（分析化学专业论文）电化学和光谱法研究药物及农药与dna的作用机理.pdf

摘要 本沦义共分为五个部分，主要对近年来小分了与d n a 相互作刚的研究现状进行了综述，并分别 研究了几种药物和农药小分子与d n a 的相互作i l j ，同叫尝试将化学计量学方法_ l j 十解析实验得到的 二维吸收光谱数据和三维同步荧光数据，讨沦了方法的原理和实际j 、v 刚，并探讨了化学训量学存复杂 的生物化学体系中( 探针一d n a - 小分子体系) 实现同刊解析多组分甲衡浓度和纯光谱的町行性。 第一部分：本节首先对d n a 的化学和生物学性质进行了简介，然后依次对小分子与d n a 相互 作h 的研究力法、研究对象和作用方式展开了评述。在分子水平上深入研究小分予化合物与d n a 的 键台与巩别机理能够帮助人们理解d n a 与小分予的作i f - | j 原理，为寻找、筛选及研制开发药效高，抗 癌或抗菌谱广及毒副作用小的新药提供丰寓的理眨依扼。最后逊展挈了小分_ r 与d n a 作埘研究的发 展趋势，将开发新的探针、各种仪器方法的联用及化学训量学方法的，i f 入作为木研究的蕈点。 第二部分：本节在实验条件接近人体生理环境的p h7 4 的t r i s h c i 缓冲液中，分别采用电化学 方法、紫外光者法及荧光光谱法并利用中性红作电化学探针研究了核黄素和小牛胸腺d n a 的相互作 州，几种方法的结果( 随着d n a 浓度逐渐增加，核黄素的峰电流减小，峰位正移：紫外光潜产生减 色效、i ；荧光产生狞灭以及梭黄索和叶1 肚红竞争与d n a 相互作川) 鄙灰明两各能发1 # 嵌拙；，j 台：多 种汁算方法得到两者作用的2 合位点数为1 ，结合常数达到】0s ml 。本休系l jh j 赴列孩黄岽电化学诱 导损伤d n a 的机理进行了推测。 弟= 部分：水节同h j 应崩紫外光谱法、电化学力法和同步荧光光谱法并通过染利中一廿：红作为光凿 探针研究j 栎精- 铜配合物和d n a 的相互作用，结果表明栎精铜配合物能够在中陛条件f 嵌插在 d n a 的双螺旋结构中。同州使_ l l = | 了交替最小二乘算法( a i 。s ) 柬解析中性红d n a 一( 栎精锕) 体系的二 维紫外光滑数据，通过i 算分辨得到了不同浓度栎精一铜配合物和中性红一d n a 体系中的中性红发生竞 争作用时，栎精铜配合物、中性自及中性红d n a 在甲衡时各自的浓度变化趋势，进一步证史r 栎精 铜配合物和中性红与d n af l i r t j 时具有相同的作用方式和作用位点，因此栎精。铜配合物可以将中性 红d n a 体系中的中性红置换出来。 第叫部分：本节t 作主要j 圳h 分厂光谱研究了= 种氟哇诺酮类药物与d n a 作j 目的模式和强度。 实验表明在t r i s h c i 缓冲液中，即使不存在金属离子或者a t p 作为中介，d n a 仍然能够和诺氟沙星、 氧氟沙星、洛美沙星及= 种沙星的混合物相互作用并形成不发射荧光的基念络含物。木义同时采川t 甲 行冈了算法解析沙星混合物与d n a 作j = i 的三绅同步荧光光暗数据，所得结果再与沙星单独与d n a 作用所得到的结果进行比较，发现当沙星混合药物与d n a 作刚时，三种沙星与d n a 的作川强度和 沙星药物单独使川于的作川强度相比会发，上变化，本文的研究就能够帮助我们在临i 爪上更合卫地使川 单一药物和复合药物以取得最显著的药效。 第五部分：本肖1 二作分别从荧光光普、紫外吸收光谱、电化学伏安峰、d n a 的热变性行为及盐 效府方面研究了氨基甲酸酯类农药异丙威及其水觯产物与d n a 的相互作用。异丙威和d n a 作用后 形成加合物的过程可阻从其吸收光谱和荧光光涪的变化反映出来，同时d n a 的熔解温度实验和盐效 应也说明异两威能够和d n a 发生嵌插作州并对其造成损伤。而异丙威水斛产物和d n a 作川以后， 会导致电化学峰正移以及电流减小，也表明两者之间存在相互作用。本工作还分别计算了两者和d n a 作用的结合伟数，发现水觯产物和d n a 的结合常数比异丙威的要人一个数量级，即其更易和d n a 形成加合物而损伤d n a 。另外，木义还对农药及其代酣产物的毒性机理进行了简单的叙述。 关键词：电化学：光谱法：小分子：d n a ：化学计量学 s t u d yo rt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fd r u ga n dp e s t i c i d ew i t hd n ab ye l e c t r o c h e m i s t r y a n ds p e c t r o m e t r yt e c h n i q u e s a b s i r a e t t h i st h e s i si sd i v i d e di n t of b c ep a r t st h er e s e a r c ha c t l l a l i t yo fi n t e r a c t i n nb c l w e e ns i n a i lm o l e c u l e sw i t h d n ai nr e c e n ty e a r si l a sb e e nr e v i e w e da n dt i l eb i n d i n gm o d e sb e t w e e ns o l n ec l i n i c a ld r u g sa n dp e s t i c i d e w i t hd n aw e r es t u d i e dt h ea p p l i c a t i o no fc h e m o m e t r i c si na n a l y s i so ft w o d i m e n s i o n a la n dt h r e e d i m e n s i n n a | d a t aa l s ul m db e e nd e r e k ) p o da n dt h ea p p l i c a t i o nu t c , h e l l l o n l e t r i e si nc o m p l i c a t e db i o c h e m i c a l s y s t e m ( p r c b e - d n a - s m a l lm o l e c u l a r ) c a l ls o l v es o m ep r o b l e m sa n do b t a i nt h ee q u i l i b r i m nc o n c e n t r a t i o na n d p u r es p e c t r ao f e a c hc o m p o n e n t i np a r to n e ，t h ec h e m i c a la n db i o l o 画c a ic h a r a c t e r so fd n aw e r ei n t r o d u c e ds i m p l yf i r s t ，t h e nt h er e s e a r c h m e t h o d s r e s e a r c ho b j e c t sa n db i n d i n gm o d e so fi n t e r a c t i o nb e t w e e ns i n a i lm o l e c u l e sa l q dd n aw e r e r e v i e w e di nt u r l lsd n ai st h eb a s i cg e n e t i cm a t e r i a lo fa llo r g a n i s m sa n dt h em a i nt a r g e to fs o m ed r u g si n t i l eo l g a n i s m ，a n ds t u d yo ui th a sb e c o m ea l li n p o n t a n tr e s e a r d lf i e l do fl i f es c i e n c e a l o n gw i t hm o r e a r e n t i o r h a sb e e ng i v e no nt h er e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i n nb e t w e e nd n aa n ds u l a ln m l e c u l e s t h e m e c h a n i s mso ft i l ea c t i o no fs o m ed r u g sa n do r i g i n so fs o h ed i s e a s e sh a v eg e n e r a l l yb e e nu n d e r s t o o d m o r e o v e r t i l ei m , c s t i g a t i n nb u s e d0 1 1d n ai n t e l - a c f i o n sw i t hs m a l lm o l e c u l a lc o m p o u n d sa l s oh a sg r e a t s i g n i f i c a n c et od e s i g nn e wd n a t a r g e t e dd r u g sa n dt os e r e e ut h e s ed r u g si nv j n o a tl a s gt i l ed e v e l o p m e n t c r e n dw a sf i r e c a s t e da n de x p l o i t i n gn e wp r o b e s ，u s i n gv a r i o u st e c h n i q u e ss i m u m n e o u s l ya n dt i l ei j s eo f c h e m o m e t r i c sw e r ec h o s e na st h ee m p h a s 【so f t h i st h e s i s i n p a r tt w o ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nr i b o f l a v i n ( v b s ) a n dd n aw a ss t u d i e db yu s i n gc y c l i cv o i t a m m e t r y ， d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ，u l t r a v m e ts p e c t r o p h o t o m e t o , a n df l u o r e s c e n c es p e c i f o m e t r yn e u t r a lr e d a l s ow a su s e da se l e c t r o c h e m i c a lp r o b ei nt h i sa r t i c l e t h er e s u l t so ft h e s em e t h o d sr t i l ep e a kc n r r c u to f r i b o f i a v i nd e c l e a s e da n dl h ep e a kp o t e n t i a ls h i f t e dp o s i t i v e l y ，t h eu v s p e c s u mp r o d u c e dh y p o c h r o m i ce f f e c t , t i l ef l u o r e s c e n c ee fr i b o f l a v i nh a dq u e n c h i n ge f f e c tw i t hi n c r e a s i n gt h ec o n c e t l t r a t i n no fd n aa n dt h e c o m p e t i t i o nb e t w e e nr i b o f l a v i na n dn e u ”a lr e di n t e r a c t e dm t hd n a lc a l lc o m et oac o n c l u s i o n ：r i b o f l a v i n b i n d st oc a l ft h y m u sd n am a i n l yb yi n t e r c a l a t i o ni n t b r m a t i o ns u c ha si n t r i l ls i cb i n d i n gc o n s t a n ta n d b i n d i n gn u m b e r so fr i b o f l a v i np e rd n aa l s ow a so b t a i n e d1 1 1 r o u g h1 1 m l l e r o u sc a l c u l a t i o n ss i m u l t a n e o u s l y , t h er e s u l ti sa p p r o x i m a t em i db e l i e v a b l e i l lp a r t t h r e e ，t b e i n t e r a c t i o n o f q u e r c e t i n - c u 2 + c o m p l e x w i t hc a l f t b y m u s d n a w a s i n v e s t i g a t e d w i t h n e u t r a l r e d 州r ) a sap r o b ea n du s i n g u v - v i s i h l es p e v t r o p h o t o m e t r y , c y c l i cv o l t a m m e t r ya n d s y n c h r o n o u s 1 _ l f l o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yt h e s er i l e m o d sa r 。s h n p l e ，c o n v e n i e n ta l l dr e l i a b l e + f h er e s u l t ss h o w e d 班a t b o 由 q u e r c e t i n c n 抖c o m p l e x a n d n r m o l e c u l ec a n j n t e r c a l a t e i n t o t h ed o u b l eh e l i x l a y e ro f d n a a n d t h e r e w a s a c m n p e t i t i o nb e t w e e n t b e s e t w o i n t e r a c t i o i l s 。i n f o r m a t i o ns u c ha s i n t r i n s i cb i n d i n gc o n s t a n t 皤。= i8 2 x 1 0 5 m0 1 a n dr a t i o ( 埘k 曲o f b i n d i n ge o n s t a l l t sf o rt h er e d u c e da n do x i d i z e df o r m so f ab o u n ds p e c i e sa n dj n t e r a c t i o n m o d ew a so b t a i n e d f u r t h e r m o r e ，f lc h e m o m e t r i c sa p p r o a c h ，a l t e r n a t i v el e a s ts q u a r e s ( a l ，s ) a l g o r i t h m ，w a s u s e dt or e s o l v et h em e a s u r e dc o m p l e x 批。一w a ya r r a ya b s o r p t i o n s p e c t r a ld a t aa n dt h ee q u i l i b t i u m c o n c e n t r a t i o ”p r o f i l e so fe a c hc o m p o n e a ti nt 1 1 er e a c t i o na sw e l lf l st h ee o f e s p o n d i n gp u r es p e c t r aw e r e o b t a i n e d 。t h ea l sa n a l y s i ss h o w e dt h a ti l a ei u t e r c a l a t i o ao fq u e r c e t m c u “c o m p l e xm o l e c u l ei a t ed n a p r o c e e d sb ye x c h a n g i n gw i t hn rp r o b e a n dc a nb ea t t r i b u t e dt ot w op a r a l l e lr e a c t i o n s i i i no 删f o t i t 。m t e r a c t i o u sb e t w e e nt h r e ef l u o q u i n o l o n e sa n dn u c l e i ca c i d sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e db vm e a n so f a b s t n p t i o na 瞄f l u o r e s c e n c e 弧ee x p e r i m e n t a ld a t as b o v , , e d t h e tf i u o q u i n o i o n e gi n c l u d l n gn o r f l o x a e i n ( n f x ) ， o f l o x a c i n ( o f x ) a n dl o m e f l o k a e i n ( l m f x ) c a nb i n dt od n ai n d i v i d u a l l ya n de l lt h ep r o c e s s e sb e l o n g e dt o s t a t i c q u e n c h i n gp r o c e s s a tt h e s a l l e t i m e ，t h es e q u e n c e o fi n t e r a c t i o n i n t e n s i t yo ft h e s et h r e e f l u o r o q u i n o l o n e sw a st h 乱l m f x n f x o f xf m l h e r m o r e , l h ep a r a f a ca l g o r i t h mw a sa p p l i e d 协 i n v e s t i g a t e t h eb i n d i n gi n t e r a c t i o nb e t w e e nm i x t u r e o ft h e s et h r e e f l u e q u i n o l o n e sa n dd n a a n dt o u n d e r s t a n dt h e i rs t a t e sa te q u i l i b r i u m 1 t mr e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nt h e s et h r e ef l u o q u i n o l o n e sw e r em i x e d a n du s e dt ob i n dt od n a ，t h e i ri n d 押i d u a li n t e r n c t i o ni n t e n s i 竹w o u l dc h a n g e ，w h i e hw i l lh e l pi i st ou s et h e s e d r a g si nc l i n i cc o r r e c t l y i np a r tg c e ，t h ep o t e n t i a ld a m a g eo fi s o p r o c a r ba l l d 讯h y d r o l y s i sp r o d u c tt oc a l ft h y m u sd n aw a ss t u d i e d b y u s i n gf l u o r e s c e n c e ，u va b s o r p t i o us p e e t r o s c a p y ，e l e c l r o e h e m i e a lt e c h n i q u e ，e x p e r i m e n to ft h e r m a l d e n a t u r a t i o na r i d s a l te f f e c te x p e r i m e a tr e s p e c t i v e l y a l lt h er e s u l t ss h o w e dt h a th o t hi s o p r o c a r ba n dj t s h d r d y s i sp r o d u c tc o u l db i n dt dc a l f t h y m u sd n a 机i n t e m a h t i o na n dp r o d u c ea d d u e t sw i t hd n at oi n d n c e g o n em u t a t i o na n dd a m a g eh e a l t ho fh u m a nb e i n g st h ei n t r i n s i cb i n d h t gc o ns t a n ta l s ow s so b t d i n e dt h a t r e v e a l e dt h eh y d r o l y s i sp r o d u c tb i n dt od n ae a s i l yt h a t l s o p r o c a r b1 i ra d d i t i o n t h et o x i c i t yu l e c h a n i mo f p e s t i c i d e sa n d t h e i rp r o d u c to f m e t a b o l i s ma l s oh a v e b e e n n a r r a t e d i n t h i s p a r t k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t t y ；s p e c t r o m e t d ；s m a l lm o l e c u l e ；d n a ；e h e m o n l e t r i a s i i l a p p l i c a n t ：s h a nd u s u p e r v i s e db yp r o eg o n g n i a nn i 。附件二 独创性声明 y 9 2 8 1 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我 i j 簖知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夯舻字日期：刎s d a7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌厶堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保管并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌友堂可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：栅 导师签名： 签字日期_ 2 n 年月j 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 争罱 签字r 期没矿铲占月和 电话： 邮编： 1 引言 第一部分小分子与d n a 相互作用的研究现状 除了少数r n a 病毒，d n a 几乎是所有生命遗传信息的携带者，具有储存和传递信息的功能。 d n a 分子携带的遗传信息，一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息；另一类是关于基因选择表达的信 息。因此，d n a 是构成生物体遗传功能、维持其生命的各种机能正常运行的基本单元，如果它在结 构上稍有变动、差错、缺失或增多，就可能导致遗传性状的改变或各种疾病的出现。同时，由于 d n a 在基因芯片和基因计算机、超微信息、d n a 疫苗等方面也潜在广阔的应用前景，所以d n a 的 研究已经成为生物化学、遗传学、分子生物学和细胞生物学等生命科学研究领域中的热点，其覆盖 面之广、进展之迅速，远超出其他领域的研究。分析化学作为化学学科的重要领域之，拥有多种 分析方法，这为它与生物学领域的交叉提供了强有力的手段，所以用分析化学方法来研究生命现象 具有许多优势。而某些小分子由于具有独特的光谱学或反应特性，己被发现可以作为d n a 结构探 针、d n a 传感器的杂交指示剂、d n a 分子光开关及抗癌化疗药剂等【】”。这些小分子物质与d n a 的 作用，将影i j i i , j 至0d n a 的生理和物理化学性质及改变d n a 的转译和复制，破坏其模板作用，使d n a 链断裂，进而影响基凶调控和表达功能，冈此研究小分子与d n a 的键合与识别机理将有助于人们对 d n a 与小分子相互作崩方式的了解，并且对一些致癌化合物的致癌机理，抗癌药物的药理和毒性， 以及新型药物的设计合成方面者j j 有很大的意义，它已经成为近十多年来国际上比较活跃的研究领域 之一。 2 d n a 的化学及生物学简介 d n a 是由大量脱氧核苷酸组成的极长的大分子，其中的戊糖核磷酸基起结构作用，而碱基则携 带遗传信息。天然d n a 分子中所含核苷酸主要有d a m p 、d g m p 、d c m p 和d t m p 四种，它们按一 定规律排列。来自不同细胞和病毒的d n a 分予，尽管在核苷酸的比例和顺序及d n a 的分子量方面 有明显差异，但其碱基有以下几点共同规律：( 1 ) 腺嘌呤与胸腺嘧啶的克分了含量相等，即a t - i ： ( 2 ) 鸟嘌呤与胞嘧啶( 包括5 - 甲基胞嘧啶) 的克分子含量相等，即g c - ；( 3 ) 总嘌呤碱与总嘧啶克分 子含量相等，即a + g t + c - 1 。 d n a 的一级结构( 即核苷酸的排列顺序) 不仅蕴藏了遗传信息，而且还决定了d n a 的二级结构 和空间结构。反之，一级结构中得到的许多信息又要用二级结构和空问结构来进行解释，还有大量 的遗传特征需要从二级结构和空间结构上加以发掘8 。 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k ”根据x 一射线衍射图谱和化学分析的结果提出d n a 是双螺旋结构的设 想，现在已经得到证实，这不仅促进了现代生物学的诞生，而且使我们跨入了在分予水平上深入探 诩d n a 生物功能的新时代。该结构可以描述如下：d n a 分子是由两条互补的、右手螺旋状的多核 苷酸构成。这两条链以逆平行方向围着同一个中心轴盘旋，形成一股双螺旋结构。所谓互补，即两 条链通过氢键使腺嘌呤a 与胸腺嘧啶t ，鸟嘌呤g 与胞嘧啶c 相互配对( 图1 ) 。这样，条链上的 碱基顺序决定于另一条链上的碱基顺序，这在复制过程中具有十分重要的意义。双螺旋d n a 存在多 种构型，一般分为a 、b 和z 型”) ，它们的结构有明显不同。表1 列出了a 、b 和z 型双螺旋 d n a 的各项结构参数。 d n a 采取哪一种构象，很大程度上取决于外部环境条件，如盐的种类和离子强度等。天然d n a 多以b 型构象存在。对于b 型双螺旋d n a 来说，每个碱基对中的两个碱基环都处于同平面，后 者与螺旋的中心轴相垂直。每一圈双螺旋包含】0 对碱基，而碱基间的“堆积”距离为34 a ，所以螺 旋每上升一圈的高度为3 4a 。由强极性的主链( 磷酸糖链) 骨架组成的双螺旋直径为2 0a ，碱基处于 中间( 图2 ) m 。 a ：鸟嘌畸 c ：胞嘧啶 o - - - 一n h 2 。、r 删吧咧一 、 嘲。0 ”丫、 a ：腺嘌峙t 胸腺嘧啶 加，鞭至釜面“掣渊 序c ，n 一1 掣：竺。! 删一“n a c c h 3 h _ c 、hh 、n 7 。、n 7 。、矿、n 7 。、】 “ 6 图1 d n a 的碱基配对 外形 每对碱基之间距离 螺旋宜径 螺旋方向 糖营键构型 内匝螺旋碱基对数目 螺距 碱基对与中心轴的倾角 大沟 小沟 图2 d n a 双螺旋结构模式图 表1 a 、b 和z 型d n a 的结构比较 螺旋类型 b 粗短 02 3 n m 25 5 r a n 右千 反式 1 1 24 6 n m 1 9 。 狭、很深 根宽浅 细长 03 8 n m l8 4 n m 左手 c ，丁反式，g 顺式 1 2 45 6 n m 甲坦 很狭深 d n a 双螺旋进一步扭曲就形成三级结构，其中包括双链中可能有的扭结和超螺旋，多重螺旋以 及分子内单链形成的环，以超螺旋最为常见。 若将d n a 的稀盐溶液加热到8 0 。c 左右，d n a 的双螺旋结构即发生破坏，两条链被拆开，形成 无规则线团，并引起一系列理化性质的改变，如2 6 0 n m 处吸光度的升高和粘度降低等。同时d n a 也失去生物活性。这种现象称为d n a 的变性j “。促使d n a 变性的因素除加热外，还有强酸、强碱 和尿素的作用等。变性的程度取决于氢键破坏的多少。d n a 的变性是可逆的，当两条d n a 链受热 被拆开后，一旦温度下降，它们能再聚合成双螺旋，这种现象称为d n a 的复性5 圳j 。 3 研究现状 3 1 研究方法 由于小分子化合物与d n a 作用方式的多样性，以及小分子种类的广泛性和d n a 结构的复杂 性，需要人们借助一些先进的分析测试手段，再与原有的常规生化分析技术相结合，建立一系列快 速、灵敏、有效的方法体系。小分子与d n a 相互作用的研究方法通常有色潜法、探针技术法、电化 学分析方法、显微光度法、免疫分析法、分光光度法、荧光光度法和传感器技术等，其中又以分光 光度法和荧光光度法的使用最为常见。 3 1 i 光谱法 2 中帅【堇手式。(雪 深撕鸯吣粥栏扇mr魁犹 某些小分子通过某种机制，与d n a 生物大分子作用生成复合物，从而改变自身或对方的光谱性 质。通过对新的光谱特性参数的测定和研究，不但可以对生物大分子做一般定量分析，而且可以推 断出它们在不同环境中的构象及其结构与功能之间的关系。 具有双螺旋结构的d n a 分子由于含有芳香性碱基和磷酸生色基团，使其在2 6 0 r i m 左右有一强吸 收峰。冈为d n a 的碱基是许多小分子与之结合的位点，两者作用后对d n a 或小分子的吸收光谱都会 引起变化。紫外可见吸收光谱法是研究小分子与d n a 十i ：i 互作用机理的最常用和最方便的方法。小分 子与d n a 作用后，会导致吸收潜带变宽、红移或蓝移及减色或增色效应。尤其是嵌插方式结合的分 子，变化会更大，不仅粘度增大，而且熔点升高。我们刚以通过光谱测量，得到表观稳定常数和结 合位点数。刘杰等【1 7 i 就利用紫外光谱法研究了卟啉化合物与小牛胸腺d n a 的相互作用。结果发现两 者作用后，卟啉化合物吸收带出现了明显的减色和红移，进一步研究表明，不同类型的卟啉化合物 与小牛胸腺d n a 产生了不同的结合方式。另外，在光照作用“f ，有些分子会切断d n a 的键，该现象 也 以使用紫外光谱法进行监测。一般说来，吸光度减小、吸收带红移以及等吸收点的形成是小分 子- 与d n a 发生嵌插作用的光谱标志【1 。 荧光分析法灵敏度高、选择性好、操作方便，在生物分析中有非常广泛的应用。有些小分子与 d n a 结合后，会使原本荧光很弱的分子荧光强度增大很多。有些小分子与d n a 结合后，又会使荧 光猝灭。利用这些现象，可以用荧光光谱法进行分析，获得热力学和动力学的数据。如用e b 作荧光 探针，可以研究b e n d r i m e r s 的特异性结合位点_ 】。另外，在应川荧光探针时，还可以用s c a t c h a l d 方 程来判定结合方式四】。小分予与d n a 作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与d n a 发生嵌 插作用的又一标准。通常情况下，如果是嵌插作用，小分子的转动受阻，荧光偏振会变大，而非嵌 插作用不会引起荧光偏振的增大8 ”。 线二色光谱采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，可快速区分非共价结合f 静电结合、 沟内结合和嵌插结合) 的3 种作用形式，并且能得到作用的准确方向信息和动力学数据姐1 。圆二色光 谱则以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研 究提供了很多信息，是研究有机化合物和生物大分子的构型、构象和三维空间结构强有力的丁具。 另外，对于些本身没有圆二色谱信号，但与d n a 结合后能产生诱导圆二色谱信号的分子，可以获 得一定的有关其结构的问接信息。 拉曼光谱是一种富含信息的分析技术，它与共振和表面增强现象相结合使其逐渐成为种极具 前途的生物医学分析技术。共振拉曼光谱可以通过共振激发d n a 色圃来研究其与小分子作_ l | _ j 的精确 位置。与此同时，共振拉曼光谱的缺色性口j 以作为区分嵌插和沟内结合的依据。文献1 2 3 , 2 4 1 利用共振 拉曼光谱分别研究了抗癌药物安吖啶( a l n s a c r i n e ) 、阿霉素( a d r i a m y c i n ) 及1 1 一脱氧洋红霉索( 1 1 d e o x y c a n n i n o m y c i n ) 与d n a 之间的相互作用，表明它们均以嵌插方式和d n a 结合。 近年来，傅立叶变换红外光谱法在小分子与d n a 相互作用的研究中也得到了广泛应用。当核酸 分子与其配体形成了超分予体系时，相互作用部位或基团伸缩振动会受到影响，从而红外光谱吸收 峰频率发生一系列的位移，根据位移可对超分子体系间选择性作用力作半定量研究。z h o u 等1 通过 红外等光谱手段对聚二烯丙基二甲基氧化铵( p d d a ) 与d n a 之间的作用方式进行了研究。红外光潜 研究结果表明，p d d a 与d n a 分予中的碱基和磷酸基团篾生了作硝，j | d n a j p d d a 复合物的形成导 致d n a 二级结构构象发生了变化。n e a u l t 等口叫也利用傅立叶变换红外光潜技术研究了叶绿酸f c h l n l 及叶绿素( c h l ) 与d n a 之间的相互作用，并对c h l n d n a 、c h l d n a 以及金属卟啉d n a 3 十) j l l 台 物的性质进行了比较。 3 1 2 电化学方法 过去。对于小分子和d n a 相互作用的研究，电化学方法由于在一定程度上受分子电活性的限制 而比较少引起人们的注意。然而，近年来人们发现电化学方法也是有力的手段之一。它不仅可以有 3 效地补充和进一步佐证光物理性质测量的结果，而且可以在某些方面发挥独特的作用，可以为d n a 与其它各类小分子物质的相互作用机理研究提供依据。由于小分子与d n a 相互作用后，分子的特征 氧化还原电流会明显降低，峰电位也有移动，所以它对静电结合方式的分子，可获得其他方法得不 到的信息，而且可靠、经济。电化学方法中使用最多的是循环伏安法( c v ) 。计量年等 2 7 , 2 8 1 采用c v 比较了一系列钴( i i i ) 多吡啶配合物与d n a 之间的相互作用。方禹之等【2 9 1 采用c v 研究了具有电化学 活性的米托蒽醌与经杂交得到的双链d n a 修饰层的插入作用。t h o m a s b m 】则在i t o 电极上用c v 对 金属配合物与d n a 的结合和氧化以及电子转移的动力学过程进行了报道。 其次，微分脉冲伏安等方法也被广泛采用。林仲华等【3 l 】采用阳离子聚合物固定长链d n a ，并用 循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了【 c o ( p h e n ) 3 】3 + ( p h e n = 1 ，1 0 一邻菲咯啉) 和硫堇在杂交前后于长链 d n a 上的电化学行为。陈洪渊等 3 2 ”】贝0 采用循环伏安法、微分脉冲伏安法研究了c u ( p h e n ) 2 2 + 和 c u ( b p y ) 2 2 + 与6 一巯基嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷及d n a 之间的相互作用。 电致化学发光( e c l ) 的现象很早就被发现【3 t ，但运用e c l 进行检测分析的文献报道直至8 0 年代 初才出现【36 1 ，将e c l 物质用于核酸标记和检测是近年来发展起来的新技术。目前，在实际应用中的 e c l 体系比较重视联吡啶钌r u ( b p y ) 3 2 + 。r u ( b p y ) 3 2 + 用作核酸标记物首先是通过r u ( b p y ) 3 2 + 与n 一羟基琥 珀酰亚胺( n h s ) 或亚磷酰胺化合物反应，生成能与核酸探针结合的r u ( b p y ) 3 2 + n h s 酯或r u ( b p y ) 3 2 + 亚 磷酸酰胺化合物。r u ( b p y ) ? n h s 酯与核酸的氨基反应可生成r u ( b p y ) 3 2 + 标记的核酸探针，标记结合率 可达8 0 以上。；采n r u ( b p y ) 3 2 + 亚磷酰胺标记还能在d n a 合成仪上合成探针的同时自动进行标记，标 记有效率 9 0 ，无需分离提纯【37 1 。 将电化学方法应用于研究溶液中d n a 与小分子物质之间的相互作用，其缺点是背景信号干扰 强。因此，基于d n a 修饰电极发展起来的表面电化学方法将会有助于此类问题的解决1 3 8 , 3 9 1 。近年 来，d n a 电化学传感器的研究已经成为热点 4 0 - 4 2 ，它是由固定了单链d n a ( s s d n a ) 的电极和电化学 活性识别元素构成。首先将s s d n a 片段固定到电极表面，在适当的温度、p h 值和离子强度条件下， 固定在电极上的s s d n a 与杂交缓冲溶液中的靶基因会发生选择性杂交反应。严格控制杂交条件，如 果样品中的d n a 片段出现不互补的碱基，在电极表面就不能形成双链杂交分子( d s d n a ) 。如果样品 中含有完全互补的d n a 片段，则在电极表面就形成d s d n a ，从而导致电极表面结构的变化，然后通 过检测电极表面的活性识别元素的电信号，达到识别和测定靶基因的目的。w a n g 等【4 3 峙艮道了高灵敏 测定肼类化合物的d n a 电化学传感器。基于检测d n a 自身的阳极响应在与肼类化合物作用前后的变 化来对肼类化合物进行监测，无需指示剂和标记，能在极短时间内测定不同的肼类化合物。同时， 他们还发展了用于有毒芳胺化合物测定的d n a 电化学传感器【4 4 1 ，为芳胺化合物的环境监测以及阐明 污染物质与d n a 的嵌插作用机理，提供了非常有用的研究方法。作为一门新兴的涉及生物化学、电 化学、医学及电子学等领域的交叉学科，与荧光标记 4 5 1 、发光标记【4 6 l 等常见标记技术相比，电化学 传感技术具有选择性好、灵敏度高、测试费用低和易于微型化等优点，同时又有不破坏测试体系， 不受生物样品中浑浊、溶血等情况干扰等优点。随着对d n a 结构和功能研究的不断深入，d n a 电化 学传感器已经在基因识别分析、生物工程研究、药物合成设计、d n a 损伤检测、环境检测和转基因 食品监控等各个方面起到非常重要的作用【47 1 。此外，它还具有实时、在线检测，活体分析等优点， 这些优点必然有利于其应用范围的扩展。 3 1 3 其他方法 核磁共振( n m r i ) 分析法可以定量确定结合位点的化学变化，并且对长距离驰豫效应更为准确。 它通过化学位移、偶合常数、n o e 值及弛豫时间等参数的变化得到d n a 分子结构及其动态变化方 面的数据。随着技术的进步，n m r 法中出现了cn m r 、1 5 nn m r 等新技术， 它们通常能够获得 比1 hn m r 更加丰富的结构信息。z h o u 等4 剐的n m r 研究结果就证明抗癌药物放射菌素d 以嵌插方 式与寡聚核苷酸 d ( a t c g a t ) h 作用。 4 随着软电离技术的发展，质谱法在小分子与d n a 加合物的结构分析中发挥着独特的作用 4 9 - 5 2 1 ， 该方法能灵敏快速地获得小分子与d n a 作用的结合区域、结合位点数、亲和力以及非共价键结合方 式等信息。 微量热法在测定过程中不会干扰生物体系的正常活动与代谢，对反应体系的光谱性质、电化学 性质及溶剂性质等无任何限制条件，因而有很多独到之处【5