（药物化学专业论文）仿生条件下珊瑚来源真菌aspergillus+ochraceus次生代谢产物研究.pdf

仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的 次生代谢产物研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得! 逵! 垫逡查墓丝重 墨壁别直塑丝! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：阙移纷签字日期劢扣年莎月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名阂准计 签字日期：弦p 年石月矿日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字： 签字日期： 电话： 邮编 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢 产物研究 摘要 珊瑚的体表及体内积聚了大量的微生物，这些微生物的次生代谢产物化学结 构新颖、种类繁多，是新药先导化合物的重要来源。但是目前对珊瑚共附生微生 物次生代谢产物的研究却鲜有报道。为了寻找新的活性先导化合物，本论文采用 了化学与生物活性相结合的集成筛选方法，开展了珊瑚共附生微生物的研究工 作。内容包括：珊瑚共附生微生物的分离与活性筛选；天才菌株的获得及环境胁 迫对其次生代谢的影响；活性成分的分离纯化；单体化合物的结构解析；单体化 合物活性的初步评价。 从海南临高及三亚附近海域的1 2 个珊瑚样品中分离得到了7 8 株微生物。采 用s r b 法，以小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞为筛选模型进行体外抗肿瘤活性的一级、 二级筛选，并结合h p l c 指纹图谱及薄层色谱进行化学筛选，得到3 株“天才菌 株”。选择其中一株l c j i1 1 0 2 对其次生代谢产物进行系统研究。l c j l1 1 0 2 经 鉴定为赭曲霉a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 。 在考察了不同的环境胁迫对目标菌株次生代谢的影响后，对目标菌进行了两 个不同环境条件( 寡营养仿生培养基静置培养3 0 天和真菌2 号高盐培养基摇床 培养9 天) 下的大量发酵。对发酵产物运用萃取，薄层色谱，正相、反相硅胶柱 色谱、l h 2 0 凝胶柱色谱、反相高压液相等化学的分离纯化手段，从仿生培养的 次生代谢产物中分离得到2 2 个单体化合物( 1 - 2 2 ) ；从真菌2 号高盐培养的次生 代谢产物中分离得到5 个单体化合物( 2 3 2 7 ) ，共2 7 个化合物。 继而利用理化性质和波谱学方法( i r ，u v ，m s ，n m r ，x r a y ) 结合化学 反应的方法( m o s h e r 反应等) 阐述了这2 7 个化合物的化学结构( 化合物结构及 名称参见t a b l e1 ) ，其中新化合物7 个。新化合物结构类型包括：内酯类衍生物 ( 2 、1 6 、1 8 ) ，c i r c u m d a t i n 衍生物( 1 9 、2 0 、2 1 ) 以及甾醇衍生物( 4 ) 。其它 已知化合物分别为内酯衍生物和c i r c u m d a t i n 衍生物。 采用滤纸片法对部分单体化合物的抗菌活性进行了初步评价，结果表明：化 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 合物1 、4 、1 3 、1 4 、1 6 、1 7 、1 8 分别对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单 孢菌、产气杆菌以及白色念珠菌表现出不同程度的抑制作用。其中，化合物4 对白色念珠菌的抑制作用比较强，m i c 为6 7 5g g m l 。其余化合物的抑菌活性微 弱。采用m t t 法、s r b 法对部分单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。结 果表明：化合物4 和化合物1 1 对h l 6 0 细胞表现一定的抑制作用，i c s o 值分别 为1 2t t m 和3 6 州。剩余化合物的抗肿瘤活性还在测试中。 综上，本文采用集成筛选的方法获得珊瑚来源的天才菌株，并阐明了1 株珊 瑚共附生真菌在两种不同环境胁迫条件下产生的2 7 个次生代谢产物的化学结 构，获得新化合物7 个，并对这些化合物的生物活性进行了初步评价。这些实验 结果证明：珊瑚共附生微生物具有很大的开发研究价值，而通过环境胁迫诱导微 生物产生不同的活性次生代谢产物是寻找结构新颖的药物先导化合物的有效手 段。 关键词：珊瑚真菌，活性次生代谢产物，组合筛选，细胞毒活性，抗菌活性 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 次生代谢产物研究 s e c o n d a r ym e t a b o l i t e so fa s p e r g i l l u so c h r a c e u s a s s o c i a t e d w i t hd i c h o t e l l a g e m m a c e a u n d e rb i o m i m e t i cc u l t u r e a b s t r a c t c o r a l a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s mi sar i c hs o u r c eo fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s 、析t l ld i v e r s es t r u c t u r e sa n db i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，b u tr e s e a r c h e so ns e c o n d a r ym e t a b o l i t e so fc o r a l - a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s ma r er a r e l yr e p o r t e d as t u d yi sc a r d - e do u tt oi n v e s t i g a t et h eb i o a c t i v el e a dc o m p o u n d sd e r i v e df r o mc o r a l a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m st h e s i sd e s c r i b e st h es t u d yo ft h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s p r o d u c e db yac o r a l a s s o c i a t e df u n g u su n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s s t u d i e si n c l u d ei s o l a t i o no fa s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s mf r o mc o r a ls a m p l e sa n da e t i v i t ys c r e e n i n g ，s e l e c t i n gt a l e n t e ds t r a i n sa n de f f e c t so fe n v i r o n m e n t a ls t r e s so i l s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，b i o a s s a y - g u i d e df r a c t i o n a t i o n ，s t r u c t u r a le l u c i d a t i o na n dc y t o t o x i c i t ye v a l u a t i o no fp u r ec o m p o u n d s 7 8f i l i l 鲫s t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m12c o r a ls a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o m t h es e a s h o r eo fl i n g g a oa n ds a n y ai nh a i n a np r o v i n c e 3s t r a i n sw e r ep i c k e do u t b a s e do nt h ec y t o t o x i ca s s a yu s i n gt h ep 3 8 8c e l ll i n eb yt h es r bm e t h o da n do nt h e h p l ca n dt l cc h e m i c a ls c r e e n i n g a m o n gt h e m ，as t r a i nw h i c hw a si d e n t i f i e da s a s p e r g i l l u so c h r a c e u sl c j 1l 一10 2i s o l a t e df r o md i c h o t e l l ag e m m a c e aw a ss e l e c t e d f o rf u r t h e rs t u d yo fh ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e s a f t e ri n v e s t i g a t i n ge f f e c t so fd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a ls t r e s s e so ns e c o n d a r y m e t a b o l i t e so fl c jil - 10 2 ，l a r g e - s c a l ef e r m e n t a t i o n so ft w od i f f e r e n te n v i r o n m e n t s w e r ep e r f o r m e dt oo b t a i nt h ea c t i v ee x t r a c t s b ym e a n so fc h r o m a t o g r a p h yo v e rs i l i c a g e lc o l u m n ，s e p h a d e xl h 2 0 ，p r e p a r a t i v et l ca n ds e m i - p r e p a r a t i v eh p l c ，2 2 ( 1 - 2 2 ) a n d5c o m p o u n d s ( 2 3 - 2 7 ) w e r ei s o l a t e df r o mt h et w od i f f e r e n tc u l t u r e s b ym e a n so fp h y s i c c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n ds p e c t r a la n a l y s i s ( i ru vm s ， n m r , x r a y , e t c ) ，s t r u c t u r e so f2 8p u r ec o m p o u n d sw e r er e s p e c t i v e l yd e t e r m i n e d a m o n g t h e mt h e r ea r e6n e wc o m p o u n d s ，i n c l u d i n g3l a c t o n ed e r i v a t i v e s ( 2 ，1 6 ，i s ) ， 3c i r c u m d a t i n ( 1 9 ，2 0 ，2 1 ) d e r i v a t i v e sa n d1s t e r o ld e r i v m i v e ( 4 ) t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h e s ec o m p o u n d sw a se v a l u a t e db yp a p e rd i s k m e t h o d c o m p o u n d sl 、4 、1 3 、1 4 、1 6 、1 7 、1 8a l ls h o w e dm o d e r a t e l ya n t i b a c t e r i a l i i i 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i i l u so c j l 眦p 虹的次生代谢产物研究 a c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 、b l a s t o m y c e sa l b i c a m 、b a c i l l u s s u b t i l i sa n d b a c i l l u sa e r o g e n e s c o m p o u n d5s h o w e df a i r l ys t r o n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s t b l a s t o m y c e sa l b i c a n s t h ec y t o t o x i c i t yo ft h e s ec o m p o u n d sa g a i n s ts e v e r a lc a n c e rc e l l l i n e sw a se v a l u a t e db ys r ba n dm t t m e t h o d o n l yc o m p o u n d4 a n d1 1e x h i b i t e d c y t o t o x i e i t ya g a i n s th l - 6 0c e l l s 谢t l li c 5 03 6r t ma n d12 州 s u m m a r i l y ，t h i sw o r k o b t a i n e d3t a l e n t e ds t r a i n sf r o mc o r a l a s s o c i a t e d m i c r o o r g a n i s mb yi n t e g r a t e ds c r e e n i n g ，a n d2 7c o m p o u n d sw e r e o b t a i n e df r o m c u l t u r e so fl c j11 10 2u n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ，i n c l u d i n g7n e w c o m p o u n d s t h i ss t u d yp r o v i d e sn o v e ls t r u c t u r et y p e sf o rn a t u r a lp r o d u c tc h e m i s t r y a n db i o a c t i v et e m p l a t ec o m p o u n d sf o re x p l o r i n gn e wd r u g s i ta l s op r o v e st h a t c o r a l a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s mi sa na f f l u e n tr e s o u r c ea n dt h em e t h o dw eu s e di s e f f e c t i v ei nl o o k i n gf o rn e wb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf r o mc o r a l a s s o c i a t e d m i c r o o r g a n i s m k 叮w o r d s ：c o r a l - a s s o c i a t e df u n g i ，e n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，b i o a c t i v es e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ，c y t o t o x i ca c t i v i t y ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 t a b l e1 s t r u c t u r eo fc o m p o u n d s l 弱， r ( - ) - m e l l e i n n ) , - o h 2 嘴 ( 研7 - h y d r o x y - 3 - ( ( r ) 一1 h y d r o x y e n e w t h y l ) i s o b e n z o f u r a n - l ( 3 h ) o n e 3 、妒o a s p y r o n e o h 4 h 。蒯汁 h a l o e r g o s t e r o lb n 唧 o 。厂 5 一 a s p e r l a e t o n e 、o h 食a 。 6 汾o 。 d i h y d r o p e n i c i l l i ca c i d 7 鄙。 c i r c u m d a t i nf v 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌d s p e r g i l l u so c h r a c e u $ 的次生代谢产物研究 8 h 3 c 。一。 c i r c u m d a t i ne 9 岫一o 。c 叱 e i r c u m d a t i nd 1 0 掷。 c i r c u m d a t i ng l l 孙。 p e n i c i l l i ca c i d 9 h 1 2 髓 3 ，7 一d i h y d r o x y - 3 一m e t h y l i s o b e n z o f u l a l l i ( 3 h ) - o n e 1 3 h x 翕 9 - c h l o r o - 8 一h y d r o x y - 8 ，9 - d e o x y a s p y r o n e h k 1 4 比冗b i 9 - e h l o r o - 8 - h y d r o x y - 8 ，9 一d e o x y - y 仑 a s p e r l a e t o n e o h 1 5 部o 。h c i r c u m d a t i nc 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 oo h 1 6 对o i 5 - h y d r o x y 一3 ，6 - b i s ( 1 - h y d r o x y e t h y n e w 1 ) - 5 ，6 - d i h y d r o 一2 h - p y r a n 一2 - o n e o ho h 1 7 h x 骈 ( 5 s , 6 r ，9 s ) 一d i h y d r o a s p y r o n e oo h 1 8 y o l - b y d r o x y 一1 一( ( 5 r ，6 s ) 一5 - h y d r o x y - 6 - m e t h y l 一2 一o x o - 5 ，6 一d i h y d r o 一2 h - n 唧 p y r a n - 3 y 1 ) p r o p a n 2 y la c e t a t e o h 1 9 o c h r a z o l i n ea n e w l q 9 ny - o 2 0 丫y n f o c h r a z o l i n eb i h q 妒o 9 hjp h 人弋一 l 、卜 o c h r a z o l i n ec 2 1 ，砖t i i e w 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r , g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 2 2 6 - h y d r o x y c i r c u m d a t i nc 2 3 噶暑 b i s ( 6 一m e t h y l h e p t y l ) p h t h a l a t e 2 4 v 、撕。 ( 12 ，15 ) - m e t h y l o n o n a d e c a - 1 2 ，15 - d i e n o a t e 2 5 嗽 d i i s o b u t y lp h t h a l a t e 2 6 o d i b u t y lp h t h a l a t e 2 7 一呲 r ( + ) - s e m i - v i o x a n t h i n a p o c h c b c o s y 2 d n l 垤r d m 【s o e s l - m s e t o a e e t o h f c m g 0 g g r i m 日瑾i c h m q c 丑p l c 珊t o l l m s i c m 玎t m e c n m e o h c m p f m r i t n e e n 1 r n o e s y p b s p i p g f - n 腿 r e e r y s s r b t l c t o f 小僵s u v v l c a b b r e v i a t i o n a p o p t o s i s c h l o r o f o r m s h i f tc o r r e l a t i o ns p e c t r o s o c o p y t w o - d i m e n s i o n a ln m r d e m e t h y l s u l f o x i d e e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r a e t h y la c e t a t e e t h a n o l f l o wc y t o m e t r y g a p 0 g a p l g a p e | m i t o s i s 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u c l e a rm u l t i p l eb o n dc o n n e c t i v i t y 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u c l e a rm u l t i p l eq u a n t u mc o n n e c t i v i t y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m o t o g r a p h y h i g hr e s o l u t i o n - t i m eo ff l y i n gm a s ss p e c t r a h a l fi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n i n f r a r e ds p e c t r a a c e t o n i t r i l e m e t h a n o l m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n m e l t i n gp o i n t m a t u r a t i o n m - p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r 3 ( 4 ，5 - d i m e t h y l 2 - t h i a z o y l ) 一2 ，5 - d i p h e n y l - t e t r a z o l i u mb r o m i d e n e c r o s i s n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e n u c l e a ro v e r h a u s e re f f e c ts p c c t r o s c o w p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p r o d i u mi o d i d e p u l s e - f i e l dg r a d i e n tn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e r e c r y s t a l l i z e s u l f o r h o d a m i n eb t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y t i m eo ff l y i n gm a s ss p e c t r a u l t r a v i o l e ts p e c t r a v a c u u ml i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 中国海洋大学硕士学位论文：堕竺壅竺! 翌塑鲞堡壅堕生墨鬯竺兰竺竺! 竺! 竺竺塑姿竺垡塑兰望堕塞 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - - _ _ i _ _ _ _ 一一 x 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 目录 前言1日日百1 参考文献2 1 珊瑚共附生微生物的分离与筛选3 1 1 样品来源与菌株分离3 1 2 天才菌株筛选模式4 1 33 株天才菌株的形态、活性及化学特征6 1 4 小结与讨论8 1 5 实验部分9 参考文献1 1 2 菌株a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 发酵条件的优化及次生代谢产物的分离1 2 2 1 菌株发酵条件的考察1 2 2 2 菌株仿生条件次生代谢产物的提取分离2 2 2 3 菌株富营养条件下次生代谢产物的提取分离2 6 2 4 小结与讨论2 7 2 5 实验部分一2 8 3 次生代谢产物的结构研究2 9 3 1仿生条件下单体化合物的结构解析2 9 3 2 富营养条件下单体化合物的结构解析4 6 3 3 小结与讨论4 8 3 4 实验部分4 8 参考文献5 1 4 化合物的活性评价5 3 4 1 抑菌活性测试方法5 3 4 2 细胞毒活性测试方法5 3 4 3 化合物活性测试结果5 5 4 4 小结与讨论5 7 4 5实验部分5 7 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l 淞o c h i c i c e u 5 笪姿生垡塑兰塑里塞 5 综述喹唑啉酮类生物碱的研究进展5 9 参考文献6 4 结语和创新点6 8 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果6 9 个人简历6 9 本论文相关研究成果6 9 致谢7 0 附图7 1 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 次生代谢产物研究 上- j 月u昌 珊瑚系低等腔肠动物，全球共有6 1 0 0 多种，中国海域分布有4 9 6 种。近年 来对珊瑚次生代谢产物的化学与药理学研究一直是海洋天然产物研究的热点【l j ， 珊瑚与海绵、海洋微生物一起构成海洋天然产物的三大来源【2 】。然而，越来越多 的研究表明：海洋生物中的某些活性物质其实际生产者可能是与之共附生的微生 物1 3 1 ，因此，海洋生物的共附生微生物逐渐成为科学家们研究的热点。目前，对 海绵共附生微生物的研究已经取得了相当的成果，例如：对海绵次生代谢产物及 其生态学的探讨性研究揭示某些活性物质实际上可能是由与其共附生的微生物 产生的，从海绵共附生微生物中已近发现了许多与其宿主相同或相关的次生代谢 产物。然而，与海绵同为海洋天然产物三大来源之一的珊瑚，其共附生微生物次 生代谢研究却鲜有报道，是一个新的可开发资源和研究领域。 海洋环境具有高盐、高压、低温、低照、寡营养等特点，如：海水中氮和碳 的含量只有陆地土壤中的0 8 和0 1 4 ，而氯和溴的含量却是陆地土壤中的1 9 3 倍和7 倍【4 】，虽然这种极端环境对于普通微生物来说也许是致命的，但正是这种 极端环境可能激活了海洋微生物的某些沉默基因1 5 - s ，从而产生结构特殊的蛋白， 进而诱导出独特的生物代谢途径f 9 】，使得处于寡营养和局部高盐环境中的海洋微 生物形成了有别于陆地土壤微生物的耐盐或嗜盐、耐饥( 寡营养) 等独特生理特 征。 在研究的过程中，科学家们发现海洋微生物次生代谢产物随外界培养条件的 改变时常差异很大。例如：实验室培养发酵时，由于选择不同的培养基导致产生 不同的次生代谢产物。这既可能是由于次生代谢酶的底物特异性在某种程度上说 是比较低的，只要供给与底物结构类似的物质，有可能得到与原始物不同的次生 代谢产物；也可能是由于培养基中部分元素的缺乏或过多，抑制或增强了某种次 生代谢酶的功能。在环境胁迫条件下，微生物为了对抗或适应环境的变化，必然 产生新的次生代谢产物。德国化学家a x e lz e e c k 曾提出( o n es t r a i n m a n y c o m p o u n d s ) 的概念【1 0 】，强调通过不断改变微生物培养基和培养条件，尽可能发 掘菌株次生代谢的潜力，从而获得大量结构新颖的活性次生代谢产物。基于这一 思想，我们开展了海洋微生物的仿生( 低氮源+ 低碳源+ 2 5 人工海盐或天然海 水) 培养，最大程度地模拟还原海洋微生物的真实生存环境，以期在实验室条件 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g f f l u sd c m c 嗽的次生代谢产物研究 下激发海洋微生物的独特生物代谢途径，从中获得结构多样的活性化合物。 本文从采白海南临高及三亚附近海域的1 2 个珊瑚样品中分离得到了7 8 株珊 瑚共附生微生物。采用s r b 法，以小鼠白血病p 3 8 8 肿瘤细胞为筛选模型进行体 外抗肿瘤活性的初步筛选，并结合h p l c 指纹图谱与薄层色谱进行化学筛选，得 到“天才菌株 3 株。选择其中1 株“天才菌株 a s p e r g i l l u so c h r a c e u s l c j l l 1 0 2 作为研究对象，为了尽可能挖掘菌株的次生代谢潜能，采用了多种环境胁迫条件 对其进行了小试发酵，并选择了两种环境胁迫条件进行了大量发酵，应用现代分 离手段对其次生代谢产物进行分离，以期寻找到更多新的生物活性的物质，为新 结构、新活性药物的研究提供候选化合物。 参考文献 【1 】张文，郭跃伟海洋生物柳珊瑚的化学成分及生物活性研究进展中国天然药物，2 0 0 3 ，l ： 6 吵刁5 【2 】j o h nw b l u n t , b r e n tr c o p p ，w a n - p i n gh u , e ta 1 m a r i n en a t u r a lp r o d u c t s n a tp r o dr e p , 2 0 0 9 ，2 6 ：17 驴艺4 4 【3 】周世宁，林永成，姜广策海洋微生物的生物活性物质研究海洋科学，1 9 9 7 ，3 ：2 7 - - - 2 9 【4 】王夔生命科学中的微量元素北京：中国计量出版社1 9 9 1 【5 】k h m e lla r e g u l a t i o no f e x p r e s s i o no f b a c t e r i a lg e n e si nt h ea b s e n c eo f a c t i v ec e l lg r o w t h r u s s g e n e t ，2 0 0 5 ，4 1 ：9 6 8 母8 4 【6 】s c m i c t m a nd ，k u b om ，s h a n k a rs ，e ta lr e g u l a t i o no fn u c l e o s i d ed i p h o s p h a t ek i n a s ea n d s e c r e t a b l ev i r u l e n c ef a c t o r si np s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ：r o l e so fa l g r 2a n d a l g n b a c t e r i o l , 19 9 5 ， l7 7 ：2 4 6 9 2 4 7 4 【7 】7 t a m b u r i n ie ，m a s t r o m e iqd ob a c t e r i a lc r y p t i cg e n e sr e a l l ye x i s t ? m i c r o b i o l , 2 0 0 0 ，151 ： 1 7 弘1 8 2 【8 】k o c hal g e n e t i cr e s p o n s eo f m i c r o b e st oe x t r e m ec h a l l e n g e s t h e o rb i o l , 1 9 9 3 ，1 6 0 ：l 2 1 f 9 】m e j a n e l l el ，l o p e zjf g u n d e - c i m e r m a nn ，g r i m a l tj0 e r g o s t e r o lb i o s y n t h e s i si nn o v e l m e l a n i z e d 如n 酉f r o mh y p e r s a l i n ee n v i r o n m e n t s l i p i d r e s ，2 0 01 ，4 2 ：3 5 2 3 5 8 【! o 】b o d eh b ，b e t h eb ，h o f sk e ta l b i ge f f e c t sf r o ms m a l lc h a n g e s ：p o s s i b l ew a y st oe x p l o r e n a t u r e sc h e m i c a ld i v e r s i t y c h e mb i oc h e m ，2 0 0 2 ，3 ：6 1 9 - - 6 2 7 2 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u $ 的次生代谢产物研究 1 珊瑚共附生微生物的分离与筛选 珊瑚是一种低等海洋动物，其体表及体内积聚了大量的微生物l l j ，这些微生 物的次级代谢产物化学结构新颖、种类繁多，是新药先导化合物的重要来源。但 是目前对珊瑚共附生微生物次生代谢产物的研究却鲜有报道，近年来只有1 篇文 献报道从l 株珊瑚来源的曲霉次生代谢产物中鉴定了2 个曲霉毒素类化合物1 2 】。为 了开发珊瑚共附生微生物资源，寻找新的活性先导化合物，本文对采白海南临高 及三亚附近海域的1 0 余个珊瑚样品进行了共附生微生物的分离，经过形态和化学 排重后共得n 7 8 株微生物。以实验室小鼠白血病p 3 8 8 j i c p 瘤细胞为筛选模型，采用 s r b 法，对所得的7 8 株微生物进行了体外抗肿瘤活性筛选，并进一步结合t l c 、 h p l c 等化学筛选方法手段，最终确定了3 株有较好活性和深入研究价值的“天才 菌株 ，为实验室提供了宝贵的菌株资源。本章归纳介绍了有关的分离筛选的方 法和结果。 1 1 样品来源与菌株分离 1 1 1 样品来源 样品来源：2 0 0 6 年4 月采白海南临高( n 2 0 、e 1 0 9 ) 、海南三亚西岛( n 1 8 、 e 1 0 9 ) 以及浙江附近海域的珊瑚样品。 1 1 2 样品的处理 稀释涂布法：用无菌海水清洗珊瑚样品的表面3 遍，将冲洗完的样品切碎后 用无菌组织匀浆器研磨至呈粘稠状液体，取适量组织液配成浓度为1 0 以的母液， 并依次稀释梯度至1 0 。2 、1 0 3 、1 0 4 、l o 、1 矿、10 7 。各取0 2 m l 不同梯度的液 体均匀涂布于不同培养基上，并做两组平行实验。 组织切块法：用无菌海水清洗珊瑚样品的表面3 遍，将冲洗完的样品切成适 当大小平铺于培养基的表面，使珊瑚与培养基接触的表面积尽可能大。 培养基的配方：不同盐浓度的p d a 琼脂培养基 ( 以海水素来调节培养基盐度，海水素浓度分别为10 、2 0 和3 0 ) 1 1 3 菌株的纯化及保藏 将涂布好的培养基平板置于2 8 。c 培养箱中，每天观察，挑出形态差异较大 中国海洋大学硕士学位论文：仿生条件下珊瑚来源真菌a s p e r g i l l u so c h r a c e u s 的次生代谢产物研究 的单菌落，采用平板划线法二次纯化后接种于固体斜面培养基，长成后置于冰箱 4 保存。 t a b l e1 - 1 本论文所获得的7 8 株珊瑚共附生真菌统计表 样品编号采集地点采集时间菌株总数三种盐度下的最适生长菌株数 1 0 2 0 3 0 l c j l l 海南临高2 0 0 6 、0 42 0 21 62 l c j l 2 海南临高2 0 0 6 、0 4l l l c j l 3海南临高2 0 0 6 、0 48l3 4 l c j l 4海南临高2 0 0 6 、0 49l26 l c j l 5海南临高2 0 0 6 、0 43l2 l c j l 6 海南临高 2 0 0 6 、0 4ll l c j 2 0 海南临高 2 0 0 6 、0 41 531 02 s y x l o沲南= 弧2 0 0 6 、0 4523 s y x l 2海南= 弧 2 0 0 6 、0 4l l s y x 2 0海南= 弧 2 0 0 6 、0 4l l z j d j d 2浙江2 0 0 8 、0 53l 2 z j d j d