（有机化学专业论文）环状氨基酸的合成及在生物活性肽中的应用.pdf

贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 主要缩写词说明 a l a丙氨酸 a r g精氨酸 a p h 对氨基苯丙氨酸 b e c叔丁氧羰基 t b u 叔丁基 b z l 苄基 c m p 对氯甲基苯丙氨酸 c p a对氯苯丙氨酸 d c c 二环己基碳二亚胺 d c m二氯甲烷 d i o x 二氧六环 d i e a 二异丙基乙胺 d m fn j n 二甲基甲酰胺 f m o c 芴甲氧羰基 f s h卵泡刺激素 g l u 谷氨酸 g i n谷氨酰胺 h i s 组氨酸 h o b t 1 - 羟基苯并三唑 l e u亮氨酸 h i s 组氨酸 l h l h r h l y s m o p n a l p h e p r o r p - h p l c s e r t l a 1 o l t y r u u p h z a c c 3 a c c s a c c 第3 页 黄体生成素 促黄体生成素释放激素 赖氨酸 4 吗啉基甲基苯丙氨 酸 萘丙氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 反相高效液相色谱 丝氨酸 三氟乙酸 对甲苯磺酰基 酪氨酸 脲基 对脲基苯丙氨酸 苄氧羰基 1 氨基环丙基羧酸 1 氨基环戊基羧酸 1 氨基环己基羧酸 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：童j 整 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：量! l 盆导师签名： 第5 l 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 摘要 文献调研发现，l h r h 拮抗剂肽链骨架中，如8 位或3 6 存在一个i i 型伊转角， 它的存在有利于提高拮抗剂与受体之间的亲和作用，使体内和体外活性得到提 高。环状氨基酸的引入可以增加结构的刚性，限制构象而产生不同的结构或生物 效应。当侧链中有体积较大的a c c n ( 佗5 ) 团时，更易于与受体的疏水性口袋结合， 还可以稳定肽链的折叠构象和螺旋结构。因此，提出将环状氨基酸引入l h r h 拮 抗剂的7 位，介入构象限制性因素，迫使肽链形成伊转角，更好地与受体结合， 而且，这种既有d 型又有l 型的内消旋式氨基酸可能会抑制蛋白酶对肽键的水解， 从而延长l h r h 拮抗剂在体内的作用时间。 基于此假设，首先合成了l o 个保护的非天然氨基酸，最终产物通过旋光测 试，达到多肽合成中光学纯的要求，以环酮为起始原料，与氰化钠反应实现了环 状氨基酸的合成，部分化合物结构经过1 hn m r 或m s 确证；然后以l h r h 拮 抗剂为先导化合物，采用固相多肽合成法，选用m b h a 树脂，采用b o e 合成策 略，d c c h o b t 法和b o p d i e a 缩合法，茚三酮指示法检测，氨基酸的扭氨基 用b o c 保护，侧链氨基则用对酸( 4 mh c l d i o x ) 稳定但可用碱( 2 5 哌啶d m f ) 或强酸( 无水h f ) 脱除的保护基保护，对l h r h 拮抗剂的5 位、6 位、7 位、1 0 位氨基酸进行合理修饰或替换，设计并合成了8 个十肽化合物，成功地将1 一氨基 环戊基羧酸( a c e 5 ) 和1 氨基环己基羧酸( n e d ) 引入到l h r h 拮抗剂的7 位， 此替换尚属首次报道。合成后的l h r h 拮抗剂类似物经过中压纯化，纯化后的 多肽经h p l c 分析，纯度均能达到9 0 以上，能够满足活性测试的需要。 关键词：l h r h 拮抗剂；环状氨基酸；伊转角 第1 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 a b s t r a c t b a s e do nt h ed e v e l o p m e n to f l h r h a n t a g o n i s t s ，i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h e r ew a s a t y p e - i i 卢衄1 1i nt h ep c p t i d eb a c k b o n ea r o u n dt h er e s i d u e s5 - 8o r3 - 6 , w h i c hw o u l d b ef a v o u r a b l ef o rt h eb i n d i n ga f f i n i t yo fa n t a g o n i s t st ot h er e c e p t o r , a n dt h ea c t i v i t i e s o ft h ea n g o n i s t si nv i v oa n di nv i t r o a si ti sk n o w nt h a tt h ei n t r o d u c t i o no fc y c l i c a m i n oa c i d sc o u l dc a l k s i g n i f i c a n tc h a n g e si np e p t i d ec o n f o r m a t i o ne n s i s t a n c o c h e m i c a la n db i o l o g i c a lp r o p e r t i e si np e p t i d e sw o u l db ea f f e c t e d w h e ni n t r o d u c e d c y c l i ca m i n oa c i d si n t ol h r i - ia n t a g o n i s t s ，t h r o u g hs i g n i f i c a n tc o n f o r m a t i o n a l r e s t r i c t i o n si nt h ea m i n oa c i dr e s i d u e s i tw o u l db ef a v o u r a b l ef o rb i n d i n gt h ep o c k e t o fh y d r o p h o b i c i t yr e c e p t o rt of o r mb - t a mo rh e l i c a ls t r u c t u r e w ea s s u m e dt h a tt h e i n t r o d u c t i o no f dla m i n oa c i di nl h r ha n t a g o n i s t sa tp o s i t i o n7 ，f o r c e dt h ep e p t i d e c h a i ni n t op - t u mt ob i n dt h er e c e p t o r t h e s edla m i f l oa c i d sw o u l db ei n c r e a s e r e s i s t a n c et op r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o na n dp r o l o n gt h ea c t i v et i m ei nr i v e b a s e do i lt h i sh y p o t h e s i s ，1 0p r o t e c t e du n n a t u r a la m i n oa c i d sh a v e b e e n s y n t h e s i z e d ，t h ee n dp r o d u c t sh a v ep a s s e do p t i c a lr o t a t i o nt c s t ，a l lo ft h e mh a v e a c h i e v e do p t i c a lr e q u i r e m e n ti np e p t i d es y n t h e s i s ，a n ds y n t h e s i z i n gc y c l i ca n l i n o a c i d sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yu s i n gc y c l i ck e t o n e sa ss t a r t i n gm a t e r i a l sr e a c t i n g w i t hs o d i u mc y a n i d e , p a r t so ft h ep r o d u c t sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db y hn m ro r m s w eu s e ds o l i d - p h a s ep e p t i d es y n t h e s i s , m b h ar e s i n , b o cs y n t h e s i ss t r a t e g y , d c c h o b to rb o p d i e ak o n d e n s a t i o n a lm e t h o d t h ea a m i n ow f f f ep r o t e c t e db y b o c ，t h es i d ec h a i na m i n o sw e r ep r o t e c t e db ys t e a d yi n4 mh c f d i o x ，a n dc o u l db e e l i m i n a t e db y2 5 p i p c r i d i n e d m fo ra n h y d r i d eh f 8d e c a p e p t i d e sw e r ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e db yu s i n ga ne f f e c t i v el h r ha n t a g o n i s ta sal e a d i n gc o m p o u n d , r e p l a c i n go r m o d i f y i n g a tp o s i t i o n5 、6 、7 、1 0 1 - a m i n o c y c l o - p e n t a n e c a r b o x y l i ea c i d ( a c c ba n d1 - a m i n o - e y c l o h e x a n e c a r b o x y l i ca c i d ( a c e 6 ) w e r ei n t r o d u c e do n t op o s i t i o n 7o f l e a d i n gc o m p o u n ds u c c e s s f u l l ya n dt h em o d i f i c a t i o no f a c ow a sr e p o r t e df o rt h e f i r s rt i m e t h ed e s i g n e dp e p t i d e sh a v eb e e np u r i f i e db yf l a s hc o l u m n , a n dt h ep u r i t y w a sa n a l y z e db yh p l c t h eb i o - a c t i v i t ya s s a yo f n e wp e p t i d e si sg o i n g k e yw o r d s ：l h r ha n t a g o n i s t s ；c y c l i ca m i n oa c i d s ；卢- t u m 第2 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 刖罱 构型限制型氨基酸一直是有机合成和药物化学研究的热点，尤其是在新型多 肽的合成设计中( c h r i s t i n all ，e la 2 0 0 2 ) 。在肽类新药设计研发中，当碳链中 需要介入构型限制同时又保持线性链烃的疏水性时，结构刚性的环状氨基酸起着 非常重要的作用。它们的引入可以增加结构的刚性，引起构象的限制而产生不同 的结构或生物效应。 多肽类药物除具有自身的优点外，还存在易被蛋白酶水解，半衰期短，生物 利用度低的缺点。目前用以提高药物抗蛋白酶降解能力的主要策略有：与酶抑制 剂的联合运用( 王萍，等2 0 0 5 ) ；肽类药物剂型的改变( m i c h e lc ，e ta l1 9 9 1 ) ； 化学结构修饰抑制酶解等。其中，通过化学结构修饰抑制酶解一直是药物合成领 域研究的重点。 环状氨基酸( 1 - a m i n o c y c l o a l k a n e c a r b o x y l i ca c i d s ) 简称 a c c ，其中1 1 表示环 的碳原子个数。其侧链碳碳键被环取代，不能自由旋转，当中心碳原子所处环 境对称时，则对应的环状氨基酸没有手性。研究表明( p 卸lpkc ，e la 1 9 8 6 ) ， 当侧链中有体积较大的a c e b ( 庀5 ) 基团时，更易于与受体的疏水性口袋结合， 而表现出更强的生物活性。将环状氨基酸引入肽链中，对多肽结构进行替换，修 饰或缩短肽链长度，有可能获得低毒、长效、经济的多肽类药物。 构效关系研究表明，高活性的l h r h 拮抗剂中均有型b - t u m 存在( 5 弼位或 3 6 位) 。n i k i f o r i c h ( k u t s e h e r b ，e t a 1 9 9 7 ) 等系统研究了l h r h 类似物的构象， 5 8 位( t y r - g l y - l e u - a r g ) 存在一个i i 型伊转角，被认为是与受体结合的优势构 象。分子中i i 型卢转角的存在有利于提高拮抗剂与受体之问的亲和作用。因此， 引入环状结构因素对于l h r h 拮抗剂更好地与受体结合可能有着重要的意义。 因此，我们以抗前列腺癌药物l h r h 拮抗剂为模型，用环状氨基酸替换7 位l e u ，使其保持生物活性的同时，增加其对酶解的稳定性。 本文报道了环状氨基酸和保护非天然氨基酸的合成，其中以环己酮、环戊酮为 起始原料成功地合成了a c 矿、a c c 6 ，并将其应用到l h r h 拮抗剂中：以甘氨酸为起 始原料合成a c c 3 ( 该路线未进行完) ；合成了保护非天然氨基酸1 0 个，a c c 3 中间体1 个，部分化合物结构已通过1 hn m r 或m s 确证。所合成多肽序列均已得到纯化， 纯化后的多肽经h p l c 分析，纯度均能达到9 0 0 o 以上，达到活性测试的要求。 第4 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 第一章综述 构型限制性氨基酸一直是有机合成和药物化学研究的热点，尤其是在新型多 肽的合成设计中。在肽类新药设计研发中，当碳链中需要介入构型限制同时又保 持线性链烃的疏水性时，结构刚性的环状氨基酸起着非常重要的作用。它们的引 入可以增加结构的刚性，引起构象的限制而产生不同的结构或生物效应。环状氨 基酸也被应用到多肽类似物中考察其结构和生物效应，以期寻找结构优化的配 体。多肽和拟肽也经常引入构型限制性因素来产生重要的结构效应。 1 1 环状氨基酸概况 1 1 1 环状氨基酸的结构特点 环状氨基酸( 1 - a m i n o c y c l o a l k a n e c a r b o x y l i ca c i d s ) 简称a c c n ，其中n 表示环的 碳原子个数( r a m e s hk e ta 1 9 9 9 ) 。其侧链碳碳键被环取代，不能自由旋转， 当中心碳原子所处环境对称时，则对应的环状氨基酸没有手性。 a c 幽不碳原子的c - c 键键角接近6 0 0 ，亚甲基碳夹角比其它骨架碳链夹角略 大，约为士6 2 0 ，晶体结构衍射在肽链中更倾向于形成伊折叠构象( v f l a i v a nc s ，e ta 1 2 0 0 5 ) 晶体结构衍射显示a c e 5 呈半椅式稳定构象，键角约为- 4 - 1 0 9 0 ，它的残基能够 稳定生物活性肽中的伊折叠构象( b a r d i e ta 1 9 8 6 ) 。 a c e 6 在结构上与v a l 、l e u 、i l e 具有相似性，其残基环扭转角+ 5 4 6 0 ，与a c c 6 更易于呈椅式构象一致，游离氨基酸h a c c 6 o h 羧基基团处于轴向位置，而 h - a c e 6 - o h h c l 氨基基团处于轴向位置，含有a c c 6 的肽链中氨基也处于轴向的 位置( p a u l p k c ，e t a l 1 9 8 6 ) 。 研究表明，当侧链中有体积较大的a c e n ( 砭5 ) 基团时，更易于与受体的疏水 性口袋结合，还可以稳定肽链的折叠构象，螺旋结构和肽链的延展。 1 1 2 环状氨基酸的合成 环丙烷体系氨基酸( a c e 3 ) 可以通过很多种方法合成( 图1 1 ) ：a 、甘氨酸、丙 二酸二乙酯或其类似物与l ，2 一二溴乙烷反应( r a j e n d r aks ，e ta 1 1 9 7 5 ；l i nss ，e t a 1 2 0 0 3 ；d o u g l a ske l a 1 9 8 5 ) ；b 、争取代丙烯酸及其衍生物与重氮甲烷的环加 成反应( h i y a m a i , e ta 1 1 9 8 2 ) ic 、酶、金属催化剂( k a l i l l ee e t 以1 9 9 5 ) 、微波 第5 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 c v i n 嘲, z os ，e ta 1 2 0 0 1 ) 或酸碱作用下引起的蛋氨酸( d a n i e lh t e ta 1 1 9 7 8 ) 、谷 氨酸( p e t e rs ，e ta 1 1 9 8 7 ) 、丝氨酸( p a t r i c i ama ，e ta 1 1 9 9 3 ) 或其衍生物 ( l o g u s c hew 1 9 8 6 ) 的环化；d 、伽亚胺环丙烷衍生物氰化水解( f a d e l a 1 9 9 1 ) 。 图1 1a c c 3 合成路线 f i g1 1 r o u t eo f a c c 3s y n t h e s i s a c c 5 和a c c 6 可以由相应的环酮与k c n ，铵盐通过s t r e e k e r 反应得到含有氰 基的环状化合物，再通过氰基的酸性或碱性水解就可得到相应得环状氨基酸 ( m u n d a y il 1 9 6 1 ) ) 也可以通过b u c h e r e r - b e r g s 方法合成( 图1 2 ) 。 竺! l 竺， k c n o h - - l b - 谭h + u n - j , 2 图1 2b u c h e r e r - b e r g s 合成路线 f i g1 2 r o u t eo f b u c h e r e r - b e r g ss y n t h e s i s s t r e e k e r 反应与b u c h e r e r - b e r g s 方法都是在碱的作用下环酮与k c n 的反应，但通 过s t r e e k e r 反应可以生成顺式( d s - ) 型产物。而b u c h e r e r - b e r g s 方法可以生成反 式( t r a m - ) 的产物。 1 1 3 环状氨基酸的生物学应用 第6 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 1 植物生长激素调节剂 a c c 3 广泛存在于植物体的果实中，是一种新型植物生长调节剂( s k o o gf ，e ta 1 1 9 8 0 ) ，可以在酶的作用下转化为乙烯，对水果、蔬菜、番茄等有明显的催熟作 用，在农业上有重大的经济意义。抑制a c c 3 生物合成的试剂也可以做防腐剂， 如具有乙烯调节器功能的s t r o b i l u r i n e 怒杀菌剂能够抑制s - a d c n o s y l - l - m c t h i o n i n e 向a c c 3 的转化、阻碍a c c 3 向乙烯的转化或抑制乙烯参加的反应，从而减少对植 物体的损伤( h a r d e nj ，e la lw 0 2 0 0 5 0 4 4 0 0 2 ) 。 2 抗炎活性 三肽f o r m y l m e t - l e u p h e , - o h 可以引起中性粒细胞的趋药性和溶酶体的释 放，使肽链与受体在中性粒细胞表面结合而具有抗炎活性，以a c c 6 取代的 f o n n y l m e t a c c 6 p h e - o h 有更强的生物活性。该类似物活性比母体肽强7 8 倍， n m r 和建模研究表明该类似物在溶液中m c = t - a c c 6 更倾向于形成伊转角，而更易 被中性粒细胞受体识别( s u k u m a rm ，e ta 1 1 9 8 5 ) 。 3 抗利尿活性 a g o n i s t so f a r g i n i n ev a s o p r e s s i n ( 精氨酸抗利尿激素激动剂，简称a v p ) 2 位或3 位被a c c 6 取代可以收缩血管，促进血压升高，产生好的抗利尿活性。引入构型限 制型氨基酸a c c 能够减少肽链的灵活性，限制构象的自由度，迫使肽链骨架和残 基适应特定的位置( w i o l e t ak e ta 1 2 0 0 4 ；j a s t r z e b s k ab ，e ta 1 2 0 0 2 ) ，还能抗蛋白 酶水解。 4 抗肿瘤活性 a c c 5 很早报道具有抑制肿瘤生长的活性( p a t r i e et e ta 1 1 9 6 2 ) 。抑癌基因 p 5 3 是一个多功能蛋白，它可以通过抑制细胞生长或引起细胞凋亡，造成d n a 损害或压力应激来调节细胞增殖。h d m 2 ( h u m a nd o u b l em i n u t e2 ) 可以调节p 5 3 的蛋白表达，肽链a c - p h e - m a - a s p - t y r t r p g i u - g i y - l e u - n h 2 在h d m 2 - 结合位点 与h d m 2 结合力较弱，将7 位的甘氨酸替换为a c e 5 时，更易于h d m 2 受体疏水性 口袋结合而加强与h d m 2 受体的结合力，其结合力可以达到母体肽的1 7 0 0 倍 ( c a r l o sge ，e ta 1 2 0 0 0 ) 。 l y s - a l a - a l a - l y s a l a - a l a - l y s a l a - m a - l y s - l y s - a l a - a i a - n h 2 是一个具有抗 菌活性的十四肽以a c 矿代替肽链中的a l a ，可将肽链缩至 第7 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 l y s - l y s - a c e 6 - a c c 6 一l y s c h c h l y s - l y s - c h - n h 2 的十肽，其抗菌活性可达到母体肽 的8 1 0 倍( y o k mts ，e ta l1 9 9 6 ) 。环状氨基酸还可用于杀菌剂( a c k e r m a n n d 只 e ta le p 0 4 3 9 4 2 6 ) 、甜味剂f r s a n gjw “a 1 1 9 8 4 ) 。 1 2l h r h 类似物的研究进展 1 2 1l h r i t 的发现 1 9 7 1 年，s c h a l l y 等从5 0 万头猪、羊下丘脑中分离出几毫克的促性腺激素释放 激素( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e , g n g n ) ，又称促黄体生成激素释放激素 ( 1 u t 6 n i z i n gh o r m o n e - r e l e a s i n gh o r m o n e , l h r h ) ，并已人工合成确证了l h r h 的结 构：p g l y - g l u - h i s t r p - s e r - t y r - g l y - l e u - a r g - p r o - g l y - n h 2 。( s c h a l l y av e t a l1 9 7 1 ； m a t s u oh ，e ia 1 1 9 7 1 ) l h r h 调控着垂体内促黄体生成激秦( l h ) 和促卵泡激素 f i s h ) 的分泌。这些促性腺激素反过来作用于生殖器官，调控着性腺类固醇的产 生，雌性动物卵巢的卵细胞成熟排卵或雄性动物的精巢发育及精子形成( f i l i c o r i m ，e ta 1 9 8 8 ；f r i e d m a naj ，“a l1 9 9 0 ) 。l h r i - i 异相作用的原因可能是大剂量 l h r h 的持续作用使垂体c m r h 受体失去敏感性，导致垂体反应性降低，产生抑 制作用。这种对性腺激素的有效抑制使l h r h 拮抗剂成为内分泌疾病的有效疗 法，如前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位、子宫平滑肌瘤0 6 r g b 2 0 0 6 ) 和性早 熟( s 6 d e f h a na ，甜a 1 2 0 0 5 ) 。 a g o n i m 123 峭_ 糖邯 e9 栅p r o i 1 0 a 嗍 ttt( t ) t( t )t a - 也峥蜘 图1 3l h r m 激动剂和拮抗剂的氨基酸取代位点 f i g1 3 t h es u b s t i t u t ma m i n oa c i ds i t e si nl h r h a g o n i s t sa n da n t a g o n i s t s 基于l h r h 的生物学功能，为了开发相关药物，近年来，人们已合成出5 0 0 0 多种l h r h 类似物，其中少部分为激动剂( a g o n i s t s ) ，大部分为拮抗剂 ( a n t a g o n i s t s ) 。高活性的l h r h 激动剂，用于治疗癌症及用作避孕药。 1 2 2l h r t i 及激动剂类似物 l h r h 在哺乳动物中含量极低，半衰期很短，仅有2 - s m i n ，在体内很快被免 第8 页 ，m l 。研5 啊 孵 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 疫蛋白酶水解( f l u k e rm1 l2 0 0 0 ) ，但其作用异常重要。自被发现以来，l h r h 就被认为是控制生物体生殖功能的关键激素。它由下丘脑以脉冲形式分泌，通过 垂体门脉系统释放，到达垂体前叶，特异地与垂体促性腺细胞上的高亲和力受体 ( g n r h 受体) 结合，刺激垂体黄体生成素( l h ) 、卵泡刺激素( f s h ) 的合成和分 泌。生理剂量的u i i m 引起血浆u i 的明显升高和f s h 轻度升高，促使雌性动物卵 巢的卵细胞成熟排卵或雄性动物的精巢发育及精子形成( n a o rz 。e ta 1 1 9 9 5 ； e v a n s jj e t u lz 9 9 9 ) 。 l h r h 及其激动剂都可因给药方式和用药剂量的不同而引起性腺轴的正反 双向反应。生理脉冲式注射l h r h 对垂体住腺轴起兴奋刺激作用，表现为升调 节，促进青春期发育，对维持生殖系统的功能具有重要作用。但大量的动物实验 及临床观察发现，当给予外源性大剂量的l h r h 或其激动剂类似物时，对生殖系 统有抑制作用( f l u k e rmr e ta 1 2 0 0 0 ) 。 l h r h 结构阐明后，人们开始寻找活性更高的l h r h 类似物，并在短期内 取得突破性进展，激动剂的活性大大提高( f u n k k w ，e t a l 9 9 8 ) 。目前，世晃 上l h r h 激动剂的产值已达每年十几亿美元。 c * 啦n a m8 n datamlbhjdm心r i - g w o n e 帅“啊嘶晰t a pp h a t a t 州p r o d u c t s | w a a k _ n o t z 岫 v r o t a m h o _ ，柚 l r o q ed e p o t i n n i t d m 咄 t t t e e l j u a o a n d 日一 s i g m a 身- 一 细z m p t a n m t _ c e a k ( m h m md e ) b 柑帅a v z a h m 口h “悯 m 蝴( w e s th 醐c n n m 柚6u 帅i 群- m “_ 哪 a t r i al 曲w m w 瞄i f 叭o 蚺c o l 铀呻 钾t 曲d 曲。璃i 小- _ p ， a r m , s h q 晡p _ n a - n n l 啊n _ kp h m n a t , m 雌k k 蛳岫 、嚣：篇= 2 ：薹：等一 表1 1已上市的用于治疗前列腺癌的l h r h 激动剂药物 1 h b l e1 1l h r h a g o n i s td r u g st r e a t i n gp r o s t a t i cc a r c i n o m ao l ls a l e 虽然u i r h 激动剂有很好的临床应用，但鉴于其对垂体开始刺激、继之抑制， 在治疗过程中呈现首先短暂过度刺激，所谓“上冲效应”( l i m o n t a p ，e l a l 2 0 0 3 ； k o ls ，e ta 1 2 0 0 0 ) ，其结果是性激素暂时升高，一般持续1 0 - 2 0 天，l h 水平升高l o 倍，f s h 水平升高5 倍( d o r o t h e aw ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。此上冲很可能短期内使前列腺 癌( d o r o t h e aw ，e ta 1 2 0 0 4 ；w i l l i a m sg ，e ta 1 1 9 8 5 ) 等病症加重，脐带压迫，疼痛， 第9 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 排尿困难等，骨密度流失等副反应( a g a r w a lsl ( ，e t a 2 0 0 2 ) 。可与抗雄性激素药 物配伍( d o r o t h e a w ，e t a 2 0 0 4 ) ，可减轻副作用，无疑又增加了治疗费用，此外， l h r h 激动剂药物还存在注射给药次数多、显效缓慢的缺点。 1 2 3l h r i t 拮抗剂类似物 l h r h 拮抗剂的研究几乎与激动剂的研究同时起步，但经历了复杂得多的过 程后才得到超高活性的拮抗剂。l h r h 拮抗剂的作用机制与激动剂不同，它竞争 性地与垂体上的o a r h 受体结合，但不引起l h 分泌释放而导致垂体对l h r h 发生阻断，进而控制促性腺激素的分泌( 图1 4 ) 。与激动剂相比，l h r h 拮抗剂 不会产生上冲效应，因此可以消除l h r h 激动剂的副作用；此外，它还具有显 效快、停药后恢复快、对血清雄性激素水平可控性强等优点。可以预料，l h r h 拮抗剂开发为前列腺癌药物，更易被患者接受，比激动剂具有更大的应用前景。 a 嘲_ 删t 结纠佃r b i k - 哐 q 矧q 制 曰# b i r t t f l n s l e _ 洲， u i h 图1 4l h r h 拮抗剂的作用机制 f i g1 4 m e c h a n i s mo f u l r h 锄t a 9 0 n i s t sa c t i o n 1 线型肽 自1 9 7 2 年以来，入们通过结构改造合成了几百上千的线型l h r h 拮抗剂类似 物并进行动物试验0 ) u t t aan ，e t 口f 1 9 8 8 ；k a r t c nm j ，e ta 1 9 8 6 ；f u j i n om ，e ta 1 9 7 4 ；s c h a l l y a v 1 9 8 9 ，1 9 9 7 ；p l a n ttm 2 0 0 1 ) 。早期的拮抗类似物是通过对h i s 2 和t r p 3 的去除或氨基酸替换得到的( s c h a l l yam e ta 1 9 8 9 ；s c h a u ya 、e ta 1 9 7 6 ；r e i s s m a n n t ，e t a l 1 9 9 5 ) 。随后，人们发现6 位以d 型氨基酸替换可提高拮抗 活性( s c h a l l yav , e ta 1 1 9 7 6 ) 。【d p h e 2 ，d - t r p 3 ，d - p h e 6 l h r h 是最早发现对男女 均有拮抗活性的类似物( s c h a u y a v 1 9 8 9 ；s c h a n y a ve t a l 1 9 7 6 ；c a i l a l 髓e s ，e t a 1 1 9 8 0 ) 。之后一系列改造，取代部位集中在1 、2 、3 、6 、l o 位( 图1 3 ) ，这些部 位与l h r h 生物学活性有关，而与受体结合无关，因此可以与l h r h 竞争受体 第1 0 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 0 a k e s zr 2 0 0 2 ) 。6 位为d - a r g 或其他碱性氨基酸的类似物拮抗活性较好( o u ：t t aa n 1 9 8 8 ；k a f t c nmj 。e ta l1 9 8 6 ；s c h a l l y a v 1 9 8 9 ) ，但随后进行的生物活性研究中 发现，此类拮抗剂引起组胺释放而导致浮肿和其他过敏反应( d u t t aan 1 9 8 8 ； s c h a l l y a v 1 9 8 9 ) 。进一步的优化发现，大多数有效的拮抗剂的结构中n 端3 个氨 基酸残基为疏水基团，6 位和8 位为亲水的碱性氨基酸。这一代拮抗剂依然容易引 起组胺释放( s c h a l l y a v 1 9 9 7 ) 。 由于第一代、第二代类似物都具有组胺释放的缺陷，大大限制了l h r h 拮抗 剂的临床应用。1 9 8 8 年，s c h a l l y ( s c h a l l y a v 1 9 8 9 ；b a j u s zs ，e ta 1 1 9 8 8 ；r c i s s m a n n t ，e t a l 1 9 9 4 ；s c h a i l y a v ，e t a l l 9 9 7 ) 等研$ f j 出c e t r o r e l i x ( s a - 7 5 ，s b 8 8 ) 系列的 拮抗剂，分子中引入d 型侧链含亲水性基团的弱碱性或非碱性氨基酸( d c i t 6 , d - h c i 6 ) ，具有很高的活性，组胺释放较以前减少了许多，标志着第三代拮抗剂的 开始。这类拮抗剂结构上有些共同特征：n 端都含d n a l l - d - c p a 2 d p a l 3 疏水基 团；6 6 7 是亲水的d 型氨基酸( 侧链是含有氨基的芳香性或烷基基团) ；c 端是亲水 性基团。此后，在氨基酸排列顺序和氨基酸侧链修饰等方面进行了系统研究，筛 选得到高活性的拮抗剂。r i v i e r ( r i v i e r j e ，e t a l 1 9 9 5 ) 等将3 氨基一l ，2 争三唑基 修饰的对氨基苯丙氨酸或l y s q 入5 位和6 位，得到a z a l i n e 系列拮抗剂，使拮抗剂 研究向前推进一步。 目前许多实验室在高活性的s b 8 8 及s b 7 5 ( c e t r o r e l i x ) 系列拮抗剂的基础 上，利用d 型非蛋白氨基酸，d 型烷基化氨基酸及侧链含活泼基团的氨基酸对分 子中5 、6 、8 位进行结构改造，以提高水溶性和体内试验的稳定性( s e m p l eg ，e ta l 1 9 9 8 ) 。拮抗剂经强极性亲水性基团( 牛磺酸、古洛糖酸、高瓜氨酸、高精氨酸、 维生素b 1 2 ) 修饰后可提高水溶性( j i a n gg ce ta 1 9 9 7 ) 。如j i 柚g 等将些极性基 团( 脲基等) 修饰的苯丙氨酸引入到5 、6 位，得到d e g r e l i x 系列拮抗剂，进一步 延长了体内作用周期，减少了组胺释放量( j i a n ggc ，e t a l2 0 0 1 ) 。表1 2 列出了 最有代表性的第三代l h r h 拮抗剂。 表1 2 第三代l h r f i 拮抗剂 t a b l e l 2 t h e t h i r d g e n e r a t i o n o f l h r ha n t a g o n i s t s c e t r o r e l i x a c ，d - n a l l d c p a 2 - d - p a l 3 - s e r 4 t y r 5 d - c i t 6 l 7 a i f 9 8 - p r 0 9 d - a i a ”- n h 2 a b a r e t i x 。 n ( m e ) t y r sd - a s p 6 第1 1 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 六肽及八肽类似物用于l h r h 拮抗剂也有报道，其结构与l h r h 的和9 位结构 相似，n 端用不同的酰基修饰。到目前为止，世界上几千种l h r h 拮抗剂中绝大 多数是线型十肽，其结构设计是在l h r h 的基础上进行有目的的氨基酸替换，修 饰或大量引入非蛋白氨基酸，活性明显提高，水溶性也在增大，组胺释放量已减 少到很低水平。 2 环肽类 环肽类化合物抗酶降解的能力比线型肽要强，且活性持续时间较长。另外环 肽化合物分予构象相对比较稳定，有利于构效关系的研究。人们在线性肽研究的 基础上，又进行了大量环肽及非肽类研究。目前，具有应用前景的环肽类拮抗剂 报道的还不多，处于研究之中的环肽有d 2 3 5 6 1 ( t w i e e r e l i x ) ，d 2 3 9 3 8 ( s e m i t w i - e e r e l i x ) ，d 2 3 6 2 0 ( c y c l o r e l i x ) ，d - 5 2 3 9 1 等，其中只有d 5 2 3 9 1 或性较好( k u t s c h e r b ，e t a l 1 9 9 7 ；b e c k e r s t ，e t a l 2 0 0 1 ) 。口服有效的非肽类l h r f i 拮抗剂是近年发展 起来的一类新型实验性药物制剂。 3 肽的模拟物拮抗剂 p l a t t n e r 等( d eb ，e ta 1 1 9 8 9 ) 偶然发现抗病菌素酮康唑( k e t o c o n a z o l c ) 注入 体内后，可使血液中的睾丸甾酮含量降低，并使前列腺癌细胞消失。进一步的体 内、体外生物活性试验表明酮康唑及其类似物在1 0 - 6 眦n o l l 浓度时能抑制促性腺 激素分泌，这是第一个非肽类化合物的l h r h 拮抗剂。其他含氮杂环化合物如苯 并二氮杂茂、噻吩羧酸衍生物、异喹啉衍生物及吲哚衍生物( c h ul ，e ta l1 9 9 9 ； c h o n ，e ta 1 1 9 9 8 ；h a v i vf ，e ta 1 1 9 9 9 ) 等，也可用作拮抗剂。 1 2 al h r h 结构特点 构效关系研究结果表明，高活性的十肽拮抗剂中均有伊t u m 存在( 5 - , 8 位或 第1 2 页 贵州大学2 0 0 7 年硕士学位论文 3 “位) 。n i k i f o d c h 等系统研究了l h r h 类似物的构象，l h r h 及各种激动剂肽链 骨架构象很相似，扣8 位( t y r - g l y - l c u - a r g ) 存在一个i i 型伊转角，被认为是与受 体结合的优势构象。从某种意义上说，引入环状结构因素对于更好地与受体结合 有着重要的意义。受体的配位结合口袋的亲和力是由疏水性基团控制的( a r v i ds e t a l 2 0 0 5 ) 。 d - a l a 6 一l i i m 激动剂的活性高于l h r h ，原因之一是6 位的d 型氨基 酸有利于i i 型伊转角的形成。 图1 5 【d t r p 6 g n r h 与受体结合示意图 f i g1 5d i a g r a mo f d t r p 6 c m r hb i n d i n gw i t l lt h er e c e p t o r 图1 6 【d t r p 6 g n r h 与受体结合简易图表示 f i g1 6s a m p l e