的3上调( 1 6 l 。i d 3 表达的情形复杂多变。i d 3 在乳头状突起的甲状腺癌，卵巢癌中其表达减弱，而在精原细胞瘤中，其表达或高或无。在肝病或肝癌中，其表达模式甚至更加复杂。在正常肝组织中可以检测到i d 3 的表达。其表达水平随着从慢性肝炎到肝硬化而提高，在高分化的肝癌( h c c ) 中i d 3 也高水平表达，然而在更进一步去分化的h c c 中，其表达水平却下降了1 1 7 4 8 】。在大多情况下，i d 3 表达的改变，有可能是由细胞生理的变化引起的，也可能是对环境信号产生的应答。因此，对i d 3 在不同类型细胞中，以及在细胞的不同生长周期、生长环境下的表达状况进行分析，将有助于探讨作为细胞调控蛋白的i d 3 分子在某些病理生理状态下的生理、生物学功能及其意义。3 2 衰老在动物的衰老过程发现有i d 基因表达的多变性。在衰老的老鼠的后腿肌肉中，i d l i d 3 的表达提高。由于i d 蛋白水平提高一直与肌肉萎缩相联系，在衰老的肌肉中i d 表达上调，可能是因为衰老过程伴随着肌肉块的减少f 1 9 1 。然而，i d 3在衰老的小鼠的垂体腺中的表达却减少【2 0 】。目前还不清楚这种变化的机理。另有研究表明，在不同组织中i d 表达的改变可能由于一些其他的生理紊乱而非衰老本身【2 1 】。3 3 炎症及动脉粥样化有研究报道证明，在发生炎症及动脉粥样化过程中，i d 3 的表达发生改变。在活动的脑和脊髓星形细胞( 这些细胞部分由于脊髓损伤后炎症过程而激发) 中，i d 的表达被上调【2 2 1 。在动脉粥样化过程平滑肌细胞中，i d 3 的表达也发生改变嘞。3 4 损伤在正常的颈动脉血管中i d 3 低水平表达，但是囊损伤的三天内i d 3 的表达会提高，而且损伤后的1 4 天一直保持表达的高水平，且该过程中伴随出现i d 3 新的拼接转录本嘲。在截肢后两栖动物肢干的胚基中，i d 3 的表达上调。i d 3 早期的下调表达可能促进了不成熟的分化和再生的失败。在肝再生过程中，f o x l l v 口b( 一个再生过程涉及的转录因子) 的过表达增强了i d 3 的表达水平。i d 3 的上调可能促进了局部肝肿块后肝的再生渊。4 i d 3 的表达调控i d 3 基因表达受多条信号传导途径调控。诱导i d 3 基因表达的因素包括：血4小板衍生生长因子( p d g f ) 、甲状腺刺激激素( t s h ) 、佛波醇酯( p m a ) 、胰岛素、表皮生长因子( e g f ) 、肝细胞生长因子( h g f )、骨形成蛋白( b m p ) 、转化生长因子p 1 ( t g f p 1 ) 、肿瘤坏死因子a ( t n f ，a ) 、神经生长因子( n g f ) 、胰岛素样生长因子i ( i g f i ) 以及雌激素等 2 5 - 2 7 】。并非所有刺激因素都以相同的方式调控i d 3 的表达，不同的刺激因素作用于不同的组织细胞，通过不同的信号途径，可导致i d 3 表达水平不同程度的升高或降低，即i d 3 的诱导表达呈现细胞特异性和双向调节性。3 1 骨形成蛋白( b m p )t g f b 家族有两个分支，t g f a c t i v i n n o d a l 和b m p g d f ，是调节细胞生长、分化、和死亡的多功能信号分子。包括b m p s 在内的t g f 一1 3 相关生长因子，通过磷酸化s m a d 转录因子而传递其信号。体外实验表明，神经原细胞短暂接触b m p 2 后便不能完成神经形成过程，同时上调i d l 、i d 3 的表达；在间充质干细胞，b m p 9 在成骨细胞的早期分化阶段上调i d 的表达，3 天后随着细胞进入终末分化期，i d 表达恢复到基准水平。胚胎干细胞中的i d 3 处于稳定低水平状态，用b m p 处理胚胎干细胞，可以诱导i d l 、i d 2 、i d 3 的表达瞄圆l 。b m p 以s m a d 4 依赖方式诱导上皮细胞持续性i d 3 表达。3 2 转化生长因子一p ( t g f p )t g f b 通常能够抑制细胞的生长和存活，t g f b 对许多上皮细胞系的i d l 、i d 2 、i d 3 水平起下调作用。上皮细胞用t g f 处理后，会出现i d 3 表达水平的瞬间提高，其后上皮细胞i d 3 表达水平被长期抑制。这表明i d 3 最初的激活和随后的长期抑制可能受控于不同的调节机制f 3 0 】。其他研究表明s m a d 参与调控t g f和b m p 对i d 3 表达的调控作用，缺少s m a n d 4 的细胞，在对任一刺激作出应答时，i d 3 表达水平不会发生改变p n 。5 i d 3 与淋巴细胞发育和分化i d 3 分子在淋巴细胞发育中也发挥重要调节作用。i d 3 缺陷性小鼠发生t 细胞和b 细胞成熟障碍和自身免疫性干燥综合征。成熟b 细胞中，当b 细胞抗原受体( b c r ) 发生聚合后，i d 3 被迅速上调，这个过程会导致细胞增殖的激活用p m a 处理成熟b 细胞，会产生瞬时的i d 3 表达的提高，在4 小时后达到峰值，2 4 小时后，即大约被刺激细胞进入s 期时，这时会产生第二次i d 3 表达的提高。相反，未成熟b 细胞w e h i - 2 3 1 细胞的b c r 发生聚合后，可引起i d 3 的持续性上调表达，同时伴有细胞增殖抑制( 3 2 1 。t 细胞在成熟过程中，t c r 经阳性选择而活化，进而激活r a s e r k m a p k 途径，诱导d p 胸腺细胞内立即早期反应基因1 ( e g r l ) m r n a 的表达。e g r l 的上调表达可快速诱导i d 3m r n a 的表达，i d 3 能抑制e 2 a h e b 与下游效应靶分子s r g 3 启动子中的e 框结合，从而抑制s r g 3 转录。i d 3 通过下调s r g 3 的表达促进未成熟胸腺细胞的分化和成熟【3 3 】。p m a 也能激活e p k 通路刺激i d 3 的表达。在这些细胞中被p m a 诱导的i d 3 的表达是一种依赖于蛋白合成的应答反应 3 2 1 。t g f b 是淋巴细胞生长和存活的强抑制剂，b m p 4 在胚胎干细胞中的表达可诱导i d 2 和i d 3 的表达；用b m p 或t g f p 刺激神经上皮细胞或肝细胞，能诱导i d l 和i d 3 的表达。同样，t g f b 可诱导早期前b 细胞i d 2 和i d 3 表达，在原b 和前b 细胞阶段，主要诱导i d 3 表达；而成熟b 细胞则以诱导i d 2 占主导地位。提示t g f b 可通过调控e 2 a i d 3 的表达，对发育中的b 细胞系的细胞周期进程进行调节【3 2 】。6 i d 3 蛋白功能的调控i d 3 蛋白发挥其功能主要通过和其目标分子形成二聚体或是对其拮抗一i d 3优先和i 级h l h 蛋白结合，而对于二级b h l h 蛋白亲和力很小或没有p 钾i d 3和其他转录因子作用，如三重复合因子t c f 和同源蛋白p a x 5 ，干扰它们和d n a的结合。b 蛋白和p a x 5 竞争与i d 3 的结合。i d 3 和目标蛋白形成二聚化可能也影响了i d 3 蛋白的稳定性和亚细胞的定位f 3 5 】。i d 3 在c o s 细胞中表达是在细胞质和细胞核的，并且半衰期很短。当和e 蛋白共表达，其半衰期提高，并聚集在核内。相对来说，在终端分肌肉分化中，干扰素可诱导的蛋白p 2 0 4 被上调，i d 3和p 2 0 4 共表达加速i d 3 的降解【3 7 】。i d 3 蛋白包含了多种蛋白激酶的潜在的磷酸化位点。在四个i d 蛋白中，有三个都含有一个保守位点，c d k 2 位点，其位置在n 末端s e r 5 附近【3 8 删。i d 3 在s e r 5 附近的磷酸化是细胞周期依赖的方式。用s e r 5 突变为a s p 5 的i d 3 蛋白来模拟磷酸化，这样可以加强阻断e 蛋白和i 级b h l h 蛋白m y o d 形成二聚体，但是很少可能阻止b 蛋白形成同源二聚体。同样的，c d k 2 引起的磷酸化可能干扰i d 3 与t c f 蛋白结合的能力。这表明s e r 5 磷酸化可能改变了i d 3 二聚体的特异性6【3 9 】7 结语自1 9 9 0 年发现i d 分子以来，有关该分子在细胞增殖、分化、肿瘤发生等方面已进行了广泛而深入的研究。人们在鼠