（微生物学专业论文）双歧杆菌高效浓缩型酸奶发酵剂制备关键技术研究.pdf

摘要 双歧杆菌作为典型的益生菌，其促进人体健康的有益作用已被公认，双歧杆菌制 品已成为面向2 1 世纪的生物工程技术产品。随着人们健康意识的提高，积极研制并 开发多功能乳制品将成为乳制品行业竞争的热点和大众的消费时尚：在迅猛发展发酵 乳制品的同时，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶发酵剂，对于推动我国乳酸菌发 酵剂产业化进程、促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重要意义。本文对优良双歧 杆菌菌种进行了分离选育和优化搭配；研究了双歧杆菌纯种和双歧杆菌与乳酸菌混种 发酵牛乳的工艺技术；优化筛选出适合工业化生产的廉价增殖培养基和冻干复合保护 剂；研究了双歧杆菌增殖培养、细胞浓缩分离、真空冷冻干燥的工艺技术；初步探索 了双歧杆菌在冷冻干燥过程中存活的适宜条件；制备出高效浓缩型双歧杆菌冻干发酵 剂，并对冻干发酵剂在乳中的发酵活力进行了检测。本文还对双歧杆菌的扩大培养进 行了初步探索和分析。 比较了4 株双歧杆菌在乳中的生长与发酵特性、冷藏期间的存活力和后酸化活性 以及抗冷冻干燥特性，获得两株特性优良双歧杆菌b b m 和b l m 。 研究了接种量、蔗糖添加量、起始p h 值、发酵温度、菌株的耐氧性等因素对双 歧杆菌在牛乳中发酵的影响；进一步利用正交试验优化了双歧杆菌与乳酸菌混种发酵 牛乳的工艺条件，结果表明：纯种发酵的最佳工艺条件为：在牛乳培养基中添加4 的蔗糖，接种量5 ( 活菌数约为5 x 1 07 e f u m l ) ，基质起始p h 值6 5 ，发酵温度3 9 ， 有氧条件发酵；发酵均在5 h 内凝乳，发酵产品活菌含量均可达l x l 0 9 c f u m l 以上、 p h 值为5 0 左右。双歧杆菌与乳酸菌混种发酵的最佳工艺条件为：在牛乳中，总接 种量3 ( 活菌数约为3 x 1 0 7 c f u m l ) ，其菌种配比( l b d r ：s t 3 ：b b mo r b l m ) 1 ：1 ：1 ， 基质起始p h 值7 0 ，发酵温度3 9 * ( 2 ，有氧条件发酵；采用双歧杆菌与乳酸菌混种最 佳工艺条件发酵牛乳，在3 h 2 0 m i n 凝乳，发酵产品的总活菌含量均可达l x l 0 9 c f u m l 以上、d h 值为4 5 - - 5 0 之间。 选择原料易得、价格低廉的农副产品，通过正交试验，筛选出易于分离细胞的胡 萝b 汁培养基、麦芽汁培养基、菊芋汁培养基、番茄汁培养基；通过冷冻试验和细胞 抗性调节试验确定番茄汁培养基为抗冻型培养基，双歧杆菌在番茄汁培养基中3 7 培养1 2 h ，经冷冻存活率高达7 1 8 1 。 研究了灭菌方式、装液量、起始p h 值、发酵温度、接种量、补料等因素对双歧 杆菌三角瓶水平扩大培养的影响；在此基础上，利用正交试验优化了双歧杼菌三角瓶 水平扩大培养的工艺条件：培养基装液量4 0 0 m l ，起始p h 值7 0 0 ，接种量o 1 ， 3 7 培养1 2 h ，活菌数可达l x l c f u m l 以上。 通过研究离心力、离心时间对双歧杆菌离心损失率影响，确定了菌体细胞浓缩分 离的最适离心条件：b l m 最佳的离心条件为：9 0 0 0 r 51 0 m i n 或4 0 0 0 r2 0 m i n ；b b m 最佳离心条件为：4 0 0 0 r1 0 m i n 或7 5 0 0 r5 1 0 r a i n 。 研究了培养条件和营养基质对双歧杆菌细胞抗冷冻性的影响，结果表明：3 7 0 培 养、对数术期或稳定初期收获菌体、保护剂p h 值调至6 5 7 0 、在番茄汁复合增菌 培养基中添加o 1 甘油和0 1 吐温8 0 ，可显著提高双歧杆菌的抗冷冻性。 研究了营养基质对双歧杆菌细胞抗冷冻性的影响，结果表明：脱脂乳、海藻糖等 1 3 种单因子保护剂具有明显的抗冻于保护作用，进一步筛选出5 种复合保护剂配方， 冻干后活菌含量达1 0 “e f u g 以上，最高冻干存活率b b m 7 4 3 6 ，b l m 6 6 7 5 。保藏 试验显示：3 3 4 保护剂制备的冻干发酵剂，真空与常压空气二种封存方式及4 c 与蜜温 二种保藏温度，保藏1 2 个月，活菌数下降不足一个l g 数量级，均在1 0 1 0 c f u g 以上。 通过冻千发酵剂发酵实验表明：冻干发酵剂发酵性能良好，以万分之一接种3 3 + 发酵剂，3 9 有氧发酵，6 h 左右凝乳，发酵产品双歧杆菌活菌含量均可达l x l 0 f u m l 以上、p h 值为5 0 左右。 利用5 l 发酵罐，培养基装液量3 0 0 0 和3 5 0 0 m l ，排气灭菌，0 1 接种量，初始 口h 值6 8 6 ，不通气，最小转速( 1 0 0 r n a i n ) 搅拌，3 7 恒温培养1 2 h ，活菌数可达 l x l 0 9 c f u m l 以上。 关键词：双歧杆菌；增殖培养基；真空冷冻干燥；浓缩型发酵剂；保护剂；扩大试验 r e s e a r c ho fc r u xt e c h n o l o g yo i lp r e p a r i n gb i f i d o b a c t e r i ah i g h a c t i v i t yc o n c e n t r a t e d y o g h o u r ts t a r t e r a u t h e r ：c h o n gk e s u p e r v i s o r ：p r o f i - i o n g t a ot i a n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y a b s t r a c t b i f i d o b a c t e r i aa sat y p i c a lp r o b i o t i c s ，i t sf u n c t i o no fi n c r e a s i n gt h eh e a l t hh a v eb e e n a d m i t t e d ，d a i r yp r o d u c t sw i t hb i f i d o b a c t e r i ah a db e e nab i o e n g i n e e r i n gp r o d u c t so f2 1 c e n t u r y w j t h t h e i m p r o v e m e n to fp e o p l e s h e a l t hc o n s c i o u s n e s s t h e s t u d ya n d d e v e l o p m e n to nf u n c t i o n a ld a i r yp r o d u c tw i l lb e c o m eh e a ti s s u e sa n dc o n s u m ef a s h i o ni n d a i r yp r o d u c t sd o m a i n w i t ht h er a p i d l yd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t i t so f s i g n i f i c a n tf o rp r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lp r o c e s so fl a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e r , i m p r o v i n g d e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t ；i nt h i sp a p e r , i th a si s o l a t e ds t r a i n sa n d o p t i m i z a t i o n c o l l o c a t i o nf o rf i n eb i f i d o b a c t e r i a s t u d i e do nt h e t e c h n o l o g y o f b i f i d o b a c t e r i as i n 出ea n dm i x e dw i t hl a c t o b a c i l l n sf e r m e n t i n gm i l k t h ec h e a pe n r i c h m e n t m e d i u ms u i t e df o ri n d u s t r i a lp r o c e s s i n ga n df r e e z e d r y i n gp r o t e c t a n tw e r es c r e e n e d t h e t e c h n o l o g yo fe n r i c h m e n tc u l t u r ef o rb i f i d o b a c t e r i a , c e l lc o n c e n t r a t i o n ，l y o p h i l i z a t i o nw e r e s t u d i e d t h es u i t a b l ec o n d i t i o n sf o rb i f i d o b a c t e r i ad u r i n gt h ep r o c e s so ff r e e z e - d r y i n gw e r e e x p l o r e di n i t i a l l y h i g he f f i c i e n c yc o n c e n t r a t e db i f i d o b a c t e r i af r e e z e - d r y i n gc u l t u r ew e r e p r e p a r e d a n d t h ef e r m e n t a t i v e a c t i v i t y o ft h ef r e e z e d r y i n gs t a r t e ri nm i l kw e r e e x a m i n e d i nt h i sp a p e r ，t h es c a l ec u l t u r eo fb i f i d o b a e t e r i aw e r ee x p l o r e da n da n a l y s e d t h eg r o w t h ，f e r m e n t a t i o n ，l i v a b i t i l yo fc o l d s t o r a g e ，p o s t a c i d i f i c a t i o n ，f r e e z e d r y i n g r e s i s t a n c eo ff o u rd i f f e r e n tb i f i d o b a c t e r i as t r a i n sw e r es t u d i e d t w os p e c i a ls t r a i n so fb b m a n db i mw e r eo b t a i n e d i n o c u l a t i o n ，t h er a t i o no fs a c c h a r o s ei n i t i a lp h , f e r m e n t e dt e m p e r a t u r e ，o x y g e n r e s i s t a n t e t cf a c t o r sw e r es t u d i e do nt h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o n o nt h eb a s i co fa b o v e ，b yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n to p t i m i z i n g t h e t e c h n o l o g yp a r a m e t e r s o fb i f i d o b a c t e r i am i x e dw i t h l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t e dm i l k t h er e s u l t si n d i c a t e d ：t h e o p t i m a lt e c h n o l o g y o f b i f i d o b a c t e r i as i n g l ef e r m e n t e dw a sa sf o l l o w s ：a d d i t i o no f4 s a c c h a r o s ei nm i l k m e d i u m ，i n o c u l a t i o n3 ( t h e v i a b l en u m b e r 5 x 1 07 c f u m l ) ，i n i t i a l p h o fm e d i u m 6 5 ，f e r m e n t e dt e m p e r a t u r e3 9 。c ，f e r m e n t e dw i t ho x y g e n ；t h es i n g l eb i f i d o b a c t e r i ao p t i m a l t e c h n o l o g yw a sa d o p t e dt of e r m e n t e dm i l k ，t h ec u r dt i m ef o rb b m o rb 1 ma r ei n5 h ，t h e v i a b l en u m b e ro fb o t hr e a c hl x l 0 9 c f u m lp ha b o u t5 0 t 1 l eo p t i m a lt e c h n o l o g yo fm i x i n g b i f i d o b a c t e r i aw i t hl a c t o b a c i l l u st o g e t h e rf e r m e n t e dw a sa sf o l l o w s ：a d d i t i o no f4 s a c c h a r o s ei nm i l km e d i u m ，t h eo v e r a l li n o c u l a t i u n3 ，t h er a t i o no fs t r a i n s ( l b d r ：s t - 3 ： b b mo rb l m ) e q u a l s1 ：1 ：1 t h ei n i t i a lp h7 0 ，f e r m e n t e dt e m p e r a t u r e3 9 c ，f e r m e n t e dw i t h o x y g e n ；t h em i x e d b i f i d o b a c t e r i af e r m e n t a t i o no p t i m a lt e c h n o l o g yw a sa d o p t e dt o f e r m e n t e dm i l k ，t h ec u r dt i m ef o rb b mo rb l ma r ea t3 h 2 0 m i n ，t h ev i a b l en u m b e ro fo v e r a l l r e a c ho v e rl x l 0 9c f u m l , p ha b o u t5 0 j e r u s a l e ma r t i c h o k ej u i c em e d i u m ，t o m a t oj u i c em e d i u m ，c a r r o tj u i c em e d i u ma n dw o r t m e d i u mw h i c ha r ea p tt og a i na n ds e p a r a t ea r eo b t a i n e db yc e l lg r o w t he x p e r i m e n t e d n e e f f e c t so fn u t r i t i o n a im e d i u mo nf r e e z e i n gr e s i s t a n c eo fb i f t d o b a c t e r i aw e r es t u d i e d ，t h e r e s u l t ss h o w s ：t o m a t oj u i c em e d i u mi st h em e d i u mo ff r e e z e i n gr e s i s t a n c e ，t o m a t oi u i c e m e d i u mi n o c u l a t e dw i t hb i f l d o b a c t e r i ac u l t i v a t e da t3 7 f o r1 2 ha n dt h eh i g h e s ts u r v i v a l r a t ea f t e rf r e e z ew e r e 7 1 8 1 s t e r i l i z a t i o nm o d e ，l i q u i dv o l u m ei nf l a s k ，i n i t i a lp h ，f e r m e n t e dt e m p e r a t u r e ，i n o c u l a t i o n ， f e d - b a t c hf a c t o r sw e r es t u d i e do nt h ee f f e c to f c u l t u r i n g i n5 0 0 m lf l a s ka b o u t b f f i d o b a c t e r i a o nt h eb a s i co fa b o v e ，b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n to p t i m i z i n gt h et e c h n o l o g y p a r a m e t e r s n er e s u l t si n d i c a t e d ：i n o c u l a t e dw i t h0 1 i n4 0 0 m lm e d i u m t h ej n i t i a lp h 7 o oa n dc u l t i v a t e da t3 7 f o r1 2 h t h ev i a b l en u m b e rr e a c ha b o v el x l 0 c f u m l i nt h e s t u d yo f t h ee f f e c to f c e n t r i f u g i n gf o r c ea n d t i m eo nt h el o s sr a t e so f b i f i d o b a c t e r i a , t h eo p t i m u mc e n t r i f u g a lf a c t o ro nc e l lc o n c e n t r a t i o nw e r ed e c i d e d ：1 h e h a r v e s t i n gr a t eo fb l ml i v i n gc e l l sr e a c h e dt h eh i g h e s tw h e nc e n t r i f u g a t e da t9 0 0 0rf o r 5 一l o m i no ra t4 0 0 0 rf o r2 0 m i n w h i l e4 0 0 0r1 0 m i no r7 5 0 0 r5 1 0 m i nf o rb b m t h ee f f e c t so fc u l t u r ec o n d i t i o na n dn u t r i t i o n a lm e d i u mo nr e s i s t a n tf r e e z e o f b i f i d o b a c t e r i a w e r es t u d i e d ，n er e s u l t ss h o w s ：c u l t i v a t e da t3 7 ( 2 ，c e l lg a i n i n ga tt h ee n d o fl o g a r i t h ma n db e g i n n i n go fs t a b l e ，p hi np r o t e c t a n ta t6 5 - 7 o , a d d e d 醇y c e f i n0 0 1 a n dv eo 0 1 c a nd r a m a t i c a l l yi n c r e a s et h ef r e e z e d r y i n gs u r v i v a lr a t eo fb i f i d o b a c t e r i a t h ee f f e c to ff r e e z e - d r y i n gr e s i s t a n c ea b o u tn u t r i t i v ei n g r e d i e n t sw e r es t u d i e d t 1 l er e s u l t s h o w e d ：1 3p r o t e c t i v ea g e n t si n c l u d i n gs k i m m e dm i l k , a 圩e h a l o s es i g n i f i c a n t l yr a i s e du p c e l ls u r v i v a lr a t eo nf r e e z e d r y i n g f i v ec o m p o u n dp r o t e c t i v ea g e n t sp r e s c r i p t i o nw e r e s c r e e n e do u t t 1 l en u m b e ro fl i v i n gc e l l sw a s1 0 “c f u t ga f t e rl y o p h i l i n a t i o n n el i i g l l e s t s u r v i v a lr a t eo fb l mw a s6 6 7 5 a n db b m 7 4 3 6 s t o r a g ee x p e r i m e n t ss h o w ：d i f f e r e n t s e a l e d - p r e s e r v a t i o n ( v a c u u m ，a i r ) a n ds t o r a g et e m p e r a t u r e ( 4 ，r t ) h a v en oe f f e c to nt h e c e l ls u r v i v a lr a t eo f3 3 8l y o p h i l i z a t e dp r o d u c t s ，s t o r e df o r3 6 0 d ，t h el i v i n gc e l ln u m b e rw a s s t i l lo v e r1 0 “c f u g ，a n dt h er e d u c e dn u m b e rd i d n ta m o u n tt oo n el o gr a n k b ye x a m i n i n gt h ea c t i v i t yo ff r e e z e d r y i n gc u l t u r e si nm i l k , t h er e s u l ti n d i c a t e s ：t h e f e r m e n t a t i o nn a t u r eo ft h em i x e df r e e z e - d r y i n gc u l t u r e sp r e p a r e db y3 3 k i n d so fc o m p o u n d p r o t e c t a n ti sb e t t e r ；i n o c u l a t e dw i t h0 0 1 a n dc u l t i v a t e da t3 9 ，f e r m e n t e dw i t ho x y g e n ， t h ec u r dt i m ea r e6 h ，t h ev i a b l en u m b e rr e a c ha b o v el x l o c f u m kp hj sa b o u t5 + 0 l i q u i d v o l u m e i n f l a s k w e r e 3 0 0 0 m l a n d3 5 0 0 m l i n 5 l f e r m e n t e r , i n o c u l a t e d w i t h0 1 ， t h ei n i t i a lp h6 8 6a n dc u l t i v a t e da t3 7 。cb yt h el o w e s tp a c e ( 1 0 0 r t m i n ) c h u r n i n gu pf o r 1 2 h t h ev i a b l en u m b e rr e a c ha b o r e1 x 1 0 c f u m l k e yw o r d ：b i f i d o b a c t e r i a ；p r o l i f e r a t e dc u l t u r e ；l y o p h i l i z a t i o n ；c o n c e n t r a t e ds t a r t e r ； p r o t e c t a n t ；e n l a r g e de x p e r i m e n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑a 垦壅些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 妇签字腓如f 年占月步日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦盔些盘茔有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权超j 垦盔些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 签字闩期：m 年占月7 7 同 学位论文作者毕业后去向： 通讯地址： 导师躲咽瑶吟 签字日期：上一年j 月，7r 电话 邮编 双歧杆菌高效浓缩型酸奶发酵剂制备关键技术研究 1 引言 1 8 9 9 年法国著名的巴斯特研究所h e n r yt i s s i e r 博士从母乳营养儿的粪便中分离出一种厌氧 的革兰氏阳性杆菌双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r l a ) 1 4 1 , 根据其独有的轻度弯曲的末端有分叉的形 态，将其命名为双歧芽孢杆菌( b a c i l l u sb i f i d u se o m m u n i s ) 。o r l a - j e n s e n 于1 9 1 9 年将其命名为双 歧细菌，并于1 9 2 4 年设置了一个独立的双歧杆菌属，但是当时未被接受1 5 , 6 。直到伯杰氏细菌鉴 定手册第8 版( 1 9 7 4 ) 才将其正式属名列入放线菌目的放线菌科下。至今双歧杆菌属由原来列入 的1 1 个种已报道有3 2 个种。目前国际上公认的能安全应用于食品的5 种双歧杆菌：两歧双歧杆 菌b i f i d u m ) 、青春双歧杆菌口a d o l e s c e n t i s ) 、婴儿双歧杆菌( b i n f a n t s ) 、长双歧杆菌阻l o n g u m ) f l 短双歧杆菌佃b r e v e ) 。 1 1 双歧杆菌的特性 1 1 1 双歧杆菌的形态和生理生化特性 双蝴平菌的细胞呈现多种形态；有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长而稍 弯曲状、疆种分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、v 型、栅栏状排列，或聚集成星状。不能游 动，无蓑孢、荚膜及鞭毛。其典型形态是有分叉的杆菌，但同种不同的菌株形态也不尽相同即 使同一株菌在不同时期或培养子不同的培养基也可能显现不同的形态，这种表型变异是可逆的。 双歧杆菌菌落光滑、凸圆、边缘完整、奶油色至白色、质地柔软有弹性。 双歧杆菌革兰氏阳性，美蓝等染色菌体着色不均。不耐酸，厌氧，不同的种和菌株对氧的敏 感性存在差异。最适生长温度为3 7 4 1 ，最低生长温度为2 5 2 8 c ，最高生长温度为4 3 4 5 ，最适发酵温度为3 5 4 0 c 。最适起始p h 为6 5 7 0 ，在p h 4 5 5 0 以下或8 o 8 5 以上不 生长。过氧化氢酶阴性，但星状取歧杆菌和蜜蜂双歧杆菌例外。双歧杆菌通常不还原硝酸盐，然 而，当生长于含有溶解红细胞的培养基时，则可能有还原硝酸盐的作用。吲哚反应阴性。明胶液 化阴性。联苯胺反应阴性。d n a 的g 十c 含量为摩尔分数5 5 6 7 。 1 1 2 双歧杆菌的代谢及其相关酶类 ( 1 ) 双歧杆菌的代谢 双歧杆菌发酵的代谢采用了特殊的双歧杆菌支路方法，和同型发酵、异型发酵均有不同，双 歧杆菌利用体内果糖- 6 书酸磷酸激酶( f 6 p p k ) ，通过特异的“果糖6 磷酸支路”对葡萄糖进行 发酵，这与其它细菌利用醛缩酶和葡萄糖- 6 一磷酸脱氢酶明显不同。双歧杆菌对葡萄糖的发酵可通 过f 6 p p k 途径和丙酮酸还原成乳酸进行解释，果糖6 磷酸经由f 6 p p k 的作用分解成乙酰磷酸和 赤藓糖_ 4 磷酸，再经由转二羟丙酮基酶( e c 2 2 1 2 ) 、转羟乙醛酶( e c 2 2 1 1 ) 、木酮糖一5 一磷 酸酶( e c 4 1 2 9 ) 的顺序作用及3 磷酸甘油醛的糖酵解途径转化形成终产物。双歧杆菌分解己 河北农业大学硕士学位论文 糖形成乙酸、乳酸，两者的摩尔比在理论上应为3 ：2 。但是在双歧杆菌实际培养中两种酸的数量 很少符合这理论比率。d e s j a r d i n s l 7 1 等人报道双歧杆菌在牛奶中培养时，产生的乙酸和乳酸比为 0 4 ：1 3 ：1 。不产丁酸和丙酸，不生成c 0 2 产生极少的甲酸和琥珀酸。 ( 2 ) 双歧杆菌的酶类 口、1 3 - 半乳糖苷酶。所有双歧杆菌都含有q 、p 半乳糖苷酶，且酶活力明显高于其它肠道菌n * 半乳糖苷酶能降解特殊糖类静d 一半乳糖苷寡糖，这种多糖不能被机体利用而可被双歧杆菌消化。 p 半乳糖苷酶能分解乳糖，用于乳制品加工中，可提高“乳糖不耐症”患者对乳制品的利用率f 9 l 口 伍、b - 葡萄糖苷酶。所有双歧杆菌中均存在着葡萄糖苷酶活力，而p 葡萄糖昔酶存在于除 b b i f i d u m 或b 1 0 n g u m 的其它双歧杆菌种中。最近研究表明，淀粉抵制小肠中的胰淀粉酶，从而 成为进入结肠的主要糖源，其水解物可能就是双歧杆菌生长的重要基质。b e v e r l e y r l 0 以淀粉作为 唯一的碳源和能源研究“- 葡萄糖苷酶。表明双歧杆菌利用淀粉作为碳源，是由于合成一个或两个 a 葡萄糖苷酶。目前，对p 葡萄糖苗酶的研究不如* 葡萄糖苷酶多，但也出现一些资料。 肽酶。生长迅速的双歧杆菌中发现有高的l - 亮氨酸氨肽酶活力，作用于蛋白质或多肽的n 端 氨基酸残基，也能水解某些脂肪酸胺类。牛乳蛋白水解物对双歧杆菌的促生长作用即部分来自肽 酶的活力1 1 1j 。n i s h i z a w a i ”| 认为双歧杆菌等乳酸茵具有磷蛋白磷酸酶，分解乳中* 醅蛋白，形成 微细的凝固奶酪脂肪肽和氨基酸等，提高蛋白消化率。 与胆酸有关的酶。双歧杆菌能产生结合胆酸水解酶，尤其是甘氨酰胆酸水解酶，使结合胆酸游 离，更有效地抑制致病菌生长i l “。 其它。某些双歧杆菌含有n 乙酰- d 一葡萄糖胺酶活力，以含n 一乙酰d 葡萄糖胺的多糖为底物， 参与合成细胞壁。含此酶的双歧杆菌多来源于婴儿，成人则未发现。在某些双歧杆菌体内，则存 在微量的n a d - 氧化还原酶，m 亚硝酸降解酶和s o d 酶”，专门用于降解或吸收某些特殊物质。 双歧杆菌中的谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺脱氢酶加强氮的存留，在氮代谢中起着重要作用。 双歧杆菌中已分离纯化的与糖代谢有关的酶，除上述之外。还有b - 呋哺果糖苷酶、甘露糖苷 酶，d 木糖苷酶，d - 木糖异构酶等，都是人体所不具有的，能水锯人体不能消化的寡糖的酶。 1 1 3 双歧杆菌对人体的生理功能 肠道菌群数量庞大、构成复杂。其中双歧杆菌属、消化链球菌属等专性厌氧菌约占肠道总菌 量的9 9 ，肠杆菌科、肠球菌属等兼性厌氧菌约占l 蚶。日本学者光冈知足认为，双歧杆菌悬 对人类整个生命活动有益的肠道细菌；国内刘秉阳通过对长寿老人肠道菌群的研究发现其肠道双 歧杆菌非但没有减少，而是显著增加，这间接表明了双歧杆菌与人类健康长寿有一定的关系。 欧洲食品与饲料菌种协会( e f f c a ) 对益生菌的最新定义为：益生菌是活的微生物，通过 摄人充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康的益处。双歧杆菌通过改善 肠道微生物菌群的平衡而发挥保健功能。 ( 1 ) 生物拮抗性。当肠道内有高浓度水平的双歧杆菌时，外侵的病原大肠埃希菌，痢疾志贺菌， 伤寒沙门菌，变形杆菌，金黄色葡萄球菌，白假丝酵母菌或内源的腐生菌、条件致病菌就会受到 抑制 1 ，| 。机制之一是双歧杆菌在肠上皮细胞的粘附与其他细菌形成的特异性微生态位，从而产生 特异生态效应。形成有益菌屏障，密布于肠粘膜形成细菌生物膜增强肠道的定植抗力，抑制肠道 2 双歧杆菌高效浓缩型酸奶发酵剂制各关键技术研究 致病菌和条件致病菌的定植和易位l ”】。机制之二是双歧杆菌发酵葡萄糖产生多种有机酸，使肠道 p h 值下降，使肠道酸化，阻止致病菌增殖。双歧杆菌可产生抗菌物质b i f i d i n ，抑制腐生菌，使 人体内的吲哚、酚氨、尸胺、亚硝胺素显著减少，双歧杆菌的酸性菌体外多糖耐受胃酸和胆汁， 增强对黏膜的粘附作用，拮抗致病菌占位。双歧杆菌可使偶联型胆汁酸分解为游离型胆汁酸，该 种酸对细菌抑伟u 作用更强。 ( 2 ) 营养作用。烈歧杆菌在人体肠道内能够合成维生素b l 、b 2 、b 6 和k 等，由人体缓慢地吸收， b 族维生素的生成量可达1 2 0 3 u g 1 0 0 m l 双歧杆菌；双歧杆菌可以合成丙氨酸、缬氨酸、天冬氨 酸和苏氨酸等人体必需的营养物质，使人体通过合理的膳食即可摄取足量的多种营养素，对于人 体具有不容忽视的营养作用，尤其对加强孕产妇、哺乳妇女、儿童、老年人的营养有重要的意义； 双歧杆菌可分泌多种酶类，促进食品的降解与吸收；双歧杆菌维持肠道酸性环境，有利于c p 、 f e 2 + 和维生素d 的吸收，有助于防i l 缺铁性贫血和软骨病；双歧杆菌发酵乳糖产生半乳糖，是构 成脑神经系统中脑苷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系，可提高“乳糖不耐症” 患者对乳制品的利用率。 ( 3 ) 抑癌作用。双歧杆菌能非特异性增加肿瘤的局部反应改善肿瘤患者淋巴细胞弧群分布及 增强其杀伤活性，促进细胞免疫功能，激活巨噬细胞的吞噬活性而抗癌【1 ”，双歧杆菌活体、灭活 菌体，以及完整的细胞壁肽多糖、胞外多糖及细菌素等，均有较高的抗肿瘤活性。双歧杆菌能分 泌一种n - 亚硝胺降解酶，使皿硝胺致癌物降解，降低了肠癌的发病率【跏。双歧杆菌对血管内皮 抑制索抗胃、肝和消化道肿瘤均有协同增效作用【2 ”。双歧杆菌能诱导血液中一氧化氮水平升高 激活了巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性，井通过与肿瘤代谢关键酶活性部位f e s 结合失去活性， 或与氧结合形成强有力杀伤性的羟自由基，促使癌细胞捅亡而产生抗癌作用f 竭。双歧杆菌能有效 地抑制肠道中的b - 葡萄糖苷酸酶和偶氮还原酶等细菌酶的活性催化致癌物质转化为粪臭紊减 少了致癌物质在肠道内的形成。双歧杆菌还具有很强的吸收煮焦肉所产生的致癌物质的能力。 ( 4 ) 润肠通便。双歧杆菌可取向调理胃肠功能p “i ，分泌大量短链脂肪酸，酸化肠道，控制有 害菌引起的异常发酵，使肠道内渗透压增高，刺激胃肠蠕动；d o n s k i k h ”l 研究证实双歧杆菌能够 产生乳酸、醋酸、甲酸，促进肠运动。何道生【2 6 j 说，当有许多难消化的寡糖在大肠中堆积，而又 缺少双歧杆菌时，患者就会出现腹胀、腹痛、便秘，但有足够的双歧杆菌时，双歧杆菌就能酵解 寡糖产生醋酸和乳酸，能促进肠的运动，使粪便连续不断的推向肛门最后排出体外。 ( 5 ) 护肝功能。琊c 歧杆菌可以抑制产生毒素的有害菌数量，从而减少内毒素、胺类等毒性物质 的产生，防i r 其对肝脏的毒害口7 1 ，舣歧杆菌在肠道内可吸收利刚这些含氮有害物质，抑制产胺的 腐败菌，降低肠道内的p h 值，使氨变为难丁- 吸收的离子型，达到降低血氮的功效。 ( 6 ) 降低胆吲醇。人体血液中日i 剞醇含量高会导致动脉硬化和高血压的发生，双歧杆菌可以影 响朋固醇的代谢使胆醇转化为人体不吸引的粪甾醇，从粪便排出体外，降低血液中担闻醇的浓 度，对高血压和动脉硬化有一定的防治作用【2 ”。另外，双跛杆菌可以降低血清腮圊醇和甘油二酯， 具有改善脂质代谢紊乱的作用。 ( 7 ) 抗衰老作用。自由基利过氧化脂质被认为是机体在代酣过程中产生的对宿主细胞有害的物 质，它们能加速细胞的衰老与死亡。烈歧杆菌体内含有过氧化物酶、过氧化物歧化酶s o d 等， 有消除自由基及过氧化脂质的能力，减少致衰老物质的产生，延缓细胞的衰老，促进人体健康。 ( 8 ) 免疫调协功能。舣歧杆曲能影响涉及到免疫廊替的体液免疫、细胞免疫和菲特异性免嫂二 河北农业大学硕士学位论文 个方匝。 双歧杆菌体液免疫调节功能 双歧杆菌在胃肠道内能够刺激b 淋巴细胞活化增殖和分泌抗体来发挥体液免疫，使机体具有 抗感染和抗肿瘤作用【2 9 】；近年来，专家学者们研究发现肠道内双歧杆菌可增加机体免疫监视功能， 尤其是通过口服可增加抗体的产生t ”。 双歧杆菌的细胞免疫调节功能 双歧杆菌作为机体消化道内的优势菌群，可以明显激活作为机体天然抵抗力的一个重要组成 部分吞噬细胞的活性，进丽增强机体的非特异性免疫功能【3 1 】；双歧杆菌具有赋活机体t 细胞 介导的免疫功能的能力，可以使机体的淋巴因子增多或者使淋巴细胞的增殖反应增强p 2 】；取歧杆 菌可激活n k 细胞p ”，抑制肿瘤的发生；双歧杆菌可提高红细胞的免疫粘附功能p “，增强其清除 循环中免疫复合物的功能，进而提高机体免疫力，防i i 感染的发生。 双歧杆菌对细胞因子诱生作用的影响 烈歧杆菌完整肽聚糖能能激活机体免瘦系统中的巨噬细胞，提高其吞噬能力和能量代谢水 平，同时分泌1 l - 2 6 和n o 等具有杀瘤活性的重要介质口5 t ，但刺激免疫的机制是否通过改变非 特异性免疫应答，抑或二者兼而有之，至今不能下定论。所以探寻双歧杆菌免疫调节机制仍是长 期而艰巨的任务。 1 1 4 双歧杆菌的营养特性 烈歧杆菌以有机碳源作为碳源和能源。通常可刹用碳源主要是葡萄糖等单糖和一些低聚糖， 不能直接利用纤维素、淀粉等大分子碳水化合物。双歧杆菌体内含有的许多糖代谢酶，都是动物 和人所不具有的。许多促进双歧杆菌生长的碳源大多是能被双歧杆菌利用但不能被机体利用的糖 类，除乳酮糖外，主要为寡糖，乳寡果糖、寡半点乳糖、大豆寡糖。 双歧杆菌的蛋白酶活性通常较弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，最适氮源为蛋白质水解产物：蛋 白胨、肽类和氨基酸等，e , c o l i 生长基质用蛋白酶消化后亦是极好的双歧杆菌促长物。1 9 9 3 年 k l a v c rfa 等报道培养在纯牛奶中的双歧杆菌，1 7 个菌株中有1 5 个菌株不能生长，需添加酪蛋 白降解产生的肽和氨基酸，这是因为这些菌株缺乏分解蛋白的活性。实验表明：人为添加动物性 复合氮基酸，可使双歧杆菌活菌数明显提高，而且活菌数的衰减会缓慢一些【3 ”，如果缺乏天冬氨 酸，则拟歧杆菌的活性降低5 0 t 驯；酵母膏富含核萤酸、蛋白质，对活菌数有明显影响，生产中 少加或不加酵母膏，凿体停止生艮或很快死亡。研究发现，这此物质均含有含硫的肽，如果它们 的二硫键被还原或烷基化则失去促双歧杆菌的生妖活性。 烈歧杆菌要求矿物元素如磷、硫、钠、钾、钙、镁、锰、铁平锌等。铁、铜、锌是双歧杆菌 超氧化物歧化酶的主要组成部分，其含量对菌体生氏有明显的的影响。n o v l kg i 等p 9 】将在加工 天然隧7 i 粉时获得的矿物质添加到青春双歧杆菌舛- 丑i m 的培养基中，可提高菌体生长速率，降 低代时，增加代谢物诸如乙酸、乳酸雨i 乙醇的积累及细胞外蛋白酶的承平。 双歧杆菌能合成维生素b 1 、b 2 、b 6 和k 等，而它们生妖同样需要维生索b 2