（分析化学专业论文）新型反胶束介质中酶催化性能研究.pdf

山东大学博士学位论文 摘要 利用酶进行物质的合成与转化，是生物学和化学领域交叉研究的热点 之一，、也是2 1 世纪化学发展的趋势。其中，酶活力的保持和提高是生物合 成与转化的关键。为了达到这一目的，除了可以通过酶的分子工程将酶进 行修饰或改造之外，还可以对酶反应的微环境进行改变或修饰，后者及所 谓的酶催化介质工程。 介质工程的研究经历了从水一有机溶剂一反胶束的过程。在水有机溶 剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，酶通常不能保持很好的催化性 能。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中， 大多数酶能够保持催化活性和稳定性。但是，目前的研究还存在着一些问 题。首先，大多数研究都是基于商品化的离子型表面活性剂如二( 2 乙基 己基) 琥珀酸磺酸钠( a o t ) 构成的反胶束来进行的，在这样的体系中， 位于反胶束界面的表面活性剂的带电头基与水池中的酶之间往往存在强的 静电作用力，从而导致酶活力的降低或丧失；其次，目前所有用于酶催化 的反胶束体系都是用传统有机溶剂来形成的，这不仅会对酶活力构成影响， 更对环境保护提出了严峻的挑战。因此，对构成反胶束的两大要素表面活 性剂和有机相进行改进是非常必要的。本论文分别从表面活性剂和溶剂两 方面出发，论述了新型反胶束介质的构建，并且对酶在其中的催化性能进 行了研究。 一新型非离子表面活性剂反胶束的构建及其中的酶催化反应 目前用于酶催化研究的反胶束介质大多是用阴离子表面活性剂a o t 来 构成的。然而，在此体系中酶受界面电性质的影响活力往往不高。向a o t 反胶束体系中添加非离子表面活性剂以提高酶活力的研究已有报道，但这 样做只能在一定程度上减弱而不能消除界面电性质对酶活的影响。利用非 离子型表面活性剂构建反胶束可以大大减弱酶与表面活性剂间的静电相互 作用，然而现有的商品化的非离子表面活性剂大多需要添加极性醇等助表 山东大学博士学位论文 面活性剂且反胶束大小只能在小范围内可控。因此，很有必要尝试新型双 尾基非离子表面活性剂。为此，我们合成了具有双尾基和糖头基的非离子 型表面活性剂n 葡萄糖基谷氨酸二癸基酯( g g d e ) ，并用来形成新型反胶 束体系。 在由g g d e 和t d t o n x - 1 0 0 ( t x 1 0 0 ) 构成的复配反胶束体系中，以木 素过氧化物酶( l i p ) 催化氧化藜芦醇( v a ) 的反应为指示反应，研究了 反胶束大小，缓冲溶液的p h 以及h 2 0 2 浓度对l i p 催化活力的影响。结果表 明，在最佳反应条件下，l i p 在g g d e t x - 1 0 0 反胶束中的催化效率是其在 a o t 反胶束中的4 0 多倍。在g g d e t x - 1 0 0 反胶束中，非离子表面活性剂头 基与l i p 之间不存在强的静电作用力，l i p 的活力得到充分发挥。 酵母醇脱氢酶( y a d h ) 在g g d e t x - 1 0 0 反胶束中的催化性能的研究 再次证明了g g d 阴x 1 0 0 反胶束作为酶催化反应介质的优越性。将y a d h 催化辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + ) 氧化乙醇的反应作为指示反应， 在各自的最佳反应条件下，y a d h 在g g d e t x 1 0 0 反胶束中的催化活力明 显高于a o t 反胶束中的活力。就动力学研究而言，y a d h 在g g d e t x - 1 0 0 反胶束中催化反应的的转化数是a o t 反胶束中的1 4 倍，而底物乙醇和辅酶 n a d + 在a o t 反胶束中的米氏常数分别是g g d e t x - 1 0 0 反胶束中的2 倍和5 倍。由此说明，胶束界面不仅会对y a d h 本身产生影响，对带有正电荷的 辅酶n a d + 的影响更加显著。在a o t 反胶束中，头基与n a d + 之间存在强的 静电吸引力，导致辅酶与y a d h 结合减弱。从而，y a d h 在g g d e t x - 1 0 0 反胶束中的催化效率要远大于在a o t 反胶束中的催化效率。 二。离子液体对醇脱氢酶失活机制的探讨以及离子液体微乳液的应用 “绿色溶剂室温离子液体( r t ，s ) 作为酶催化反应介质引起了研究 者们的兴趣。1 丁基一3 一甲基咪唑六氟磷酸盐( b m a m p f 6 】是一种普通的疏 水性离子液体。据报道，醇脱氢酶( a d h ) 在缓冲液和 b m i m j p f 6 】两相 体系中是具有催化活力的。但是，在 b p f 6 和亲水性离子液体( 如1 - 乙基3 甲基咪唑四氟硼酸盐 e m i m c b f 4 】) 的单相体系中，a d h 是没有催 化活力的。为了弄清离子液体对a d h 的失活作用及其机理，本文定量研究 山东大学博士学位论文 了离子液体 b m i m p f 6 对酵母醇脱氢酶( y a d h ) 催化活力的影响以及相 关的抑制机制，并且首次将离子液体微乳液引入酶催化反应。结果表明， 在由h 2 0 ，c h 3 c h 2 0 h 和 b m i m p f 6 构成的均相溶液中，y a d h 活力随着 田m m 】【p f 6 】摩尔分数的增加而迅速下降。 b m i m p f 6 对y a d h 的抑制作 用可能是通过 b m i m p f 6 d e 的咪唑基团与辅酶n a d + 竞争y a d h 的结合位 点而引起的。同理可以解释季铵型离子液体对醇脱氢酶的失活作用。将酶 促反应置于 b m m p f 6 微乳液中进行时，y a d h 显示出催化活性。在离子 液体微乳液中，表面活性剂构成的界面膜将y a d h 与离子液体【b 删 p f 6 】 隔离开来，从而避免t b m i m p f 6 对y a d h 的直接失活作用。在此微乳液 中，y a d h 的催化活力能够达至k j 5 1 出r a i n 。这是在离子液体微乳液中进 行酶催化反应的首次报道。 三新型离子液体微乳液的研究 随着离子液体应用范围的不断扩展，对离子液体中的生物催化的研究 活跃起来。实验表明，多种酶在离子液体或离子液体水两相体系中体现出 了较好的催化活力和立体选择性。但是，值得注意的是，研究证明只有悬 浮在离子液体中的酶才具有催化活力，溶解在离子液体中的酶却是没有催 化活力的，这就大大限制了酶的催化效率的发挥。h 2 0 t x 一1 0 0 【b m m p f 6 】 离子液体微乳液作为能够将酶单分子水平分散的均相溶液被用来尝试作酶 催化反应介质取得了成功。我们的研究表明酵母醇脱氢酶、木素过氧化物 酶以及漆酶在此体系中都能够保持催化活力。但这一离子液体微乳液相区 大部分都在表面活性剂含量很高( 5 0 ，w w ) 的区域。这样以来会导致 酶活力的损失以及反应后处理非常麻烦。所以，有必要开发表面活性剂含 量较低的离子液体微乳液。a o t 在有机溶剂中能够形成稳定的聚集体，并 且具有良好的增溶水的能力，是传统反胶束中最常用的表面活性剂，于是 我们尝试将a o t 引入离子液体微乳液的构建。即在溶有适量非离子表面活 性剂t x - 1 0 0 的离子液体中溶入少量的a o t ，并加水使之形成微乳液。本 文详细论述了h 2 0 a o t - t x 1 0 0 1 3 m i m p f 6 】离子液体微乳液的构建和形 成，并且对这种新型离子液体微乳液中的酶催化反应进行了初步的研究。 山东大学博士学位论文 以脂肪酶( 1 i p a s e ) 催化的酯交换反应作为指示反应，研究了l i p a s e 在此微 乳液体系中的催化性能。将l i p a s e 在几种离子液体微乳液中的催化活力作 比较时发现，l i p a s e 在h 2 0 a o t - t x - 1 0 0 b m i m p f 6 微乳液中的催化活力 与h 2 0 t x - 1 0 0 b m i m p f 6 的催化活力相当，尽管与t x 一1 0 0 相比a o t 是一个抑制作用较强的离子型表面活性剂。这说明利用此方法将离子液体 微乳液中的表面活性剂含量降低是可行的。并且随着离子液体碳链的增加， l i p a s e 活力具有增加的趋势。这一研究结果不仅大大丰富了传统的胶束酶学 理论，拓展了胶束酶学的适用范围，而且对今后的离子液体微乳液的深入 研究具有指导意义。 关键词：表面活性剂反胶束微乳液离子液体酶催化 i v 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t e n z y m ec a t a l y z e db i o s y n t h e s i sa n db i o t r a n s f o r m a t i o n sa r eh o tt o p i c si n t h ei n t e r s e c t a n tr e s e a r c ha r e ao fb i o l o g ya n dc h e m i s t r y ，i tw a st h ed e v e l o p m e n t t r e n do ft h ec h e m i s t r yi n21 t hc e n t u r y t h em a i n t e n a n c ea n de n h a n c e m e n to f t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fa ne n z y m ew a st h ek e yp r o b l e mo fb i o s y n t h e s i sa n d b i o t r a n s f o r m a t i o n s t oa c h i e v et h eg o a l ，t h ee n z y m ec o u l db em o d i f i e db y m o l e c u l a re n z y m ee n g i n e e r i n g , a n dt h em i c r o e n v i r o n m e n to ft h ee n z y m e l o c a t e dc o u l da l s ob ec h a n g e d ，w h i c hi st h es o - c a l l e dm e d i u me n g i n e e r i n g t h ed e v e l o p m e n to fm e d i u me n g i n e e r i n gg o e st h r o u g ht h r e es t a g e s ： w a t e r , o r g a n i cs o l v e n t , r e v e r s e m i c e l l e i nt h et w op h a s es y s t e mo f w a t e r o r g a n i cs o l v e n to rt h es i n g l ep h a s es y s t e mo fo r g a n i cs o l v e n tc o n t a i n i n g m i c r o - w a t e r , t h ec a t a l y t i cp e r f o r m a n c eo fe n z y m eu s u a l l yn o ts o9 0 0 d r e v e r s e m i c e l l ec o u l ds i m u l a t et h en a t u r a le n v i r o n m e n to fe n z y m e s ，s om o s to fe n z y m e s c o u l dr e t a i ni t sc a t a l y t i ca c t i v i t ya n ds t a b i l i t yi nr e v e r s em i c e u e h o w e v e r , t h e r e a l es e v e r a lp r o b l e m si nt h ep r e s e n ts t u d y ，f i r s t l y , m o s to ft h es t u d yw a sb a s e d o nt h ec o m m e r c i a li o n i cs u r f a c t a n t ss o d i u mb i s ( 2 一e t h y l h e x y l ) s u l f o s u c c i n a t e ( a o t ) i nt h ea o t r e v e r s em i c e l l e ，t h e r ee x i s t ss t r o n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n b e t w e e nt h ec h a r g e dh e a dg r o u po fs u f f a c t a n ta n de n z y m e ，w h i c hw o u l dc a u s ea d e c r e a s eo ft h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fe n z y m e s e c o n d l y , a l lt h er e v e r s em i c e l l e u s e df o re n z y m ec a t a l y s i sw a sb a s e do nt r a d i t i o n a lo r g a n i cs o l v e n t , w h i c h w o u l di n a c t i v a t ee n z y m e 弱w e l l 弱p o l l u t et h ee n v i r o n m e n t t h e r e f o r e ，t h et w o k e yf a c t o r s s u r f a c t a n ta n ds o l v e n tw e r en e c e s s a r yt ob ei m p r o v e d t h i st h e s i s w a sb a s e do nt h et w os i d e s n ef o r m a t i o no fn o v e lr e v e r s em i c e u es y s t e m sa s w e l la st h ec a t a l y t i cp e r f o r m a n c eo fs e v e r a le n z y m e sw e r ed e s c r i b e da n d d i s c u s s e d 1 f o r m a t i o no fn o v e lr e v e r s em i c e l l ec o m p o s e do ff u n c t i o n a ln o n i o n i c s u r f a c t a n ta n de n z y m ec a t a l y s i s a tp r e s e n tt h er e v e r s em i c e l l eu s e di ne n z y m ec a t a l y z e dr e a c t i o n si s v 山东大学博士学位论文 i 1 m o s t l yc o m p o s e do fa n i o n i cs u r f a c t a n ts o d i u mb i s ( 2 - e t h y l h e x y l ) s u l f o s u c c i n a t e ( a o t ) h o w e v e r , t h ea c t i v i t yo fa ne n z y m ei na o t r e v e r s em i c e l l e si su s u a l l y l o wb e c a u s eo ft h es t r o n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ee n z y m ea n dt h e i n t e f f a c e a d d i t i o no fn o n i o n i cs u r f a c t a n t st ot h ea o t r e v e r s em ic e l l ec a l lt oa c e r t a i ne x t e n td e c r e a s et h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ，b u tc a nn o te l i m i n a t ei t a r e v e r s em i c e l l ec o m p o s e do fn o n i o n i cs u r f a c t a n t sm a y b eag o o dc h o i c et ot h e e n d h o w e v e r ，a tp r e s e n t m o s to ft h ec o m m e r c i a l l y a v a i l a b l en o n i o n i c s u r f a c t a n t sn e e dc o s u f f a c t a n t ss u c ha ss t r a i g h tc h a i na l c o h o l s t of o r ma w a t e r - i n o i lm i c r o e m u l s i o na n dt h es i z eo ft h er e v e r s em i c e l l ec a l lb et u n e d o n l yi nan a r r o wr a n g e a n o n i o n i cs u r f a c t a n tn - 西u c o n y lg l u t a m i ca c i dd i d e c y l e s t e r ( g g d e ) w h i c hh a st w oh y d r o p h o b i c h y d r o c a r b o n t a i l sa n do n e h y d r o p h i l i cs u g a rh e a dg r o u pw a ss y n t h e s i z e dt of o r m u l a t ean o v e lr e v e r s e m i c e l l e b a s e do nt h el i pc a t a l y z e do x i d a t i o no fv e r a t r y la l c o h o l ( v a ) i nt h i sn o v e l r e v e r s em i c e l l ec o m p o s e do fg g d ea n dn t o n x - 1 0 0 ( t x - 1 0 0 ) ，t h ee f f e c t so f t h es i z eo ft h er e v e r s em i c e l l e ，t h eb u f f e rp h , a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2o n t h ec a ：t a l y u ca c t i v i t yo f “pw e r ei n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， t h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yo fl i pi nt h e ( x 讧) i y l l r i t o r 妊1o or e v e r s em i c e l l ew a s4 0 t i m e sh i g h e rt h a nt h a ti nt h ea o tr e v e r s em i c e l l e t h ef u l le x p r e s s i o no f c a t a l y t i ca c t i v i wo f “pi n t h i s m e d i u mw a sm a i n l yd u et ot h el a c ko f e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nl i pa n dt h eh e a dg r o u po fg g d ea n d t r i t o n x 10 0 s t u d yo ft h ec a t a l y t i cp e r f o r m a n c eo f y e a s t a l c o h o ld y h y d r o g e n a s e ( y a d 国 i ng g d e 汀x 一1 0 0r e v e r s em i c e l l es h o w e dt h ea d v a n t a g e so ft h i s r e v e r s e m i c e l l ea g a i n t h eo x i d a t i o no fe t h a n o lc a t a l y z e db y 啪h a tt h ep r e s e n c eo f c o e n z y m en i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ef n a d 3 w a ss e l e c t e da si n d i c a t o r r e a c t i o n t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fy a d h i ng g d e t x - 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b a s e dm i c r o e m u l s i o nw i t h l o wc o n t e n to f s u r f a c t a n ti su r g e n t l yn e e d e d a o tw a sac o m m e r c i a l l ya v a i l a b l ea n i o n i cs u r f a c t a n tw i t ht w ot a i l s b e c a u s eo fi t se a s ya g g r e g a t i o ni no r g a n i cs o l v e n t s ，i t i sw i d e l yu s e dt o f o r m u l a t ew a t e r - i n - o i lm i c r o e m u l s i o n s i nt h ep r e s e n c eo fn o m o n l cs u r f a c t a n t t x - 1 0 0 ，a n i o n i cs u r f a c t a n t a o tc o u l db ee a s i l yd i s s o l v e di n ac o m m o n h y d r o p h o b i ci o n i cl i q u i dt b m i m t l f 6 t o f o r m u l a t ea b m i m p f 6 - b a s e d i i l i c r o e m u l s i o n i nt h i sn o v e lm i c r o e m u l s i o n , t h eo p t i m u m 咖a n dp h w e r ec a 5 6a n d7 8 r e s p e c t i v e l y f o rt h em o d e lr e a c t i o no fl i p a s e _ c a t a l y z e d t r a n s e 删矗c a 五o n u n d e rt h er e s p e c t i v eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec a t a l y t i c a c t i v i t y o f l i p a s e i nt h e p r e s e n t h 2 0 a o t - 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1 1 0 0 3 c 4 h 6 0 2 u v h p l c f t - 之 d l s 符号与缩写 木素过氧化物酶 醇脱氢酶 酵母醇脱氢酶 脂肪酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 二( 2 乙基己基) 琥珀酸磺酸钠 苯酚聚氧乙烯( 9 ) 醚 n 葡萄糖基谷氨酸二癸基酯 反胶束中水与表面活性剂的摩尔比 室温离子液体 1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐 1 辛基3 甲基咪唑六氟磷酸盐 藜芦醇 2 羟甲基1 ，4 苯并二氧杂环乙烷 醋酸乙烯酯 紫外可见光谱 高效液相色谱 红外光谱 动态光散射 i x 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科 研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：醢杰 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文储虢迭聊签辫啸地 山东大学博士学位论文 i i_ 第一章绪论 生物工程( b i o e n g i n e e r i n g ) 又称生物技术或生物工艺学( b i o t e c h n o l o g y ) ， 是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一门新的综合性技术学科。生物技术的发展， 将促进工农业生产的根本变革对人类生产和生活将产生深远的影响。酶 工程是生物工程的重要组成部分。酶工程是指在一定的生物反应器内，利 用酶的催化作用，进行物质合成与转化的技术。其中，对酶的催化性能的 调控是研究的关键问题之一。为了提高酶的催化性能以及扩大其应用范围， 除了可以通过酶的分子工程将酶进行修饰或改造之外，还可以对酶反应的 微环境进行改变或修饰，即所谓的介质工程。 有机相酶催化反应以其特有的优势成为介质工程中极具意义的研究方 向。然而有机溶剂易使酶失活或活力降低，酶在有机相中溶解度较小，增大 了反应的扩散限制，所以大部分酶在非水相中的反应速度远远低于在水相 中的反应，因而使它的应用受到了极大的限制。胶束酶学即是在此基础上发 展起来的一门新的交叉学科。反胶束是由表面活性剂稳定的油包水介