（预防兽医学专业论文）猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究.pdf

本论文受到下述项目资助： 农业公益性行业科研专项经费项目一 猪场疫病综合控制技术研究与示范( n y h y z x 0 7 0 3 4 ) 法国m e r i a l 公司合作项目一圆环病毒2 型致病机理 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授丸彬 学位论文咯 如需保密，解密时间年 月 日 是否保密 f 弋。 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生幽：嘭敞 帆砂l 。年b 月 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密 的论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：l ，呼钆导师签名：俅参 签名日期：年月 日 签名日期： 功fp 年多月z 夕日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 1 2p c v 2 的免疫抑制机理：。7 1 3 蛋白质组学研究技术及其应用7 1 3 12 d e m s 分析差异蛋白质组方法7 1 3 2 双向凝胶电泳结合质谱分析的蛋白质组学研究8 1 3 3蛋白质组学研究的其他技术8 1 3 3 1 酵母双杂交系统9 1 3 3 2 表面等离子共振技术( s p r ) 9 1 3 42 d e m s 在病原研究中的应用1 0 1 3 4 1 2 d e m s 在细菌中的应用10 1 3 4 22 d e m s 在寄生虫中的应用1 0 1 3 4 32 - d e m s 在病毒中的应用11 第2 章研究目的和意义1 3 第3 章材料与方法1 4 3 1 材料。1 4 3 1 1病毒、细胞1 4 3 1 2主要试剂1 4 3 1 3 主要仪器1 4 3 1 4 主要缓冲液1 4 3 2 方法15 3 2 1 细胞培养、病毒感染及蛋白样品的制备1 5 3 2 2 1 p c v 2 病毒感染3 d 4 2 1 细胞及i f a 检测1 5 3 2 2 2 病毒感染及蛋白样品制备1 5 3 2 2 蛋白定量1 6 3 2 3 双向凝胶电泳分析1 6 3 2 3 1第一向等电聚焦1 6 2 0 1 0 届硕士学位论文 3 2 6m a l d i t o f t o f 质谱方法鉴定变化的点以及数据库搜索2 0 第4 章结果与分析。2 2 4 1 结果2 2 4 1 1p c v 2 病毒感染3 d 4 2 1 细胞及i f a 检测2 2 4 1 2 蛋白定量结果2 2 4 1 3p c v 2 感染3 d 4 2 1 细胞的双向电泳结果2 2 4 1 4 差异表达蛋白分析2 4 4 1 5 质谱鉴定差异表达蛋白2 6 4 1 6 差异表达蛋白的分类3 2 4 1 6 1 功能分类3 2 4 1 6 2 亚细胞分类3 3 第5 章讨论3 4 5 1 细胞骨架蛋白的表达在p c v 2 感染的p a m 细胞中发生变化3 4 5 2 热应激蛋白3 4 5 3 细胞大分子生物合成相关蛋白3 6 5 4p c v 2 感染对p a m 细胞中泛素蛋白酶体途径的调控3 7 5 5 干扰宿主的r n a 加工和能量代谢3 8 5 6 其他重要的蛋白3 8 第6 章结论4 0 参考文献。4 1 致谢。5 0 i i 8 9 9 9 0 o 1 1 1 1 2 2 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究 摘要 猪圆环病毒2 型( p o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2 ，p c v 2 ) 感染主要引起断奶仔猪多 系统衰竭综合症，还可引发肺炎，同时对猪的免疫系统产生影响，能诱导仔猪的 免疫抑制。而猪肺泡巨噬细胞( p o r c i n ea l v e o l a rm a c r o p h a g e ，p a m ) 不仅是猪圆 环病毒2 型的靶细胞，而且是一种重要的免疫细胞，具有抗原递呈、产生细胞因 子、吞噬外来病原微生物的功能。因此，研究p c v 2 与猪肺泡巨噬细胞的互作以 及p c v 2 感染p a m 后的蛋白质组水平的变化，将有助于阐明p c v 2 的致病机理。 本研究以猪肺泡巨噬细胞3 d 4 2 1 细胞系为模型，通过对感染p c v 2w h 株 3 d 4 2 1 细胞的比较蛋白质组学研究，试图从细胞和蛋白质水平探讨猪圆环病毒2 型的致病机理。 应用双向凝胶电泳结合质谱鉴定的方法，对p c v 2 感染的p a m 细胞差异蛋白 进行分析。数据分析显示，在p c v 2 感染p a m 后的不同时间点，共有5 8 个差异表 达蛋白被发现，主要的差异表达蛋白出现在p a m 感染后2 4 4 8 h 。经 m a l d i t o f t o f 质谱分析，共成功的鉴定出3 2 个差异表达蛋白，包括1 4 个上调 表达蛋白和1 8 个下调表达蛋白。其中，p c v 2 感染p a m 后2 4 h 上调蛋白有：醛脱氢 酶9 a 1 、前m r n a ) j h 工因子1 9 、微丝相关蛋白，下调蛋白有：多聚腺苷酸结合蛋 白、磷脂结合蛋白、含有e f h 结构域的蛋白d 2 、蛋白酶体激活复合物亚型1 、蛋 白酶体1 3 亚基、热休克蛋白1 3 1 ；p c v 2 感染p a m 后4 8 h 上调蛋白有：t _ 复合多肽1 、 分子伴 吕e r p 和t a p a s i n - - 聚体、谷氨酰胺酶、q 烯醇化酶、线粒体鸟氨酸氨基转 移酶、t a r d n a 结合蛋白、中间丝相关蛋白、酸性核蛋白体磷蛋白p 0 、微管蛋白、 真核细胞起始因子5 a 、c l i c 蛋8 4 ，下调蛋白有：微丝相关蛋白、增殖细胞核抗 原、中间丝相关蛋白、前m r n a 剪接因子、天冬氨酸氨基转移酶、精氨酸酶、磷 脂结合蛋白；p c v 2 感染p a m 后9 6 h 下调蛋白有：微丝相关蛋白t r o p o m y o s i n 3 、 1 4 3 3 蛋白。这些差异蛋白主要涉及细胞骨架蛋白，生物大分子合成相关蛋白， 能量代谢、应激蛋白，泛素蛋白酶体途径，信号转导和基因调控相关蛋白等。 本研究通过蛋白质水平的动态变化，为进一步探索猪圆环病毒感染的致病机 理，提供了丰富的理论基础。 关键词：猪圆环病毒2 型；比较蛋白质组；双向凝胶电泳；致病机理 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t p o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2 ( p c v 2 ) i st h ep r i m a r yc a u s a t i v ea g e n to fp o s t w e a n i n g m u l t i s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m e ( p m w s ) a n dp o r c i n ep n e u m o n i a , w h i c hc a nd a m a g e i m m u n es y s t e ma n di n d u c ei m m u n o s u p p r e s s i o ni np i g l e t s p o r c i n e a l v e o l a r m a c r o p h a g e ( p a m ) i sb o t ha nc r i t i c a lt a r g e tc e l lo fp c v 2a n da ni m p o r t a n ti m m u n e c e l l ，w h i c hf u n c t i o n si na n t i g e n p r e s e n t i n g ，p r o d u c i n gc y t o k i n e sa n dp h a g o c y t o s i n g f o r e i g nm i c r o o r g a n i s m s i no r d e rt oe x p l o r et h ep o s s i b l ep a t h o g e n e t i cm e c h a n i s m s i n v o l v i n gt h ep r o g r e s s i o no fp m w s ，t h ee f f e c t s o fp c v 2w hs t r a i ni n f e c t i o no n 3 d 4 21f u n c t i o n sa tt h ec e l l u l a rl e v e lh a sb e e ns t u d i e db yc o m p a r a t i v ep r o t e o m i c s a n a l y s i st op r o b ep o t e n t i a lc e l l u l a rf a c t o r si n v o l v e dd i r e c t l y o ri n d i r e c t l yi nv i r a l i n f e c t i o n t oc h a r a c t e r i z et h ec e l l u l a rr e s p o n s et op c v 2i n f e c t i o n ，t h ed i f f e r e n t i a lp r o t e o m e s o fp o r c i n ea l v e o l a rm a c r o p h a g e s ，w i t ha n dw i t h o u tp c v 2i n f e c t i o n ，w e r ea n a l y z e da t d i f f e r e n tt i m ep o i n t sw i t ht w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - d e ) f o l l o w e db y m a l d i t o f t o fi d e n t i f i c a t i o n at o t a lo f5 8d i f f e r e n t i a lp r o t e i n sw e r ef o u n di n p c v 2 一i n f e c t e dp a m sa n dc o m p a r a t i v ea n a l y s i so fm u l t i p l e2 - d eg e l sr e v e a l e dt h a t t h e m a j o r i t y o fp r o t e i ne x p r e s s i o nc h a n g e sa p p e a r e da t2 4 - 4 8 ha f t e r p c v 2 i n f e c t i o n m a s ss p e c t r o m e t r yi d e n t i f i e d3 2 a l t e r e dc e l l u l a r p r o t e i n s ，i n c l u d i n g 1 4 u p r e g u l a t e dp r o t e i n sa n d18d o w n r e g u l a t e dp r o t e i n s2 4 9 6ha f t e ri n f e c t i o n t h e u p r e g u l a t e dp r o t e i n sp r e s e n ti n2 4 hp i oa r ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e9 a 1 ，b e t a - a c t i n p r e m r n ap r o c e s s i n gf a c t o r19 ，a n dt h ed o w n - r e g u l a t e dp r o t e i n sp r e s e n ti n2 4 h p i oa r ep o l y ( a ) b i n d i n gp r o t e i n ，a n n e x i na 5 ，e f - h a n dd o m a i n - c o n t a i n i n gp r o t e i nd 2 ， p r o t e a s o m e a c t i v a t o rc o m p l e xs u b u n i t l ，p r o t e a s o m es u b u n i t ，h e a ts h o c kp r o t e i n b e t a - 1 t h eu p r e g u l a t e dp r o t e i n so c c u ri n4 8 hp o ia r et - c o m p l e xp r o t e i n1s u b u n i t ， t a p a s i n e r p 5 7h e t e r o d i m e r , g l u t a m i n a s e ，q - e n o l a s e ，m i t o c h o n d r i a l o r n i t h i n e 2 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究 a m i n o t r a n s f e r a s e ，t a r d n a b i n d i n gp r o t e i n ，c y t o s k e l e t a l 19 ，a c i d i c r i b o s o m a l p h o s p h o p r o t e i np 0 ，b e t a - t u b u l i n ，e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o n i n i t i a t o nf a c t o r5 a ，c h l o r i d e i n t r a c e l l u l a rc h a n n e l p r o t e i n 4 ，a n dt h ed o w n r e g u l a t e dp r o t e i n s 4 8 h p i o a r e b e t a - a c t i n ，p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ，c y t o s k e l e t a l 19 ，p r e - m r n a s p l i c i n g f a c t o r , a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ，a r g i n a s e ，a n n e x i n ，a n n e x i n 1 t h e d o w n r e g u l a t e dp r o t e i n s9 6 hp i oa r et r o p o m y o s i na n d14 3 3p r o t e i n ( a l s oc a l l e d s t r a t i f i n ) a l lo ft h e s ep r o t e i n si n v o l v e s i n c y t o s k e l e t o np r o t e i n s ，s t r e s sr e s p o n s e p r o t e i n s ，m a c r o m o l e c u l a rb i o s y n t h e s i s a s s o c i a t e dp r o t e i n s ，s i g n a lt r a n s d u c t i o np r o t e i n s ，e n e r g ym e t a b o l i s m a s s o c i a t e dp r o t e i n s ，u b i q u i t i np r o t e a s o m ep a t h w a ya s s o c i a t e d p r o t e i n sa n dg e n er e g u l a t i o na s s o c i a t e dp r o t e i n s t h i sw o r ke f f e c t i v e l yp r o v i d e su s e f u ld y n a m i cp r o t e i n - r e l a t e di n f o r m a t i o nt o f a c i l i t a t ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o no ft h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s mo fp c v 2i n f e c t i o na n d p a t h o g e n e s i s k e y w o r d s ：p o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2 ；d i f f e r e n t i a lp r o t e o m e ；2 - d e ；p a t h o g e n e s i s 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 d e a p s c h a p s d t t i a a e d l a i e f i p g p a m b i s p a g e p m s f s d s o r f s p c v m a l d i t o f m s m s k b k d a m i 矾a p i p m f 1 m s m o i t c i d 5 0 0 d 缩略词( a b b r e v i a t i o n ) t w o d i m e n t i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s a m m o n i u mp e r s u l f a t e 3 - ( 3 一c h o l a m i d o p r o p y l ) d i m e t h y l a m m o n i o - 1 - p r o p a n e s u l f o n a t e d i t h i o t h r e i t o l i o d o r a c e t a m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d i s o e l e c t r i cf o c u s i n g i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t p o r c i n ea l v e o l a rm a c r o p h a g e s n ，n - m e t h y l e n e b i s 一( a c r y l a m i d e ) p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h e n y l m e n t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e o p e nr e a d i n gf r a m e s p o r c i n ec i r c o v i r u s m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e - o f - f l i g h tt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y k i l o b a s e k i l o d a l t o n m e s s e n g e r r i b o n u c l e i ca c i d i s o e l e c t r i cp o i n t p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e m u l t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n 5 0 t i s s u ec u l t u r ei n f e c t i v ed o s e o p t i c a ld e n s i t y 4 双向凝胶电泳 过硫酸胺 3 环乙胺1 丙磺酸 二硫苏糖醇 碘乙酰胺 乙二胺四乙酸 等电聚焦 固相p h 梯度 猪肺泡巨噬细胞 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶电泳 苯甲基磺酰氟 十二烷基硫酸钠 开放阅读框 猪圆环病毒 基质辅助激光解吸飞 行时间串联质谱 千碱基 千道尔顿 信使核糖核苷酸 等电点 肽质量指纹谱 三羟甲基氨基甲烷 感染复数 组织培养半数感染量 光密度 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究 第1 章文献综述 1 1 猪圆环病毒2 型研究进展 1 1 1历史背景 1 9 7 4 年德国学者t i s c h e r 首次从p k l5 细胞系( a t c c c c l 31 ) 中分离到一 种小的病毒，人们当时认为这种“圆形小颗粒 是一种细胞污染物而没有给与足 够的关注( t i s c h e rle ta 1 ，1 9 7 4 ) 。直到8 年后，t i s c h e r 等才再次证实，这种圆形 小颗粒其实是一种新的病毒，而且在p k 1 5 细胞系中感染非常普遍，对猪并没有 致病性，并将其命名为p c v ( t i s c h e rle ta 1 ，1 9 8 2 ) 。1 9 9 7 年，c l a r k 等从患有猪断 奶后多系统衰竭综合征( p m w s ) 的猪群中发现一个p c v 的变异株，将其命名为猪 圆环病毒2 型( p c v 2 ) ，p c v 2 具有致病性( c l a r keg e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。目前，该病 在世界范围内广泛流行，对养猪业造成了严重的经济损失，己成为严重影响养猪 业发展的传染病之一。 猪2 型圆环病毒引发的相关疾病( p o r c i n ec i r c o v i r u sd i s e a s e ，p c v d ) 除断奶 仔猪多系统衰竭综合征( p m w s ) 外，还包括猪的皮炎与肾病综合征( p d n s ) ( m o l n a re ta 1 ，2 0 0 2 ；e l b e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) 、猪的繁殖障碍( l a d e k j a e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 、猪 的呼吸道疾病，统称为呼吸道疾病综合征( p r d c ) 、增生性坏死性肺炎( p n p ) 和先天性震颤( c t ) ( s t e v e n s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 等，这些疾病的发生给养猪业带来了 严重的经济损失。 1 1 2p c v 2 分类 p c v 2 能感染脊椎动物，是一种环状单链的d n a 分子，基因组约2 0 0 0 n t s 。 圆环病毒共有两个属，圆环病毒属和环旋病毒属( m c n u l t ye ta 1 ，2 0 0 0 ) ，属于圆 环病毒属的成员除了猪圆环病毒l 型( m a n k e r t ze ta 1 1 9 9 7 ) 和猪圆环病毒2 型 ( h a m e le ta 1 ，1 9 9 8 ) 外，还包括喙羽病病毒( b e a ka n df e a t h e rd i s e a s ev i r u s ) ( b a s s a m ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 、金丝雀圆环病毒( c a n a r yc i r c o v i r u s ) ( p h e n i xe ta 1 ，2 0 0 1 ) 、 鸽圆环病毒( c o l u m b i de i r c o v i r u s ) ( m a n k e r t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 、鹅圆环病毒( g o o s ec i r c 0 2 v i r u s ) ( t o d de ta 1 ，2 0 0 1 ) 及牛圆环病毒( b o v i n ec i r c o v i r u s ) 。该属成员均具有典型的 双义链环状基因组结构。然而环旋病毒属的唯一成员鸡贫血病病毒( c h i c k e n a n a e m i av i r u s ) ( k a t oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 基因组结构却截然不同。除p c v l 外，其他圆环 病毒感染均能影响机体的免疫系统。同属圆环病毒科的病毒还有香蕉蔟顶病毒 ( b a n a n ab u n c h yt o pn a n o v i r u s ，b b t v ) 、地三叶草侏儒病毒( s u b t e r r a n e a nc l o v e r s t u n t i v i m s ，s c s v ) 等。 华中农业大学2 0 1 0 届硕：t 学位论文 1 1 3p c v 2 的分子生物学特性及主要编码蛋白 圆环病毒属所有成员均具有非常紧凑的基因组结构：一个基因间隔区隔开两 个首尾相连的开放阅读框隔开。这两个开放阅读框分别是r e p 基因和c a p 基因。 r e p 基因负责编码复制相关的蛋白，而c a p 基因编码衣壳蛋白。 r e p 基因位于病毒基因组的负义链，编码r e p 蛋白，在所有圆环病毒中高度 保守( m a n k e r t ze ta 1 ，1 9 9 8 a ) ，系统进化分析表明，圆环病毒的r e p 蛋白可能来源 于香蕉蔟顶病毒编码的r e p 蛋白与小r n a 病毒编码的r n a 结合蛋白之间的重 组( g i b b se ta 1 ，1 9 9 9 ) 或者是来源于原核生物的螺旋酶( n i s h i g a w ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 r e p 基因可转录产生两个共线性的转录本r e p 和r e p ，全长的r e p 蛋白由3 1 2 a a 组成，r e p 蛋白是r e p 蛋白的剪接体，由1 6 8 a a 组成( m a n k e r t z e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 c a p 蛋白由2 3 4 a a 组成，定位于细胞核，c a p 蛋白又称为衣壳蛋白，具有 免疫原性，为p c v 2 的主要保护性抗原位点，其中6 9 位8 3 位和1 1 7 位1 3 1 位氨基酸编码的蛋白能产生p c v 2 型特异性抗血清。o r f 3 编码的蛋白对于感染 p c v 2 个体的免疫抑制具有重要作用。 o r f 3 作为一种新发现的蛋白，对于病毒的复制不是必须的，但能诱导细胞 凋亡，在p c v 2 的致病性方面发挥重要作用。 l i u 等将o r f 3 起始密码子突变后的p c v 2 突变株接种b a l b c 小鼠，从而 研究o r f 3 蛋白对小鼠的致病性，结果表明，感染突变株的小鼠抗体水平升高， c d 8 + 、c d 4 + 、c d 4 + c d 8 + 各亚群细胞比例降低不明显，血清中病毒载量降低，组 织中抗原和核酸减少，o r f 3 基因缺失毒株比野生毒株对小鼠的淋巴器官致病性 显著降低( l i ae t a l ，2 0 0 6 ) 。这一结果表明，o r f 3 蛋白在p c v 2 的致病型中起到 重要作用。l i u 等通过进一步研究发现，p c v 2 的o r f 3 蛋白通过激活c a s p a s e 8 和c a s p a s e 3 途径诱导猪肾细胞p k 一1 5 的凋亡( l i ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。l i u 等从p k - 1 5 细胞中分离鉴定出o r f 3 蛋白的2 个受体蛋白：猪的p 5 3 i n d u c e d r i n g h 2 ( p p i r h 2 ) 和e 3 泛素连接酶( e 3u b i q u i t i nl i g a s e ) 。在转染o r f 3 基因的p k - 1 5 细胞中检测 到p 5 3 蛋白表达量上调，并通过p 5 3 蛋白第4 6 位丝氨酸s e r 磷酸化，从而诱导 细胞凋亡( l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ) 。2 0 0 9 年，x j m e n g 等通过o r f 3 基因缺失毒株在 猪体内试验表明：o r f 3 对p c v 2 的复制不是必需的，这与l i uj 结论一致，但 他质疑了缺失株具有降低的致病性的说法，并指出l i u 关于o r f 3 诱导细胞凋亡 的说法有待进一步的验证( x j m e n ge ta 1 ，2 0 0 9 ) 。同年，l i u 等研究发现，p c v 2 感染可以激活j n k 和p 3 8 m a p k 信号通路，p c v 2 的复制依赖于j n k p 3 8 m a p k 下游信号分子c j u n 和a t f 2 的磷酸化。对j n k l 2 和p 3 8 激酶的有效抑制，可 以阻断p c v 2m r n a 的转录、蛋白的合成以及病毒粒子的释放，阻断p c v 2 诱导 的c a s p a s e 3 凋亡通路( l i u e ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 6 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究 1 2 p c v 2 的免疫抑制机理 p c v 2 引起免疫抑制的致病机理主要表现在：1 ) 诱导淋巴细胞凋亡。p m w s 猪的独特病变和基本疾病特征即淋巴细胞减少、淋巴组织巨噬细胞侵润。p c v 2 可引起淋巴结中淋巴细胞的严重缺失，可能是细胞增殖受到抑制和细胞凋亡的结 果，这可能是p c v 2 感染引起仔猪免疫抑制的重要机理之一。2 ) 引起抗原递呈 通路受阻。m a n d r i o l i 等发现p c v 2 感染导致机体m h c i 和m h c i i 的异常表达及 其功能抑制，不能使t 细胞活化，细胞长期处于失活状态，免疫功能受到抑制。 3 ) 干扰细胞因子的作用。p c v 2 可通过部分细胞因子的上调和下调作用而影响 机体的免疫反应，从而使机体的免疫功能受损( d a r w i c he ta 1 ，2 0 0 3 a ，b ) 。p c v 2 可诱导单核细胞产生i l 1 0 ，i l 一1 0 通过抑制外周血淋巴细胞( p b m c s ) 产生 i l 1 2 ，从而起到免疫抑制的作用。此外，其他病毒诱导p b m c s 合成a 、丫干 扰素的能力也会因为p c v 2 感染而受到抑制。研究表明，p c v 2 可使猪天然干 扰素分泌细胞( n a t u r a li n t e r f e r o np r o d u c i n gc e l l s ，n i p c s ) 分泌干扰素的能力下降， 从而逃避宿主的天然免疫。另外，p c v 2 感染引起的t h l 细胞增殖受到抑制是导 致机体免疫抑制又一重要因素。 p c v 2 致病及免疫抑制的机理还没完全明了，同时p c v 2 造成机体免疫抑 制对其它疾病发生的促进作用机制说法也不尽一致。因此，p c v 2 致病机理及免 疫抑制机制的研究仍是这一领域今后研究的重点之一。 1 3 蛋白质组学研究技术及其应用 1 3 1 蛋白质组学的概念 1 9 9 4 年澳大利亚的w i l k i n s 和w i l l i a m s 首先提出了蛋白质组( p r o t e o m e ) 的概 念，即在一定条件下由一个特定细胞或生物体产生的所有蛋白质。对一个细胞的 蛋白质进行全面分析可获得一个综合的观点：在建立和维持一个正常运行的生物 系统的过程中，蛋白质是如何相互作用和协调作战的。由于蛋白质表达随机体生 理状态的改变而改变，细胞内的蛋白质组应该是动态的。 随着蛋白质组的提出，蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 也孕育产生。蛋白质组学是 研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，它 对基因组所表达的全部蛋白质的分析。现阶段，蛋白质组学研究的内容包括对各 种蛋白质的序列、结构、丰度、定位、修饰及相互作用和生化功能的分析。通过 对不同时间和空间上特定蛋白质组群进行研究，在蛋白质的水平上探索其运作模 式、功能机理、调节调控以及组群内的相互作用，从而为临床诊断、病理研究、 新陈代谢途径研究、药物筛选、新药开发等提供理论依据。 我们通常认为，通过基因产物在m r n a 水平上能够反映出蛋白质的表达水 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 平，但是最新研究表明，基因的转录水平与细胞中相应蛋白质的含量之间没有严 格的一致性。9 8 的疾病与蛋白质的表达有关，而基因水平的分析有时并不足以 了解疾病发生的机制。造成这一现象的主要原因有：两者表达时间上的差异、基 因表达的部位与相应蛋白执行功能的部位的差异、两者间稳定性的差异、m r n a 在转录后可生成不同的蛋白质。此外，蛋白质修饰对于蛋白质的活化、执行功能 也具有十分重要的影响。因此，研究细胞中蛋白质的表达丰度对于研究疾病的分 子机制具有非常重要的意义。另外，特定细胞的基因组资料与蛋白质组资料的相 互补充和完善也有助于疾病机制的研究及药物的开发。 1 3 2 双向凝胶电泳结合质谱分析的蛋白质组学研究 双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最广泛的蛋白质组学的研究方法。 f a r r e l l 等在1 9 7 5 年发表的，称得上是里程碑的文章中首次将该方法用于蛋白质组 学规模的研究。这种二维凝胶电泳的方法，是按照蛋白质的分子量和等电点，将 蛋白质分离成单个的蛋白质点。该方法在建立初期，未能取得良好的实验效果， 直到使用t p h 固定化胶条后，二维凝胶电泳结果才有了比较好的分辨率及重复 性。随着针对疏水性蛋白质、低丰度蛋白质的提取方法的改进和窄p h 范围胶条 的应用，二维凝胶电泳技术取得了进一步的发展。二维凝胶电泳可区分数千个蛋 白质点，同时可分离经糖基化或磷酸化修饰的蛋白质点，并且还可通过蛋白质点 的染色深浅对蛋白质进行初步定量。 基于双向凝胶电泳技术和质谱技术的蛋白质组学的研究程序为：蛋白样品制 备- 第一向等电聚焦一第二向s d s p a g e 凝胶电泳_ 凝胶染色感兴趣的蛋白 质点的挖取一胶内酶解- 质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列- 利用蛋 白质数据库确定蛋白。 近几年来，质谱测序技术获得了快速的发展并且被广泛应用。基质辅助激光 解吸电离飞行时i h ( m a l d i t o f ) 质谱可以用于蛋白质量指纹图谱分析，以达到 初步鉴定蛋白的目的。质谱测序技术是通过已知的数据库初步鉴定蛋白质的方 法，而如果想对多肽序列和蛋白质修饰进一步测定，那么就必需借助串联( t a n d e m ) 质谱。目前主要的测序方法是建立在电喷雾电离( e s i ) 技术的基础上，虽然源后 裂解技术( p s d ) 可以在一定程度上进行序列分析，但是由于e s i m s 可与h p l c 等 技术相匹配，可以解析蛋白质的各种修饰位点，如糖基化等，而成为目前蛋白测 序应用最为广泛的质谱。 1 3 3 蛋白质组学研究的其他技术 尽管二维凝胶电泳技术及质谱技术发展很快，也为蛋白质组学研究提供了一 些突破点，但由于蛋白质的复杂性、蛋白质溶解度的不同、高通量扩增蛋白质的 8 猪圆环病毒2 型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋亡j 质组学研究 缺少以及低浓度蛋白质检测方法存在瓶颈等原因，上述技术并不能解决所有问 题。因此，一些新的方法已经被开发出来用以蛋白质组学的研究，如多维色谱、 抗体显示系统、酵母双杂交系统、蛋白质芯片等方法。随着各种方法的逐渐成熟， 蛋白质组学的研究将更加深入。 1 3 3 1酵母双杂交系统 酵母双杂交系统( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ) 通过在酵母细胞内检测蛋白质问 相互作用，而实现在体外情况下研究蛋白质间相互作用。其原理是：真核生物的 转录激活因子结构上和功能上相互独立的结构域，通过两个融合蛋白来转配转录 激活因子，并通过报告基因的激活情况来检查这种装配。酵母双杂交系统是第一 个适合全面分析蛋白质相互作用的技术。将诱饵蛋白和捕获蛋白的单倍体酵母细 胞分别在微量滴定板上阵列排序，并以系统的方式两两交配，这种方式可以在一 次实验中筛选到上万个相互作用蛋白质。对酵母的蛋白质相互作用进行分析，目 前有两种方法，第一种是矩阵筛选法( m a t r i xs c r e e n i n g ) ，在该方法中表达诱饵 蛋白和捕获蛋白的酵母细胞以阵列的方式进行交配，第二种是文库筛选法 ( p o o l e dm a t r i xs c r e e n i n g ) ，这种方法中的