（微生物学专业论文）铜绿假单孢菌Ⅲ型分泌系统调控机制的研究.pdf

中文摘要 t sfs 同 时 存在才能启 动。 我们在研究户 ， 万 .突变子m型分泌系统时发现， 胎牛血 清能够单独启动 e x 0 s和 e x o t蛋白的分泌，与钙离子浓度无关，而牛血清白蛋白 b s a则 不能。结果显示， 血清中 可能存在一种或几种有效成分， 具有激活户 叩 万突 变子tts s的功能。 进一步研究发现，这种特殊因子具有热不稳定和对蛋白酶敏感 的 特性， 血清经过加 热或蛋白 酶处理后， 失去了 诱导户 印犷突变子分泌e x o s 和e x o t 蛋白的功能。 采用截留分子量为l ookd的滤膜过滤含有胎牛血清的培养基， 发现滤 出的 部 分同 样失 去了 诱 导功能， 我 们称这 种 特殊因子为m型 分泌激 活因 子自 y pem 业 c r el i ona c t i v a t o r ， t s a ) ， 它是分子量大于l ookd的蛋白 质。另外， 我们通过构建 不同 基因的突变子， 分别研究它们对血清的反应， 发现p o p n 、 p c r l 和p crz 蛋白 均 参与了识别诱导信号t s a因子的过程。 在研究中我们发现， 不同的铜绿假单抱菌菌株p a k和队0 1 菌株， 它们的竹5 5 分泌水平存在着显著差别，调查存在这种差别的原因，对进一步完善trs s的调控 机制具有重要意义。 首先，我们分析了pak菌株中存在tts s 激活因子的可能性。 即构建队k的染色体d n a文库，转化进入以01 菌株中，筛选竹55 表达水平提 高的菌落， 提取并纯化这些菌落中的质粒， 测定d n a序列，并结合基因定位实验， 我们发现队k编码m e x s 蛋白的基因， 具有提高paoi 菌株t t s s 分泌水平的功能。 m e x s 蛋白 是多重药物泵出系统m e xef -o p rne ffi uxsy s t e m的负调控因 子，受m e x t 激活因子的调控。 为了进一步验证上述实验结果， 我们分别在队k和队0 1 菌株中， 构建了加 盯 了和m ext 突变子，测定它们t t s s的分泌能力，结果发现，队01 菌株 的m e xl 了 和m ext 突变子t l ，5 5 的分泌能力得到了明显提高， 而加 曰 心和m ext 两个基 因突变则不影响队k菌株，trs s 的分泌水平没有变化。 为了更进一步调查其中的 原因， 我们分别克隆并测定了m e 军 5 和m ext 基因序列， 发现pak和队0 1 菌株中， 同一基因编码的蛋白， 在氨基酸水平存在着关键区别，显示氨基酸的变化可能影响 蛋白的功能，进而影响菌株trs s的分泌水平。为了验证蛋白功能是否受到影响， 我们观察了 两菌 株中 受m e x s 和脚 ex t 基因 调控的m e x e f 一 叩rn操纵子的表达水平， 同时通过基因缺失实验进一步发现， pao i 菌株trs s 的表达受m ext 和脚 曰 沼负调 控， 但 是 与e m ux系 统m e x e f 一rn 的 高 水 平表达无关. 其次， 我 们分析了pa0 1 菌株中存在抑制因子的可能性，该因子使tts s的表达和分泌不能进行。实验过程 中文摘要 中我们采用转座子m 幼n er，构建 paoi 菌株的转座子文库，在特定条件下，筛选 i t s s 表达水平增高的菌落。提取突变子的染色体d n a ，用限制性内 切酶消化后， 分别克隆到载体上， 然后通过测定序列的方法， 分析转座子在染色体上插入的位置。 分析51个深蓝色菌落， 其中3 个菌落竹5 5的分泌能力明显高于其它突变子。 测序 结果表明， 一个突变子转座子插入m ext 基因的中间， 另外一个插入pa5265基因的 c端， 位置为1 0 5 3 川 氨基酸， 该基因编码一个未知功能的蛋白 ， 大小为1089aa， 含 有4 个跨膜结构域， 该基因是它所在操纵子的第二个基因， 其下游基因为队5264， 转座子可能通过pa5 2 64基因影响竹55 的表达与分泌，该基因同样编码一个未知 功能的跨膜蛋白，大小为3 23aa，有4 个跨膜结构域。 关键词:铜绿假 单抱菌、 m型 分泌系统、 夕 ， 万 突变子、蛋白 酶、 m分泌激活 因子、多重药物泵出系统、娜 。 召基因、m ext 基因 ah七a c t ab s t 怕ct 仰声1 11“ 沈 r e t i ons y s t e m( tfs s ) o f 凡e u dom o ae八 召 协 o sap l a y s a s i gni 幻 c a n t ro l e inp at h o g ene s i s . we h a v e p r e v 1 o u s i y i d e n t i fi e d t y peiil， 尤 r et i onn t o r (ts f ) t h a t i s r 冈u i r e dfor e 月 七 c t i v e 成 沁 r e t i on o f th e ty pel l l e 伤 比 t o r m o l ecu l e s ， i nadd i t i on toth e l ow calctums i gna l . t 七 et s fi n c l u desm any】 o wa ffin ity h i gh c ap留ity c al ci um b i n d l n g p 叹e i n s suchasse r u mal b u m i nandc a e in . s e a r c hfor th e t s fb i n d i n g ta 唱 e tsont h e b a c t e ri alo ut erm elnb ra n ei d e n t i fi ed p o p n ， ac o m pon e n t o f th et3s st h a t is化 adil y d e t ec ta b 1e onth e b ac t e ri aicel l s u r fa ce . the p o pn s pec i fi call yl n t e ra c t s 初thp c r l ， 朗d 加t h p 卯 哪and p c r i m u ta n tsd i spl ayc o n st i tutive ty pei l i se c r e t 1 onp h e n o ty p e ， s u g g e stin g th e 妇 刀 o p ro t e l n s fo n ” a c o m p l ext h atfo n ctio nsastts s 比 p r e s sor. f u rtherana l y s i s o f 咖 户 护no pero ng ene s i d e n t i fi ed p ro t e i n 一 p r o t e i ni n t e ra c t i ons b et w e e np c r 1 andp c r4， p c r4 朗d p cr3 aswel l asp 0 p nand p c r 2 inthe p r e se n ceo f p s c b . f u rt h e r m o 邝 ， we h a v e fo u nd somen ew i n t e r a c t i o n s am0 n g th e g e n e p redu ctp ai rs ， s u chas夕 印从助c rr， 户 r l 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、 数字化或其它手段保存论文;学校有权提供目 录检索以及提供本学位 论文全文或者部分的阅览服务;学校有权按有关规定向国家有关部门 或者机构送交论文的复印件和电子版;在不以赢利为目的的前提下， 学校可以适当复制论文的部分获全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名: ) 个 夕舀 夕 日 经 指 导 老 师 同 意 ， 本 学 位 论 文 属 于 保 密 ， 在夕沐 解 密 后 适 用 本 授权书。 指导教师签名: 解密时间: 镇 巷学 位 论 文 作 者 签 名 : 寻 各 潞 诊 年 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 内部 5 年 最长5 年， 可少于6 年) 秘密10年 ( 最长 10年，可少于 10年) 机密2 0 年 ( 最长20年，可少于20年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体， 均己 在文中以明 确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由 本 人承担。 学位论文作者签名: 第一章 前言 第一章前言 第一节铜绿假单抱菌的基础生物学 1 . 1 . 1铜绿假单抱菌简介 铜绿假单抱菌卢 毖 巴 u do咖 a s pro t e o b a c t e r i a 的丫 一 s u b d i v i s i o n 。 韶厂 以 9 2 刀 口 吕 是革兰氏染色阴性细菌，属于 一般情况下为好氧性非发酵细菌， 但在厌氧条 件下，能够利用硝酸盐或精氨酸作为电子受体。该细菌拥有细胞色素氧化酶 ( c yto c h r o m eo xid ase ) ，是区分肠道细菌的标志。铜绿假单抱菌一般呈略为弯曲 的杆状，细胞直径为0 . 5 气. 0阳，长度为3 飞 腼，大部分细胞一端具有鞭毛。在基 本培养基中或感染时，铜绿假单抱菌分泌色素包括p y ocy a n i n 、pyoverd in、 f l u r e s c e i n ， 菌落 呈 兰 绿色。 铜绿假单抱菌拥有一个相对较大的基因组，2 0 00年基因组序列测定己 经完成， 大约为 6 ， 2 64kb， 预 计编码5 ， 5 70个基因11 。 与其它已 经完成基因组序列测定的 细菌 相比， 铜绿假单抱菌具有最复杂的调控网络，目 前己经发现超过90种双因子调控系 统( t ， 0 一 c o mp o n e n t r e 创 l a t o r y s y s t e o 5 ) ， 使 得 该 细 菌 能 够 适 应 各 种 环 境 ， 广 泛 存在于水、空气、土壤、动物和植物等。铜绿假单抱菌能够利用自 然界中存在的各 种有机化合物作为碳源， 这一极端能力与它本身巨大的基因组和细胞内复杂的调控 网络有关 12 .除了 在营养和生态的多样性外， 铜绿假单抱菌对抗菌素和各种杀菌剂 具有显著的耐药性和存活率。医院内流行病学调查结果显示，铜绿假单抱菌是最常 见的5 种病原菌之一， 特别是在重症监护病房中，该细菌是院内感染的主要病原菌。 虽然医学在不断地进步， 铜绿假单抱菌仍然是人类健康的一个明显威胁，大量研究 表明，该细菌的流行，除了患者本身可能存在的遗传和生理因素之外，铜绿假单抱 菌独特的对多种抗菌素的耐药性以 及它侵染宿主免疫系统的能力， 是该细菌流行的 主要原因13，4 习 。 1 . 1 . 2铜绿假单袍菌是人类机会致病菌 l 第一章 前言 铜绿假单抱菌能 够引 起多种疾病。首先， 它是纤维肺 (cy s tic f i b ros is， c p) 患者肺部感染的主要病原菌:其次，在白血病癌症患者、艾滋病患者以及其它免疫 力低下的患者中，也存在铜绿假单抱菌的感染。另外，铜绿假单抱菌还与其它一系 列疾病有关， 包括在烧伤或外伤患者感染中引发急性败血症、 尿道插管患者的尿道 感染、隐形眼镜配戴者中的角膜炎、静脉输液患者感染导致的心内膜炎以及医院内 使 用呼吸 机患 者引 发的 肺炎 等 13 . cp是很常见的遗传疾病，存在于美国和欧洲的数个国家。目 前研究发现，每28 个白 人 ( caucasi an) 中， 就有1 个携带该基因的突变，总人数超过一千万人， 通常 他们是无临床症状的。 根据cf基金会的统计，今天在美国大约有30， 0 00个cf患者， 铜绿假单抱菌在cf患者的肺部形成长期慢性感染，导致cf患者的平均寿命只有31 岁。 虽然关于cf的遗传和分子基础已经取得了显著的进步， cf疾病的发病机理仍然 不清。一般认为，引起cf疾病的最重要原因是编码跨膜调控因子的基因 ( cystic f i b r o s i st r a n s m emb r a n er e 即l a t o rp r o t e i n ，c ftr )发生突变，该基因编码的蛋 白 具有跨膜氯离子通道的 功能6 。 近来研究表明， cf气管上皮 细胞氛离子转运的 异 常，导致了气管表面粘液的持续分泌，形成了厚厚的粘液斑或粘液团。这种粘液丰 富的环境，成了细菌生长的最好场所，特别是那些形成生物膜的细菌，如铜绿假单 抱菌口 刀 。 造成c f 患者高发病率和死亡率的主要原因是， 患者的呼吸系统存在铜绿假单抱 菌长期慢性感染。在成年以 前，超过80% 的患者已经被该细菌感染，反过来影响肺 功能和患者的生存。感染早期，研究认为，c ftr 介导铜绿假单抱菌的摄取过程，是 清除气管表面细菌的关键环节。很显然，该基因发生突变影响这一过程的进行，该 细菌感染就演变成慢性感染15， 9，1 01 。 cf患者呼吸系统的损伤和进行性退化是铜绿假单 抱菌反复感染的结果，并随着该细菌的定居而达到顶峰，即使杀伤力最强的方法也 不能清除该细菌。 从cf患者分离的铜绿假单抱菌通常认为是粘液型，因为表面存在 着由大量多糖形成外壳。 虽然cf患者仍具有正常免疫系统， 但是不能对粘液型铜绿 假单抱菌形成有效的反应， 吞噬细胞由于吞噬作用失效而不能清除细菌， 而激活的 炎症反应和严重的 组织损伤， 导致了 cf患者严重的 肺功能不 足和高死亡率队12， 13. 1 ，o 第一章 前言 1 . 1 . 3铜绿假单抱菌对抗菌素的耐药性 上世纪50年代以来，随着青霉素和其它抗菌素的大量应用，在不同患者群中， 引起严重感染的细菌种类发生了变化，革兰氏染色阴性细菌特别是铜绿假单抱菌， 成为住院患者中最大的医院内感染的威胁。 虽然许多针对铜绿假单抱菌的新型抗菌 素在投入使用之初，对控制铜绿假单抱菌的感染，具有明显作用，但是由于该细菌 本身具有的能力， 很快产生对新抗菌素的耐药性， 在治疗过程中造成新的麻烦14.1气 控制铜绿假单抱菌感染的主要困难， 来源于细菌本身具有对抗菌素的较高耐药 性，该细菌细胞外膜通道的通透能力很低，同时又存在着多种药物泵出系统 ( 。l t i p l e由 u ge f f l u xp u llll)s ) 1， 61 ， 研究比 较深入的 包括 ， e x a es ln e x 价 即 r m i 门 、 mex c es 口 ex d- oprjt 幻 和 m e xe 一 me x 卜 叩 rn 阴等 系 统 。 在 最 近的 一 次 研 究中 发 现， 1 32 株 临床分离的铜绿假单抱菌菌株，16株具有对抗菌素的耐药性，对1 2 种抗菌素中的8 种具有抗性tzo，说明问题的严重性。 耐药性菌株的快速出现，促使人们加快研究控制铜绿假单抱菌的其它替代方 法，通过研究该细菌的必需致病因子，以其能够发现新的治疗靶位。同时发展新的 免疫治疗手段和免疫预防措施，来刺激宿主提高自身的免疫能力，控制铜绿假单抱 菌的感染，也是非常重要的。 1 . 1 . 4生物膜的形成 铜绿假单抱菌的一个重要特征是在感染过程中，该细菌能够以生物膜的形式生 长， 这种 特性提高了 铜绿假单饱菌对抗菌素和细胞吞噬功能的 抵抗能力121 那3 。 生 物膜由细菌细胞附着在固体表面，或细胞间相互结合，并且包埋在细胞外聚合物形 成的 基质膜 ( idat rix) 中24 1 。 处于生 物膜中的 微生物细胞显示了 不同的 性状， 细胞 生长速度、 基因表达和蛋白质表达等方面， 与自由生长的细胞存在明显的区别和优 势，例如，基质膜能够获取和富集环境中存在的多种营养物质，如碳、氮和磷等。 并且能够保护细菌不受外界恶劣条件的影响，如杀菌剂、机械剪割、宿主细胞吞噬 第一章 前言 功能的 清除、氧自 由 基损伤以 及蛋白 酶的降 解作用等【 251。生 物膜的厚 度变化很大， 外形可以是柱形或磨菇形，内部具有网状通道， 传递各种营养。在生物膜中，代谢 水平和细胞分裂速度都明显下降，与平衡期的正常细胞相似。并且抗菌素穿透生物 膜屏障后，浓度明显降低，因此细菌对抗菌素的抵抗能力也相对增加，同样起到了 保 护 作 用 15 。 铜绿假单抱菌在植入体内的医疗装置表面， 也能形成生物膜，从而导致严重的 感染。 形成成熟的生物膜需要有功能的 鞭毛和iv 菌毛的共同 作用126。 首先， 鞭毛介 导的细胞吸附到固体表面，形成单细胞层.由于在ly菌毛的颜动 ( 七 衬t chi ng motility) 过程中 存在的聚合和解聚合作用， 单个细胞聚集形成微菌落。 研究表明， 鞭毛和iv型菌毛的参与需要一定的碳源。在形成的生物膜时，最初在玻璃表面的附 着过程不需要鞭毛和iv型菌毛， 它们涉及到生物膜的成熟过程2n。 当生 物膜形成到 一定程度， 脱附着过程发生， 聚集的细胞脱落下来扩散移动， 在新的表面重新附着， 使生物膜的面积不断扩大。 1 . 1 . 5 细菌的通讯系统o u o r u ms e n s i n g quorum sensi ng是细菌间的通讯手段，能够协调细菌的行为和功能，与多细胞 生物相似。细菌通过分泌aut oinducers 来进行信息传递，当细菌密度和信号分子的 浓度达到一定程度时，激活各种应答反应，使每个细菌与多细胞生物一样，协调一 致的启动基因表达。对革兰氏染色阴性细菌来说，信号分子为卜acety l ated homoserine l actone ( hsl) 的衍生物，由细菌分泌到细胞外面，该信号分子能够 自由进出细胞，当细胞内外信号达到一定程度时， 与其它因子结合，启动一系列基 因的 表达。 在铜绿假单抱菌中 存在两 种q uor 皿sensi ng系统， l asr/i 和r h1r/i 系统， las 系统调节r hl系统的表达128。 在l as系统中，l asl 合成信号分子3 一 ox。 12 一sl， 与l asr 结合形成的复合物， 激活多种基因的表达， 包括h型分泌系统、弹性蛋白酶 和外毒素e x o t oxina 等。在第二个系统中，rhh合成信号分子c 4-hsl ，与rh1 r 一起 调节各种基因的表达24 洲。另外，铜绿假单抱菌还产生第三种信号分子p qs ( p s e u d o 咖 a s叭i n o l o n es i g n a l ) 301. 第一章 前言 1 . 1 . 6双因子调节系统 铜绿假单抱菌能够迅速适应环境的各种变化而生存下来， 这种适应能力主要来 源于是细菌编码多种双因子调节系统 ( t ， o-c o . p one nt reg ulato ry s y s t 朗) 。这些 系统一般包括s e n s o r k i n a s e ( 绝大部分为h i s t i d i n e k i n a s e ) 和r e s p o n s e r e g u l a t o r 两种因子。 环境中一种或几种信号激活细菌的激酶分子，导致该分子发生自身磷酸 化，然后将磷酸集团转移到对应的调节因子上，磷酸化的调节因子处于激活状态， 启 动相 应基因的 表达， 来 适应环 境的 变化151。 目 前在铜绿 假单抱菌中 ， 已 经发 现90 余种双因子调控系统， 在各种细菌中 名列第一i t 川 气 1 . 17鞭毛 铜绿假单抱菌端生单个鞭毛，为细菌在液体介质中的游动提供动力。 鞭毛由大 约20种蛋白 质组成，而鞭毛的组装及调控等过程还需要另外30多种蛋白参加。简单 地讲，鞭毛是一个能够旋转的结构，基体部分存在类似马达的动力结构，使鞭毛旋 转起到 类似螺旋桨的 作用阶3 3 。 鞭毛由 三部分组成， 丝状结构、 钩形结构和基体结 构。基体结构为鞭毛组装所必需，丝状结构由f l i c 单体蛋白聚合组成， 这一过程需 要帽子蛋白 f lid 协助完成。有意思的是，许多结构蛋白与hl 型分泌系统的相应蛋 白 具 有 高 度 同 源 性 134 。 1 . 1 . s i v 型菌毛 ( t v p ei vp i l i ，t f p ) 铜绿假单抱菌能够合成iv型菌毛，iv型菌毛为直径6 7 二杆状结构，位于铜绿 假单抱菌的两端。主要功能为使细菌在固体表面移动，称为颤动，该过程不需要鞭 毛的存在，通过菌毛结构蛋白的聚合和解聚合完成。真核细胞表面t f p 受体推测为 多糖结构。 通过iv型菌毛的吸附作用， 与上皮细胞结合135 。 iv型菌毛的合成涉及多种基因，它们根据功能分成4 组，转录调节基因，包 括刀 j l 从刀 月从厂 艺 瓜 又a l 勃和2 ， m等基因; 类趋化基因， 包括刀 z1吞 -l、 勿 别 和 如刀 第一章 前言 等基因: 结构基因如 p l 别一 护弘 1/-i琳i t 物八 几 油 群 等 基因; 菌毛功能必需基 因如p 刀用p z1尹 。 菌毛主要由单体蛋白 p i la聚合而成，当然可能存在少量其它蛋白如p il卜x 、 pi1e 和pimu等。 pila蛋白的 n 端疏水部分， 在铜绿假单抱菌的不同 菌株中高度同 源， 被认为位于菌毛结构内部。具有双活性的酶p i ld (xc 妞) ，同时在h型分泌系统和 i v 型菌毛的形成中发挥作用， 即酶切p r e p i l i n 转化形成p i l i n ， 并且对p i l i n 进行卜 甲基化修饰. p i lb蛋白同样参与菌毛的组装，它具有结合核昔酸的结构域，可能为 组装过程提供能量.p i lc蛋白位于细胞内膜，推测与p i lb蛋白相互结合。两个蛋白 缺失的菌株没有iv型菌毛，但是p i la蛋白的表达水平没有变化，显示缺失影响菌毛 的装配过程。p i lt突变子，与大多数t fp突变子不同，存在过多的菌毛，因为菌毛 收缩的解聚合过程不能正常进行。 p i lq是系统中唯一位于细胞外膜的蛋白， 属于分 泌 蛋 白 13 7 ， 名 ， 9 胭 。 1 . 1 . gc u p a 蛋白 是 一 种吸附 分子， 属于 ch即 eron 一 us h er家 族， 最 近在铜绿 假单 抱菌中 发 现4l. 吸附分子的ch即eron一 ush er由 三个部分组成， 位于周质间隙的ch即eron分子， 参与 iv型菌毛单体蛋白分子在细胞表面的组装;ush er蛋白在外膜形成通道，允许第三 种组分菌毛单体蛋白 分子分泌到细胞外并组装。 革兰氏染色阴性细菌已经发现两类 主要c hap er。 二ush er吸附分子，粗而刚性的p 型或1 型三 口 了 了 菌毛 ( 7 nln) ，细而柔 软的 f 17 型 col 消毛 ( 2 “ 5 二) 等 42。 另外， 另 一类非菌毛的 纤细吸附 分子也 通 过c hap eron一 ush er途径组装，该类分子也被称为非典型结构，目前研究较少，很可 能由单体或寡聚体组成的非菌毛亚单位在细菌表面组装而成，如耶尔森氏菌的ph6 抗原 143。 在 pila 突 变子中 ， c u p a 操纵子基因 的 任何 突变， 导 致铜 绿假 单 抱菌附 着玻 璃或塑料表面的能力降低，表明在某些条件下，cu证参与结合非生物表面的过程， 另外有实 验发现， c u p a 突变子影响生物膜的 形成ilj。 1 . 1 . 1 0脂多糖 ( i i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l ps) 第一章 前言 lps 分子位于革兰氏染色阴性细菌外膜，与外部环境直接接触，是细菌重要的 结构组成。 l ps由 三部分组成， 疏水的 l i pid a ， 定位于细胞外膜的 磷脂层:寡 聚糖核心区c e n t r a l c o r eo l i g o s a c h a r i d er e g i o n ， 和由 重复单位组成的多聚糖 结构， 称为。 抗原困 j 。 结构研究表明， 存在两种l ps，一种为 光滑表型， 包括。 抗原; 另一种为粗糙表型， 。 抗原缺失 145 。 研究结果显示，光滑型细菌对血清不敏感， 具 有较强的致病性;而粗糙型细菌对血清敏感， 致病性较低146.4刀 。 铜绿假单抱菌的 。 抗原由两部分组成，即ab and 和bb and ，区别在于组成它们的多糖重复单位不同. 在cf患者中，感染的铜绿假单抱菌由 非粘液型转化为粘液型，l ps的组成也发生了 变 化， 0 抗 原 的 b 一 b an d 数 量 减 少 或 消 失 “ 8.4 9 浏。 l p s 的 outerc ore r egi on具有两种功能， 与角膜细胞结合， 促进铜绿假单抱 菌进入角膜细胞的内部，导致眼部的严重感染。与宿主c f t r 受体结合，被认为是 健康人群清除铜绿假单抱菌的重要步骤.l ps的l i p i d a 又被称为内毒素，能够引起 宿主大部分免疫反应，激活免疫细胞，导致败血症，甚至导致宿主死亡。另外，0 抗原免 疫 原 性很强， 刺 激宿主 产生 很强的 抗体反应 11 ， 阴。 1 . 1 . 1 1藻多糖和粘液型表型 ( a l g i n a t ea n dm u c o i dp h e n o t y p e ) 临床分离的铜绿假单抱菌具有一个重要特征，即细菌转变成粘液型表型，在cf 患者 肺部， 该转变很 可能是 变成 慢 性感染的 第 一步 【521。 与 携 带非 粘液型 铜绿假单 抱 菌的c f 患者相比，携带粘液型铜绿假单抱菌的c f 患者预后更差。 作为对特定环境的反应，铜绿假单抱菌五 2 彭基因的启动子被激活，导致藻多糖 的大量合成，alg i nate形成c apsul e 保护细菌不受免疫系统的攻击，并参与细菌附 着过程。cf患者分离的粘液型细菌，产生过量的藻多糖。其中，超过8 既的菌株是 因为抗519 口 af act or的枷ca因子发生点突变，从而激活sig ln a 因子al叫 (t) ，使藻 多 搪的 合成持 续进行153 川。 另外， 5 1 娜 因 子 r p o n 也能够促 进铜绿假单 抱菌向 粘液 型表型的 转换15 5 1 。藻多糖是乙 酞化的 二 n u r o n i ca c i d 和即l u r oni c a c i d 共聚体， 不同 菌株的乙 酞化程度不同网 。 粘液型表型并不稳定，当 在体外培养时， 许多临 床 第一章 前言 分离的菌株能够回复到非粘液型表型。 1 . 11 2铜绿假单袍菌的其它吸附分子 ( o t h e ra d h e s i o n肋 i e c u l e s ) 除了以上介绍鞭毛、iv型菌毛、cupa蛋白、l ps以及藻多糖等各种具有吸附功 能的分子， 还存在其它分子， 参与铜绿假单抱菌附着到不同细胞或固体表面的过程。 例如外膜通道oprf蛋白， 可以 作为 介导铜绿假单抱菌附 着到 肺上皮细胞的 表面isn。 铜绿假单抱菌分离菌株的多样性， 使确认在不同吸附过程中， 哪种分子发挥关键作 用很困难，例如，研究显示在建立balb/cb y j 幼鼠急性呼吸道感染实验中，iv型菌 毛具有重要作用，与没有菌毛的菌株相比，具有菌毛的细菌在实验对象中引起更多 的 肺炎、 菌血 症 和更高的 死 亡率15 81 。 但是， 不同 的 分离菌 株显示不同的 致病性， 实 验结果虽然显示iv型菌毛很重要， 但不是建立急性呼吸道感染的必需因素155 。 1 . 1 . 1 3铜绿假单袍菌的分泌系统 ( s e c r e t i o ns y s t efn: ) 革兰氏染色阴性细菌的蛋白质分泌过程需要穿过细胞内膜、周质间隙的 pe ptid ogl yc anl ay er 和 细 胞外 膜159。目 前己 经发 现 两 种系 统 能 够运 输蛋白 跨过 细 胞内膜到周质间隙，即s ec依赖系统和tat 途径。s ec依赖系统运输的蛋白通常n 端有 16 、 26从的信号肤， 包括n 端的 碱性结构域、疏水的中间区和切割位点，当跨过细胞 内膜时，信号肤从蛋白分子上切割下来。碱性和疏水区被分泌器识别。运输非折叠 蛋白需要能量，由a tp酶s e c a 提供。另外，s e c d 、s e c e 、s e c p 和s e c y 蛋白等内膜蛋 白 、 。 h 即 er on 蛋 白 s ec b 以 及 其 它 一 些 必 需 蛋白 是 该 系 统 的 组 成 成 分 哪， 10 近来发现运输折叠蛋白的系统，即双精氨酸转运系统 ( 介i n 一rgi nine t r a n s l o c a tin ， t a t ) 。 该系统识别的信号肤与s ec依赖系统相似，不同的是，n 端的 双精氨酸结构是转运所必需的。另外该途径不需要水解a tp来提供能量，运输动力 来源于州梯度【6 2 16 3 。 通过s ec依赖系统或t at途径运输的蛋白 质， 可以 保存在周质间 隙，或整合进入细胞外膜，或依靠其它分泌系统穿过细胞外膜，分泌到细胞外，例 如h型和v 型分泌系统 ( 自 动转运系统) 。 第一章 前言 h型分泌系统是功能性的复合体，至少涉及到12种蛋白，该途径运输多种明显 没有关系的蛋白 到细胞外，蛋白 为 折叠形式冈。 许多分泌到细胞外的 酶类和毒素， 如铜绿假单抱菌的弹性蛋白 酶、 e xot oxin a 和磷脂酶c 等161 1 。 有意思的是，h型分 泌系统涉及的几种蛋白质与参与iv型菌毛生物合成的几种蛋白质具有高度同源性。 如组成iv型菌毛的单体蛋白 p i l in与h型分泌系统的单体蛋白 pseud 叩i l in;另外， 少e p i l i np e p t i d a s e 能够切除信号肤和n 甲 基化p i l i n 前体。 推测p s e u d o p i l i n 组成 类似菌毛的结构，将被分泌的蛋白导入细胞外膜分泌器的通道中。铜绿假单抱菌中 同 源蛋白 x cpg(t)也能形成类似菌毛的结构165，66 汾! 。 通过v 型分泌途径运输的蛋白不需要其它蛋白的辅助作用，因为被分泌蛋白能 够介导本身穿过细胞外膜，即自 动转运.首先，被分泌蛋白c 端在细胞外膜形成通 道，接着蛋白的n 端通过该通道分泌并经过切割后进入细胞外环境中159 。 在其它分泌系统，如i h型分泌系统和工 型 (ab c 运输)分泌系统中，不经过周 质间隙，蛋白直接分泌到细胞外，也没有切割信号肤。这些过程不依赖于s ec系统， 即使分泌器的 一些结构蛋白 需要s ec途径进入周质间隙161 .6sj。 1 型分泌系统需要三种 蛋白 的参与: 细胞内 膜的 运输 a t p 酶 ( a bc，r o t e i n f o r atp 一 b i n d i n g 。 a s s e t t e ) ， 为运输提供能量，细胞外膜蛋白和膜融合蛋白，定位于内膜，并分布在周质间 隙，分泌信号存在于c 端。在铜绿假单抱菌中， 碱性蛋白酶apra通过1 型分泌系统分 泌。 iv型分泌系统是用于细胞之间运输不同的分子，例如接合转移过程中的蛋白 d n a 复合物， 或者在农杆菌中，将蛋白dna 复合体转入植物细胞内，是植物基因工程 的重要工具1591 。 第二节 1 1 . 型分泌系统 1 . 2 . 1川 型分泌系统是铜绿假单抱菌重要的致病因子 第一章 前言 对于许多革兰氏染色阴性细菌，t t ss是重要的致病因子，如志贺氏菌、沙门氏 菌、 耶尔森氏 菌、 铜绿假单抱菌、 衣原体以 及部分大肠杆菌等169，70， 通过tfss把编 码的 毒素蛋白 转运进入动物或植物细胞内 哪 1 ，引 起细胞损伤的发生。 铜绿假单抱 菌的t t ss， 在疾病发展和致病性等方面具有关键作用， 多种动物模型的研究结果显 示，ttss显著地影响感染的结果。另外，体外表达pcr y 蛋白，免疫老鼠，能够避免 铜绿假单抱菌诱导的肺部损伤。下呼吸道感染和菌血症患者发病率和死亡率的升 高，与ttss的表达成正相关性。 1 . 2 . 2川 型分泌系统编码分泌的毒素蛋白 tts s 分泌的四种蛋白，即exos，e xot ，e xoy ，和exou。前两种蛋白具有a d p 核 糖基转移酶活性，其中e xos 修饰宿主细胞ras 家族蛋白，能够导致细胞凋亡的发生: exo t 修饰c r k l 八1蛋白， 抑制细胞的分裂。 exoy具有宿主特异的腺昔酸环化酶的活 性， e xou 是急 性细胞毒素，具有脂酶的活性7l ，72 ，731。临床分离的大部分菌株编码三 种毒素蛋白e x o s 、e x o t 和e x o y ，或者含有e x ot、e x o y 和e x o u ，e x o s 与e x o u 蛋白不能 同时 存在与同 一菌株，具体原因并不清楚i7 ，75) . 对临 床菌株调查显示， 临床菌株分 为两类，根据侵染哺乳动物细胞的能力，分成侵染性和非侵染性菌株，典型的侵染 性菌 株编码e xos 蛋白 i76)，而非侵染性菌株能 够裂解细胞， 编码e xou 蛋白 17 几 . 2 . 3111 型分泌系统编码蛋白的分泌信号 通过竹55分泌的蛋白没有发现共同的结构域，但在耶尔森氏菌中，发现n 端 巧一 17两性氨基酸是毒素蛋白y 叩e 分泌所必需的。另外，还有研究认为in r n a 的结构 可能参与毒素蛋白的分泌调节17 510 . 2 . 4川 型分泌系统的调控与环境诱导信号 铜绿假单抱菌t t ss的诱导需要环境信号的存在，目 前认为有两种环境信号，一 种是与真核细胞直接接触， 另一种是低钙环境ivg.咧。 t t ss由 arac类转录调节因 子控 第一章 前言 制表 达，目 前已 经发 现四 种调节因 子， e x s a 、 e x s c 、 e x s d 和 e x s e 8 ， . 其中 e x s a 是 激 活因子， hl 型分泌系统的表达，受转录激活因子e xsa 的调节，它是dna 结合蛋白， 识别一段保守序列 ( t 刊 a 认 八 n a ) ， 位于转录起始位点上游5 1 一 5 2 b p 位置， 激活hl 型 分泌系统基因的表达，也包括已 在 别 基因本身，e xse 是负调节因子.关于调控如何进 行，有两种模型，一种为“ 塞子结构”(pl ug s t ructure) 模型，即一种或几种蛋 白 形成塞子， 从细胞内部堵住分泌器， 阻止分泌的发生; 另一种为“ 帽子结构气。 ap struct盯e) 模型，即一种或几种蛋白形成帽子结构， 在细胞外堵住分泌器的顶部， 使分泌不能发生g2 .g3 洲。当 诱导信号存在时， 帽子结构从分泌器顶部脱落，负调节 因子e xse 由细胞内分泌到细胞外，与之结合的e xsc 释放出来，结合e xsd ，从而释放 出与 e x s d 结合的 e x s a ，自 由 e x s a 启动t t s s 基因 簇的 转录18 ， 1 0 最近研究发现，另外一些基因也参与调控 hl 型分泌系统基因的表达，如腺普 酸环化酶 ( 。 砚 刀 ) 、 p s e u d o u r i d i n a s e( 。 侧) 和丙酮酸脱氢酶 ( a c 酬b ) 等s 5 那 ， 吕 刀 ， 同时hl 型分泌系统基因的表达，还受一些基因的负调节，包括肋1 1/ 字 酌 1 尸 和平衡 期 a 因子即0 5 等18 8 。 1 . 2 . 5 川 型分泌系统基因簇的结构 111型分泌系统编码于近3 o kb的基因片断， 分别属于5 个操纵子， 包括p 叩n 操 纵子 ( 含7 个基因) ， 刀 。 石 操纵子 ( 含5 个基因) ，“ 右 操纵子 ( 含4 个基因)， e 万 叨操纵子 ( 含12个 基因) ， 和pscn操纵子 ( 含8 个基因)891， 这 些基因 编码 的蛋白分别具有结构、调控和伴娘蛋白等功能。 12 . 6 川 型分泌系统编码蛋白的功能 铜绿假单抱菌hl 型分泌系统t tss 涉及多种蛋白， 分泌器至少由20种蛋白 组 成，大部分蛋白 位于细胞内 膜，分泌过程的能量由 具有a tp酶活性的p scn 蛋白 提 供， 该蛋白 位于细胞内， 并可能附着在细胞内膜上。 研究发现， ttss在内膜上的蛋 白，与鞭毛分泌和形成所需的蛋白高度同源。p 毋 沼 、 刀 毋 刃、 刀 巴 厂 犷 基因编码的蛋白， 第一章 前言 是t tss将毒素蛋白 转运到哺乳动物细胞内所必需的因子，任何一种蛋白缺失，转 运过程则不能进行。推测这三种蛋白位于分泌器的端部，与哺乳动物细胞接触时， 使毒素蛋白注入到宿主细胞内。pcry 蛋白则没有出现在宿主细胞膜上，推测 pcry 蛋白 起到识别宿主细胞膜上受体的功能18990，91.92)。 同时研究发现， 缺少p crv 蛋白， pop b 和p 叩d 仍能在细胞膜表面形成孔状， 但孔径变小193.94。 夕 夕 尸 基因编码的蛋白 是hl 型分泌系统分泌器的主要组成成分， 体外实验证实， 该蛋白能够和另外两种 ttss编码的蛋白p scg 和p sce 相互结合， 形成 1 :1 :1 的复合体，该结构的功能目 前还不清楚(95l。 刀 毋 洲 操纵子的部分基因的功能己 经被研究， 刀 毋 洲基因编码的产物 对ttss起到负调控作用， p 叩n 基因缺失后， 在非诱导条件下， t tss 也能分泌e xos 和e xo t 蛋白 190. 刀 “了 ， 夕 盯 了 ， 和刀 突变子中 ， ttss分 泌e xos 和exot蛋白 的 能力则完全丧失 阴， 目 前还不清楚造成这种变化的 具体原因， 估计可能与分泌器的 形成有关。 第三节 三因子多重药物泵出系统 1 . 3 . 1三因子多重药物泵出系统简介 革兰氏染色阴性细菌中广泛存在三因子多重药物泵出系统 ( t h ree 一 c o 口 p o nent 侧l t i d r u g e f f l u xs y s t e m ) ，属于rnd( r e s i s t anc e 一 n o d u l a t i o n 一 d i v i s i o n )家族， 细菌对抗菌素和消毒剂的耐药性、细菌内源性或后来获得的抗性，大部分是由于这 些系统的 存在阅。 铜绿假单 抱菌已 知对多 种抗菌素存在抗性98， 目 前已 经发现至少 7 个刚 d 三因子泵出系统，流x 卜晚x b -0p r m i 6 只， 00， ， 0 1 1 、从 e x c we m e x d ee o p rjl l 02)、 拢x 卜 m e x f 气 扣 r n 103 1、 m e x x 书e x y -0p 水1 1 04 ，1 0 5 ，1 峋 、 旋x j- m e x k 刁p 丽1叨 mex h we m exl 司p 动11 佣 ，i 闪 和 旋 xv书ex ， se o p r m p lo 。 其中 m ex a 谧ex b es o p r m 系 统为 组成型 表 达 110 1，1 川 ， m e xx一 晚x 卜 op r m 在 抗菌 素诱导 下 表达11 21 ， 这两 个 系统的 存在是 铜绿 假单 抱菌对多种抗菌素和杀菌剂具有抗性的主要原因。 其它系统在调节基因发生突变时 能够表达，突变经常发生在负调节因子如刀 了 、 j i 叨 和那 曰 比 【 1叨基因突变， 分别导致 m e x c-m exd ee o p r j 和h ex j we m e x k ee o p r h 大量表达。同样如果突变发生在负调节因子如 皿 已 址 矛 1 13， 14. ， 15 ，l 6 和那澎， 17. ， 18基因突变，也能够分别导致mexa we m e xb一 即 州和 第一章 前言 添x x ee m e x y 一 o p r m 的大量表达。 13 . zm e x e 一 m e x f 刃p r n 系统 在 通常的 实 验 室 培 养条件下， 在野生型 菌株的 m ex e - m e xf一 即rn系 统不 表 达11 o 510 但是仍然能 够在体外11 03. ， 19 1 或临 床标本中 12 01 ， 分离出 刀 艺 r 理 契 对多重抗菌素耐受的菌 株。刀 众乙突变子对f l uor o q u i n o l o n e s 、c h l o r a 田 p h e n i c o l 、t r i m e t h opr i m 和 ca rbap 如 .1 耐pene 。 等 抗菌素具 有耐药 性 11 03， ， ” ， 其中 对1 耐 penem 的 抗 性 是由 突 变 引 起 饰rd外膜蛋白 减少 造成的 。 03 .l2 1 ， 该蛋白 在细胞 膜形成 通道， 是 氨基 酸、 多 肤 和1 耐p en eln的 主 要 运 输通道 l 22. 1明。 对1 耐pene m 耐 受的 铜绿假 单抱菌菌株，印 厂 厌 篡 因经常缺失。 除了 将抗菌素和杀菌剂泵出并产生抗性， m exe 书exf - o p r n 系统还促进 了 对 有 机 溶 剂、 染 料、 t ri cl os an等 的 抗 性或 耐 受 性 11 24. 1 25. 1261 。 刀 众 公 突 变 子中 ， mexe一 m exf ee o p r n 系统大量表达的结果，受quor二 s ensing调控的几种致病因子表达 水平下降112 7 ， 因 此推测该系统能够将aut oinducer即 h sl泵出 细胞， 造成细胞内 h sl 浓度降 低， 从而使依赖aut oinducer的 致病性降低11 25。铜绿假单抱菌的大多数洲d 型泵出系统，受相邻的负调节因子调控。而m exe 一 mexf一 op州系统受与之相邻的正调 节因子m ext 调节，该因子属于l y s r 家族，同时在刀 式 r 企突变子中抑制oprd的表达 11 29 .l 划。 研究数据表明， m ext 对oprd的