（无机化学专业论文）过氧化氢酶的电化学研究.pdf

摘要 过氧化氢酶广泛存在于动物、植物和微生物中，是生物体内一种重 要物质，具有非常重要的生理功能，其中最主要的是参与活性氧代 身 过 程。通常生物体在环境胁迫等逆境情况下，广泛存在活性氧爆发现象， 会导致自由基增多，使细胞膜产生过氧化，导致细胞膜的破坏和损伤， 而过氧化氢酶在清除超氧自由基、h ：o ：和过氧化物以及在阻止或减少羟 基自由基形成等方面发挥重要作用。另外，过氧化氢酶在现实生活、生 产实践中也应用广泛。纺织业、食品业、造纸业、环保业以及在电路板 的制作上都有应用。在对过氧化氢酶的众多研究中，涉及到过氧化氢酶 的提取、纯化、表征、活性研究等等很多，但是对过氧化氢酶的电化学 研究却很少，实际上采用电化学方法并结合其它生物、化学技术研究生 物体系的电子传递以及相关过程对揭示生命本质有着重要的意义，尤其 近几年来，修饰电极的理论研究和发展较快，为更好的进行电化学研究 创造了有利条件。 因此在此基础上，我们选用了生物体自身就存在的d n a 膜修饰热解 石墨电极( p g ) 来研究过氧化氢酶相关的一系列电化学性质，研究过程 中发现，过氧化氢酶在d n a 修饰的p g 电极上有较好的电化学响应，其 式电位为：一0 2 0 9 v ；随后测定了紫外一可见光谱，证明在d n a 膜中， 过氧化氢酶保持了其原有结构不变；电子传递速率测得为对于 c a t d s d n a p g 电极，还原和氧化电子传递速率常数分别为：k s ，r e d = 1 3 5 s “和k s ，o x = 1 3 - 3s 。而对于c a t s j d n a p g 电极则分别为：k s ，r e d = 2 1 0 s 。和k s ，o x = 3 3 0s ；稳定性实验显示过氧化氢酶的电信号随时间和扫描 次数在减小；随p h 的变化证明为一电子的传递伴随有一质子的耦合； 对h 2 0 z 的催化实验说明膜中的过氧化氢酶保持了对h 2 0 ：的催化活性。 此外，由于单螺旋、双螺旋的d n a 的结构不同，我们设想在其上的电化 学性质会不同，因此比较了在单螺旋、双螺旋的d n a 膜中过氧化氢酶的 电化学性质，结果显示在单螺旋的d n a 膜中电子传递较快。此后，由于 在打磨成粗糙面的p g 电极上，过氧化氢酶表现出很好的电化学性质， 且在溶液中稳定性很好，而这是其它的含血红素蛋白所没有表现出来的 现象，因此，将过氧化氢酶与血红蛋白在打摩成镜面的p g 电极( m e p g ) 、 打磨成粗糙面的p g 电极( c e p g ) 、新揭取的b a s a l - p l a n e 面的p g 电极 ( b p e ) 上的电化学性质作了研究，结果显示，在多次重复实验后，过 氧化氢酶在c e p g 电极上始终有好的信号，在另外两种不同取向的电极 上则几乎没有响应，血红蛋白则在m e p g 上有好的信号，其它实验均未 出现好的循环伏安峰。进一步地，我们研究了在c e p g 电极上的电子传 递、随p h 变化、随扫描速度的变化以及催化性质，结果在c e p g 电极上 电子传递速率为：k 。= 2 0 2 2 9s ；也是一电子伴随有一质子耦合且保持 了催化活性。 关键词：过氧化氢酶；直接电化学；d n a ；电催化 a b s t r a c t c a t a l a s ec o n s i s ta b r o a di n k i n do fi m p o r t a n te n z y m e ，h a v e a n i m a l s ，p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m s ，a n di sa i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s t h em a j o r f u n c t i o ni st h a tt h e yt a k ep a r ti nt h em e t a b o l i cp r o c e s so fa c t i v eo x y g e n u s u a l l y , o r g a n i s mw i l lo c c u ra c t i v eo x y g e nb u r s t i n go u tp h e n o m e n o nw i t h t h ei n t i m i d a t i o no fs u r r o u n d i n g s i tr e s u l t si nt h ei n c r e a s i n go ff r e er a d i c a l ， o x i d a t i o no fc e l lm e m b r a n e ，s oa st od e s t r o yt h e m t h e r e b y , c a t a l a s eh a v e i m p o r t a n t e f f e c to ne l i m i n a t i n gt h e s u p e r o x i d ef r e e r a d i c a l ，h 2 0 2 a n d p e r o x i d ea n df u r t h e rp r e v e n t i n gt h ef o r m a t i o no ff r e er a d i c a l ，i na d d i t i o n ， c a t a l a s e sa p p l i c a t i o n sa r ea b r o a di nr e a ll i f ea n dp r o d u c t i v ep r a c t i c e ，s u c ha s t e x t i l ei n d u s t r y , g r o c e r yi n d u s t r y , p a p e rm a k i n gi n d u s t r ya n de n v i r o n m e n t p r o t e c t i o ni n d u s t r ya n de v e ni nc i r c u i tb a nt h e ya r ea l s oa p p l i e d a m o n gt h e s o m a n yr e s e a r c h e s ，i n c l u d i n gs y n t h e s i s ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ， a c t i v i t ye x p l o r a t i o n a n ds o o n ，t h e r e a r es e l d o me l e c t r o c h e m i c a l i n v e s t i g a t i o n sa p p l i e di nc a t a l a s e a c t u a l l y , p e o p l ea d o p t e de l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d sc o m b i n i n gt h eo t h e rb i o l o g i c a la n dc h e m i c a lt e c h n o l o g yh a dt h e i m p o r t a n tm e a n i n go nd i s c o v e r i n gt h ee s s e n c eo fl i f et h r o u g hi n v e s t i g a t i o n s o fo r g a n i s me l e c t r o n t r a n s f e ra n dr e l a t e dp r o c e s s e s p e c i a l l yi nr e c e n ty e a r s ， t h er e s e a r c h e so fm o d i f i e de l e c t r o d e st h e o r yd e v e l o p e dq u i c k l y , t h e ys u p p l y t h em o r ea v a i l a b l ec o n d i t i o n sf o re l e c t r o c h e m i c a lr e s e a r c h e s u n d e rt h i sg r o u n d w o r k ，w ec h o s et h ed n af i l me x i s t i n gn a t u r a l l yt o m o d i f yp y r o l y t i c g r a p h i t ee l e c t r o d e s ( p g ) t o r e s e a r c has e r i e so f e l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r so nc a t a l a s e i nt h ec o u r s eo fi n v e s t i g a t i o n ，w e d i s c o v e r e dt h a tc a t a l a s es h o w e dap a i ro fw e l l d e f i n e dc y c l i cv o l t a m m e t r y p e a k so nd n a m o d i f i e dp ge l e c t r o d e s t h ef o r m a lp o t e n t i a l ( ( e 。) f o rc a t a l a s e w a s - 0 2 0 9 v i 、l v i sa b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p yd e m o n s t r a t e dt h a tc a t a l a s e r e t a i n e da n e a rn a t i v ec o n f o r m a t i o ni nd n af i l m s a tad s d n a p ge l e c t r o d e ， r e d u c t i o na n do x i d a t i o ne l e c t r o n t r a n s f e rr a t ec o n s t a n tv a l u e so fk s ，r e d = 1 3 5 s a n dk s ，o x _ 13 3s w e r eo b t a i n e d a tas s d n a p ge l e c t r o d e ，t h ev a l u e s w e r ek s r e d221 0s a n dk s ，o x23 3 0s ，r e s p e c t i v e l y t h ef o r m a lp o t e n t i a lo f f e ( i i i ) f e ( i i ) c o u p l e si nc a t d s d n af i l m sh a dal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t h i nt h e p hr a n g eo f 3 8 1 7 7 2w i t has l o p eo f - 5 8m vp e ru n i to f p h s u g g e s t i n gt h a t o n ep r o t o ni sc o u p l e dw i t hs i n g l e e l e c t r o nt r a n s f e rf o re a c hh e m eg r o u po f c a t a l a s ei nt h ee l e c t r o d er e a c t i o n t h ee m b e d d e dc a t a l a s ei nd n af i l m s s h o w e dt h ee l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt o w a r dh y d r o g e np e r o x i d e s i n c et h ec o r n f o r m a t i o nb e t w e e nt h es i n g l ed n a ( s s d n a ) a n dd o u b l e d n a ( d s d n a ) a r ed i f f e r e n t ，w eg u e s s e dt ob es h o w e dd i f f e r e n tq u a l i t i e sa t t h e s et w od i f f e r e n te l e c t r o d e s ow ed i ds o m ec o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ti t ss l i g h tf a s t e ra ts s d n am o d i f i e dp gt h a na td s d n a m o d i f i e dp g t h e r e a f t e r w ef o u n di ts h o w e dw e l l d e f i n e d c y c l i c v o l t a m m e t r yp e a k sa tb a r ec o a r s ee d g e p l a n ep ge l e c t r o d e ，w h a t sm o r e ，t h e s t a b i l i t yo fc a t a l a s ei n s o l u t i o na l s oi s g o o do ni t h o w e v e r ，o t h e rh e i n e p r o t e i nd i d n te v e rs h o wt h i sp h e n o m e n o n ，s ow ef u r t h e ri n v e s t i g a t e dt h e c a t a l a s e sv o l t a m m e t r i c a lc h a r a c t e r sa tm e p g ( p o l i s h e di n t om i r r o rs u r f a c e e l e c t r o d e ) ，c e p g ( p o l i s h e di n t oc o a r s es u r f a c ee l e c t r o d e 姻p g ( f r e s h l ys p l i t b a s a l p l a n ep g ) a f t e rm a n yr e p e a t e de x p e r i m e n t s ，t h r e s u l t ss h o w e dt h a t c a t a l a s es h o w e dw e l l d e f i n e de l e c t r o c h e m i c a ls i g n a la t c e p g ，b u tal i t t l e r e s p o n s e sa tt h eo t h e rt w o t h er e p e a t e da c t i v i t yi sp o o ra tm e p g s oi no d e r t oo b t a i nt h em o r ei n f o r m a t i o na b o u tc a t a l a s ea tc e p g w ei n v e s t i g a t e da s e r i e so fe l e c t r o c h e m i c a lq u a l i t i e sa tc e p g t h ee l e c t r o n t r a n s f e rr a t ec o n s t a n t i sk s 22 0 2 2 9 s ；a n da l s oo n ep r o t o ni sc o u p l e dw i t hs i n g l e - e l e c t r o n t r a n s f e r k e y w o r d s ：c a t a l a s e ；d n a ；d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r y ；e l e c t r o c a t a l y s i s 第一章前言 第一章前言 1 1 背景研究 生命现象的许多过程皆伴随着电子传递反应，应用电化学方法研究生物体系的 电子传递及相关过程是揭示生命本质的较好的途径。近年来，采用电化学方法并结合 其他现代生物、化学技术在很多领域取得突破性进展，其中，研究氧化还原蛋白质与 电极之问的电子传递过程具有十分重要的意义，不仅为理解代谢过程提供有价值的 信息，而且为制备生物传感器奠定了牢固的基础。 1 9 7 7 年，hi l l 1 和k u w a n a 2 1 分别发现马心细胞色素c ( c y tc ) 与金电极和掺锡氧 化铟电极之间有直接可逆的电化学反应。1 9 7 9 年，酶与电极的直接电子传递也见报 道 ”。这些开创性的工作为用电化学手段探索生物体系的奥秘打开了大门 4 _ 1 。有 关过氧化氢酶的研究有很多，其中有关过氧化氢酶的提取、纯化、表征和活性研究 已有很多的报道，而有关过氧化氢酶的电化学性质的报道却不多，1 9 7 4 年将过氧化 氢酶吸附固定于用脂肪酸或磷脂修饰的硅胶中获得了高活性的吸附过氧化氢酶【1 1 1 。 过氧化氢酶又常常被用来作为检测过氧化氢、葡萄糖的一种酶膜而研究，在工业上， 过氧化氢酶用于当过氧化氢作为氧化剂、漂白剂、消毒剂使用后的去除。由于过氧 化氢酶分子量大，结构复杂，其氧化还原中心深埋于分子内部，又或是过氧化氢酶 在通常的电极上的吸附使电极钝化，使很难实现其与电极之间的电子传递，因此在 生物催化和电化学系统中过氧化氢酶主要以固定态使用，即将过氧化氢酶修饰在电 极表面来研究直接的电化学和电催化性质。这就使我们更多的关注于电极的修饰， 关注于修饰电极上被加强了的直接的电化学反应。 1 2 化学修饰电极 化学修饰电极( c m e ) 是当前电化学、电分析化学方面十分活跃的研究领域。 1 9 7 5 年化学修饰电极的问世突破了传统电化学中只限于研究裸电极电解液界面的范 围。开创了从化学状态上人为控制电极表面结构的领域。通过对电极表面的分子剪 裁，可按意图给电极预定的功能，以便在其上有选择地进行所期望地反应，在分子 水平上实现了电极功能的设计。初期采用共价键合法和化学吸附法制备的修饰电极 属单层体系，虽然达到了对电极表面进行人工修饰的目的，但前者的制各手续繁琐， 后者又有不易控制电极表面修饰的缺点，而且无论用哪一种方法都得不到高于单层 的表面覆盖量( s 5 1 0 叫o t o o l e r a 2 ) ，因此响应信号小，修饰物与电极表面接着不牢 过氧化氢酶的电化学研究 固，存在性能不够稳定的问题。8 0 年代以来，发展最快的是聚合物薄膜法，这样制 备的修饰电极属于多层体系，已有大量工作发表。聚合物薄膜中含有大量的电活性 中心，其表面覆盖量可达5 1 0 “o - - 5 1 0 - 6 m o l c m 2 后来无机物薄膜电极也相继出现。 与单层修饰电极相比，其响应信号大、易观测，而且制备方法简单，有效性及通用 性强。 1 2 1 修饰单层最初用化学强吸附和共价键合法在电极表面形成单层结构，用 欠电位沉积法可形成原子级单层，后来发展到用l b 膜法和用自组膜法可在电极表面 获得高度有序排列的单分子修饰层。后者的优点是能使修饰层的结构得到精细控制。 1 2 2 修饰均相复层它属于单一结构的多层体系。这种修饰层的内部均匀，没 有晶粒界面存在，重要的典型代表是含氧化还原体的聚合物薄膜，修饰膜的厚度从 几十纳米到几个微米。由于它们通常是被溶剂化的，其厚度和内部性质可被外部的 电解质所调制。氧化还原体可借配合作用、离子交换反应或者由含氧化还原体的单 体聚合而成。这种均相复层膜可防止外界物质的进入，对电极表面提供完全的保护。 更重要的是，在这种修饰膜内部的传输性质是很均匀的，因此这种修饰膜本身很适 于进行基础理论的研究。 1 2 3 修饰有粒界的厚层实际上许多修饰层是不均匀的而且具特有的内部结构， 例如氧化物膜。以粒界为特征的这种修饰膜可将单个的晶体分离开来，或者存在小 孔洞，外部的电解质可以渗入其中。例如已知并得到广泛研究的n a 士q o n 膜，它本身就 含有亲水畴和憎水畴的内部结构。混合的聚合物膜可能会隔成不同性质的畴。具粒 界的厚层中有时甚至含有明显的外界粒子，例如在聚合物膜或某种氧化物膜层中沉 积上p t 微粒。这里所说的粒界是指区分层与层间在传输性质上具有内部空间的不连续 性。凡是有粒界的修饰层体系在本质上是很复杂的，这种修饰层体系虽然不适于做 定量的理论研究，却具有合成方法上的灵活性，而且提供了广泛结合具有不同化学 性质的物质到单一结构上的能力，很有实用前途。 1 3 蛋白质修饰电极的发展 蛋白质在电极表面具有良好的取向是实现蛋白质电极之间直接快速电子传递 的前提。因此采用适当的方法在电极表面固定蛋白质，是目前蛋白质电化学研究的热 点。 1 3 1 蛋白质膜修饰电极 由a r m s t r o n g 等创立的蛋白质膜伏安法( p f v ) 具有许多优点：( 1 ) 蛋白质膜电极 第一章前言 的制各简单，需用蛋白质的量较小；( 2 ) 克服了溶液体系中蛋白质的扩散系数较小的 限制；( 3 ) 能使用快速扫描伏安法研究电子传递过程；( 4 ) 通过电化学数据分析可获 得丰富的生物化学信息。蛋白质膜修饰电极的制备：经过抛光的棱面裂解石墨电极 ( e p g ) 表面产生较多的亲水含氧基团。在低温( 0 0 c ) 、低离子强度和共吸附剂( 如氨 基环多醇) 的存在下，通过静电吸附作用，在电极表面形成一层蛋白质膜。共吸附剂 在荷电的蛋白质和电极之间起着促进电子传递的作用。 蛋白质中的铁一硫簇是电子传递中心，但铁一硫簇缺乏特征光谱，难以实时监测氧 化还原过程中铁硫簇组成和结构的变化。p f v 所得的循环伏安曲线犹如蛋白质中铁 - 硫簇氧化还原电势的指纹图，清晰地给出蛋白质中不同铁硫簇的氧化还原电势。 p f v 也被成功地应用到酶的研究。细胞色素c 氧化酶在低温低离子强度条件下， 吸附在e p g 电极表面，无h 2 0 2 时，得血红素f e ( i i i ) fe ( i i ) 电对可逆的氧化还原峰。当 ) j 1 1 x h 2 0 2 后，则得催化氧化h 2 0 2 的电流峰【1 2 1 。研究多活性中心酶分子内的电子传递 过程，p f v 也显示出优势【13 , ”l 。马富酸还原酶的循环伏安图反映出3 种铁一硫簇和黄 素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 的两对可逆氧化还原峰，当加入马富酸时，可得两个催化 电流峰。从峰的电势、相对大小和形状可以推断酶分子内的两种电子传递途径：电极 一2 f e 3 f e f a d 和电极一4 f e f a d 1 1 31 j 如果能进一步提高蛋白质膜的稳定性和重 现性，蛋白质膜伏安法无论在理论研究还是生物传感器的研制方面都将具有重要价 值。 1 3 2 蛋白质溶胶凝胶修饰电极 蛋白质包埋在溶胶凝胶中，一方面与硅酸酯形成氢健，使之构象不易变化：另 一方面，与硅酸酯中的甲基等疏水基团存在相互作用，既能保持蛋白质的活性，又可 防止蛋白质从凝胶膜内泄漏，而一些小分子、离子则可以自由进出溶胶凝胶的孔隙。 特别是些掺杂和衍生的溶胶凝胶，克服了生物分子在溶胶凝胶形成过程中，因温 度、酸度及有机溶剂等不利条件而降低酶活性的问题【m 。16 1 。 将葡萄糖氧化酶( g o d ) 和辣根过氧化物酶( h r p ) 同时包埋在溶胶凝胶中，构 成无媒介体的双酶传感器【1 7 】，特别是丝网印刷技术的使用 1 8 】，为研究以溶胶凝胶 为基质的氧化还原蛋白质的电化学特性和制备生物传感器提供了新的思路和途径。 目前存在的问题是制备凝胶过程中有些保持蛋白质构象和活性所需的条件苛刻。 1 3 3 蛋白质表面活性剂膜修饰电极 生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特征决定了它们在生物 膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质相结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性 过氧化氢酶的电化学研究 结构，它们在电极表面能形成稳定的膜【1 9 1 ，并能促进氧化还原蛋白质与电极之间的 电子传递【20 1 。制各蛋白质一表面活性剂修饰电极有两种方法：( 1 ) 在电极表面蘸涂含 表面活性剂的氯仿溶液，氯仿挥发后，形成表面活性剂膜电极，该电极可从溶液中吸 附蛋白质；f 2 ) 将蛋白质与表面活性剂的微囊分散混合，取混合液蘸涂至电极表面，空 气干燥。基体电极以棱面裂解石墨、金、铂电极为佳，而膜在掺锡氧化铟和银电极上 的稳定性较差。在表面活性剂膜中，蛋白质保持着原始构象不变，与电极之间的电子 传递速度大大加快。肌红蛋白( m b ) 2 1 , 2 2 1 、血红蛋白( h b ) 【2 ”、细胞色素p 4 5 0 ( c y t p 4 5 0 ) 【2 4 1 、辣根过氧化物酶( h r p ) 【”1 、过氧化氢酶2 6 ，”1 、细胞色素c 氧化酶2 8 】等含有血 红索的蛋白质，都可实现了f e ( i i i ) fe ( i i ) 电对与电极之间直接、可逆、快速的电子传 递过程。在表面活性剂膜中，蛋白质表现出较强的催化活性。表面活性剂的结构和所 带净电荷对蛋白质在电极表面的取向有一定影响。 1 3 4 蛋白质一双层类脂膜修饰电极 双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似，能将生物分子嵌入其中同时保持其生 物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂膜的高度有序且 稳定性良好的特点，作为仿生膜，可以模拟氧化还原蛋白质生物代谢过程的特性 【2 。将细胞色素c 氧化酶固定在双层类脂膜中，与金电极之间直接传递电子，且能氧 化溶液中的c y t c 3 0 ，圳，将h r p 固定于盐桥支撑的双层类脂膜中，实现了直接电化学 反应及对h 2 0 2 的催化还原2f 。 1 3 5 蛋白质一d n a 膜修饰电极 d n a 和氧化还原蛋白质同存在于线粒体内，研究氧化还原蛋白质与d n a 的作 用，对理解生物呼吸链能量转换具有极其重要的意义。d n a 在金电极和碳电极表面 能形成稳定的薄膜，可用于基因杂交指示剂的选择f 口d n a 损伤检测3 3 ，3 4 】。r u s l i n g 等采用逐层组装的方法，将d n a 肌红蛋白( m b ) 干 i d n a - - c y t p 4 5 0 定在电极表 面，得到f e ( i i i ) fe ( i i ) 电对的可逆电化学反应，应用于环境污染物的检测与转化 【3 ”。用d n a 固定h r p 于石墨电极表面，加快t h r p 与电极的直接电子传递速度，用 于h 2 0 2 的检测。但使用d n a 膜对过氧化氢酶的研究未见报道。表面活性剂膜、双层 类脂膜和d n a 膜具有独特的类生物结构和生物相容性，为电化学模拟氧化还原蛋 a 质的生物功能创造了条件。 1 3 6 蛋白质一纳米粒子修饰电极 纳米粒子具有比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点，用于固定生物组分 备受关注。h r p 固定于金纳米粒子表面，制得h r p - - a u 胶粒修饰电极，不需媒介体便 第一章前言 能催化还原h 2 0 2 ，【 皂明金微粒与h r p 作用，缩短了酶活性中心与电极表面的距离，实 现了直接电子传递过程【”1 。用自组装膜吸附纳米金粒，再固定h r p 或血红蛋白( h b ) ， 其辅基血红素直接与电极传递电子，且能催化还原h 2 0 2 。h r p 或h b 在电极表面的覆 盖量和催化能力与金粒直径大小有关，直径越小，催化效率越高【3 “”j 。用纳米憎水 a u 颗粒、亲水a u 颗粒、憎水s i 0 2 颗粒以及a u j f u s i 0 2 颗粒混合与聚乙烯醇缩丁醛( p v b ) 构成复合固定酶膜基质，用溶胶凝胶法固定葡萄糖氧化酶( g o d ) 制备纳米增强型葡 萄糖传感器。实验表明，纳米颗粒可以大幅度提高固定化酶的催化活性，认为是通过 a u 颗粒的作用，葡萄糖氧化酶的辅基f a d 与铂电极间直接进行电子传递。将纳米金 自组装至三维硅凝胶中，可实现h r p 的直接电化学反应，构筑第三代电化学生物传感 器【”1 。纳米t i 0 2 膜电极不仅具有生物亲和性和相容性，而且能加快氧化还原蛋白质 的电子传递速度【4 。利用h 岍i 0 2 电极的光电特性，可研究蛋白质光氧化还原现象， 检测水溶液中微量的一氧化碳1 4 1 1 。在磁性纳米粒子表面修饰媒介体，可作为酶与电 极之间电子传递的开关，制备由磁场控制的生物电化学传感器【4 2 1 。碳纳米管( c n t ) 对c y t c 的电子传递也有加速作用【4 “。在玻碳、金和铂等基体电极上，采用不同方式 将c n t 修饰在基体表面上，即可得到相应的修饰电极。修饰电极对0 2 、n o 、多巴胺 等神经递质及代谢产物、细胞色素c 、铜蓝蛋白、胰岛素、h r p 、葡萄糖氧化酶和d n a 等生物分子有良好的电催化效应，极大地改善了它们的伏安响应。特别是使许多生 物大分子的直接电化学得以实现。单( 多) 壁碳纳米管对过氧化氢酶与电极之问的 电子传递有极好的促进作用“5 1 。 随着纳米粒子与蛋白质作用机理研究的深入，各种新型纳米粒子的制备，特别 是量子点的引入及制各微型传感器和芯片实验室技术的发展，可望从分子水平动态 研究生物体系，揭示其内在规律。 1 4 过氧化氢酶研究现状 过氧化氢酶c a t a l a s e ，c a t ，e c l 11 1 6 t 46 j 研究可追溯到1 9 世纪初。t h e n a r d ( 1 8 1 1 年) 首先发现过氧化氢( h 2 0 2 ) 可以被动、植物组织分解产生氧气s c h o n b e i n ( 1 8 6 3 年) 认为是某种酶在起作用。1 9 0 1 年，l o e w ：t 该酶命名为过氧化氢酶( h y d r o g e n p e r o x i d a s e ) ，又称触酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) 4 7 。s t e m ( 1 9 3 6 年) 证明卟啉环是c a t 活性 中心，其后s u m n e r 等( 1 9 3 7 年) 得到了牛肝c a t 结晶，h e r b e r t 和p i n s e m ( 1 9 4 8 年) 则从藤 黄微球菌获得了原核c a t 。随后大量研究发现c a t 广泛存在于动物、植物和微生物 中，动物肝脏、红细胞、植物叶绿体以及细菌、真菌、放线菌等中含有大量c a t 。 迄今c a t 已经成为农业，以及与之相关的食品与乳制品业、纸浆和造纸业、以及农 过氧化氢酶的 b 化学研究 业环保产业中有应用价值的酶之一。 1 4 1 过氧化氢酶的类型划分 早期按来源不同把c a t 划分为真核c a t , 1 3 原核c a t 。真核c a t 主要来源于动植 物组织中，其中哺乳动物组织中c a t 含量差异很大，肝脏中含量最高，结缔组织中 含量最低，在上述组织细胞内，c a t 主要与细胞器，如线粒体和过氧物酶体结合形 式存在，而在红细胞中则以可溶状态存在。原核c a t 主要来源于微生物，研究发现， 几乎所有需氧微生物中都存在c a t ，但也有少数好氧菌，如过氧化醋杆菌( p e r o x y d a s ) 不存在c a t 。1 9 8 9 年，g o l d b e r g 矛l l h o c h r n a n 按照不同理、化特性，将c a t 划分为典 型性( t y p i c a l ) 、非典型性( a t y p i c a l ) 和c a t 一过氧化物酶( c a t a l a s e p e r o x i d a s e s ， c a t p o d ) ，通常认为这也是种符合进化关系的划分。按催化中一0 结构差异可分为 两类，( 1 ) 含铁卟啉结构c a t ，又称铁卟啉酶，典型性c a t 和i c a t p o d 属于此类； ( 2 ) 含锰离子代替铁的卟啉结构，又称为锰过氧化氢酶( m n c a t ) i 4 8 1 ，非典型性c a t 属 于此类。 1 4 2c a t 的结构特点和功能 1 4 2 1 典型c a t ，又称单功能血红素c a t ，几乎存在于所有需氧呼吸组织，包 括真核生物和原核生物。大部分典型c a t 尽管来源不同，但在结构上具有高度相似 性。它们都是由4 个具有相同多肽链的亚基组成，每个亚基含有一个血红素辅基作为 活性位点，该辅基的形式为铁卟啉，一个分子中含有四个铁原子，其作用基团是血 红素，相对分子量一般为2 0 0 3 4 0 k d 4 9 。跨越4 个结构域，典型性c a t 大约7 0 4 6 0 个氨基酸残基。目前几种获得晶体结构的c a t 分别来自牛肝( b l c ) 、微紫青酶 ( p v i t a l e ) 、溶壁微球菌( 1 y s o d e i k t i c u s ) 、奇异变形菌m i r a b i l l s ) 、大肠杆菌( e c o l i ， h p l l ) 、啤酒酵母( s c e r e v i s i a e ，c a t a ) 、人体红血球( h e c ) 【5 0 】。晶体结构的数据表明， 非同源c a t 亚基结构有很大相似性，如在水溶液中，黑曲霉c a t 希i 牛肝c a t 的二级 结构含量基本一致口”。天然典型性c a t 活性位点处于高度自旋f e 3 十状态，它可以在 h 2 0 2 的2 电子氧化下形成化合物i ，在此过程中铁原子失去一电子从而与h 2 0 2 的氧原 予形成氧代铁部分，卟啉环失去另一电子形成阳离子基，然后化合物i 又在另一分子 的h 2 0 2 的2 电子还原下转变成天然的状态，g f j f e ”状态，从而完成一个催化循环。 1 4 2 2c a t - - p o d 该类c a t 广泛存在于动、植物组织中，原核生物仅在真菌中 有发现。可以说c a t - - p o d 在自然界中是典型性c a t 的衍生物，是c a t 同p o d 产生 的可逆聚合体。它们的分子量大约为1 2 0 3 4 0 k d ，通常该酶属于同型二聚体，也有 一部分属于四聚体。同典型性c a t , h 比，c a t p o d 具有更为庞大的结构单元，它包 6 第一章前言 含至少7 0 0 个氨基酸残基。 1 4 2 3 c a t 生理功能和环境胁迫的关系 c a t 作为生物体内重要物质，具有非常重要的生理功能，其中最为主要的就是 参与活性氧代谢过程。氧分子对生物体是无毒性的，一旦氧分子的电子分布发生改 变，就变成活性氧。活性氧的种类包括h 2 0 2 ，羟自由基( o h 。) 、超氧阴离子( 0 2 ) 3 种。 在活性氧代谢过程中，c a t 可以使h 2 0 2 发生歧化生成水和氧分子，发挥了重要作用。 在环境胁迫等逆境情况下，生物体内广泛存在活性氧爆发现象，导致自由基增多， 使细胞膜产生过氧化，导致细胞膜的破坏和损伤。c a t 与超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化物酶( p o d ) 共同组成了生物体内活性氧防御系统，在清除超氧自由基、h 2 0 2 和过 氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。据国外资料报导，动、 植物体：j c a t 对多种环境因子均有明显的生态效应( 紫外光，二氧化硫：氮氧化物， 氨气以及重金属等等1 。其研究成果的应用价值在于抗毒、防癌及环境生物学监测等 诸多方面。多种环境因子对生物生理生化过程的影响，可以通过生物体内c a t 表现 出来。 1 4 3 过氧化氢酶的电化学研究 过氧化氢酶是高度专一的酶，它的基本功能是催化过氧化氢的分解，生成水和 氧分子。另外过氧化氢酶还表现出中等强度的过氧化物酶特性，例如，它能够加速 与过氧化氢的氧化反应【5 2 1 ，由光谱证明过氧化氢酶与过氧化氢反应时类似于过氧化 物酶形成三种化合物。当过氧化氢酶与过氧化氢反应时，首先形成了化合物i ，它 是一种中间态的酶底物化合态i ，能够进一步氧化过氧化氢，可被两种单电子还 原作用恢复，首先被还原的是反应基的位置，生成的物种具有形式上含铁基f e ( i v ) = o 中心，称为化合物i i ，化合物是化合物与过氧化氢的氧化反应形成的，它具有 三价的氧化态f e ( i i i ) 1 5 3 。化合物i 具有很高的活性，在参加酶反应过程中不仅过 氧化氢而且其他的可提供氢的物质都能够与化合物i 反应，例如乙醇、甲酸盐、亚 硝酸盐，化合物比化合物i 活性低1 0 ，而化合物则没有酶活性。 在生物催化和电化学系统中过氧化氢酶主要以固定态使用。当过氧化氢酶吸附 固定在纤维素中时【5 ”，得到高活性的吸附酶。另外在用脂肪酸或磷脂修饰的硅胶中 1 5 5 ，和滑| 生碳纤维物质中，还在非水溶剂中做了过氧化氢酶的生物催化活性研究。它 过去经常被用来固定于玻碳表面的聚合物膜中【5 6 制作有机相的电流生物传感器。使 用聚丙烯酰胺垫来固定过氧化氢酶来测定其热行为 5 7 】。还有研究了过氧化氢酶作为 过氧化氢生物传感器和酶抑制剂( 如：氟化物，氰化物) 的生物传感器的【5 8 j 。与葡 过氧化氢酶的电化学研究 萄糖氧化酶共修饰后，过氧化氢酶作为电化学检测葡萄糖的酶膜而使用。1 9 9 7 年 e h o r o z o v a 等研究了过氧化氢酶吸附于两种类型的烟灰( s o o t ) 中的特性”，指出它 的吸附符合y y o m k i n 吸附等温线且进一步研究了分解过氧化氢的特性，同时肯定了过 氧化氢酶固定于烟灰和石墨中后参加了电化学氧化苯酚。此后2 0 0 0 年j i l i ek o n g 等又 将过氧化氢酶修饰于十二( 烷) 基二甲基溴化铵液晶膜( d d a b ) 中1 6 ，使用了热 解石墨电极( p g ) ，发现有加强了的电子传递速率，并用方波伏安非线性衰减法测 定了其速率值。2 0 0 1 年a b e r g e l 等在玻碳电极表面研究了过氧化氢酶催化还原氧分 子的两种不同的机制1 6 ”。k m i t r a 等用微分脉冲的方法研究了过氧化氢酶共价结合于 玻碳粉膜中的电化学性质1 6 ”。2 0 0 2 - - 2 0 0 5 年期间n a i f e ih u ，h u i h o n gl i u 等将过氧 化氢酶修饰于一系列的膜中，包括聚铵基胺( p a m a m ) 、甲基纤维素膜( m c ) 、 聚丙烯酰胺膜( p a m ) 、壳聚糖聚合膜( c s ) 、胶原质膜中，都得到了加强了的电 子传递，并得出了包括式电位、电子传递速率、质子耦合、对亚硝酸盐，氧，过氧 化氢的催化还原等有价值的信息。同时使用了紫外一可见光谱，和电子扫描显微镜 等方法做了细致的研究。2 0 0 3 年j i a n x i u w a n g 等将过氧化氢酶在金电极上修饰于单壁 碳纳米管中【6 3 1 ，测定了其直接电化学性质，发现直接的电子传递被极大的加强了。 而在多壁碳纳米管上也于2 0 0 5 年由a b d o l l a hs a l i m i 等人对过氧化氢酶做了研究【6 ”。证 明不仅电子传递加强而且稳定性也极大的加强了，是可以用来作为与过氧化氢酶的直 接电化学相联系的生物传感器的新型材料。 1 5 过氧化氢酶的适用的电化学研究方法及原理 在蛋白质修饰电极的研究中，最基本的三种电化学方法有( 1 ) 循环伏安法( 2 ) 方波伏安法( 3 ) 线性扫描伏安法。 ( 1 ) ：循环伏安法：是以线性扫描伏安法的电位扫描到头后，再回过头来扫描到原 来起始电位值，所得的电流一电压曲线为基础的分析方法。其电位与扫描时间的关 系呈等腰三角形。如果前半部扫描为去极化剂在电极上被还原的阴极过程，则后半 部扫描为还原产物被氧化的阳极过程。因此一次三角波扫描完成一个还原过程和氧 化过程循环，设还原过程o x + n e # r e d 为可逆则峰电流可用r a n d l e s e v 6 i k 公式表 示i 。= 2 6 9 1 0 5 n 3 佗a d 。1 佗v 1 + 设r e d o x + n e 也为可逆，则峰电流仍可用 r a n d l e s g e v 6 i k 公式表示i 。，。= 2 6 9 1 0 5 n 3 胆a d r e d l l 2 v 1 陀c + 循环伏安法不仅可以发现、 鉴定电极过程的中间产物，判断电极过程的可逆性和研究物质电活性，同时也是研 究伴随化学反应电极过程和电极表面吸附现象的重要方法。 第一章前言 ( 2 ) 方波伏安法是在直流缓慢线性增加的电压上叠加一小振幅方波交流电压( 振幅 一般小于3 0 m v ，频率2 2 5 - 2 5 0 h z ) 测量方波电压后期通过电解池的交流电流而进 行定性、定量分析的方法，常用于测定电子传递速率。 ( 3 ) 线性扫描方法是将一快速线性变化电压施加于电解池上，并根据所得的电流一