（分析化学专业论文）dna纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用.pdf

p r e p a r a t i o no fd n a - - h y d r o x y a p a t i t em o d i f i e de l e c t r o d a n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a la n a l y s i s n u oz h a n g u n d e rt h es u p e r v i s i o no f p r o f q i nw e i at h e s i ss u b m i t t e dt ot h eu n i v e r s i t yo fj i n a n i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t s f o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e u n i v e r s i t yo f j i n a n j i n a n ，s h a n d o n g ，p r c h i n a m a y1 8 ，2 0 1 0 导师的指导下，独立进 外，本论文不包含任何 本文的研究作出重要贡 人完全意识到本声明的 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和 汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：至垒选导师签名： 锌 济南大学硕士学位论文 目录 目录i 术语、符号说明v 摘要v i i a b s t r a c t i x 第一章绪论l 1 1d n a 修饰电极的制备2 1 1 1 直接吸附法3 1 1 2 共价键结合法4 1 1 3 自组装膜法4 1 1 4 聚合物膜法5 1 1 5 化学免疫法5 1 1 6 组合法5 1 1 7 生物亲和法5 1 2d n a 修饰电极的应用6 1 2 1d n a 与小分子的相互作用的研究一6 1 2 2 环境检测9 1 2 3 药物检测9 1 2 4 食品检测1 0 1 2 5 基因诊断l o 1 2 6d n a 损伤的研究1o 1 3 纳米材料在d n a 电化学生物传感器中的应用1 1 1 4d n a 电化学生物传感器的应用展望1 2 1 5 本论文的研究内容及创新性1 2 1 5 1 主要研究内容1 2 1 5 2 创新性1 3 第二章纳米羟基磷灰石的制备及表征1 5 2 1 引言15 2 2 仪器与试剂1 5 2 2 1 主要仪器15 2 2 2 试剂配制16 l d n a 纳米羟基磷灰石修饰电极的制各及在生物分析中的应用 2 3h a p 的制备。17 2 3 1 酸度选择l7 2 3 2 微乳液的制备18 2 3 3h a p 的制备18 2 4h a p 的表征19 2 5 结论2 0 第三章d n a 修饰电极用于研究d n a 与三甲铵基苯基卟啉的相互作用及d n a 损伤2 3 3 1 引言。2 3 3 2 仪器与试剂2 4 3 2 1 主要仪器2 4 3 2 2 试剂配制2 4 3 3 实验方法2 5 3 3 1h a p 的制备2 5 3 3 2d n a h a p g c e 的制备2 5 3 3 3 电化学扫描一2 6 3 4 结果与讨论2 6 3 4 1d n a 固定在h a p g c e 上的电化学表征2 6 3 4 2t a p p 在d n a h a p g c e 上的电化学行为2 9 3 4 3 扫描速度对t a p p 在d n a 修饰电极上电化学行为的影响3 0 3 4 4p h 对t a p p 在d n a 修饰电极上电化学行为的影响31 3 4 5 离子强度对t a p p 在d n a 修饰电极上电化学行为的影响一3 2 3 4 6t a p p 与d n a 结合常数的测定3 3 3 5 结论3 5 第四章基于纳米羟基磷灰石的d n a 修饰电极及与维生素b 1 2 相互作用的研究 3 7 4 1 引言3 7 4 2 仪器与试剂3 8 4 2 1 主要仪器3 8 4 2 2 试剂配制3 8 4 3 实验方法3 9 4 3 1h a p 的制备3 9 济南大学硕士学位论文 4 3 2d n a h a p g c e 的制备3 9 4 3 3 电化学扫描4 0 4 4 结果与讨论4 0 4 4 1d n a 固定在h a p g c e 上的电化学表征4 0 4 4 2 维生素b 1 2 在玻碳电极上的电化学行为4 2 4 4 3 维生素b 1 2 与d n a 相互作用的u v - v i s 光谱证据4 2 4 4 4 溶液p h 值的影响4 3 4 4 5 维生素b 1 2 与d n a 相互作用的电化学行为探讨一4 3 4 5 结论4 6 第五章基于纳米羟基磷灰石的d n a 电化学传感器对氯霉素的电催化作用4 7 5 1 引言4 7 5 2 仪器与试剂一4 8 5 2 1 主要仪器4 8 5 2 2 试剂配制一4 8 5 3 实验方法一4 9 5 3 1d n a m a p g c e 的制备4 9 5 3 2 循环伏安扫描4 9 5 4 结果与讨论4 9 5 4 1d n a 在h a p g c e 上的电化学表征4 9 5 4 2d n a 对c a p 的电催化作用5 0 5 4 3 影响c a p 还原峰电流的因素5 1 5 4 4 样品检测5 3 5 4 5d n a 电化学传感器的稳定性和重现性5 4 5 5 结论5 5 结论5 7 参考文献5 9 致谢7 1 附录a ：在校期间发表论文及获奖情况7 3 1 1 1 d n a 纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用 i v 扫描速度 电子转移系数 标准速率常数 v 仅 起 v d n a 纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用 济南大学硕七学位论文 摘要 d n a 是活细胞中最重要的分子，它含有特定细胞的全部遗传信息，在分子生物学 和生物医学领域的研究非常广泛。d n a 生物传感器是当今生物传感技术的研究热点。 用d n a 修饰电极研究d n a 与其他物质的相互作用，不仅能克服溶液电化学方法背景 信号大，弱信号难以提取的缺点，而且d n a 的用量大为减少，方法的灵敏度得到提高， 以较少样品消耗得到多种作用参数。研究d n a 与其它小分子的相互作用是生物化学和 分子生物学中的重大课题，对疾病诊断、环境检测、医药研究和新药设计起着重要作用。 水溶性阳离子卟啉具有优异的生物活性，可以作为潜在的抗癌、抗菌药物和核酸结构及 动力学探针，其与d n a 的相互作用成为研究的热门话题。对卟啉化合物与d n a 结合 模式的研究也有助于寻求卟啉化合物的生物活性及其与d n a 的结合模式之间的关系。 d n a 与药物分子等相互作用的研究，有助于人们了解某些药物分子对d n a 体内复制和 转录的影响以及由此引起的物种性变异、各种化合物与d n a 间亲和力的大小和化学核 酸酶的作用机制等信息。 本文合成了具有优良生物相容性和独特吸附性的羟基磷灰石( h a p ) ，并制备了d n a 纳米羟基磷灰石修饰电极( d s d n a h a p g c e ) ，用表面电化学法研究了d n a 与其它小分 子的相互作用。论文主要包括以下几个方面的内容： 第一部分概述了d n a 修饰电极制备方法的研究现状及d n a 修饰电极的研究意义 和应用。介绍了本论文的研究内容及特点。 第二部分介绍了h a p 的制备及表征。h a p 【c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 】是常用的骨修复材料， 其规则的立体化学结构和独特的多吸附位点使其在催化、蛋白质分离等领域倍受瞩目。 本文采用共沉淀法与微乳液法方法，制备了纳米h a p ，并分析了在微乳液介质中h a p 的合成过程。 第三部分研究了d n a 与水溶性阳离子卟啉三甲铵基苯基卟啉( t a p p ) 的相互作用及 检i 贝| d n a 损伤。利用滴涂法将具有优良生物相容性和独特吸附性的h a p 修饰在玻碳电极 上形成纳米薄膜。电化学实验结果证明该纳米h a p 薄膜能有效地将双链d n a 吸附于其表 面。采用循环伏安法和交流阻抗法系统研究了固定在h a p 薄膜_ l 的d n a 与t a p p 之间的 相互作用并将此修饰电极用于检钡j j d n a 损伤和测定卟啉类物质。实验结果表明，在5 0 一 2 5 0m v s j 扫描速度范围内该电极反应过程系表面吸附反应控制：在p h 值为3 7 9 1 的 v l l 。n a 纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析巾的应用 区间内，随p h 值增大，t a p p 的氧化还原峰都发生正移，这表明t a p p 在d n a 修饰电极 上的氧化还原过程不仅有电子参与，而且还有质子参与；在p h = 7 0 的磷酸盐缓冲溶液 ( p b s ) 中，随溶液离子强度增大，t a p p 在d n a 修饰电极上的表观式量电位不断正移，表 明t a p p 与d n a 之间的相互作用主要是小沟槽的嵌入作用，二者可生成超分子化合物。 根据l a n g m u i r 吸附公式，得出t a p p 与d n a 之间的结合常数为1 4 8 1 0 5m o l l 一。 第四部分研究了维生素b 1 2 与d n a 的相互作用。采用循环伏安法系统研究了维生 素b 1 2 与d n a 在p h = 4 9 的h a c - n a a c 中相互作用的电化学行为，所得结论比溶液电 化学法更具说服力。实验结果表明，d n a 的存在能导致维生素b 1 2 还原峰电流的降低。 通过测定裸玻碳电极和d n a 修饰电极的一些电化学参数，证明维生素b 1 2 与d n a 在该 实验条件下结合生成了一种非电活性的超分子化合物，并利用一系列方程求得该超分子 化合物的组成为l ：1 ，结合常数= 5 3 5 1 0 5m o l l 。 第五部分研究了d n a 修饰电极对氯霉素的电催化作用。利用d s d n a h a p g c e 对 氯霉素的电催化作用，建立了对氯霉素含量进行定量分析的一种电分析方法。在p h = 6 0 的k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 缓冲溶液和o 1m o l l dk c i 溶液中，氯霉素的浓度在2 8 0 1 0 一 3 6 0 1 0 击m o l l d 范围内与峰电流呈良好的线性关系，线性回归方程和线性相关系数分 别为：i p o a a ) = 5 8 6 5 + 0 4 7 8 4c ( p m o l l 。1 ) ，= 0 9 9 4 2 ，检测限可达1 3 5 1 0 m o l l 。 利用该法对氯霉素滴眼液进行定量分析，8 次平行样品分析结果的相对标准偏差小于3 关键词：c td n a ；三甲铵基苯基卟啉；维生素b 1 2 ；氯霉素；修饰电极 济南大学硕士学位论文 a bs t r a c t d n ai st h em o s ti m p o r t a n tm o l e c u l ei nl i v i n gc e l l ，i tc o n t a i n sa l lt h eg e n e t i ci n f o r m a t i o no f as p e c i f i cc e l l d n ab i o s e n s o ri st h eh o tt o p i ci nb i o - s e n s o rt e c h n o l o g yt o d a y c o m p a r e dw i t h s o l u t i o ne l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s ，u s i n gd n am o d i f i e de l e c t r o d et os t u d yi n t e r a c t i o n s b e t w e e nd n aa n do t h e rs p e c i e sc a nn o to n l yo v e r c o m es h o r t c o m i n g so ft h eb i gb a c k g r o u n d s i g n a lo ft h es o l u t i o ne l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sa n dt h ew e a ks i g n a ld i f f i c u l tt oe x t r a c t ，b u t a l s oh a v eas i g n i f i c a n tr e d u c t i o ni nt h ea m o u n to fd n a t h em e t h o dc a ni m p r o v et h e s e n s i t i v i t ya n dm a k ep e o p l eo b t a i nav a r i e t yo fp a r a m e t e r sw i t hl e s ss a m p l ec o n s u m p t i o n s t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n aa n do t h e re l e m e n t si sam a j o rr e s e a r c ht o p i ci n b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ，w h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nd i s e a s ed i a g n o s i s ， e n v i r o n m e n t a lt e s t i n g ，a n dp h a r m a c e u t i c a lr e s e a r c ha n di nt h e d e s i g no fn e wd r u g s w a t e r - s o l u b l ec a t i o n i cp o r p h y r i n sh a v ee x c e l l e n tb i o a c t i v i t y , a n dt h e yc a nb eu s e da sp o t e n t i a l a n t i c a n c e ro ra n t i b a c t e r i a la g e n t sa n dp r o b e sf o rt h es t r u c t u r ea n dd y n a m i c so fd n a s t u d i e s o nt h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t hp o r p h y r i nc a nh e l pt os e e kt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e b i o l o g i c a la c t i v i t yo fp o r p h y r i na n dt h eb i n d i n gm o d e l i n v e s t i g a t i o n so nt h ei n t e r a c t i o no f d n aw i t hd r u gm o l e c u l e sh e l pp e o p l et ou n d e r s t a n dt h ee f f e c to fs o m ed r u gm o l e c u l et ot h e c o p y i n ga n dt r a n s c r i p t i o no fd n a ，a n dv a r i a t i o nc a u s e db yt h i s ，w h i c hc a na l s op r o v i d e i m p o r t a n ti n f o r m a t i o no nt h ea f f i n i t yb e t w e e nd n a a n do t h e rc o m p o u n d s ，a n dt h em e c h a n i s m o fs o m en u c l e a s e i nt h i sa r t i c l e ，n a n o h y d r o x y a p a t i t e ( h a p ) w a sp r e p a r e db yc o m b i n i n gc o p r e c i p i t a t i o n w i t hm i c r o e m u l s i o nm e t h o d ，w h i c he x h i b i t e ds t r o n ga d s o r p t i o nf o rd n ab a s e do nt h e a d v a n t a g e so fi t se x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t ya n dp a r t i c u l a ra d s o r b a b i l i t y d n aa n dh a p w e r e e a s i l ym o d i f i e do n t og l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) b ys i m p l ea n dc o n v e n i e n t t i p c o a t i n g ” m e t h o d w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t l lo t h e rs m a l lm o l e c u l e sb ys u r f a c e e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d t h em a i nc o n t e n t so ft h ep a p e rw e r ep r o v i d e da sf o l l o w e d i nt h ef i r s t p a r t ，w ed e s c r i b e dt h er e s e a r c hs i g n i f i c a n c ea n ds t a t u so ft h ep r e p a r a t i o n m e t h o d sa n da p p l i c a t i o no fd n am o d i f i e de l e c t r o db r i e f l y t h er e s e a r c hc o n t e n t sa n d c h a r a c t e r i s t i c so ft h i sp a p e rw e r ea l s oi n c l u d e d i x t h es e c o n d p a r t i sa b o u tt h e p r e p a r a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f h a p h a p ( c a lo ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ) ，i sw i d e l yu s e da si m p l a n t so ra sc o a t i n g so np r o s t h e s e si nt h ef i e l do f m e d i c i n e t h es t e r e o s c o p i cc h e m i s t r ys t r u c t u r ea n du n i q u el o c u so fa d s o r p t i o nm a k eh a p f o c u s e di nt h ef i e l do fp r o t e i ns e p a r a t i o na n dc a t a l y t i c w ep r e p a r e dh a p b yc o m b i n i n g c o - p r e c i p i t a t i o nw i t hm i c r o e m u l s i o nm e t h o d ，a n da n a l y z e dt h es y n t h e s i sp r o c e s so fh a pi n m i c r o e m u l s i o nm e d i u m t h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t h m e s o t e t r a 一( 4 一t r i m e t h y l a m i n o p h e n y l ) p o r p h y r i nb y d n a - h y d r o x y a p a t i t em o d i f i e de l e c t r o d e ( d s d n a h a p g c e ) a n dd e t e c t i o no fd n ad a m a g e w e r es t u d i e di nt h et h i r dp a r t c y c l i cv o l t a m m e t r yw a su s e dt o i n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no f m e s o - t e t r a - ( 4 一t r i m e t h y l a m i n o p h e n y l ) p o r p h y r i n ( t a p p ) w i t hd n ai m m o b i l i z e do nh a pf i l m a sw e l la st h ed e t e c t i o no fd n a d a m a g ea n dd e t e r m i n a t i o no fp o r p h y r i n t h er e d o xc u r r e n t s o ft a p po nd n am o d i f i e dg c ei n c r e a s e dw i t hs c a nr a t ef r o m5 0t o2 5 0m v - s 一，s h o w i n ga l i n e a rr e l a t i o n s h i pa se x p e c t e df o ras u r f a c e - c o n t r o l l e dp r o c e s s b o t hr e d u c t i o na n do x i d a t i o n p e a kp o t e n t i a l so ft a p pu n d e r w e n tap o s i t i v es h i f tw i t hi n c r e a s i n gp hf r o m3 7t o9 1 ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tt h er e d o xp r o c e s so ft a p ph a db o t he l e c t r o na n dp r o t o ni n v o l v e d i np h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) w i t hp h7 0 ，t h ef e a t u r e dp o t e n t i a lf o rt a p po nd s d n a h a p g c e s h i f t e dp o s i t i v e l yw i t ht h ei n c r e a s eo fi o n i cs t r e n g t ho f s o l u t i o n ，s u g g e s t i n ga ni n t e r c a l a t i o n m o d ee x i s t e db e t w e e nt a p pa n dd n a ，w i t haf o r m a t i o no fs u p r a m o l e c u l a rc o m p o u n d s a c c o r d i n gt ol a n g m u i ra d s o r p t i o nf o r m u l a , t h eb i n d i n gc o n s t a n to ft a p pt od n aw a s c a l c u l a t e dt ob e1 4 8 10 5m 0 1 l 一 a n di nt h ef o u r t hp a r t ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n dv i t a m i nb 1 2w a si n v e s t i g a t e d c y c l i cv o l t a m m e t r yw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no fd n ai m m o b i l i z e do nt h eh a p f i l mw i t hv i t a m i nb 1 2 ( v b l 2 ) t h ee x i s t e n c eo fd n al e dt ot h ed e c r e a s eo fr e d u c t i o nc u r r e n t o fv b l 2 b o t ht h ee l e c t r o nt r a n s f e rc o e f f i c i e n t ( a ) a n dt h es t a n d a r dr a t ec o n s t a n tf k s ) w e r e d i f f e r e n to b t a i n e do ng c ea n dd s d n a h a p g c e ，w h i c hi n d i c a t e dt h ef o r m a t i o no fa n e l e c t r o c h e m i c a li n a c t i v es u p e rm o l e c u l a rc o m p l e xd n a n v b l 2 t h ee q u i l i b r i u mc o n s t a n to f t h i sc o m p l e xw a sc a l c u l a t e dt ob e5 3 5 10 5m o l l la n dt h eb i n d i n gn u m b e rb e t w e e nd n a a n dv b l 2o f t h ec o m p l e xw a sd e t e r m i n e dt ob e1 a tl a s t ，w es e t t e du pa ne l e c t r o a n a l y s i sm e t h o do fd e t e r m i n i n gc h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) b a s e do nt h ee l e t r o c a l y s i sp r o p e r t yo fd n am o d i f i e de l e c t r o d i nk h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 b u f f e r x 济南大学硕士学位论文 s o l u t i o nw i t hp h6 0c o t a i n i n go 1t o o l l k c l 。t h ep e a kc u r r e n tw a sp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fc a pi nt h er a n g eo f2 8 0 10 7t o3 6 0 x10 击t o o l l 一，w i t had e t e c t i o nl i m i t o f1 3 5 1 0 m o l l 一t h el i n e a rr e g r e s se q u a t i o nw a sf p ( a ) = 5 8 6 5 + 0 4 7 8 4c ( p m o l - l 。1 ) ， a n dt h el i n e a rc o r r e l a t i o nc o f f c i e n tw a s ，= 0 9 9 4 2 t h em e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fc a pi nr e a lc h l o r a r n p h e n i c o le y ed r o p ss a m p l e s ，w h i c ht o t a l l y m e e tt h ed e m a n do fm i c r o a n a l y s i s t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no fe i g h ts a m p l e sa n a l y s i s r e s u l t sw a s1e s st h a n3 k e y w o r d s ：c td n a ；m e s o t e t r a - ( 4 - t r i m e t h y l a m i n o p h e n y l ) p o r p h y r i n ；v i t a m i nb 1 2 ； c h l o r a m p h e n i c o l ；m o d i f i e de l e c t r o d x l d n a 纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用 x i l 济南大学硕士学位论文 第一章绪论 在电化学研究中，自组装修饰电极和电化学生物传感器是研究十分活跃的领 域。自组装修饰电极的主要特征是组织有序、定向、密集和完好的单分子层而且 稳定性好，它具有明晰的微结构，为电化学提供了一个重要的实验场所，借此可 探测在电极表面上微结构和宏观电化学响应之间的关系。 生物传感器是以生物学组件为主要功能性元件，能够感受特定的靶物质并按 一定规律将这种感知转换成可识别信号的器件或装置。生物传感器的产生在医药 检测、食品检测、环境监测以及基因诊断等各个领域有着广泛的应用，其显现的 优越性推动着相关学科及社会的快速发展，并使人们越来越集中于此领域的研 究。尽管生物传感器从产生至今仅有2 0 多年的历史，但已经很快从酶传感器和 组织传感器迅速发展到特异性更加突出的免疫传感器和基因传感器r ( d n a 传感 器) 。电化学d n a 生物传感器是将d n a 探针固定在电极上，电极作为信号传导 器将表面发生的杂交反应导出。电化学d n a 生物传感器可以分为两类，一类是 电化学d n a 杂交生物传感器，它是在电极表面固定单链d n a 作为探针，实现 对探针互补d n a 的检测；另一类则是非基因识别的电化学d n a 生物传感器， 它是在电极表面固定双链d n a 作为传感器的敏感器件，利用其它物质与敏感元 件的作用或者利用d n a 的特性来实现对特定物质的检测和研究f 1 1 。由于d n a 是 电化学惰性的，这就需要在电化学检测中加入电化学活性识别组分。通常这些识 别组分可以选择性地与单链d n a 或双链d n a 作用，所以电化学d n a 传感器通 常是以检测这些电化学活性组分的信号来分析杂交反应的。 在电化学生物传感器中应用的关键技术就是生物分子在载体上的固定。一个 好的生物传感器，不仅要求表面被固定的生物受体达到一定的浓度，而且被固定 的生物分子要保持很好的生物活性。随着人类基因组计划的顺利实施，基于d n a 探针的基因传感器及基因芯片的研究正成为基因组研究的一个热点【2 ，3 1 。无论是 在基因传感器和芯片研究中，还是在其它诸如d n a 与小分子的相互作用研究中， d n a 在基底材料上的固定化都是一个令人感兴趣的课题。各类聚合物、生物亲 和素以及具有大的比表面积、高的电催化活性、良好的稳定性及生物相容性的纳 米材料在电化学传感器的制备中得到了广泛的应用。 d n a 纳米羟幕磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用 众多的新兴生物技术，为发展高灵敏、高特异的实用型生物分析检测注入了 活力。d n a 电化学生物传感器就是一种全新的思路和尝试，与传统的检测技术 相比，其具有快速、灵敏、操作简单的特点，并具有分子识别功能，是当今生物 检测技术的前沿性课题。近年来，国内外关于d n a 修饰电极及电化学d n a 生 物传感器的研究十分活跃，现总结如下： 1 1d n a 修饰电极的制备 d n a 修饰电极是d n a 传感器的一个重要部分，其中d n a 的固定起着至关 重要的作用。d n a 探针的覆盖度、固定方向及稳定性对检测十分重要，有效固 定探针能消除不明确吸附，提高传感器的灵敏度和选择性。电化学d n a 传感器 的性质，包括灵敏度和使用寿命等，很大程度上与探针d n a 的固定方法密切相 关，因此d n a 探针在电极表面的固定首先要考虑实现其与电极的稳定连接和杂 交活性的保持。 先前d n a 修饰电极多采用将巯基引入d n a 末端，通过在金电极表面上吸 附或自组装来制备。但该修饰方法存在着一些问题，诸如s h 修饰的d n a 难以 合成，且需要分离提纯操作繁琐，而且在操作过程中d n a 的生物性质会受到一 定程度的影响；另一方面，巯基化合物结合d n a 后，其体积大幅度增加，故在 金表面自组装比较困难。寻求d n a 在电极表面固定的新方法仍是今后的发展方 向。 文献【4 叫报道通过静电引力将带有负电荷的d n a 固定在带正电的电极上，探 针是平躺在电极表面上的。b e l o s l u d t s e v 等【7 1 使用放射性标记的方法测定了吸附 在氨基硅烷表面上d n a 的杂交反应效率可达5 0 以上，认为这是由于氨基硅烷 表面所带的正电荷较弱，带负电荷的d n a 与电极间作用力就相对较弱，使得单 链d n a 骨架有一定的自由度进行杂交并形成双螺旋结构。但在后续的研究中， 研究者观察到杂交反应形成的双链可以解链恢复成探针和靶序列并继续吸附在 电极表面，因此这个假设是存在缺陷的【引。该研究证明靶序列是以一种非有序的、 松散的螺旋结构与探针结合。因此，很多靠吸附法固定探针的杂交实验得到的都 应该是这种松散的螺旋结构。 近年来，较为理想的d n a 固定方法是通过末端修饰基团实现d n a 在电极 表面的共价自组装。末端连接各类修饰基团可以使d n a 骨架在空间构型上有很 2 济南大学硕士学位论文 大的自由度，有利于碱基暴露和双螺旋结构的形成。同时，探针的组装密度对杂 交效率也有很大影响，并非越多越好。探针过密时，带负电荷的探针对同样带负 电荷的靶序列的静电排斥力就越强，杂交反应越难进行；另一方面，过大的探针 密度会增加靶序列与探针杂交时的空间位阻，进而降低靶序列与探针的接触机 厶 z ；o 电化学d n a 传感器一般用玻碳电极、石墨电极、汞电极、金电极等固体电 极作基础电极，d n a 探针片段要有效地与电极相结合，结合量应满足灵敏度的 需要，不脱落且保持活性。所以d n a 的固定化是重要环节，决定着传感器的性 能。将d n a 修饰到电极上的方法，文献报道主要集中在表面富集、共价修饰、 自组装、组合法等方面。近年来也有报道利用硅烷化法将d n a 固定在玻璃表面 的方法，还有利用生物素亲和素方法固定d n a 等【9 ，10 1 。目前在小分子检测中 d n a 的固定方法主要有以下几种。 1 1 1 直接吸附法