（植物病理学专业论文）芒果畸形病病原鉴定及致病机理初步研究.pdf

过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 杨嵌锦 日期：乙，d 年乡月2 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：蜀、檐铭 日期：叫d 年月2 日 导师签名名姊砑 日期：沙细年6 冉争日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回童途塞逞窑卮澄卮! 旦当生i 旦= 生；旦三生叁盔。 论文作者签名：扬临绵 日期：b 细年6 月2 日 榷名：店哮狰 日期：沙i o 年6 月印日 摘要 芒果畸形病是芒果的主要病害。早在2 0 世纪六十年代，南非、巴西和马来西亚等 国家和地区就报道了该病是由镰刀菌引起的。我国最早在云南和四川等省区发现了芒果 畸形病，但对该病病原菌的分离、鉴定以及发病机制等方面的研究至今尚未有报道。本 研究从四川攀枝花一发病果园内采集芒果畸形病病组织，运用柯赫氏法则证实分离物 m g 6 为该病的致病菌。为明确该菌的分类地位及致病机理，利用常规形态观察和e f 1 a 延伸因子、1 3 微管蛋白及i t s 序列分析对菌株进行了鉴定，测定了芒果感染畸形病 后内源激素的含量变化，并观察和比对了芒果健感病组织的解剖形态，以期从内源激素 和组织病理学角度初步探索病原物对寄主的致病机理。 m g 6 菌株在p s a 上气生菌丝无色，不产生色素。在s n a 和c l a 上，分生孢子梗 简单分枝，复瓶梗，瓶状小梗细长，近圆柱形，( 9 9 3 3 1 ) i j i n x ( 1 3 1 5 ) 岬，有时对生 形成三叉状；小型分生孢子大多数为无隔，椭圆形或者卵形，大小( 3 1 1 0 2 ) g m x ( 1 5 2 2 ) 岬，主要以假头状产生，不产生小型分生孢子链；大型分生孢子镰刀形，3 5 分隔，典 型3 隔，顶端细胞逐渐而均匀的狭细，圆锥形，足孢不明显，大d x ( 1 8 3 8 ) g m ( 1 8 2 4 1 l a i n ，主要以以假头状产在复瓶梗上。在f u s a r i u m i d 数据库里，菌株e f 10 延伸因 子序列与e m a n g i f e r a e 同源性达9 9 6 8 。结合形态学鉴定结果，将m g 6 菌株初步鉴定 为e m a n g i f e r a eb r i t z ，w m g f i e l d & m a r a s a s 。 运用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 对芒果畸形病畸形芽与正常芽间内源激素的含量进 行了测定。结果表明：病、健组织中内源生长素( i a a ) 、玉米素核苷( z r ) 、赤霉素( g a ) 、 脱落酸( a b a ) 的含量在感病组织中分别为1 7 3 4 3 2n g r r m 、9 8 7 3 1n g m l 、3 6 2 5n g m l 、 2 2 9 5 1 2 0n g m l ，而在健康组织中则分别为5 7 1 9 9n g n m 、5 5 6 4 0n g m l 、7 0 5n g l r m 、 1 3 1 5 1 9 9r i g m e 。在感病组织中的上述激素的含量分别比在健康组织中高出3 0 3 、1 7 7 、 5 1 4 、1 7 4 倍，其中赤霉素( g a ) 浓度相差最大。 采用石蜡切片制片法观察芒果幼茎的解剖形态。结果显示：在病健组织中存在明显 差异。畸形组织皮层薄壁细胞有9 1 3 层，而对照只有4 7 层。与对照相比，畸形组织中 维管束扁长，韧皮纤维数量多，排列紧密，在形成层的区域发现许多色素沉淀，木质部 在幼茎中占的面积较大，导管分化少，孔径较小，髓部细胞排列紧密，体积较小，特别 在垂直方向上，细胞长度骤减，约为对照的1 3 。 关键词：芒果畸形病病原内源激素石蜡切片 w i n g f i e l d & m a r a s a s a ne l i s am e t h o d w a su s e dt od e t e c tt h ee n d o h o r m o n ec h a n g eb e t w e e nm a l f o r m e db u d s a n dh e a l t h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti a z r , g aa n da b aw e r e17 3 4 3 2n e g r r 儿，9 8 7 31 n e g r r l l ，3 6 2 5n e g m la n d2 2 9 51 2 0n e g n 也r e s p e c t i v e l yi nm a l f o r m e db u d sa n di nh e a l t ho n e s ， w h i c hw e r e5 71 9 9n e g m l ，5 5 6 4 0n g m l ，7 0 5n e g m la n d13151 9 9 n e g m l o b v i o u s l y , d i f f e r e n c eo fg aw a st h em o s ts i g n i f i c a n t a n a t o m i c a lm o r p h o l o g yo ft h es t e mw a so b s e r v a t i o nb yp a r a f f i ns e c t i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e r ew e r ed i f f e r e n c eb e t w e e nm a l f o r m e ds t e ma n dh e a l t h t h e r ew a s9 - 13l a y e r s o fp a r e n c h y m ac e l l si nm a l f o r m e dc o r t e x ，w h e r et h eh e a l t hw a s4 7 v a s c u l a rb u n d l e sw e r e f l a ta n dl o n gi nm a l f o r m e ds t e ma n dp h l o e mf i b e rw e r em o r ea n dc l o s e r i nc a m b i u ml a y e r , t h e r ew a sp i g m e n td e p o s i t i o n p r o p o r t i o no fx y l e mw a sl a r g e r ，l e s sd i f f e r e n t i a t i o no fv e s s e l c e l l sa n ds h o r t e ri na p e r t u r e t h ep a r e n c h y m ac e i l si nm a r r o wo ft h em a l f o r m e ds t e mw e r e o b v i o u s l yc l o s e ra n ds m a l l e rt oa b o u t3t i m e s k e yw o r d s ：m a n g om a l f o r m a t i o np a t h o g e n e n d o h o r m o n e p a r a f f i ns e c t i o n i 1 l 。l u 1 1 1 2 2 1 1 2 2 病毒理论2 1 1 2 3 瘿螨为害2 1 1 2 4 真菌侵染3 1 1 3 芒果畸形病的发病规律及致病机理3 1 1 3 1 发病规律。3 1 1 3 2 致病机制4 1 1 4 芒果畸形病的防治6 1 1 4 1 加强检疫6 1 1 4 2 农业措施6 1 1 4 3 化学药剂6 1 1 4 4 其他措施。6 1 2 镰刀菌属的研究概况。7 1 2 1 镰刀菌的分类7 1 2 1 1 形态学分类的发展。7 1 2 1 2 生物学种的研究8 1 2 1 3 系统发育学种的研究8 1 2 2 芒果畸形病病原菌e m a n g i f e r a e 的生物学特性1 0 1 2 3 芒果畸形病病原菌e m a n g i f e r a e 的遗传特性研究1 0 1 - 3 本研究目的与意义1 1 第二章芒果畸形病病原菌的分离和鉴定 2 1 材料与方法 2 1 1 供试病样 2 1 2 供试培养基 2 1 3 病原菌分离 2 1 4 菌株的纯化 2 1 5 菌株致病性测定 ，2 1 6 菌株培养性状 2 1 7 菌株形态学观察 2 1 8 病原菌分子学鉴定 2 1 8 1 主要试剂与仪器1 3 2 1 8 2 菌株d n a 的提取13 2 1 8 3 序列扩增与测序1 4 2 1 8 4 序列比对1 4 2 2 结果与分析1 4 2 2 1 病原菌分离与纯化1 4 2 2 2 菌株致病性测定15 2 2 3 培养性状观察。1 5 2 2 4 形态学观察15 2 2 5 分子鉴定1 9 2 3 讨论2 0 第三章芒果畸形组织中内源激素的测定2 2 3 1 试验材料2 2 3 2 供试试剂。2 2 3 3 激素的提取2 2 3 4 激素测定方法2 3 3 4 1e l i s a 原理2 3 3 4 2e l i s a 测定步骤2 4 3 4 3 结果计算方法。2 4 3 5 结果与分析2 5 i v 3 5 1 标准曲线的建立2 5 3 5 2 畸形组织中激素含量测定2 6 3 6 讨论2 8 第四章芒果感染畸形病组织病理学观察3 0 4 1 试验材料3 0 4 2 方法3 0 4 3 结果与分析31 4 4 讨论。一。j 3 2 第五章结论3 7 参考文献。3 8 芒果畸形病是危害芒果生产的重要病害，在世界各芒果主产国普遍发生，在巴基斯 坦，畸形病使芒果产量损失6 0 一9 0 ，墨西哥损失达到3 0 一4 0 ，在埃及，每年损 失1 4 0 0 6 万美元以上。国内芒果畸形病主要分布在云南、四川海拔较高的地区，云南 元江西北灌渠发病株率达7 5 4 ，元江县城与元谋县城都有发病记载，云南华坪县有一 果园发病株率达6 1 ，四川攀枝花市清香坪发病株率达3 4 2 。近年，据笔者调查，在 云南华坪县及四川攀枝花的某些芒果园也日趋严重，发病株率3 0 - 6 0 ，高的达9 5 。 芒果畸形病症状明显，分为枝叶畸形和花序畸形。幼苗容易出现枝叶畸形，病株失 去顶端优势，节间异常，长出大量新芽，并且膨大畸形，节间变短，叶子变细而脆，最 后干枯，这与束项病症状相j 以( k v a s ，2 0 0 8 ；k u m a r , 1 9 9 3 ) ( 图1 1 a ) 。成年树感染该病后 可继续生长，病部畸形芽干枯后会在下一生长季重新萌发。通常畸形营养枝的出现，会 导致花序畸形，其花轴变密，簇生，初生轴和次生轴变短、变粗，严重时分不清分枝层 次，更不能使花呈聚伞状排列，畸形花序呈拳头状，几乎不座果( 图1 1 b ) 。畸形花序 的直径和主轴直径显著大于正常花序，但都比正常花序的短，畸形花序主轴直径和幅度 增长快。畸形花序的两性花为7 7 ，显著少于正常花序( 的2 9 9 ) ，但雄花多于正常 花序，畸形花序通常每朵花有2 4 个子房，而正常花的两性花只有一个子房。畸形花 序的花胚9 2 7 3 退化，正常花序花胚退化率为1 2 5 。概括而言，畸形花序与正常花 序相比，主要表现为主轴增粗，变短；两性花偏少；雄花和子房数量增多；花胚退化率 加大( a r i t z ，2 0 0 2 ；p a n d e r 2 0 0 2 ；陈秀红，1 9 9 2 ) 。 图1 - 1 畸形病症状a ：畸形枝叶b ：畸形花序 f i g 1 _ 1s y m p t o m so fm a n g om a l f o r m a t i o n 1 1 2 芒果畸形病病原研究史 1 1 2 1 生理失调 由于感染畸形病的芒果病株叶子变细，与典型的缺锌症状“小叶”症相似，因此早期 把病因归结为生理因素，如矿质营养失调，土壤湿度大，c n 比不正常等。然而，1 9 5 5 年t r i p a t h i 在实验中发现畸形病病株不存在微量元素如铜、锌、硼等的缺失；缺失大量 元素的症状也没有出现在畸形病病株上。所以他指出，畸形病并不是缺素引起的。 s i n g h ( 1 9 9 1 ) 分析病、健株之间大量和微量元素的含量差异得出，病株组织中的很多元素， 特别是氮元素，都比健株含量高，而钙元素含量较低，尽管如此，他认为这种元素的含 量变化并不是畸形病的病因。后期研究表明，病健组织中的矿质元素并没有太大的差异， 注射或喷洒特定的矿质元素不能治愈畸形病( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。 1 1 2 2 病毒理论 在上世纪5 0 年代，有报道称畸形病是由病毒传播引起，他们根据畸形病与一些叶 蝉携带的病毒病症状相似，且在畸形组织中分离到任何病因生物，所以认为畸形病是由 病毒引起的，然而近年来血清学的研究和电镜扫描结果表明，病株上没有致病的病毒菌 株( k u m a r , 19 9 3 ) 。 1 1 2 3 瘿螨为害 曾有报道指出芒果瘿螨a c e r i a ( e r i o p h y e s ) m a n g i f e r a 可能是引起病害的病原生物。 理由是在病株营养枝和花序中发现这种瘿螨。后续的报道亦指出多种螨类包括肉食性螨 类与畸形病有关( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。随着病害的不断研究，研究发现病害的发生与螨类有一 定的关系，在螨类数量多的时候，发病率显著提高。g a m l i e l a t i n s k y ( 2 0 0 9 ) 等通过对转 入绿色荧光蛋白的病原菌菌株侵入过程的观察发现，病原菌分生孢子可以附着在瘿螨身 上，瘿螨可以携带病原孢子，帮助病原菌传播，并为病原菌的侵入提供侵入伤口，而并 非是引起病害的病原生物。 2 l 1 2 4 真菌侵染 1 9 6 6 年，s u m m a n w a r 首次从畸形病株成功分离出串珠镰孢胶孢变种f u s a r i u m m o n i l i f o r m ev a t s u b g l u t i n a n s ，并且用柯赫氏法则证明此菌为致病菌，推翻了在此之前所 提出的各种病因的假说。1 9 8 3 年此菌被命名为胶孢镰孢e s u b g l u t i n a n s ( w o l l e n w e b e r & r e i n k i n g ) n e l s o n , t o u s s o u n & m a r a s a s ( n e l s o n ，1 9 8 3 ) 。u s h a ( 1 9 9 7 ) 等通过扫描电镜对畸形 花序观察，发现在膨大的畸形芽基部有菌丝侵入，畸形组织经过培养，长出的真菌鉴定 为e m o n i l i f o r m ev a t s u b g l u t i n a n s ( = e s u b g l u t i n a n s ) 。19 9 9 年f r e e m a n 等利用质粒 p g p d g u s 把g u s ( d g l u c u r o n i d a s e ) 基因导入e s u b g l u t i n a n s 中获得转化子，然后以此 转化子接种到健康芒果上。结果表明，接种后的芒果出现典型的畸形症状，并且在病株 的叶原基、萼片、花梗和蜜腺中均找到带g u s 基因的转化子菌丝，接种原始e s u b g l u t i n a n s 菌株的也表现出相同的畸形症状，而对照不发病，这个实验进一步成功验证了 e s u b g l u t i n a n s 是芒果畸形病的病原菌( f r e e m a n , 1 9 9 9 ) 。2 0 0 0 年s t e e n k a m p 等对南非地区 的胶孢镰孢进行检测，基于h 3 组蛋白和b 微管蛋白基因序列发现两种不同分子特征的 镰刀菌( y o u s s e l ，2 0 0 7 ) 。2 0 0 2 年他们把此二菌株重新命名，把f r e e m a n 证明的胶孢镰孢命 名为e m a n g i f e r a eb r i t z ，w i n g f i e l da n dm a r a s a ss p n o v 。还有一个为e s t e r i l i h y p h o s u mb r i t z ， m a r a s a s & w i n g f i e l d ，s p n o v ( b d t z ，2 0 0 2 ) 。 多数研究表明e m a n g i f e r a e 是芒果畸型病的病原菌，然而在畸形组织中还检测到其 它镰刀菌种类( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。报道较多的主要是e s t e r i l i h y p h o s u m ，该菌株首次在南非的 芒果畸形病株中分离获得( b r i m ，2 0 0 2 ) ，后期，在巴西也有相同的报道( l i m 2 0 0 9 ； z h e n g ，2 0 0 2 ) 。另外，也有报道尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h l ) 也是引起芒果畸形 病的病原菌，与s u m m a n w a r 从花芽和花轴局部中分离出的胶孢镰刀菌不同，除病株的 根部外，尖孢镰刀菌可从其它大部分组织中分离至u ( b h a m a g a r , 1 9 7 7 ；n o r i e g a c a n t 6 ，1 9 9 9 ) 。 在马来西亚发现 e p r o l i f e r a t u m也与畸形病有关( b r i t z ，2 0 0 2 ； n o r i e g a - c a n t 6 ，1 9 9 9 ；z h e n g ，2 0 0 2 ) 。然而至目前为止，尚没有确切的证据表明这些镰刀菌 可以单独导致畸形病的发生，各种镰刀菌与病害的关系如何，还有待更进一步的研究。 1 1 3 芒果畸形病的发病规律及致病机理 1 1 3 1 发病规律 一直以来，芒果畸形病的流行规律尚不完全清楚。然而，有研究表明，温度是制约 病害流行的一个重要因子，当日平均温度达到2 5 ，最高温度有3 3 时，病害不发生 ( y o u s s e l ，2 0 0 3 ) 。在印度地区，北部地区就比南部发病严重，低温比高温发病率高。温度 在8 - 2 7 c ，湿度8 5 左右时，病原菌孢子密度达到最大，在干热季节，密度降低 ( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。在墨西哥，每年病害发生有三个高峰，芒果采后的1 0 1 1 月、1 月花期和 3 - 4 月，此时的病组织会一直留到采果后，作为下次循环的初侵染源 ( c h a k r a b a r t i ，1 9 8 9 ；n o r i e g a - c a n t f i ，1 9 9 9 ) 。不同的气候环境下病害的严重程度不同，不同的 芒果品种对病害的抗性也不一样，a n w a rr e t a u l ，f a j r i ，l a n g r a , s s i 3 ( a t m a a d ，2 0 0 4 ；i q b a l ，2 0 0 4 ) 这些品种都表现出中度抗性。但是不同的地域，同一品种的抗 性程度也不一样，在印度是中抗的品种，在埃及有可能就变成了感病( p l o e t z ，2 0 0 2 ) 。 畸形病不是系统侵染的病害( y o u s s e l ，2 0 0 7 ；l i m a ，2 0 0 9 ) 。同一株芒果树上可以出现畸 型和健康的枝叶；同一枝条上存在畸型和健康的花序。并且病害的传播十分慢，在发病 植株旁边的一株健康的芒果树可以保持好几年不受该病菌的侵染( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。畸型病 可能是以成年树病枝上的病原菌为初侵源的一种风传病害( g a m l i e l a t i n s k y , 2 0 0 9 ) 。在冬 季，病原菌孢子可以在土壤中存活1 8 周左右，而在夏季只有2 周时间。虽然病原菌可 以在土壤中存活，但是此病害不是典型的土传病害，带毒的土壤不能作为病害的初浸染 源( y o u s s e l ，2 0 0 7 ) 。在发病果园中，生长2 个月的果实上分离到的病菌菌落较多，而此时 的果园中病原菌分生孢子密度较大，随着病原菌分生孢子密度的降低，成熟果实上分离 到的菌落也相对较少。再者，分离到的菌落都来自于果皮，在种子和果肉上检测不到病 原菌的存在，发病植株上部比下部带菌数量多，根部很少分离到病菌 ( k u m a r , 1 9 9 3 ；y o u s s e l ，2 0 0 7 ) ，这说明了病害非种传病害。 1 1 3 2 致病机制 1 1 3 2 1 病原菌毒素与芒果苷积累 镰刀菌属产生的毒素种类很多，其中主要是玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素、串珠镰 刀菌素和伏马菌素等。单端孢霉毒素分为a 和b 两类，单端孢霉毒素a 包括t - 2 毒素、 h t - 2 毒素、新茄病镰刀菌烯醇和蛇形霉素( d a s ) ；单端孢霉毒素b 包括脱氧雪腐镰刀菌 烯醇( don ) 和雪腐镰刀菌烯醇( 彭杰，2 0 0 9 ) 。研究表明，芒果畸型病组织的形成与 病原菌的毒素分泌有一定相关性。g h o s a l ( 1 9 7 9 ) 等对畸型病的致病机理研究发现，镰刀 菌的代谢产物中，在培养基上检测出1 2 ，1 3 环氧单端孢霉素和镰刀菌酸，而在病组织中 并不发现镰刀菌酸。u s h a ( 2 0 0 0 ) 用外源壳梭孢素( f u s i c o c e i n ) 处理花芽，导致畸形花序的 产生，他认为镰刀菌毒素的释放是病害产生的关键。并且他猜测，镰刀菌中的赤霉酸与 芒果赤霉素合成前体同为内根一贝壳杉烯( e n t k a u r e n e ) 。由于镰刀菌的不断繁殖，竞争 抑制后者的合成，从而阻断了细胞的伸长。随着顶芽细胞的不断分裂而不伸长，畸型组 织随之形成( u s h a , 2 0 0 9 ) 。 芒果苷( m a n g i f e r i n ) 存在于多种植物体内，芒果叶片中芒果苷含量高，已有报道表明 其对病原菌有一定的抑制作用( 宋风平，2 0 0 9 ) 。芒果苷在病组织上的含量比健康的高，叶 芽上达到3 5 倍，花序达到1 0 倍，并且在病原茵侵染的皮层细胞中，芒果苷的含量最 高，远离皮层细胞则慢慢降低。用芒果苷( 1 0 4 m ) 处理芒果顶芽，3 个月后叶芽增生成 束，叶片变小，与畸形病症状相似。用病原菌发酵液培养的芒果枝条则出现落叶现象。 他认为芒果苷的大量积累和类胡萝卜素的分泌都与畸型病的发生有一定的关系 ( g h o s a l ，1 9 7 9 ) 。芒果苷的存在可以抑制病原菌的扩展，镰刀菌的侵入引起芒果苷在侵入 局部积累，这容易使芒果苷转化成聚合醌类物质，最后芒果出现枯死、畸型等症状。当 芒果苷转化成醌类物质后，失去对镰刀菌扩展的抑制作用。所以，镰刀菌可以在畸型病 4 组织中迅速繁殖( c h a k r a b a r t i ，19 8 9 ；s i n g h ，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 2 2 植物内源激素 i 内源激素对植物生长发育的调节 生长素是五大类植物激素中发现最早的一种，其中吲哚乙酸( i a a ) 是自然界最广泛存 在的生长素，在植物体内通过色氨酸和非色氨酸途径合成。i a a 在植物体内参加了许多 生理生化过程的调节与控制，如细胞的伸长生长、形成层的细胞分裂、维管组织的分化、 叶片和花的脱落、顶端优势、向性、生根和同化物的运输等。它促进生长有三个特点： 在低浓度下可促进生长，在高浓度时则抑制；不同器官，不同年龄细胞对i a a 的敏感性 不同；对离体器官的生长具有明显促进作用，而对整株植物往往效果不明显( 赵晓 菊，2 0 0 6 ) 。 细胞分裂素( c t k ) 是控制植物的细胞分裂和分化、侧芽形成、营养代谢、叶绿体发 育等生理过程的植物激素。由于c t k 在植物细胞内的生理作用的研究技术还存在若干 困难，以及c t k 的生理生化较复杂，所以对其分子的作用机理所知甚少，c t k 的研究 进展落后于其它激素的研究( 李玉珍，2 0 0 7 ) 。 赤霉素( g a ) 影响着高等植物生活史的各个阶段，如种子萌发，茎的伸长，花器官的 诱导和发育以及种子和果实的形成( 周明兵，2 0 0 4 ) 。美国沈庆喜指出，在小麦种子发育过程 中，a b a 和g a 是在不同时期起作用的，a b a 作用早，引起休眠，而g a 则是在后期 刺激萌发所必需( 蔡传杰，2 0 0 1 ) 。 脱落酸( a b a ) 常被称为胁迫激素，在各种逆境下，如脱水、干旱、盐胁迫、低温、 病虫害和机械创伤等环境因子，植物的内源a b a 水平都会急剧上升。a b a 可引起气孔 关闭，降低蒸腾，这是a b a 的重要生理效应之一。a b a 能够促进器官的脱落，这主要 是促进了离层的形成。a b a 还可以抑制整株植物或离体器官的生长( 赵晓菊，2 0 0 6 ) 。 气态植物激素乙烯参与高等植物的发育进程和胁迫反应的调控，这些生理过程包括 种子萌发、幼苗生长、叶片脱落、果实成熟、器官衰老、病原体反应等( 李玉珍，2 0 0 7 ) 。 许多植物逆境反应都刺激乙烯合成，乙烯也能增强许多与防御相关基因的表达。 i i 内源激素间的相互作用 不同激素生理效应有着互相促进或者互相拮抗的效果，其影响涉及到它们的合成、 运输、代谢等各个过程，植物生长发育往往是多种激素综合作用已达到平衡的结果( 赵 晓菊，2 0 0 6 ) 。如植物茎的伸长生长受多种内源激素的调控，如i a a ，g a ，b r ( 油菜素内 酯) 和乙烯等都促进茎的伸长生长( 黄颖，2 0 0 9 ；张娟，2 0 0 9 ) 。不同的激素可能通过控制不同 的过程共同促进植物茎的伸长，其中赤霉素和生长素可能起着主要的作用( 叶梅 荣，2 0 0 7 ) 。激素对植物生长发育的调控一般通过调控细胞分裂、细胞分化、细胞伸长和 细胞死亡等方式实现。不同的激素有可能通过调控相同的下游基因的表达来控制相同生 理过程。如生长素不仅可以通过调节d e l l a 蛋白的稳定性来调节根细胞的伸长，还可 以调控g a 合成，这一途径需要a u x s a a 蛋白的降解并依赖于a r f 7 的功能( 赵普 5 庆，2 0 0 4 ；熊国胜，2 0 0 9 ) 。而有时植物细胞对激素的敏感性才是激素作用的关键因素，而敏 感性的强弱取决于激素受体蛋白的数量、受体与激素的亲和性、植物反映能力等因素决 定。所以，植物生长发育的任何阶段都不可能是某一种激素单独作用，而是由多种激素 相互作用的结果。 i i i 畸形病组织中内源激素的变化 畸形症状的出现与植物内源激素的失调有十分密切的关系。上世纪8 0 年代对畸形 病激素的研究报道较多，但是各研究结果中的各激素含量变化不尽相同。与健康组织对 比，在“丛枝状”的发病部位，l a ，l 久n ( 3 - i n d o l e a c e t o n i l r i l e ) 和赤霉素类似物含量较低， 而抑制生长物质( 如a b a ) 含量则比较高( b e n i w a l ，1 9 7 9 ) 。而m i s h r a ( 1 9 8 0 ) 贝t 发现病组织中 高含量的赤霉素会导致畸形花序中雄花的大量产生。在整个畸形病的生长阶段，细胞分 裂素含量都比较高。在畸形组织中，赤霉素的含量随着季节变化而变化，2 月较低，在 3 月达到高峰，随后慢慢降低，到5 月上旬最低( b i a ，1 9 8 6 ) 。低含量的i a a 、赤霉酸和 高含量的玉米素、脱落酸、乙烯会抑制芒果苗的顶端优势，影响向性生长，导致叶芽的 不断分化生长。节间的变短是由于不正常的赤霉素含量，而叶片变小，向上微卷是由于 乙烯含量的升高( s i n g ha n dd h i l l o n ，1 9 8 9 ) 。在整个生长阶段，l 蚣较低，而玉米素、脱落 酸和乙烯都是病组织的含量比较高，而赤霉素在病株的萌芽阶段，健康植株比较高，其 他阶段则病组织较高。 1 1 4 芒果畸形病的防治 从发现芒果畸形病以来，没有找到有效的防治方法，只能在一定程度上控制病害。 1 1 4 1 加强检疫 加强检疫，严禁从病区引进苗木和接穗。目前，国内已在四川省攀枝花市和云南省 华坪县发生该病害，一旦在其他地方发现疑似病例，建议采取应对措施，防止病害扩散 蔓延。 1 1 4 2 农业措施 留在病枝上的原菌可作为再侵染的侵染源。所以及时清理果园上的病枝可以有效的 降低病害的侵染几率( k u m a r , 1 9 9 3 ；c h a k r a b a r t i ，1 9 8 9 ) 。保持田间清洁，建立无毒的苗床， 不在发病果园里育苗，不取发病果园的材料进行嫁接。 1 1 4 3 化学药剂 喷洒杀菌剂和杀螨剂是比较有效的方法，对于苯菌灵和多菌灵，都可以减轻病害的 发生。减少螨类的数量可以减少芒果的伤口，从而降低病害的侵染。 1 1 4 4 其他措施 病原菌侵染芒果的幼嫩组织( 叶芽，花芽，花序) ，这些组织中芒果苷可以在一定 程度上阻止病原菌的扩展。但是，芒果苷的积累容易转变成聚合醌类物质，而此醌类物 质对抵抗病原菌的扩展没有效果。用铜或锌的芒果苷螯合物可以防止醌类物质形成，从 而起到防病的作用并提供矿质元素( c h a k r a b a r t i ，1 9 8 9 ；g i r e e s hc h a n d ，2 0 0 2 ) 。适当的施加 6 微量元素和页面肥，有助于提高果树抗病力，并且提高果实产量。 植物生长调节剂的适当施用也可以减少发病。如喷洒n a a 推迟花芽的萌发，待花 芽萌发时遇上较高温度，发病率就会降低( k u m a r , 1 9 9 3 ) 。曼陀罗、牛瓜角和印楝中提取 的活性物质对镰刀菌有很强的抑制作用( u s h a , 2 0 0 9 ) 。 多种防治方法的综合运用可以大大提高防治效果。除了剪除病株上的畸形芽；在抽 叶时每月喷施氧氯化铜，从花芽的萌动到座果期间每两周轮流施用克菌丹、苯菌灵和代 森锰锌，还要每月喷施除螨剂；用k n 0 3 控制开花使花期一致。这些方法在墨西哥 ( n o r i e g a - c a n t 6 , 1 9 9 9 ) 被证明可以提高芒果产量、减轻病害发生。当然，培育抗病品种是 防病的理想途径。 1 2 镰刀菌属的研究概况 1 2 1 镰刀菌的分类 1 2 1 1 形态学分类的发展 镰刀菌属为真菌中较大的一属，广泛分布于自然界中。由于该属真菌对人类的生产 活动的影响极大，所以近2 0 0 年来许多科学家不断对镰刀菌的形态、生理、致病性等多 方面进行研究。在国际上有1 0 种不同的分类系统，他们根据小孢子有无和形态特征， 厚垣孢子的形成与否和着生方式，大孢子和足细胞形态、特征来划分组。根据子座有无 和颜色，菌核的形成与否，大孢子的隔膜数、长度和宽度等特征来划分亚组、种、变种 和型。但这些特征属于不稳定性状，易受环境影响而发生变化，同一菌种在众多的培养 基上又有所变异，以致不同菌株之间在形态上发生交错，从而使这个系统变得十分复杂， 成为长期争论的焦点。不同历史阶段的植物病理学家、分类学家及遗传学家都尝试用当 时生物学的新方法和新技术研究其发生变异的原因，并试图建立符合自然界系统发育规 律的分类系统和分类鉴定方法( 林清洪，1 9 9 6 ) 。 1 9 3 5 年w o l l e n w e b e r & r e i n k i n g 提出了镰刀菌属的一个较完整的分类系统，这成为 镰刀菌属分类研究的基础。它系统的总结了此前镰刀茵分类的研究成果，整理了当时十 分混乱的镰刀菌分类状态，所采用的分类依据和分组都为以后的镰刀菌分类研究做出了 不可磨灭的贡献。它将镰刀菌划分为1 6 个组，分别是枝孢组( s p o r o t f i c h i e l l a ) 、美丽组 ( e l e g a n s ) 、马特组( m a r t i e u a ) 、腹状组( v e n t r i e o s u m ) 、直孢组( a r t h r o s p o r i e l l a ) 、粉红组 o s e u m ) 、砖红组( l a t e r i t i u m ) 、蛛丝组( a r a c h n i t e s ) 、亚微孢组( s u b m i c r o c e r a ) 、假微孢组 ( p s e u d o m i c r o c e r a ) 、真粘孢团组( e u p i o n n o t e s ) 、大孢组( m a c r o c o n i a ) 、拟穗霉组 ( s p i c a r i o i d e s ) 、李瑟组( l i s e o l a ) 、膨孢组( g i b b o s u m ) 、色变组( d i s c o l o r ) ( 邢安，2 0 0 9 ) 。 其它的分类系统包括s n y d e r & h a n s e n 系统( 1 9 4 0 1 9 4 5 ) 、r a i l l o 系统( 1 9 5 0 ) 、b i l a y 系统( ( 1 9 5 0 ) 、g o r d o n 系统( 1 9 5 2 ) 、b o o t h 系统( 1 9 7 1 ) 、j o f i e 系统( 1 9 7 4 1 9 8 6 ) 、g e r l a c h & n i r e n b e r g 系统( 1 9 8 2 ) 、n e l s o ne ta 1 系统( 1 9 8 3 ) 。现为人们经常采用的主要有两大分类系 7 统：一个是g e r l a c h & n i r e n b e r g ( 1 9 8 2 ) 的欧洲分类系统，另一个是n e l s o ne ta 1 ( 1 9 8 3 ) 澳 大利亚美国南非的分类系统。其中后者综合了现有各分类系统的优点，采用的培养基 除p d a 之外主要采用了f i s h e r 等采用的康乃馨叶片琼脂( c a m a t i o nl e a fa g a r ，c l a ) 。这 种培养基的最大优点是能促进分生孢子梗和分生孢子的大量产生，其形态又和自然情况 下产生的极相似，种的概念简明扼要，很适合种的鉴定。系统共描述了1 2 个组、4 6 个 种、其中常见种3 0 个，其分种依据是：( 1 ) 大孢子的性状，顶细胞和基细胞的特征；( 2 ) 小孢子有无、性状和着生方式；( 3 ) 分生孢子梗的特征和瓶梗类型；( 4 ) 厚垣孢子有无和 着生位置；( 5 ) 菌落的生长速度和颜色等。 经过分类系统的发展，对于镰刀菌形态学方面的分类依据，专家们有较为一致的观 点和做法：( 1 ) 尽快将分离到的培养物转移至营养贫乏的培养基s n a 或c l a 上，冷冻干 燥或液氮超低温冻结保藏，以保持菌株的野生型状态。( 2 ) 用p d a 培养基培养观察其显 微特征，诸如颜色、气味、生长速度、气生菌丝等。( 3 ) 用s n a 或c l a 培养基培养观察 其显微特征。镰刀菌种的鉴定所依据的显微特征主要包括大、小型分生孢子的产生情况 及其形态；厚垣孢子的有无和产生方式；气生菌丝及分生孢子座上分生孢子的着生方式 ( 假头状假链状) ；产孢细胞的类型( 单瓶梗或复瓶梗) ；粘孢团、菌核的产生情况等( 张向 民，2 0 0 5 ) 。 1 2 1 2 生物学种的研究 生物学种的概念是要求同一种类的成员彼此之间可以进行有性交配。上世纪七十年 代以后l e s l i e 等相继研究并证明，在镰刀菌属形态学的同一个种中存在着不同的交配群， 到目前为止在g i b b e r e l l af u j i k u r o i 交配群复合群中存在着至少9 个以上的交配群。这些 交配群是在交配群内可以进行有性交配，并且交配后能够产生具有繁殖能力的后代的类 群，实际上符合生物学种的概念。在同一交配群内的菌株杂交可育，不同交配群杂交不 可育，证明了交配群作为镰刀菌生物学种是可靠的( 李丹，2 0 0 8 ) 。 1 2 1 3 系统发育学种的研究 系统发育学种是根据d n a 序列建立系统发育树，在一定水平上处于同一单元进化 群的群体被认为是同一种。随着分子技术的成熟，1 5 年来在该属研究过程中用系统发育 学澄清了该属许多种间、种内系统发育关系、有性型一无性型的联系等( 赵志慧，2 0 0 8 ) 。 该属系统学研究的主要基因位点包括：p t u b u l i n ；m t s s ur d n a ；2 8 sr d n a ；i t s ；e f 1 a ； i g s 等，常用的有i t s 和e f 1 a 。有时可通过单基因位点的最大简约性分析就可以说明 一些问题；有时对某些问题的探讨则需要对多个基因位点统一进行分析。 r d n a 也称为核糖体d n a ，它是指r r n a 基因群中的一个重要单位，包括5 8 s 、1 8 s 和2 8 sr r n a 的基因及其相邻的间隔区、非转录区，在有些生物中还包括5 sr r n a 基因。 r d n a 基因序列在进化过程中保守性强、序列拷贝数多，而且存在可变区和高变区，因 此，r d n a 基因序列分析一直是真菌分类学家们关注的热点( 缪承杜等，2 0 0 7 ) 。对大多真 核生物而言，r d n a ( 5 - - 3 ) 包括非转录区( n t s ) 、