（微生物学专业论文）生物流化床法处理油田开发废水的研究.pdf

摘要 j 随着我国各油田的开发，大量含油废水对环境造成了严重的污染，治 l， 理石油污染问题已迫在眉睫。l 从本实验室保存的6 0 个菌群中筛选得到一个高效降解兴一联原油的 混合菌群新3 1 l ，经鉴定由六种细菌组成。优化了该混合菌群的降解原油 条件，发现在3 0 0 c 、p h 7 6 、适当通气和矿化度、均匀补加氮磷源的条件 下，降油效率达9 0 以上；经重新配伍，得到了一个新混合菌群f 6 ，降油 效率得到提高，残油量降低3 0 。利用气相色谱技术评估了各组成菌在降 解原油的协同作用中的“分工”和效果，证实n ，和n 。菌是关键菌株，而 n ，n 。菌则起辅助作用。测试了生物膜法处理含油废水的效果，除油率约 9 7 。考察了不同制膜方法对生物膜降油效果的影响，说明生物膜的适应 和驯化对除油效率至关重要。 根据以上结果，在室内模拟了含油污水的生物膜处理，比较了三种生 物膜系统的处理效果，证实生物流化床法最适用于兴一联采出水的处理， 其最佳停留时间为6 小时。流出水的含油量和c o d 稳定，含油量由4 5 m g l 降至4 1 m g l 、c o d o 由4 7 0 m g l 降至4 2 m g l ，符合国家石油污水一级排 放标准。 关键词：混合菌群，生物膜，含油污水生物处理，生物流化床 a b s t r a c t a l o n g w i t ht h eo i lr e c o v e r y , al a r g ea m o u n to f p e u o l e u m - p o l l u t e dw a s t e w a t e r c a u s e ds e v e r ec o n t a i - n i n a f i o nt oe n v i r o n m e n t i ti si m p e r a t i v et ot r e a tt h ep e t r o l e u m - p o l l u t e dw a s t e w a t e r a f t e rf i r s ta n ds e c o n ds c r e 层n ，am i x e dc u l t u r en e w 3 一l l ，w h i c hi sa b l et o d e g r a d ex i n g y i l i a n o i le f f i c i e n t l y , w a ss e l e c t e da m o n g6 0o n e sr e s e r v e di nm yl a ba n d i d e n t i f i e da st h em i x t u r eo fs i xs t r a i n so f b a c t e r i u m o p t i m i z e dt h ef a c t o r st h a ta f f e c t i t s b i o d e g r a d a t i o no fp e t r o l e u m , f o u n dt h ed e g r a d a t i o nr a t ea m o u n t st oa b o v e9 0 w h e ni ti s3 0 0 c ，p h 7 6 ，a p p r o p r i a t eo x y g e n ，s a l i n i t ya n dw e l ld i s t r i b u t e dn i t r o g e na n d p h o s p h a t es o u r c e s i m p r o v e di t sw a ss e l e c t i o n ，g o ta m o r ee f f i c i e n tn e wm i x e dc u l t u r e f 6 w h i c hc a nd e c r e a s et h er e s i d u eo i l b y3 0 w i m t h e t e c h n i q u e s o fg a s c h r o m a t o g r a p h y , b r i e f l y a c c e s s e de a c hs t r a i n sf u n c t i o n sa n de f f e c t si nt h e c o o r d i n a t i o no fp e t r o l e u md e g r a d a t i o n , p r o v e dn 5a n dn 6a r ek e ys t r a i n s ，a n dn l n 4 a r e s u p p l e m e n t a r y t e s t e dt h er e s u l t s o fb i o f i l mt r e a t m e n tt o p e t r o l e u mp o l l u t e d w a s t e w a t e r , t h eo i ld e g r a d a t i o nr a t ei s9 7 o r i n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so ft h e d i f f e r e n td e v e l o p i n gf o r m a t st ob i o f i l md e g r a d a t i o np e t r o l e u m ，p r o v e da d a p t a t i o na n d t r a i n i n gi sn e c e s s a r ya n di m p o r t a n t b a s e do nt h e s er e s u l t s ，s i m u l a t e dt h eb i o f f i mt r e a t m e n to f p e t r o l e u m - p o l l u t e d w a s t e w a t e ri nl a b o r a t o r y , a c c e s s e da n dc o n t r a s t e dt h er e s u l t so f t h r e eb i o f i h ns y s t e m s ， c o n c l u d e dt h a t “f l u i d i z e d - b e db i o r e a c t o r ”i st h em o s ta p p r o p r i a t et o x i n g y i l i a n w a s t e w a t e r t h eb e s th y d r a u l i cr e s i d e n c et i m ei s6h o u r s ，t h ea m o u n to fo i la n d c o d e ri nw a t e ra r e s t a b l e ，w h i c ha r ed e c r e a s e df r o m4 5 m g lt o4 1 m g la n d 4 7 0 m g lt o4 2 m g ls e p e r a t e l y , a c c o r d sw i t ht h ef i r s tc l a s ss t a n d a r d so fc h i n e s e w a s t e w a t e r d i s c h a r g er e g u l a t i o n s k e y w o r d s ：m i x e dc u l t u r e ，b i o f i h n ，b i o t r e a t m e n t o f p e t r o l e u m - p o l l u t e dw a s t e w a t e r , f l u i d i z e d - b e db i o r e a c t o r 直五左堂甄班宜生望些l 堂焦2i 盒室苴 直 前言 ( 一)概述 水是一种宝贵资源，是人类赖以生存的必要条件，一切活动归根结底都离 不开水。随着经济发展和人们生活水平的提高，对洁净水的需求量越来越大。 然而，伴随着工业的迅猛发展，水的污染日益严重，已到了非治理不可的程度， 尤其大量的石油开采、排放的含油废水对环境造成了严重的污染。我国各油田 采出液分离出的大量含油污水，不经任何处理就地排放，不但污染农田，同时 也污染了内陆和沿海水系。据报道，水体含油达o o l m g l 即可使鱼肉带有特殊 气味而不能食用。含油稍多时，在水面上形成油膜，导致水体缺氧。在油污染 水域中孵化的鱼苗，多数呈畸形，生命力也弱。油膜还能附在鱼腮上，使其呼 吸困难，甚至窒息而死。石油污染物对植物也影响巨大，妨碍其通气和光合作 用。石油废水进入海洋后，对海洋生态以至人类健康危害严重。石油中富含大 量诱变物、致癌物和生长抑制物，极微量即能致死微藻和许多其它海洋生物的 幼体。并且最近报道称石油可干扰微生物的趋化性而抑制其分解海水中的有机 物质。总之，石油污染对水产业、娱乐资源和公共健康都将造成严重危害。 据河北省资料调查，石油和有机物是该省沿海环境污染的重要污染源。其 中，来源于油田开采、输油作业的跑漏、溢流以及压舱洗舱的含油污水占污染 物总负荷的2 5 1 。胶州湾是我国的重要港口，自从黄岛输油码头投入使用后， 随着油运和沿海石油工业的发展，胶州湾受到了严重的石油污染，不但影响了 海产养殖业和盐业，而且成为南黄海的污染源。渤海湾及其它港湾的油污情况 亦相当严重，位于葫芦岛的五里河入海口石油厚2 4 毫米，5 公里的浅海生物已 绝迹，并且以每年1 0 米的速度向湾内推进，每5 年就吞食掉2 平方公里的海 域。据估计，全世界每年通过各种途径排入海洋的石油烃类约有1 0 0 0 万吨n 5 “”。 这不但使许多水生生物面临着灭顶之灾，也直接威胁着人类的健康。因此，治理 水体石油污染物的问题已迫在眉睫。 ( 二) 废水处理方法概述 多年来，污水处理一直是环保领域的一个重要课题，经过不断的研究探索 直五盔堂亟土班程生望些( 坐位2i 金塞 一一一j l 且一 现代废水处理方法已发展为物理处理法、化学处理法和生物处理法等三大类： 物理处理法：主要是利用物理作用分离废水中成悬浮态的污染物质，在其 处理过程中不改变污染物的化学性质。常用的物理方法有采用格珊、筛网、砂 滤等方法截留各类悬浮物、漂浮物等；利用沉淀、气浮等方法分离比重与水不 同的各类污染物质：利用离心法分离各类悬浮物质等。 化学处理法：是利用化学反应的作用，去除污染物或改变污染物的性质， 它包括投加絮凝剂生成不溶于水或难溶于水的化合物的化学沉淀法；利用电解 原理，在阴阳两极分别发生氧化和还原反应而净化水体的电解法等。 此外，还有吸附、离心交换、浮选、萃取、吹脱、汽提和膜分离法等其他 物理化学法。然而，物理方法通常是将有机物从液相转移到固相( 如活性炭吸附) 或气相( 如吹脱) ，并没有最终消除( 降解) 这些有机污染物。而且由于一些技术上 和经济上的原因，有机污染物不能得到很好的回收利用，依然具有再次污染环 境的可能；由于水中有机污染物的复杂性和多样性，使得化学方法往往顾此失 彼t 6 1 ，单纯的一种方法往往达不到预期目的，而几种技术的联合使用，又在经 济上及技术上存在着诸多困难。并且化学剂的使用实际上是人为地给水体添加 化学污染物。更为严重的是，在化学应用中，往往有中间产物或部分氧化产物 的产生，它们对环境的危害可能更大。而生物为主的治理方法则具有既可处理 污染物，又不产生二次污染的优点，并且能将有机污染物完全矿化为无机物( 如 c o ，、h 2 0 、c l 、n o ；) ，因而具有诱人的前景。 生物处理法：是处理污水中应用最广泛且比较有效的一种方法。它是利用 自然界中存在的各种微生物，将污水中有机物分解并向无机物转化，从而达到 净化水质、消除其对环境污染的方法。生物处理法又分为好氡生物处理和厌氧 生物处理两种类型。厌养生物处理法，又名生物还原处理法，主要用于处理高 浓度有机废水和污泥；废水生物处理广泛使用的是好氧生物处理法，又分为活 性污泥和生物膜法两类。 ( 三) 生物膜法处理污水的进展 生物膜法是废水好氧生物处理的一种，是指使废水流过生长在固定支承物 表面上的生物膜，利用生物氧化作用和各相间的物质交换，降解废水中有机污 染物的方法2 3 l 。 直珏盔堂亟班宜生望些f 堂僮2 逾塞 益言 一一 1 9 世纪末，在研究土壤净化污水的过滤田的基础上，创造了生物过滤法“”， 并应用于生产。然而，其与随后出现的活性污泥法相比，有诸多缺点；体积负 荷和b o d 去除率低，环境卫生条件差，处理构筑物易堵等，于是在二十世纪4 0 6 0 年代有逐渐被活性污泥法代替的趋势。但到6 0 年代，由于环境保护对水质要求 的进一步提高，以及新型合成材料的大量生产，一些高强、轻质、比表面积大、 空隙率大的滤料相继被采用，从而极大地改善了滤床易堵塞的弊病，扩大了生 物膜法应用的范围，因具有运转管理方便、简易，剩余污泥量较少等优点，而 发展为最为广泛应用的一种污水处理方法。现在，生物膜法根据其所用设备不 同可分为生物滤池、塔式滤池、生物转盘、生物接触氧化法和生物流化床法等。 1 生物膜的形成及影响因素 生物膜形成于自然环境和人工环境中，代表了一种稳定的由微生物细胞组 成的复杂混合物的微生态系统，细胞镶嵌在胞外聚合物的基质中，并且附着到 固体表面。生物膜发育形成的条件和过程大致为n 1 ：存在着清洁的可用于 聚居的固体表面；一种有机分子膜快速形成；聚结的细胞松散地附着； 聚居的细胞牢固地附着；微生物群落形成，产生胞外聚合物；群落向上和 向外扩展，形成规则和不规则结构；生物膜成熟，新的菌种进入生物膜并生 长：成熟的生物膜部分脱落，使这种循环交替进行。 2 生物膜的形态和结构 关于生物膜的形态有不同观点。经近期工作，研究者不再将生物膜看作是 连续的层状结构，而更多地看作是附着在一起由独立的堆体或群体的随机组合， 这些堆体或群落周围存在很多通道，水和捕食的原生动物可以通过这些通道移 动。 3 生物膜的化学组成 生物膜由细胞生物量和胞外聚合物组成，主要成分是蛋白质，从所有生物膜 的胞外聚合物组分中可以提取出腐殖酸、多糖、糖醛酸和d n a 。各种环境条件 下形成的生物膜的化学组成不同。在污水生物膜中胞外聚合物可能由细菌产 生，可能为水解产物，或者是从废水中吸附的离子，也可能存在着来自废水的 有机纤维物。 4 生物膜的物理化学特征 生物膜的物理化学特征主要包括生物膜的粘附强度、吸附性质、亲疏水性、 直珏盔堂亟丛宜生望些i 坐篮2j 垒塞 菌 言一 带电性等方面。生物膜的粘附强度在其生长初期阶段相对较高，后期则急剧下 降。在基底表面的粘附强度最低。而张力比剪应力更易于导致生物膜粘附强度 的降低，造成生物膜从基底表面脱落。 生物膜吸附有机化合物受有机物分子大小和带电性的影响。小分子有机物可 扩散进入有孔的生物膜基质，较大的分子则被排除在生物膜孔之外，富集在生 物膜水界面。并且由于生物膜显弱负电性而使其吸附负电饽有机分子的能力较 低。 5 生物膜的生化性质和抗性 由于生物膜的细胞组织结构，而对抗生素、生物杀虫剂或者杀菌剂表现了明 显的阻抗性。胞外聚合物不能阻止抗生素扩散到底部的细胞，但它们猝灭具有 化学反应性的生物杀虫剂，并极大地结合带电性的抗生素，而对较深层的细胞 提供了保护作用。 6 生物膜的脱膜【3 生物膜的脱除方式主要分为冲刷、磨损、整块脱除、人为干预以及被捕食等 五个方面。其中，冲刷和磨损为连续脱膜过程，而其余几种方式则为非连续脱 膜过程。除被捕食外，脱膜过程实际上是依靠外力作用使生物膜的最外层脱除。 外力来源于剪切力和生物颗粒间的碰撞和摩擦。影响生物膜的脱除因素主要包 括上升流速( 气体速度或液体速度) 、剪切力、载体浓度以及载体的表面特性等。 7 好氧生物流化床的研究进展 好氧生物流化床是以小颗粒的载体作为生物膜的附着基质，污水由下向 上流过使载体里“流化”状态，依靠载体表面附着生长的生物膜，使污水得到 净化。生物流化床的特点是比表面积大、处理能力强，为一般生物膜法负荷量 的五倍以上。由于生物膜颗粒的剧烈运动，使系统的传质效果好、生物膜不断 更新、生物活性强，因此废水处理效率高弛1 。 固体颗粒流态化技术发展于四十年代i l l , 并在七十年代移植于废水处理领 域。最早的研究是美国环保局在1 9 7 0 - 1 9 7 3 年进行的。美国e c o l o t r o l 公司于1 9 7 5 年首次取得生物流化床处理废水的专利，称之为h y f i o 生物流化床工艺，应用 于废水的二、三级处理。其后，美国d o r r - o l i v e r 公司在流化床的实用性方面做 了很多研究，尤其在充氧器与进水分布系统上取得t # t 大进展。随后，英国水 研究中心通过厌氧充氧两段流化床对废水进行全面的二级处理，试验结果令人 惠珏鑫堂题主鲤宜垒望些堂焦2 谂塞蕴 直 满意。与此同时，美国水处理中心的c o o p e r 等人也把厌氧- 好氧结合起来，用 二段流化床系统对废水进行处理，此后又设计了两种自动脱膜装置，使流化床 操作更为完美。日本在7 0 年代中期开始对生物流化床进行研究，8 0 年代初开 展了大量的工作，着眼于中小型工厂的废水处理，如三菱公司研制的流动循环 曝气反应器把脱膜、曝气、循环合为一体，很有特色。1 9 9 3 年日本h o k k a i d o 大学研制了一种由颗粒流化床分离器、好氧生物滤床和薄膜过滤器组成的新型 处理系统，先用化学混凝法除去高分子量的有机物和悬浮物。降低了b o d 负 荷，再用颗粒流化床进一步除去低分子量的有机物，因而极大提高了系统的处 理效率。 我国在这方面的研究起步较晚。兰化研究院环保所1 9 7 8 年开始进行纯氧生 物流化床处理石化综合废水的研究工作，先后进行了石化废水、丁烯氧化废水、 甲醇废水和油漆厂废水处理的研究 2 1 0 除兰化研究院外，国内主要研究的是空 气曝气流化床。1 9 8 4 年抚顺石油研究所与石油六厂合作，采用射流曝气三相流 化床处理炼油废水，流化床直径2 2 m ，日处理量达8 6 0 m 3 。近年来，国内三相 生物流化床研究较快，内外循环三相生物流化床、磁场生物流化床以及其它复 合式流化床等研究较多，取得了许多成果。 ( 四) 石油烃生物降解机理及影响条件 1 机理 关于烷烃、芳香烃的代谢途径，经三十年来的研究证实。微生物氧化烷烃 作用一般有三种途径 4 3 1 单端氧化成醇醛专酸；次末端氧化成酮专脂专 酸；双端氧化成二元酸。而对芳香烃则通过双加氧酶( 细菌) 或单加氧酶( 真菌) 作用经水杨酸- - a , 茶酚途径代谢。已经证明微生物在降解某些烃类时共用部分 代谢途径。 实验证明，微生物对烃的降解既可能由质粒控制，如a m 。c h a k r a b a r t y 等 于1 9 7 3 年发现在腐臭假单胞菌中，短连烷烃( c 6 _ c 。) 的代谢基因都是质粒携 带的：又可能是由染色体控制，如1 9 7 6 年s i n g e r 和f i n n e r t y 发现不动杆菌h 0 1 一n 中所有十六烷代谢基因都位于染色体上；还可能是由质粒和染色体共同控制的。 1 9 7 9 年，f e n n e w a l d 等绘出了腐臭假单胞菌p 。g 6 中烷烃氧化所需位点的遗传学 模型。如下图所示： 赢珏盔堂亟鲤窀生生些f 堂健2 ：| 幺塞 蓝毒 烷烃( 诱导物) 卜一一一一一一一一一一 j ， o c t 质粒 一j ! p b aa l k ba l k a a l k ea l k da l k r a l k c 烷烃一一寸醇一寸醛 7 一蹦卜7 斗 染色体 一- _ 卜，f ；l 一1 _ 卜，_ 一1 卜1 z ；l i 岸一_ i a l c aa l c ba l d aa l d b o l c 2 影响烃降解的因素 石油是链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃化合物的复杂混合物。石油 的生物降解性因其所含烃分子的类型和大小而异。短链烷对许多微生物都有毒， 不过他们通常很快就从油中挥发掉了，n - 链烷( c 。- c ：) 最易降解，而更长的链 烷则对生物的抗性增强。从烃分子类型来看，链烃比环烃易降解；直链烃比支 链烃易降解；多环芳烃很难降解。 ( 1 ) 物理化学因素 影响石油烃的微生物降解的物理、化学因素很多2 “”一”，这些因素因影 响微生物的生长速率和酶活性而最终影响微生物降解石油烃的速率，包括：石 油烃的化学组成：石油烃的物理状态； 石油烃的浓度；环境温度；溶 解氧；营养物浓度；无机盐浓度；压力；水活性；酸碱度。 ( 2 ) 生物因素 混合菌群的联合作用： 一种微生物只能代谢一种或少数几种烃类物质，因而象石油这种复杂的烃 类混合体就需具有更广泛的酶活性的混合菌群的联合作用。如：b l a l 研究发 现将a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s $ 3 0 和彳o d o r a n sp 2 0 混合培养可以显著提高单 独培养时的石油降解速率；p g b e r m c k 也发现混合菌群可降解c h r i s t a s - b i t a s 原 油组分的9 7 ，而同样条件下，三个分离的菌株则只能降解5 6 左右。 适应驯化： 在污染物的微生物降解中，适应是一个重要因素，是一个使微生物群体结 6 盎五古生亟主班宜圭生些! 堂位2i 金塞 一盖一 构向着适应于环境条件的方向变化的过程： 法与过程，使微生物逐步适应某特定条件， 的菌株t 2 2 | 。 驯化则是一种定向选育微生物的方 以获得具有较高耐受力和代谢活性 适应一驯化有三种机制】：a 特定酶的诱导和阻遏；b 遗传变化而产生新 的代谢能力；c 降解石油烃微生物的选择性富集。 ( 五) 微生物处理油田污水的研究进展 早在1 8 9 5 年，m y o s h i 就己提出了微生物降解烃类的实验报告。1 9 4 6 年，e z o b e l l 发现很多微生物具有以烃类作为唯一碳能源而生长的能力，并且这些微 生物在自然界中是广泛分布的( 4 0 4 0 。d o r t o n 于1 9 5 2 年指出，去除海洋中的油 污，细菌起着重要作用。p i p e l1 9 6 8 年亦发现，在海洋中细菌对烃类的氧化作 用，比烃的自氧化快几十倍。迄今为止，已发现7 0 个属，2 0 0 多种微生物能够 氧化一种或几种石油烃类。这些实验和调查都为进一步研究微生物解烃机理、 条件优化以至石油污水的生物处理奠定了理论基础。 近年来，国外普遍采取在水体中添加营养盐的办法来提高水中原油分解速 度，如o l i v i e r i 等人用辛基磷酸盐和石蜡化尿素混合液作营养，对原油的分解 速度可提高1 0 倍。法国e i f - a q u i t a i n e 公司则研制出一种叫作u n i p o l e a p 2 2 的商品用以补加氮磷养分，降油效果显著，用于处理油污一周可去除6 0 - 8 0 。 为防止营养盐在水中扩散，一些国家还研制了各种亲油性的缓释肥料，既提高 了原油分解速度，又不刺激藻类的大量繁殖。与之类似，村上昭彦等应用富含 营养盐的缓释胶囊法有效地加速了解烃细菌对海面油膜的降解。 近几年来，国外生物处理油田污水技术获得很大发展，0 a c f b r ( 活性 炭生物流化床反应器) 就是一种新工艺流程。该技术主要是为满足日益严格的 废水排放标准，特别是零排放标准，目前已进行了中试放大试验。在美国的墨 西哥湾油田采出水排放标准规定油含量日最高不超过4 2 m g l ，月平均不超过 2 9 m g l ，该技术能完全达到，甚至可达到更严格的排放标准，即日最高油含量 不超过1 0 m g l 。采出水的治理工艺由原来的隔油一混凝一过滤技术改为隔油一 混凝一生化一过滤技术，其中生化技术的采用已成为先进工艺的一种标志。 我国对微生物治理水体石油污染的研究比较滞后，八十年代，中科院海洋 研究所进行了解烃细菌海洋生态区系调查，发现在石油污染的沿海存在着多种 直珏太堂亟虹峦童望些l 堂位2 硷毫 赶宣 一 解烃微生物。中科院林业土壤研究所在室内采用曝气多次连续培养法研究了水 体中轻质柴油的降解。北京大学生物系采用活性污泥曝气法对处理石化废水进 行了研究。最近，林涛和李哲用s b r 法分别对处理炼油厂废水和油田采出水， 黄广萍对生物接触氧化法处理石化废水进行了初步研究。2 “2 ”。 目前，国内油田采出水一般仍在采用已日益落后的隔油一混凝一过滤工艺， 外排污水的c o d e r 一般难以达标。根据近年来国外技术的发展状况，将生化法 引入治理流程将是未来的发展方向。但由于各油田采出水的性质差异较大，生 物技术应用于油田污水的治理可能会遇到诸多困难。目前，国内尚未见将生化 技术用于油田污水治理的工业化报道。但可预见，在不远的将来，先进的生物 膜、生物流化床技术将得到进一步完善并最终应用于这一领域。 本研究用生物流化床法针对辽河油田兴隆台采油厂污水的生化处理技术进 行了初步探索。 8 材料与方法 一、材料 1 菌种 新3 一1 1 ，为本实验室筛选并保藏的混合菌株，由6 种细菌组成。 2 原油 由辽河油田兴隆台第一联合站( 本文以下简称兴一联) 提供。该油含蜡 6 9 ，含胶质沥青1 4 1 7 。 3 污水 由兴一联提供。 4 柱状活性炭 0 3 6 m m 柱状颗粒，冀东油田提供。 5 粒状活性炭 中1 2 r a m 颗粒，天津塘沽滨海化工厂。 6 主要实验仪器、设备 7 2 1 可见分光光度计 7 5 2 紫外光栅分光光度计 空气压缩机 笔式酸度计 s h i m a d z ug c - t a 气相色谱仪 s u n t e k 色谱工作站 t g l - 1 6 型台式离心机 电子分析天平f a l1 0 4 j 2 一m e 高速离心机 电子显微镜 光学显微镜 二、培养基 1 肉汤培养基( ) 上海第三分析仪器厂 上海第三分析仪器厂 天津市达因仪器厂 葡萄牙姒n n a 公司 日本岛津 先德( 天津) 科技仪器有限公司 上海安亭实验设备厂 上海天平仪器厂 美国b e c k m a n p h i l i p se m 4 0 0 s t 日本o l y m p u s 9 直五去堂亟班峦生望些l 堂焦2i 金塞 挝抖生左鎏 蛋白胨1 o牛肉膏0 5 n a c l0 5 p t i 7 5 2 营养琼脂培养基 肉汤培养基+ 1 2 琼脂粉 3 基础培养基( ) k h 2 p 吼0 3 4n a 2 h p 0 4 0 1 5 ( n h 4 ) 2 s o , 0 4 m g s o 。7 h 2 0 0 0 7酵母粉0 0 0 1 p h 7 2 4 液蜡培养基 基础培养基+ 2 液体石蜡 5 原油培养基 基础培养基+ 1 原油 6 配制石油污水 基础培养基+ 0 0 5 原油 三、溶液 i 重铬酸钾标准溶液( c , f $ 2 c r m z = 0 2 5 0 0 m o l l ) 精确称取预先在1 2 0 c 烘干2 h 的优质纯重铬酸钾1 2 2 5 8 9 溶于蒸馏水 中，移入1 0 0 0 m l 容量瓶中定容，摇匀。 2 硫酸亚铁铵标准溶液( c ) 2 f e ) 2 6 h 2 0 o i m o l l ) 称取3 9 5 9 硫酸亚铁铵溶于水中，边搅拌边缓慢加入2 0 m l 浓硫酸，冷 却后移入1 0 0 0 吨容量瓶中定容，摇匀。临用前，用重铬酸钾标准溶液标 定。 3 试亚铁灵指示液 称取1 4 8 5 9 邻菲罗啉( c 。2 h 8 n 2 h 。0 ) 、0 6 9 5 9 硫酸亚铁溶于水中，稀 释至l o o m l ，贮于棕色瓶内。 4 硫酸一硫酸银溶液 于5 0 0 m l 浓硫酸中加入5 9 硫酸银。放置卜2 天，不时摇动使其溶解。 5 氮磷补加液( m v ) ( n h ) 2 h p o 。0 5 n h d n 0 3 3 0 6 标准油贮备溶液 准确称取标准油品o 1 0 0 9 溶于正己烷中，移入l o o m l 容量瓶内定容， 1 0 直珏盍堂亟班塞生生些i 坐焦2i 幺塞 挝抖与友法 一 贮于冰箱中。此溶液每毫升含1 0 0 m g 油。 7 标准油使用溶液 临用前把上述标准油贮备液用正己烷稀释l o 倍，此溶液每毫升含o 1 0 m g 油。 四、方法 1 兴一联油标准曲线的测定 取标准兴一联油使用溶液，用正己烷稀释后，在波长2 1 5 3 0 0 n m 间，用 1 0 m m 石英比色皿测得吸收光谱图，得到最大吸收峰的波长，即为测定波长。在 7 个5 0 m l 容量瓶中，分别加入0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，8 0 0 ，1 2 0 0 ，2 0 0 0 ，2 5 0 0m l 标准油 使用溶液，用正己烷稀释至标线。在测定波长处，用1 0m i l l 石英比色皿，以正己 烷为参比测定吸光度，经空白校正后，绘制标准曲线。 2 污水中油量测定 ( 1 ) 将一定体积的水样。仔细移入1 0 0 0m l 分液漏斗中，加入5m l5 0 浓度的 硫酸酸化，并加入2 ( m v ) 的n a c i 。 ( 2 ) 用5 0m l 正己烷清洗水样瓶，移入分液漏斗中。 ( 3 ) 再用2 0i l i l 正己烷溥洗水样瓶，移入分液漏斗后，充分振摇3m i n ，静置 使之分层。 ( 4 ) 收集油相，用正己烷作适当稀释后，用1 0 m m 石英比色皿，以正已烷为 参比，测量其吸光度。 ( 5 ) 根据测得的吸光度，在标准曲线上查出相应的油含量。 3 高效降解兴一联油菌株的筛选 以兴一联油配制原油培养基，5 接种量，3 7 c 摇床振荡培养4 8 h ，对6 0 个 混合菌群进行初筛。选取原油分散均匀，细腻，不挂壁的蔷群进行复筛。精确 称取1 0 0 9 原油( 本文以下未特指者均为兴一联油) ，量取1 0 0 m l 基础培养基， 配成原油培养基后，将初筛菌种按5 接种量接入，3 7 ( 2 摇床振荡培养4 8 h 后， 用正己烷萃取，取油相，测o d 值，选出o d 值最低的菌群。 4 菌种的鉴定 将混合菌群新3 1 1 分离纯化，得到六株细菌，依次编号为n ，m ，斜面 保藏。依据伯杰式手册( 第九版) 进行分类鉴定。 壶珏友堂亟主班峦生生些s 堂焦2 监塞扭魁当友擅 5 混合菌群新3 1 1 最佳降油条件的确定 ( 1 ) 生长曲线的绘制：用稀释平板法测出不同生长时间的菌体浓度，绘出菌 体生长曲线。 ( 2 ) 酸碱度：配制原油培养基，并分别用5 nh c i 和5 nn a o h 溶液调至所 需p h 值，按5 的接种量，接入新3 - 1l ，3 7 c 摇床振荡培养4 8 h 后测定 残油含量。残油含量最低时的p h 值即为最佳生长p h 值。 ( 3 ) 矿化度：维持基础培养基配比不变，适当增减培养基中无机盐的总浓度， 并配成无机盐总浓度不同的原油培养基，接种、培养、测定残油含量方 法与( 2 ) 同。残油含量最低者即为最佳矿化度。 ( 4 ) 温度：配制原油培养基，如( 2 ) 接种，并在不同培养温度下，摇床振 荡培养4 8 h 后，测定残油含量。残油含量最低时，即为最佳生长温度。 ( 5 ) 通气量：配制原油培养基，分别用纱布、棉布及密封塑料封口。如( 2 ) 接种、培养、测定原油残量，原油残量最低者即为最佳通气条件。 ( 6 ) 营养物：取1 0 0 m l 兴一联污水加入1 , 0 0 9 兴一联原油，如( 2 ) 接种、 培养，并在不同时间补加不同量的氮磷营养液，4 8 h 后测定残油量。残 油量最低者即为最佳营养物条件。 6 菌种复配 ( 1 ) 新3 1 1 混合菌群中各菌原配比的确定：用稀释平板法计数测出n 。n 。 菌的相对浓度( 即配比) 。 ( 2 ) 将n 。 n 。菌分别从斜面转接肉汤培养基，3 7 c 摇床振荡培养过夜。 ( 3 ) 将n 。讣j 6 菌分别从肉汤培养基转接液蜡培养基，3 7 ( 2 摇床振荡培养4 8 h 。 ( 4 ) 将n ，n 。菌的液蜡培养基分别按不同配比接入原油培养基，并使总接种 量保持一致。 ( 5 ) 3 0 c 摇床振荡培养4 8 h 后，测定残油量。 ( 6 ) 按残油量最低的菌种配比，在液蜡培养基中繁殖种子液，3 0 c 摇床振荡 培养4 8 h 后，4 1 2 保藏。命名为f 。 7 曝气法降油室内模拟 在2 l 发酵罐中加入原油培养基，并接入2 0 m l 菌液，空气压缩机曝 气，定时取样测定残油含量。 匝珏盔堂熊主班基垡坐些f 掌焦2 监塞挝魁复左洼 8 新3 - 1 1 混合菌群及各组成菌降解兴一联油组份气相色谱分析 ( 1 ) 原油样品的制备：将一定体积的作用前后培养基中的油用正己烷萃取 ( 参见污水中油量测定方法) ：取1 0 m l 油相，用氮气吹干溶剂正己烷； 重新加入1 0 m 正己烷将残油溶起；用微量注射器取l i x l 样品进样。 ( 2 ) 色谱条件： 色谱柱：s e 3 0 ( 甲基硅橡胶) 弹性石英毛细管柱，0 2 5 3 0 m ； 分流比：1 0 0 ：1 ： 检测器：f i d 氢火焰离子检测器： 柱温：8 0 ，恒温1 6 m i n ，以4 1 2 m i n 升到3 2 0 ： 气化室和检测室温度：3 3 0 ： 尾吹；6 0 m l m i n ： 载气：n ，流速1 2 c m s e c ： 燃气：h 。，流量0 6 k g c m 2 ； 助燃气：a i r ，流量0 5k g c m 2 。 9 活性炭生物膜的制备及验证 ( 1 ) 配制污水：称取0 2 9 兴一联原油，加入4 0 0 m l 基础培养基，在匀浆器 中高速搅拌3 m i n ，制成原油浓度约为5 0 0 m g ，l 的配制污水。 ( 2 ) 生物膜的制备：取1 0 0m l 配制污水，加入5 9 活性炭，接入5 m l 菌种， 3 0 振荡培养7 2 h ，每隔2 4 h 补加l o r a l 污水。 ( 3 ) 生物膜的验证：取挂膜活性炭数粒，无菌水充分冲洗，用玻璃棒轻轻压 碎活性炭( 或用刀片轻刮) ，取活性炭粉末制片镜检。 1 0 硫酸亚铁铵标准溶液的标定 准确吸取1 0 0 0 m l 重铬酸钾标准溶液于5 0 0 m l 锥形瓶中，加水稀释至1 1 0 m l 左右，缓慢加入3 0 m l 浓硫酸，混匀。冷却后，加入3 滴亚铁灵指示液( 约 o 1 5 m l ) 用硫酸亚铁铵溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。 0 2 5 0 0 x1 0 0 0 c = - - - - - - - - - - v 式中：c 硫酸亚铁铵标准溶液的浓度( t o o l l ) ； v 硫酸亚铁铵标准溶液的用量( m l ) 。 直珏盘堂亟班宜生生些f 堂位2 论室 拉拦兰左鎏 一 11 化学需氧量( c o d c r ) 的测定 ( 1 ) 取2 0 0 0 m l 混合均匀的水样( 或适量水样稀释至2 0 0 0 m l ) 置于2 5 0 m l 磨口 回流锥形瓶中，准确加入1 0 0 0 m l 重铬酸钾标准溶液及数粒小玻璃珠，连 接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口慢慢加入3 0 m l 硫酸硫酸银溶液，轻轻 摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2 h ( 自开始沸腾时计时) 。 ( 2 ) 冷却后，用9 0 m l 水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液总体积不得少于 1 4 0 m l ，否则因酸度太大，滴定终点不明显。 ( 3 ) 溶液再度冷却后，加3 滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定， 溶液颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的 用量。 ( 4 ) 测定水样的同时，取2 0 0 0 m l 重蒸水，按同样操作步骤作空白试验。纪 录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。 计算公式： ( v o v 1 ) 。c 8 x 1 0 0 0 c o d o ( 0 2 ，m g l ) = v c 硫酸亚铁铵标准溶液的浓度( m o l l ) ； v 。滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液用量( m l ) ； v ，滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量( m l ) ； v 水样的体积( m l ) ； 8 氧( 1 2 0 ) 摩尔质量( g t 0 0 1 ) 。 1 2 生物膜法处理污水的室内模拟 将挂膜的活性炭装入内径为3 5 c m 的玻璃管，使挂膜活性炭高度为2 1 c m ( 即直径与高度比为l ：6 ) ，调节污水流速。使之均匀流过生物膜，定时 取样检测。 1 4 直珏态堂亟虹宜生生些l 堂僮2i 金塞 结墨皇过监一 结果与讨论 一油降解标准曲线的制备 1 波长的确定 在2 1 5 。3 0 0 n m 波长之间，每间隔5 r i m 取一点测定兴一联油的o d 值 ( 2 5 4 n m 除外) ，绘制吸收光谱图( 图1 ) 。 2 0 02 2 02 4 0 2 6 02 8 03 0 03 2 0 “o 图l 兴一联油紫外吸收光谱 由图l 可知。在2 2 5 n m 波长处，所测样品的光吸收值最大，因而选 定2 2 5 n m 为测定波长。可以看到在2 5 4 n m 处，还有一个小的吸收峰。这 是由于芳香族化合物中苯环的特征吸收所致 2 兴一联油标准曲线 051 01 52 0 2 53 03 54 04 5 5 05 56 0 图2 兴一联油标准曲线 。g 。 0 8 6 4 2 o 8 6 4 2 0 2 1 l 1 1 1 0 o o 0 o 4 2 l 8 6 4 2 0 1 0 o o 0 -uc窖o 馥珏太堂亟班荭生望些f 坐焦2 ：| 金塞 缝基生过淦 以正己烷为参比测定已知浓度油样品的o d ：。，经空白校正，绘制 标准曲线如图2 。 二高效降解菌群的筛选 根据原油乳化分散的摇瓶初筛结果，选出9 个混合菌群( 见表1 ) 进行 复筛，测定油降解率。原油降解率最高者即为最佳菌群。结果表明，新3 - l l 对兴一联原油的降解率高达8 9 9 ，为最佳菌株。 表l高效降解兴一联菌群的复筛结果 菌种观察样品l样品2平均平均 结果o d 值o d 值o d 值降油率( ) 勋瑕( 瑜 1 4 4 71 4 5 l1 4 4 9 3 群 + 0 9 9 30 9 8 90 9 9 l3 1 6 7 1 + + + o 6 3 90 7 2 80 6 8 45 2 8 污水s 搬 + + 0 7 4 80 8 5 20 8 0 04 4 8 污水1 2 m + 1 1 2 51 2 3 21 1 7 91 8 6 港c d 2 + + + 0 7 6 90 8 3 20 8 0 04 4 8 新3 i i + + + + o 1 7 l0 1 2 00 1 4 68 9 9 1 1 8 + + + 0 。5 4 30 5 3 40 5 3 96 2 8 8 0 液蜡 + + 0 7 8 1o 8 2 00 8 0 14 4 8 菌胶团 + + + 0 3 2 40 4 1 00 3 6 77 4 7 在菌种筛选时，观察油的分散性及是否挂壁是一种简便快捷的方法， 但由于油被分散并不一定表明油被降解。也可能是表面活性剂或其他原因 乳化的结果，因而此方法只适用于初筛，、复筛时则以原油降解率为准。 三菌种鉴定 经鉴定，结果如表2 ，新3 1 1 菌群中各菌的光学及电镜照片详见附录。 6 表2 新3 - l l 菌群组成菌的鉴定结果 特征菌株 1 2 3 4 05 6 浅黄，边乳白，边黄、大、白色，圆，桔红，圆，透明，小， 菌落 缘整齐缘整齐，平，边缘小小圆 形态 有粘性有粘性不整，褶 皱 菌体 0 4 , - , 0 5 0 5 , - - 0 7 0 4 , - 0 6 0 4 - - 0 6 0 5 , - 0 6 0 5 o 8 大小0 7 一i 5 p1 1 2 o p m 0 9 一i 5 p r o0 6 , , - 0 8 1 t m1 5 2 i p m1 0 - i 6 p r o 形 态 m 菌体杆状，较杆状，细短杆，两球杆，瓜短粗杆，短粗杆， 特 形状细，不整短端钝圆子状棒状八字棒状八字 征 齐 排列排列 g 氏染色 g g g g +g +g + 芽孢 荚膜 + 运动性端生一根极生三根无鞭毛无鞭毛无鞭毛 无鞭毛 鞭毛鞭毛 糖氧化 + + 糖发酵 生 + 氧化酶 理 + + h 2 0 2 酶 生 硝酸盐 + 化 还原 特 水解 + 征 纤维素 产吲哚 产h 2 s 1 和掣为假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ： 3 。为不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) ； 结论 4 。为微杆菌属( m i c r o b a c t e r i u m ) ： 5 。为纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) ： 6 。为棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 。 直珏盍芏鳃班盔生生些i 堂也2 逾塞 绩墨生过j 金 四新3