（微生物学专业论文）东方拟无枝酸菌产聚乳酸降解酶和蛋白酶的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 a a a a a k k 吒 g g f g g g h p l c k 1 ) a p a g e p b s p c 乙 p 船 p l a s d s t l c 4 缩写词表 a m i n oa c i d 氨基酸 n s u c c i n y l a l a a l a a l a p n i t r o a n i l i d e n - s u c c i n y l a l a a l a p r 舻p h e p n i t r o a n i l i d e n - s u c c i n y l - g l y - g l y p h e - p n i t r o a n i l i d e n - s u c c i n y l g l y g l y g l y p - n i t r o a n i l i d e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相 k i l l o d a l t o n 予道尔顿 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚焉烯酸胺凝胶电泳 p o l y ( b u t y l e n es u c c i n a t e ) 聚丁烯琥珀酸酯 p o l y ( 中性溶液。聚乳酸不同酌结晶性也导致了其降解性 的差异。般来说，非结晶态懿p d l a 比结晶态的p l l a 更容易加水降解。p d l a 材料在生理盐水中降解，相对分子质量半衰期为3 星期至1 0 星期，而p l l a 则 至少为2 0 个星期。据报道，半结晶态的p l l 。a 降解存在着两个阶段，第个阶 段，水分子扩散到聚乳酸的无定型区域，导致酯键随机断开。随着降解的进行， 当无定型区域降解几乎结束时，结晶度增加。在第二个阶段，水解才由结晶区边 缘向结晶中心开始降解。在无定型区水解过程中，生成立构规整的低分子物质， 结菇度增大，延缓了进一步东解的进行。这一性能被用于骨修复和骨内固定材料 中，调节材料的降解速度以满足人体对材料的要求。 酶催化水解、微生物降解是可降解材料在自然界中最普遍存在的降解方式， 聚乳酸可以被微生物降解。通过生物降解试验，即模拟材料在自然环境中加速降 解的试验方法，研究了聚乳酸在活性污泥，室外土埋条件下的降解速度，发现在 微生物含量较多的活性淤泥中的降解速度快，这是因为微生物能分泌使聚乳酸降 解的酶。 1 3 1 聚乳酸降解菌株 自然界中已知能够降解聚乳酸的微生物是十分有限的，n i s h i d a 和p r a n a m u d a 等人利用平板透明圈计数法，对不同土壤环境中能够降解聚酯的微生物情况进行 了测评。结果显示，自然界中能够降解聚羟基丁酸酯( p h b ) ，聚己内酯( p c l ) 的微生物数量是基本相似的，大约在o 8 。1 1 ，而降解p l a 的微生物数量还不 到0 0 4 。土壤掩埋的对照实验也显示如，p l a 在土壤中的降解速度相对比较 缓慢，一般要在一年以上。1 9 9 6 年a t o r r e s 等人报道了f u s a r i u m m o r t y i i f o r m e 能够吸收d l - - * l 酸和部分可溶的寡聚物，并能在共聚物上生长。毽这种作熏十 分缓慢，并且必须以自然条件下寡聚物自身的大量水解为前提。1 9 9 7 年 p r a n a m u d a 筛选到了一株能够高效降解p l a 的微生物菌株_ 爿朋弦d 肠鲫灯心 h t - 3 2 ，经过1 4 天的液体培养能够使6 0 的p l a 薄膜发生降解，这是关于p l a 降解菌株的首次报道。 目前，人们从自然环境中和已经建立的菌株库当中，分离到了大约几十种能 山尔大学硕士学位论文 够降解p l a 的菌株，这些降解菌株大部分部属于放线菌，例如爿厦粥。扬印s 如 属菌株，k i b d e l o s p o r a n g i u ma r i d u m 和s a c c h a r o t h r i xw a v w a v a n d e n s i s 等。 在2 5 株a m y c o l a t o p s i s 属的菌株中，有1 5 株能够在p l a 乳化平板上形成明显的 透明圈。鉴于这些菌株都属于稀有放线菌，人们对菌种库4 1 个属的1 0 5 株放线 菌进行检测，并进行了1 6 sr r n a 序列分析，结果显示p l a 降解菌在系统发生上 属于p s e u d o n o c a r d i a c e a e 家族以及其相关属，包括a m v c o l at o p s i s ，l e nt z e a ， k i b d e l o s p o r a n g i u m ，s t r e p t o a l o t e i c h u s 和s a c c h a r o t h r i x 。据此，入们推测 p s e u d o n o c a r d i a c e a e 家族以及其相关属可能在自然界的聚乳酸降解中起着重要 作用。 此外，还分离到少数能够降解p l a 的细菌，以及唯一株具降解活力的真菌 7 “t i r a c h i u ma l b u m 。加t i r a c h i u ma l b u m 在加入0 1 明胶诱导物的液 体培养基中，经过1 4 天培养可以使7 6 的p e a 薄膜发生降解。已有的结果显示， 上述相关微生物的p l a 降解能力与它们可以分泌产生某类特殊的蛋白酶相关。同 时，研究还发现大多p l a 降解菌株能够吸收降解产物乳酸，但也发现有些菌 株并不能吸收乳酸，因此会在培养基中造成产物的积累。 1 3 2 聚乳酸降解酶类 1 9 8 1 年，w i l l i a m s 首次报道了来源予t r i t i r a c h i u ma l b u m 的蛋白酶 ( 对聚 乳酸具有降解作用。此后，蛋囱酶k 一直作为一种公认的p l a 降解酶来研究p l a 及 其混合物的降解特性。t s u j i 等人研究了蛋白酶k 对p l a 无定型区和结晶区的降 解情况，结果显示，无定型区要比结晶区的酶解速率快。鉴于蛋白酶k 对p l a 的 降解作用，o d a 等人对5 6 种商业蛋白酶进行了检测，结果发现酸性和中性蛋白 酶基本上都不能降解p l a ，丽些来源予细菌的碱性蛋白酶剐对p l a 有骧显的 降解作用。对这些蛋白酶的迸步研究表明，有降解作用翡酶均属予丝氨酸蛋蛊 酶家族，焉且对角蛋自都有降解作用，但并非所有能够降解角簧自的酶都能够降 解p l a ，这种结果显示出p l a 和角蛋白的酶解存在一定的相关性，但又存在着 一定的差别。对丝氮酸蛋白酶酶解各种聚酯结果显示，蛋白酶k ，枯草杆菌蛋白 酶，q 一胰凝乳蛋白酶以及弹性蛋白酶和胰岛索都能够在定程度上降解p l a ，但 降解能力逐渐减弱，而且丝氨酸蛋自酶抑制剂能够强烈抑制这些蛋白酶的p l a 降 1 0 出衷大学硬士学蓥论文 解活性。因此，可以推测这些酶对p 乙a 的降解机制可能与降解簧白的机制是相同 的，但e d t a 和表面活性赛u p l y s u r f 对酶解p l a 也有很强的抑制作焉，这说明蛋 白酶对p l a 的降解可能还有其独特性。 因为脂肪酶能够随机地切断聚醮主链的酯键，在脂肪族聚酯y x i p c l 的降解 中起重要作用，而p l a 属于脂肪族聚酯，其单体乳酸之间是靠酯键进行连接的， 因此从理论上讲，脂肪酶应该对p l a 具有降解作用，但对1 8 种商业脂肪酶的研 究结果却表明，虽然大部分脂肪酶对p c l ，p b s 等都呈现较好的活性，但只有一种 来源于a l c a l i g e n e ss p 的脂肪酶在5 5 滞8 5 的条件下，经过2 0 天可以实现 对p i a 的完全降解。推测这静酶的降解是以高温和高p h 豹水解为基础，对p i a 水鳃的中闻产物乳酸寡聚物的降解起主要作用。有人推测，脂肪酶能够降解 各种低t m ，没有手性碳原子，在酯键和酯键之间具有大量亚甲基基团的无定型聚 合物，而不能水解具有典型手性碳的聚酯例如p h b 和p l a 。但2 0 0 3 年 a k u t s u s h i g e n o 等人采用分子生物学的方法进行功能筛选，克隆了 p a e n i b a c l l l u sa m y l o l y t i c u st b - 1 3 的一个p l a 降解酶基因，并在最c o l l 中实 现7 功能性表达。这个降解酶分子量在2 2 k d a 左右，底物特异性较宽，对脂肪酶 底物和许多生物聚醺都有降解作用。经过序列比对发现p l a a 的氨基酸序列与杆 菌脂肪酶的同源性不到4 5 一5 0 ，但1 0 7 位到1 1 l 位的氨基酸残基 a l a 一s e r _ g 1 y 却是作为细菌脂肪酶保守性五肽而存在的，系统发生分析显示 出p l a k 与细菌脂肪酶家族f a m il yi - 4 具有序列相似性，但与此家族中的其它酶 同源性不高，因此成为f a m i l yi - 4 中一个独立的分支，它的许多功能特性与典 型的f a m i l y 王q 脂肪酶有着嗡显不同。 随着高效p l a 降解菌株的发现，p l a 降解酶昀研究也取得很大进展。 n a k a m u r a 等人从a m y c o l a t o p s i ss t r a i nk 1 0 4 1 中纯化到了一个p l a 降解酶组 分，分子量为2 4 k d a ，酶反应的最适温度和p h 分别为5 5 6 0 和p h 9 5 。它除了 对p l a 具有酶解作用以外，对酪蛋白和纤维蛋白都有降解作用，因此推测其为 丝氨酸型蛋白酶。同年，p r a n a m u d a 等人也报道了) 叭a m y c o l a t o p s i ss t r a i n 4 1 分 离获得了一个降解酶组分，其分子量为4 0 k d a ，反应的最适温度和p h 分别为 3 7 4 5 。c 藕p h 6 ，对酪蛋自和纤维蛋白也有降解作瘸。从底物特异性上分析，这两 类降解酶可能属于蛋白酶家族，但荚精确的作雳机制仍不清楚。此外m a e d a 等 出家大学谚! 士学位论文 鼬删獭。移, z a e 菌株的发酵液中分离到了一分子量为2 1 6k d a 的p b s 降解 酶，氨基酸序到比对分橱推断是一种角质酶，丽这种蕉质酶对p l a 也有一定的 降解作用。m a s a k i 等人也报道了来源于酵f 蕈c r y p t o c o c c u ss p s t 商ns - 2 的一神类 似子角质酶的降解酶对p l a 等生物聚醚都有相对高效的降解作用。这些新型降 解酶的发现无疑为p l a 降解酶的研究以及降解机制的阐明提供了新的信息。 下表总结了近年来发现的p l a 降解菌株及其产生的降解酶的相关信息。 表1 懿型的p l a 降解微生物及其降解酶 近来，m a t s u d a 等人获得了a m y c o l a t o p s i ss t r a i nk 0 4 - 1 编码p l a 降解酶的 基因p l d ，并在s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s1 3 2 6 中进行了表达，其表达需要n 端3 5 个氨基酸，包括2 6 个氨基酸的信号肽和9 个氨基酸的前残基，从而产生2 0 ， 出哀大学硬士擎建论文 9 0 4 d a 的成熟酶，其中前序列的切除是自催化的。p l d 显示滋与许多真核生物 丝氨酸蛋白酶4 5 的相似性，而且它具备丝氨酸蛋自酶编码催化三联体的保守 序列，结合其它的保守性分搴厅，推测这种酶属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家 族。 综上所述，p l a 作为种非天然存在的人工合成聚酯，它的降解酶并不是作 为一种单的酶类而存在的，脂肪酶，蛋白酶和角质酶都有可能对p l a 具有降 解作用，j a r e r a t 等人研究了各种氨基酸、多肽等蛋白类物质对p l a 降解酶的诱 导彳乍用，对它韵产生及降解模式作了推测。 l 。4 蛋白酶与聚乳酸降解 由于许多p e a 的降解菌株同时也能降解蚕丝蛋白等蛋自餍，分离纯化到的 p l a 降解酶也都呈现与丝氨酸蛋白酶相似皎底物特异性，因此，p e a 降解酶越来 越被倾向于认为是种蛋自酶类，并推测这些菌株或酶可能将p l a 的重复l 。 乳酸单元识别为丝纤蛋白主要成分l a l a 单元的类似物而发生催化降解。 蛋白酶是类可以催化蛋白质水解反应的酶，本世纪以来科学家们对蛋白酶 作了大量的研究，包括它们的生理生化和物理特性。蛋白酶也是一种蛋白质，适 用于一般蛋白质结构功能的研究方法也适用于蛋白酶。为了弄清楚蛋白酶的构效 关系，各种研究酶的结构与功能的方法均被采用。其中蛋自酶结晶帮基因测序是 研究蛋自酶结构和功能的主要方法。但是蛋自的晶体结构中只含5 0 的水，晶 格力对蛋白质的结构有一定的约束作用，不能够完全反映蛋白酶在溶液状态下的 天然构象。而且更多的蛋白酶是没有得到结晶结构的。如何快速，自由，灵活的 研究溶液中各种蛋白酶构象和功能，可以借助其它蛋白质的一些研究方法，如紫 外光谱、荧光光谱、圆二色谱、核磁共振、氢氘置换等f f e l l e ra n dg e r d a y ，1 9 9 7 ) 。 其中，荧光光谱和圆二色谱己被用于多种蛋白结构的分析当中，为多种蛋自构象 和功能的研究提供了试验依据。 1 4 i 蛋白酶研究的历史与现状 大约个世纪之前，科学家就发现自然界中存在着一种能使其他蛋白质的肽 键发生断裂的蛋白质，即摄白酶类。本世纪以来对蛋白质酶进行了大量的分离纯 山东丈学硕士学位论文 化工作。对蛋白质的生化性质，作雳机理开震了大量研究，有许多的科研成果发 表，主要涉及到生理，生诧，物理等方葫。其中，许多工业焉葳研究用的蛋囱酶 均已商晶化，如洗涤剂用蛋囟酶t h e r m o l y s i n ，s s p e r a s e ，s a v i n a s et 等，又如基 因工程常用工具位点专性蛋白酶：胰蛋白酶，胶原蛋白酶，内肽酶，激肽释放 酶，血管紧张肽原酶，凝血酶，v 8 蛋白酶，梭菌蛋白酶，凝血因子，肠凝酶等。 重组d n a 技术的发展为我们进一步深入研究殛自酶提供了技术基础，新兴 的蛋白矮工程，主要研究内容就是改变已有蛋白酶的生物，物理特性，以适应特 殊的要求。胰蛋白酶，枯草蛋白酶是人们研究最多的两个方面，对这两类酶的蛋 自质结构耜催化棍理均巴研究的很清楚。多种胰蛋白酶的氨基酸顺序，e d n a 的 核苷酸序列已测定清楚：从枯草专于菌，地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌等不同来 源的菌株中克隆了s u b t i l i s i n 基因，在空间结构上已经测定出s u b t i l i s i nn o v o ， s u b t i l i s i nb p n ，s u b t i l i s i nc a r l s b e r g 的三级结构。因此胰蛋白酶和枯草蛋白酶可 以作为蛋白质工程很好的模型系统，事实上在已有的蛋白酶中胰蛋囱酶和枯草蛋 白酶的蛋白质工程研究进行的最早，进展也最大。1 9 8 4 年c r a i k 等人受限将胰 蛋白酶进行了工程改造，重新设计已知蛋白酶，并对各种突变型胰蛋白酶的性能 进行了分析。他们作的改造主要有：改变底物专一性，改变活性部锭的残基，翡 除分子表面的环状结构等。对s u b t i l i s i n 的定向改造也取缛了巨大的进展，成功 地获得了抗氧化，耐热，耐碱，高比活的突变酶体。同时，值得一提的是，现代 医学发现许多疾病，如艾滋病和某些癌症的发病和相关病毒的蛋白酶作用有关。 这启示人们应用蛋白酶抑制剂以病毒蛋囱酶为靶子，开发出治疗艾滋病和某些癌 症髂新药。国肉对予蛋白酶的研究，多集中于动植物来源的蛋白酶，如胰蛋自酶， 木瓜蛋白酶，胃蛋囱酶等，微生物来源的蛋白酶研究较少，并且大郝分报道也是 针对枯草芽孢杆菌蛋自酶，放线菌中产蛋自酶的研究较少。动植物来源的蛋自酶 的研究涉及多个方面：酶的固定化，酶的分离纯化，酶活测定，酶的抑制剂，酶 结构与活性调节，酶的专性，酶的分子修饰，酶的稳定性改造，酶分子定位改 造，酶与免疫，酶与细胞凋亡，酶与信息传递等。产蛋白酶的微生物有：枯草芽 孢杆菌，地衣芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，嗜热芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，无 色杆菌，嗜水气单胞萤，粘质赛氏菌，芳香黄杆菌等，另外还有黑瞄霉，酱油懿 霉等凡株真菌。对于他们的研究，主要内容有；产酶菌种选育与培养条件优化， 1 4 出东大学硕学篷论文 酶的分离提纯与性质研究，酶的性质改造，代谢调控等。 l 。4 2 蛋白酶的分类 蛋白酶( p r o t e a s e ) 是指能水解脓链中肽键的类酶。国际生物化学和分子生物 学联合会在1 9 8 4 年推荐使用肽酶( p e p t i d a s e ) 作为肽链水解酶类的总称，而更广泛 使用的名称：蛋白水解酶( p r o t e o l y t i ce n z y m e s ) 和蛋白酶( p r o t e a s e ) 是它的同义词。 蛋白酶归于第3 组( 水解酶) 中的第4 分组。目前对蛋白酶的划分主要有三个标准： 催化反应的类型活性中心的化学性质结构上的进化关系。根据蛋白酶作用 位点在肽链中的位置，可将其初步划分为外肽酶( e x o p e p t i d a s e ) 和内肽酶 ( e n d o p e 两d a s e ) 两类：外肽酶水解最接近蛋囱质底物n 一端或c 一端的肽键；内肽 酶的 乍用位点链于蛋白质内部，远离n 一端和c 一端。按照活性中心的功能基圈， 蛋白酶可进一步分成丝氨酸蛋囱酶、天冬氮酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋 白酶等4 类。 l 421 外肽酶 根据作用位点的不同，外肽酶分为氨肽酶( a m i n o p t i d a s e s ) 和羧肽酶 ( c a r b o x y p e p t i d a s e s ) 。 1 氨肽酶 作用予多肽链游离的n 一束瑞，释放是单个氨基酸、二肽或三肽，还会切去 蛋白质n 一末端的m 鹾存在于许多微生物中，包括细菌和真蘸，属胞内酶。 2 羧肽酶 作用于多肽链的c 一末端，释放出单个氨基酸或二肽。按照酶活性中心氨基 酸残基的性质，羧肽酶被分成3 类：丝氨酸羧肽酶( s e r i n e c a r b o x y p e p t i d a s e s ) 、金 属羧肽酶( m e t a l l o c a r b o x y p e p t i d a s e s ) 和半胱氨酸羧肽酶( c y s t e i n e c a r b o x y p e p t i d a s e s ) 。 1 4 2 2 内肽酶 按照催化机制，内肽酶被分成4 个亚类：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 山东大学硕士学使论文 1 丝氨酸蛋自酶( e c 3 4 2 1 ) 活性中心存在丝氨酸残基，丝氨酸蛋白酶种类繁多，在外肽酶、内默酶、寡 肽酶和q 肽酶中都有发现：广泛分布于病毒、细菌和真菌中，暗示它们对这些 生物体是至关重要的。丝氨酸残基是这类蛋白酶活性所必需的，酶活性中心丝氨 酸残基通过其侧链羟基对易断裂肽键的羧基进行亲核攻击，形成中间体。活性中 心的组氨酸接受丝氨酸的质子，形成的酶酰基化合物通过水分子的亲核攻击发 生断裂，从而完成肽键的水解。 丝氮酸蛋自酶主要分为四个宗族：胰凝乳蛋自酶 c h y m o t r y p s i n ( s a ) 、枯草 杆菌蛋自酶 s u b t i l i s i n ( s b ) ，羧肽酶 c a r b o x y p e p t i d a s ec ( s c ) 】和e s c h e r i c h i a d a l a d 触ap e p t i d a s ea ( s e ) 。这4 个宗族中成员的一级结构完全无关，暗示丝氦 酸蛋白酶至少有四个分别独立进化的祖先。 2 天冬氨酸蛋白酶( e c 3 4 2 3 ) 这类蛋白酶的名称是由于其活性中心的天冬氨酸而来的，以前常被称作“酸 性蛋自酶 ，都是肽链内切酶，一般存在子真核生物中，有证据表明一些病毒基 因也能编码合成此类蛋白质，细h i v - i 帮p o l i o 病毒，此类蛋白酶在病毒的多蛋 自加工过程中起到重要作用。 其催化活性依赖于天冬氨酸残基，活性中心是豳2 个空间上相隔很近的天冬 氨酸残基形成的二联体结构，水解肽链时，两个质子同时发生转移，一个从水分 子转移到二联体结构中的一个天冬氨酸的氨基基团上，另个从二联体结构中的 氨基氧转移到底物，导致肽键断裂。天冬氨酸蛋白酶分为三个家族：胃蛋白酶 ( 趟) 、r e t r o p e p s i n ( a 2 ) 和来自p a r a r e t r o v i r u s e s 的蛋白酶( a 3 ) 3 ，半胱氨酸巯基蛋自酶( e c 3 4 2 2 ) 广泛存在予原核和真核生物中，拥有2 0 个家族，木瓜蛋白酶是其代表。半 胱氨酸蛋白酶一般只在还原剂( 如h c n 和c y s 等) 存在的情况下有活性；其活 性依赖于由半胱氨酸和组氨酸构成的催化二联体，在家族之间，半胱氨酸和组氨 酸残基的顺序( c y s - - h i s 或h i s - - c y s ) 是不同的。与丝氨酸蛋自酶类似，半胱 氨酸蛋白酶也是通过形成一个共价中间物来水解蛋白质，活性中心c y s 2 5 和 琢s 1 2 9 ( 本悉蛋白酶中的编号) 的作用分别相当予丝氨酸蛋白酶的s e r l 9 5 和h i s 5 7 ( 胰蛋白酶编号) 。根据底物专一性，半胱氨酸蛋白酶分成四类：类本瓜蛋白 1 6 氆衮丈警疆拳爱谂文 酶；类簇凝乳蛋崮酶，优先谫割精氨酸残基；专切割谷氯酸的酶；其它 毒。金属蛋岛酶( e c 3 + 4 。2 4 ) 其活性中心依赖金属离子，懿z 非2 呻等。是催化类型最多的蛋鲁酶，来源广泛， 从离等生物的胶原酶，蛇毒液中的燃血毒素到嗜热细菌的高温蛋白酶，共有3 0 个家族，其中1 7 个家族全是肽链内切酶，1 2 个家族只有肽链外切酶，另外1 个 家族既有内肽酶也有外肽酶。按照构成金属结合位点的氨基酸性质，可将金属蛋 白酶划分为不同的寨族。二价金属离子对金属蛋白酶的活性是必需的，其活性中 心含有一个金属离子，活性受到基p 儆掷镧。墨经谣暖，许多金属簧尝酶具有重 要的生理作用。 1 4 3 蛋囱酶的应用 1 4 3 1 蛋皇酶魈基础与应用研究 自从蛋自酶被发现，它就在基础与应甭研究幸发挥了重要的俸焉。蛋宦酶对 肽键有高度的选择性，可耀来阐黉其链蛋自震的结构帮功能。 l 。耀蛋自凄霹突蛋幺覆结构：蛊于对肽键豹裹度选择性，一些蛋自酶能使 底物蛋幺质产生有限的断裂。它们的一个主要作用就是分析蛋白质的一级结构。 由予e d m a n 降解法( e d m a nd e g a d a t i o n ) 和质谱分析法( m a s ss p e c t r o s c o p y ) 等 化学方法和技术的限制，能被测定一级结构的蛋白质一般较小，仅有4 8 4 9 个氮 基酸长度。这样用蛋白酶断裂蛋自质或多肽测定氨基酸顺序就显得非常重要了 ( 可测定出的蛋自质可禽有5 0 - 5 2 个氨基酸) 。 2 。耀蛋自酶合成默类：一般合成默类采用标准圈相戏标准渡相方法。徨是， 这种方浃需要条终苛刻，往咎破坏一些氨基酸。另外，应熙起来这种方法仅能合 成3 0 。5 0 个氨基酸残基长度的肽链。这种情况下，采用蛋白酶合成肽链成为一种 明智的选择，可以避免使用有毒的化学试剂，避免肽链的消旋作用。运用这种方 法已成功合成或半合成了包括人胰岛素在内的多种重要的肽类。 量。4 。3 。2 蛋白酶在工业生产中的应用 食晶监、制药业、皮革监、洗涤裁监等，都离不开蛋白酶的使用。超过8 0 1 7 山东大学磺学位论文 的工业胡酶是水解酶，它们绝大部分的作用是解聚天然物质，两几乎6 0 的工 业雳水解酶是蛋自酶，工韭爝酶中占市场最大份额的是家用洗涤剂矮蛋白酶。 食品业：蛋白酶能提高食品的品质、稳定性和可溶性，蛋白酶是食晶工业用 酶中应用最广泛的酶，因为它具有以下优点： 1 来自动物、植物、微生物，一般不含毒性物质； 2 在温和环境下发挥作用，所需酶浓度非常低，副反应极低； 3 反应完成后，酶容易被灭活。 皮革监：皮革糯工过程幸，脱毛帮增加皮革柔韧性都离不开蛋白酶的应用。 工序开始，需要浸泡生疫，以便清洗杂物和再水化作用，添加低浓度的蛋自酶有 利于后翥。这个过程常使用胰蛋白酶，它还含有脂酶能溶解脂肪，树脂等，有利 于水的吸收。羊毛可以制作高级毛线，脱羊毛时，将液体蛋白酶加于羊皮背毛一 侧，蛋白酶扩散至毛囊基部，引起蛋白质水解，使羊毛脱落。这样可以使对羊 毛的损害减至最低。一般的脱毛过程是在一个碱性环境中，通过使用碱性蛋白酶 ( 如枯草蛋自酶) 完成的。碱性环境有利于毛根膨胀，有利于蛋白酶选择性水解 毛囊部位的蛋白质。皮革的鞣制包括降解弹性蛋白，角蛋白，显然皮革鞣制也离 不开蛋白酶的使用。 洗涤剂业：蛋白酶是洗涤剂常用的添加剂，因为蛋白酶能溶解血液、食物、 身体分泌物、皮肤微粒等污渍。另外还可以除去因高温( 洗涤温度般大于5 0 ) 而凝固在衣物纤维上的蛋白质类污垢。现在，全世界酶销售的大约2 5 为 洗涤剂用蛋自酶。 1 5 本论文研究的内容和意义 通用塑料在给人们生活带来便利的同时，产生的“白色污染 也给人类赖以 生存的自然环境造成了不可忽视的破坏。随着世界环境问题的日益严重和人类环 保意识的增强，人们越来越重视对生物可降解材料的研究和开发。聚乳酸( p l a ) 是种极其重要的生物降解材料，具有良好的生物兼容性、可降解性和优异的加 工性能。p l a 制品在医药、农业、生活、服装等领域都有着广阔的应用前景。 研究聚乳酸等人工合成聚脂类化合物的降解，对于研究聚乳酸降解酶类以及 阐述其降解机制，以及了解天然酶类和非天然底物之间的作用机理都有很重要的 1 8 山袤大学疆士学棼论文 意义；同时，也有利于更好的解决自色污染闻题，健迸瓷源的可循环利用。 本论文的工作主要集中在以下几个方面： 从自然环境和实验室酌菌种痒中，筛选分离具有聚乳酸降解能力的菌株；研 究其产蛋白酶及其与聚乳酸降解酶间的关系，获得最佳的产酶培养条件和最佳诱 导物，提高产酶的效率。进一步研究菌株胞外酶系组成及粗酶性质，尝试建立聚 乳酸降解产物分析方法，为聚乳酸酶学降解的机理研究提供技术平台。 幽袭大学颟士学爱论文 2 1 导言 第二章聚乳酸降解菌株的筛选 墅前发现的自然环境中存在的可以降解跣a 的菌株系统发生上属于 p s e u d o n o c a r d i a c e a e 家族以及相关菌属，主要包括a m y c o l a t o p s i s , l e n t z e a ， k i b d e l o s p o r a n g i u m , s t r e p t o a l l o t e i c h u s 和s a c c h a r o t h r i x ，我们从自然坏境和菌株 库当中筛选剿了一株可以高效酶解觊a 靛菌株a m y c o l a t o p s i s o r i e n t a l i s ( 东方 掇无枝酸菌 。 2 2 材料和方法 2 2 。1 菌株来源 ( 1 ) 自然环境中取自活性污泥，垃圾场，造纸厂，牛粪等的样品 ( 2 云南某地区的九株放线菌样品 ( 3 ) 实验室已有菌株库的菌种 2 2 2 试剂 p l a 粉米( m r5 ，0 0 0 ；2 0 ，0 0 0 翻2 0 0 ，0 0 0 ) 魏垂中国科学院成都有机化学 研究掰 p l a 颗粒( m r 8 ，0 0 0 1 6 ，0 0 0 ) 购自s i g m a 公司 乳化剂p l y s u r f a 2 10 g 购色d a i i c h ik o g y os e i y a k u ( j a p a n 其它试剂为市售分析纯或生物试剂。 2 2 3 仪器 k q 一1 0 0 e 型超声波清洗器( 瑟由市超声仪器有限公司 沿。粥2 型定时恒温磁力搅拌器( 上海天平仪器厂) 恒溢摇床( 太仓市实验设备厂 囊襄大学硕士学蓥论文 o l y m p u sb x 一5 l 光学显徽镜( o l y m p u s 公司) 2 2 4 培养基和溶液 ( 1 ) 明胶营养培养基： 明胶1 0g ，葡萄糖1 0g ，酵母膏2g ，n a c i6g ，k 2 h p 0 41 6g ，k h 2 p 0 4 0 , 2g ，m g s 0 40 5g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h 自然。 ( 2 ) 富集培养基： k 2 h p 0 47g ，k h 2 p 0 42g ，( n h 4 ) 2 s 0 41g ，m g s 0 40 。1g ，微量元素母液1m l ， 酵母膏o 1g ，明胶1 舀，p l a1g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h 自然。 ( 3 ) 筛菌培养基： m g s 0 4 o 1g ，n a c io 1g ，c a c l 2 2 h 2 00 0 2g ，f e s 0 40 0 1gk 2 h p 0 41 6g ， k h 2 p 0 40 2g ，( n h 4 ) 2 s 0 4lg ，微量元素母液1m l ，酵母膏0 0 1g ，p l a lg ， 蒸馏水1 0 0 0m l ，p h 自然。 ( 4 ) 诱导基本培养基： m g s 0 4 o 。1g ，n a c l0 1g ，c a c l 22 h 2 00 0 2g ，f e s 0 40 0 1g ，k 2 h p 0 41 6g ， k h 2 p 0 4 0 2g ，( n i - h ) 2 s 0 41g ，微量元素母液1m l ，葡萄糖1g ，酵母膏o 。1g ， 另外分别加入1g 的p l a ，蚕丝蛋白，明胶，氨基酸等作为诱导物，蒸馏水1 0 0 0 n l l ，p h 自然。 ( 5 ) 微量元素母液： n a 2 m 0 0 4 0 0 5g ，n a ：w 0 4 2 h ：o0 0 5g ，m n s 0 40 0 5g ，蒸馏水10 0m l ，避光 保存。 以上培养基，11 5 灭菌3 0 r a i n 。 ( 6 ) p l a 乳化液： 2 l 出东大学酸士学位论文 02g 娩a 粉末，翔入4 粥l 三氯警烷中溶解，将溶解后的魏a 溶液热入劐 2 0 0m l 含0 0 2 p l y s u r f a 2 1 0 g ( 乳化剂) o 0 1 m 的k 2 h p 0 4 - n a o h 缓冲液中， 置于磁力搅拌器充分混匀羼，超声波乳化，当溶液呈现牛奶状的乳浊液耐，謦止 乳化，于磁力搅拌器上加热搅拌，使溶于其中的三氯甲烷充分挥发后，定容至 2 0 0m l 。 2 2 。5 菌种筛选 ( 1 环境样晶菌株筛选 1 取适量土样接入到含1 0 0m l 富集培养基的5 0 0m l 三角瓶中，培养条件为 3 0 ，1 8 0r p m 振荡培养7 2h 。 2 将富集培养的菌株，涂布到以p l a 作为唯一磺源的筛菌培养基平板上， 3 0 培养7 2h ，挑取单菌落接入到含i 0 0m l 营养培养基的5 0 0m l 的三角瓶中， 3 0 ，1 8 0r p m 振荡培养7 2h 。 3 蒋活纯豹菌株涂布到以乳巅二的p l a 为唯一碳滚酌瓣菌培养基平板上，琨 察是否有透明圈形成。 ( 2 ) 菌株摩样品筛选 1 将保藏的菌株接入到含1 0 0m l 营养培养基的5 0 0m l 三角瓶中，3 0 ， 1 8 0r p m 振荡培养活化7 2h 。 2 。将活化的菌株涂布到以乳化的p l a 蔻唯一碳源的筛菌培养基平板上，寝 察是否有透臻圈形成。 2 2 6 菌株鉴定 ( 1 - 1 6 s e n a 序列测定 以筛选褥到的可以赢敬降解聚乳酸的菌株的基隧组d n a 为模舨，进行1 6 s p u n a 序列扩增。 ( 2 ) 菌体光镜形态观察 山东大学母! 士学位论文 先将菌种接种在营养培养基平板上，3 0 培养4 8h 后，挑取菌落，涂片镜 检。观察记录菌体的形态。 ( 3 ) 菌体电镜形态观察 菌种接种在营养培养基中，3 0 ，1 8 0r p m 培养4 8h 后，离心菌体，溶于 生理盐水后涂片，经戊二醛，单宁酸4 固定，生理盐水漂洗，乙醇梯度脱水 后，自然干燥。 2 3 结果与讨论 2 3 1 高效降解p l a 菌株的筛选 通过从自然环境以及从菌种库中进行初筛和复筛，最终得到了3 株可以在 p l a 乳化平板上形成透明圈的菌株，其中有一株从菌种库中筛选到的菌株活力 较高选取它作为下一步研究工作的对象菌株。菌株在p l a 平板上形成透明圈 的结果如图2 - 1 ，图2 - 2 ： 【l 一 图2 - 1 土样中筛选到的菌株图2 - 2 菌株库中筛选到的菌株 2 3 2 菌株鉴定结果 ( 1 ) 1 6 s r n a 序列比对结果 p c r 扩增出的对象菌株的1 6 s r r n a 的大小为1 2 9 6b p ，结果如图2 - 3 所示 山东大学硕士学位论文 缛到的序列在n c b i 数据库中b l a s t 进行同源性分析，与a m y c o l a t o p s i s 属中豹 a m v c o l a t o p s i sn o g a b e c o t i c a ，m z y c o l a t o p s i so r i e n t a l i s 等的1 6 s r r n a 序列 同源性高达9 9 ，进步判定该菌属于拟无技酸菌属( a m y c o l a t o p s i s ) 。 c a c g t g g g c a a t c t g c c e t g t a c t t t g g g a t a a g c c t g g g a 从c t g g g t c t 从t a c c g g a t a t g a c t g c t g a t c g c a t g g t t g g t g g t g g a a a g c t c c g g c g g t a c a g g a t g a g c c c g c g g c c t a t c a g c t t g t t g g t g g g g t a a t g g c 研a c c a a g g 0 3 a c g a g g g g t a g c c g g 硎；a g a g g g t g a c 。g g c c a c a c t g g g a c t g a g 是泓e g g c c c a g a c t c c t a c g g g a g g c a g c a g t g g g g a a t a t t g c a c 姒t g g g c g c a a g c c 彳g a t g c a g c g a c g c g g o g t g a g g g a t g a c g ( ；c c t t c g g g t t g t a a a c c t c t t t c g c c a g g g a c g a a g c g c a a g t g a c g g t a c c t c a t a a g a a g c a c c g g c t a a c t a c g t g c c a g c a g c c g o g g t 从t a c g t a g g g t g c g a g c g t t g t c c g g a a t t a t t g g g c g t a 从g a g c t c g t a g g c g g t t t g t c g c g t c g t t c g t g 从a a c t c c a c g c t t a a c g t g g a g c g t g c g g g c g a t a c 粥c a g a c t t g a g t t c g g t a g g g g a g a c t g g a a t t c c t c t g t a g c g g t g a a a c g c a g a t a t c a g g a g g a a c a c o g g t g g c g a a g g c g g g t c t c t g g g c c g a t a c t g a c g c t g a g g a g c g a a a g c g t g g g g a g c g a a c a g g a t t a g a t a c c c t g g t a g t c c a c g c t a a a c g t t g g g c g c t a g g t g t g g g c g a c a 彳e c a c g t l c c g e t a g 醴怂c g c a t t a 鑫g c ( ；c c 锻c c t g g g g a g t a c g g c c g c a a g g c t a a a c t c a a a g g a a t t g a c g c c o g c a c a a g c g g c g g a g c a t g t g g a t t a t t c g a t g c a a c g c g 从g a a c c t t a c c t g g c t t g a c a t g c g c c a g a c a t c c c t a g a g a t a g g g c t t c c c t t g t g g t t g g t g t a c a g g t g g t g c a t g c t g t c g t c a g c t c g t g t c g t g a g a t t g t t g g t t a a g t c c c g c a a c g a g c g c a a c c c t t a t c c t a c g t t g c c a g c g c g t c a t g g c g g g g a c t c g t g g g a g a c t g c c g g g g t c 必c t c g g a g g a a g g t g g g g a t g a c g t c a a g t c a t c a t g c c c c t 张t g t c c a g g g c t t c a c a c a t g c t a c 从t g g c t g g t a c a g a g g g c t g c g a t a c c g c g a g g t g g a g a a t e c c t t a a a g c c g g t c t c a g t t c g g a t c g c a g t c t g c 怂c t c g a c t g c g t g a a g t c g g a g t c g c t a g t a a t c g c a g a t 繇g e 怂c g c t g e g g a 矗t a c g t t c c c g g g c c t t a c a c a c c g c g t e a c g t c a 氍a a a g t c g g t a a 鼢c c c g a a g c c 图2 3 a r g y o o l a t o p s i so r i e n t a l i 菌株1 6 s r r n a 序列 ( 2 ) 菌体形态 属革兰氏阳性菌，产生柱型分生孢子，成柔曲长链状，基丝多分枝。菌落略 显黄色，边缘不规则，干燥不易挑取。菌落形态和菌体形态如图2 4 ，图2 5 ， 图2 - 6 。 2 4 山东大学硕士学位论文 鬻 图2 4 菌落形态 t 。2 葛。 p ? ，e 。j 图2 - 5 光镜下菌体形态图2 - 6 电镜下菌体形态 根据以上结果，参考放线菌鉴定手册以及菌株来源的背景信息，此放线菌符 合a m y c o l a t o p s i so r i e n t a l i s ( 东方拟无枝酸菌) 形态特征，结合1 6 s r n a 的测定 结果，将此菌株确定为a m y c o l a t o p s i s o r i e n t a l i s ( 东方拟无枝酸菌) 。 由于a m y c o l a t o p s i so r i e n t a l i s ( 东方拟无枝酸菌) 本身可以产生万古霉素类 抗生素，目前对于a m y c o l a t o p s i s o r i e n t a l i s ( 东方拟无枝酸菌) 的研究主要集中 在优化培养条件，采用新方法筛选高产菌株以及对原始菌株进行诱变改造，以期 获得高效价的万古霉素产生菌株。对于该菌株胞外酶系的研究并没有见到过相关 报道。但通过初步筛选，发现此菌株对于p l a 有很强的降解作用，表明 a m y c o l a t o p s i so r i e n t a l i s 的胞外酶系可能存在着一些性质特殊的酶类。 2 4 小结 对从不同的环境中采集的样品以及菌种库中的菌株进行筛选，得到了一株可 山农大学颧士学伊论文 以高效降解p l a 的菌株，对这株蔚进军亍了1 6 s r n a 序列测定，并结合形态学特 征，参照