（微生物学专业论文）嗜肺军团菌高温胁迫反应相关基因的筛选.pdf

l t 山大学硕士学位硷文嗜肺军刚菌高温胁迫反应相天基因的筛选莫凌霄 嗜肺军团菌高温胁迫反应相关基因的筛选 专业：微生物学 硕士生：莫凌霄 指导老师：陆勇军副教授 中文摘要 嗜肺军团菌( lp n e u m o p h i l a ) 是一种在水环境中普遍存在的革兰氏阴性细 菌，能够在水中长期存活，并能适应高水温的环境。在适当的条件下可以进入宿 主细胞内进行胞内增殖，对人体肺部的侵染能够导致一种名为“军团病”的非典型 肺炎。本研究首先构建了缺乏启动子的g f p m u t 2 为报告基因的质粒载体p b g 0 1 ， 并在此基础上构建军团菌基因组的启动子文库。然后以4 2 。c 为高温胁迫反应条 件，筛选被抑制或者被诱导表达的启动子片段，经过多轮筛选，一共获得7 个候 选转化子。通过从l p n e u m o p h i l a 的基因组序列中搜索分析，选择其中的l t g m 鞭毛合成的负调控因子( a n t i s i g m a 2 8 因子) 进行了初步的分析。用相关的软件 分析、预测其启动子序列的特征，并将l p n e u m o p h i l a 与其他病原菌中的f l g m 氨基酸序列进行比对，分析其保守区域。f i g m 调控f l i a ( s i g m a 2 8 因子) 的机 制在沙门氏菌等病原菌中研究比较深入，但在军团菌中尚未有相关报道。本研究 结果显示，当温度从3 7 。c 上升到4 2 。c 时，f l g m 的转录和表达被抑制，这与沙门 氏菌、耶尔森氏菌的表现是一致的。由于在l p n e u m o p h i l a 中，f l 认除了是传统 定义的鞭毛转录因子外，还与侵染期相关毒力表型以及抵抗逆境能力的调节有 关，因此，在高温胁迫条件下，f l g m 的转录降低是与l t i a 的大量表达抵抗逆境的 需要相关的。 关键词：嗜肺军团菌，高温胁迫，g f p m u t 2 报告基因，逆境基因筛选 叫j 山大学硕士学位论文 嗜肺军团苗高温胁迫反应柏关基因的筛选莫凌霄 s c r e e n i n gf o rg e n e sr e l a t e dw i t hh i g ht e m p e r a t u r es t r e s s r e s p o n s e i nl e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a m a j o r ：m i c r o b i o l o g y c a n d i d a t e ：m ol i n g x i a o s u p e r v i s o r ：l uy o n g j u n a s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t l e g i o n e l l ap n e u m o p h i l ai sa nu b i q u i t o u sa q u a t i cg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a lp a t h o g e n w h i c hc o u l ds u r v i v ei nw a t e rf o ral o n gt i m ea n da d a p t e dt oh i g ht e m p e r a t u r eu n d e r c e r t a i nc o n d i t i o n ，i tw o u l di n f e c tt h eh o s tc e l la n dm a yc a u s e dan o n t y p i c a l p n e u m o n i ac a l l e dl e g i o n a k e s d i s e a s e i nt h i st h e s i s ，w ec o n s t r u c t e dap r o m o t e r l e s s v e c t o rp b g 0 1u s i n gg f pa s r e p o r tg e n e ，b u i l tap r o m o t e rl i b r a r yf r o mt h el p n e u m o p h i l ag e n o m ea n ds e t4 2 。ca ss t r e s sc o n d i t i o nt os c r e e nf o rt h eg e n e si n d u c e d o ri n h i b i t e db yh i g ht e m p e r a t u r e 7c a n d i d a t e sw e r ef i n a l l yo b t a i n e d b ya n a l y s i so f t h e l p n e u m o p h i l ag e n o m es e q u e n c e ，w ef u r t h e ra n a l y z e dt h ef l g mf l a g e l l u m b i o s y n t h e s i sn e g a t i v er e g u l a t i v ef a c t o r ( a n t i s i g m a 2 8f a c t o r ) a n dp r e d i c t e dt h e p r o m o t e rs e q u e n c ea sw e l la sc o n s e r v e dd o m a i nb ys o f t w a r e w ea l s oa n a l y z e dt h e m e m l t i c so f f l g mf r o m l p n e u m o p h i l aa n do t h e rp a t h o g e n s t h ef l i a f l g mr e g u l a t i o n m e c h a n i s mw e r ec l e a ri ny e r s i n i aa n ds a l m o n e l l a , b u th a s n tb e e nr e p o r t e di nl p n e u m o p h i l a o u rr e s u l ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f f l g mw a sr e p r e s s e dw h e nt h e b a c t e r i aw e r ec u l t u r e di n4 2 。cc o m p a r e dt o3 7 。c ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h e s i t u a t i o ni ny e r s i n i aa n ds a l m o n e l l a s i n c ef l i af u n c t i o n e dm o r et h a nat r a d i t i o n a l s i g m a 2 8f a c t o ri nl p n e u m o p h i l aa n dw a si n v o l v e di nt h et r a n s i m i s s i v e - p h a s er e l a t e d v i r u l e n c ea n dt h e a b i l i t yt o r e s i s ts t r e s s e sw es u g g e s t e dt h a tu n d e rt h e h i g h 巾山大学硕士学位沦文嗜肺军团菌高温胁迫反应相关基因的筛选 莫凌霄 t e m p e r a t u r es t r e s s ，r e p r e s s i o no f f l g mc o o r d i n a t e dw i t ht h en e e dt om a x i m a l l ye x p r e s s f t at oc o p ew i t hs t r e s s e s k e yw o r d s ：lp n e u m o p h i l a ，h i g ht e m p e r a t u r e ，g f p m u t 2r e p o r t e rg e n e ，s c r e e nf o rg e n e i i i 中山大学硕士学位论文嗜肺军幽菌高温胁迫反应相关基困的筛选莫凌霄 第一章前言 嗜肺军团菌( l e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a ) 是广泛分布在水环境中的兼性厌氧革 兰氏阴性细菌，大小为0 3 o 4 # m x 2 3 t m 。在不同生长期呈现不同的形态， 在液体培养下到达对数生长期时，菌体形态发生明显的变化：从丝状体 ( f i l a m e n t o u s ) 至l j 短丝体最后呈单个或成双的雪茄烟状，长期培养后呈球杆状，端生 鞭毛。它可以生活在生物被膜中，也可以在原生动物等宿主细胞内增殖。当人体 吸入了含有军团菌的气溶胶颗粒后，军团菌可以在人体的肺泡巨噬细胞中复制， 裂解细胞，导致一种称为“军团病”的肺炎，临床症状为咳嗽、发烧、呼吸衰竭等， 对人体危害严重。其中血清i 型是导致军团病病发的主要菌株。目前国内对其分 子遗传学的研究较少。嗜肺军团菌全长为3 ，3 9 7 ，7 5 4b p 的全基因组序列已经于 2 0 0 4 年9 月由美国哥伦比亚大学基因组中心( c o l u m b i ag e n o m ec e n t e r ) 测序完 成并对外公布( v d v d v l ，1 e g i o n e l l a c a g e n o m e o r g ) 。 l p n e u m o p h i l a 在宿主细胞内生活的后期称为侵染期，相当于人工培养的指 数后期，细胞呈现一系列的毒力特征。s w a n s o n 等( 1 9 9 5 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 卜一直以来 对l p n e u m o p h i l a 的指数后期相关毒力表型进行了深入的研究。提出了警戒素 p p g p p ，作为第二信使，调控各种相关基因的转录表达。鞭毛是病原菌侵染宿主 的一个重要的毒力因子，与细菌黏附宿主有关。在l p n e u m o p h i l a 中，鞭毛是在 指数期后期( 相当于胞内生长的侵染期) 特异性表达的。鞭毛合成蛋白基因的转 录选择调控因子f l i a ( s i g m a 2 8 ) 与l p n e u m o p h i l a 侵染期的毒力和抗逆性有关。 本研究以4 2 。c 为高温逆境条件，在l p n e u m o p h i l a 基因组启动子文库中筛选得到 鞭毛合成的负调控因子f l g m ( a n t i s i g m a 2 8 因子) 。f i g m 与f l 认的作用机制在 沙门氏菌以及耶尔森氏菌等病原菌中研究得比较清楚，然而在l p n e u m o p h i l a 中 尚未有相关的报道，我们对l p n e u m o p h i l a 中的f l g m 进行了初步的生物信息学 分析。 中山大学硕士学位论文嗜肺军团菌高温胁迫反廊相关基因的9 帝选莫凌霄 1 1 军团菌及军团病的研究进展 1 1 1 军团病的流行病学、临床症状表现 军团菌是引起非典型肺炎的一种机会致病菌菌。它能够通过人工管道系统以 气溶胶的形式进入人体呼吸道，在肺部的巨噬细胞内进行胞内生长，出军团菌所 引起的疾病统称军团病，分为退伍军人病( l e g i o n a i r e s d i s e a s e ) 和p o n t h c 热。 退伍军人病的病征是以轻微的咳嗽、身体不适、肌肉酸痛、低烧以及肠胃病 开始的，后期表现为高烧、齿槽炎和支气管炎，透过x 光胸透可见肺部相当大 的损坏部位( s w a n s o n ，h a m m e ，2 0 0 0 ) ，其致死率为7 一2 4 。p o n t i a c 热在 临床上与退伍军人病明显不同，这是一种温和的，类似流行性感冒的非肺炎疾病 ( f i e l d se ta 1 ，1 9 9 0 ) ，它的病发率较高，而致死率则为零。在感染p o n t i a c 热3 6 小时后，病人会发热，发冷，干咳，肌肉酸痛不适，头痛，但没有肺炎症状。p o n t i a c 热病人血清中含有l p n e u m o p h i l a 抗体，但是却无法在病人体内分离出l p n e u m o p h i l a ( m u d e r e t a l ，1 9 8 9 ；f i e l d se t a l ，1 9 9 0 ) ，估计这是由军团菌毒力因 子的改变，毒力反应以及超敏性反应引起的，也可能是l p n e u m o p h i l a 处于v b n c ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ) 状态( s t e i n e r t ，e m o d y e t a l ，1 9 9 7 ) 。 出现急性肺炎或者支气管炎的军团病的病人的肺泡分泌物中经常带有多核 细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a rc e l l ) 、巨噬细胞，并含有血纤维蛋白、血红细胞、蛋白 物质以及数量显著的细胞碎片( s w a n s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在肺泡细胞胞质囊泡中 或者吞噬溶酶体( p h a g o l y s o s o m e s ) 内或者胞质中可见大量的杆状的军团菌。军 团菌吞噬细胞包围汇集着内质网等细胞器( v o g e l e t 以，1 9 9 9 ) ，老年人以及免疫 缺陷的病人为易感人群，( g a v i n s ，h u g h e s ，2 0 0 0 ) 由于宿主的易感程度不一以 及细菌毒力的不同，很难清晰地判定感染的细菌剂量。 1 1 2 军团菌污染状况及军团病发生的统计 l p n e u m o p h i l a 能够存活在广泛的水环境中，在自由活动的原生动物体内进 行胞内复制增殖。当它从自然的水环境进入人工水环境设备如饮用水系统、中央 空调冷却塔、淋浴器等，可以侵染人体并对人类健康造成很大的危害( 见图1 1 ) 。 2 巾山大学硕士学位论文 嗜肺军团苗高温胁迫反应相关基因的筛选荧凌霄 随着中央空调系统以及各种自动人工水系统的普及，军团菌的污染问题也将愈趋 严重。 a ：e n v i r o n m e n t 雹蘸淼囊篾辣 。v b n c 粤d 。r 旧 i n l ，a c e ! l u l a rg r o v v t hi np r 。i ts u v i v 日 nb i o l 5 i m s b ：i n f e c t i o n 图1 - 1 ：游离在环境中的l p n e u m o p h i l a 侵染原生动物和人体的途径 ( m i c h a e ls t e i n e r t ，e t a l ，2 0 0 2 ) a l p n e u m o p h i l a 在环境中进入可培养状态v b n c ，在生物膜上生存或者在原生动物 内寄生。 b 通过各种人工设备( 淋浴器，空调系统，冷却塔等) 进入人体呼吸道。 c 被巨噬细胞吞噬后，l p n e u m o p h i l a 在一个营养丰富的封闭囊泡内复制繁殖，最后裂 解宿主细胞释放到环境。 f i g 1 1 ：t h ei n f e c t i o np a t h w a yo flp n e u m o p h i l af r o mf l e e i n gl i v i n gt oi n t r a c e l l u l a rg r o w ( m i c h a e ls t e i n e r t ，e t 以，2 0 0 2 ) 据估计，军团病在美国每年有1 0 0 0 宗病例。从北美到西欧的一系列调查研究 发现，在所有的肺炎个案中，大概有1 一1 3 是与军团菌有关的。在社区获得 3 中山大学硕士学位沦文 嗜肺军团菌高温胁迫反应牛h 荚基冈的筛选莫凌霄 性肺炎病例中，有2 一1 5 是军团病( s w a n s o n e t a l ，2 0 0 0 ) 。而医院病发的军 团病症状则更，m 重，根据美国疾病控制中心的监督系统数据显示，其病死率高达 5 0 ( c a r r a t a l ae ta 1 ，1 9 9 4 ：m u d e re la 1 ，1 9 8 9 ) 。1 9 9 9 年2 月，在荷兰w e s t f r i e s e f l o r as h o w 爆发的军团病是有记录以来最严重的一次，其中有2 3 1 人发病，2 1 人 死亡( w i a t e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在我国特别是几个大城市的人工水系统中进行的军 团菌污染调查显示军团菌污染普遍存在。广州、北京、青岛和上海等地的中央空 调冷却塔水检测出军团菌阳性率分别为8 4 、5 5 _ 3 、4 0 * 口3 1 2 ( 旌海琼等， 2 0 0 3 ；彭晓晏等2 0 0 0 ；鲁晓晴、陈悦等，2 0 0 0 ) 。鉴于军团病与其他的肺炎和流 行性感冒病症相似、难以区别，很可能有相当一部分的军团病个案未被报道。 1 1 3 检测与预防措施 在已分离鉴定的军团菌的4 7 个种中，l p n e u m o p h i l a 是分离得最多的与疾病 有关的菌株( m a i w a l d ，e t a l ，1 9 9 8 ) 。传统培养是检测军团菌的标准方法。其他 的常规检测方法包括：p f g e 脉冲电场凝胶电泳，a f l p 扩增片段长度多态性， 随机p c r 和嵌套式p c r 。另外，气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h i c m a s ss p e c t r o m e t r y ) 法可以测定军团菌特异的3 一羟基和2 ，3 一二羟基脂肪酸( b e n s o n ，e la 1 ，1 9 9 8 ) 。 当军团菌的浓度超出规定的标准1 c f u ，m i 水时，必须对水系统进行有效的 净化清洁和维护以预防军团病爆发。尽管红霉素，利福平，都是治疗军团病的有 效抗菌剂，但还是经常有报道这些抗菌剂在致死剂量下仍然无法有效杀灭军团菌 ( b r e i m a n ，1 9 9 8 ) 。由于还没有发现军团菌存在人传染人的途径，因此预防军团 菌的首要措施集中在水系统的清洁环节上，控制军团菌以及其原生动物宿主的污 染。管道系统的材料应用铜质的材料，若采用塑料材料则高度利于lp n e u m o p h i l a 的高度生长繁殖。( r o g e r s ，e ta 1 ，1 9 9 4 ) 4 中山大学硕士学位硷文嗜肺军团苗高温胁迫反应相关基因的筛选莫凌霄 1 2 军团菌的生物学 1 2 1 生态学特征 l p n e u m o p h i l a 是一种嗜热的细菌，能够在2 5 。c 一4 5 c 下生长，最适生长温度为 3 6 。c 。其最适生长的p h 为6 8 7 0 。在人工培养l p n e u m o p h i l a 时需要浓度为2 5 的二氧化碳。其代谢途径独特，不能利用糖类物质氧化或者发酵，只能以氨基酸 作为碳源和能源( m o l m e r e t ，e t a l ，2 0 0 4 ) 。军团菌的生长较常见的细菌慢，代 时为3 个小时。将过夜培养物以1 0 的接种量转接到新鲜培养液中一般1 8 个小 时能到达稳定期，在固体平板上培养大概3 天能形成灰白色、表面光滑的圆形菌 落。在人工条件下培养需要高浓度的l 一半胱氨酸和铁离子，并且以a c e s 为缓 冲剂维持p h 6 9 左右。军团菌在生长过程中产生特殊的腐酸气味，为了保证其生 长，在固体培养同时必须加入活性炭以吸附有害的杂质和自身的代谢物质。 1 2 2 生活环境：自然环境和宿主寄生 在自然的水环境如湖泊河流，l p n e u m o p h i l a 能够低密度地自由存活，而在 生物膜中则大量繁殖。温度、水中有机物、无机物的含量以及胞内生长宿主原生 动物的比例等各种因素都大大地影响着l p n e u m o p h i 肠的生长和传播。这也是为 什么它在人工的暖水系统环境有适宜的温度、有机物以及原生动物，这就是它在 人工水道系统中中密度较高的原因。它对人体的感染途径比较固定：空调系统， 淋水器还有淋浴花洒等产生能够悬浮在空气的微粒一气溶胶，军团菌通过这种形 式进入人体的呼吸系统进而侵染肺部( a t l a s ，1 9 9 9 ) 。 棘状阿米巴( a c a n t h a m o e b a ) ，哈氏变形虫( h a r o n a n n e l l a ) ，纳氏虫属 ( n a e g l e r i a ) 等是在被p n e u m o p h i l a 污i 染的管道系统中分离得最多的原生动物 宿主，其他与l p n e u m o p h i l a 有关的还包括砂壳虫( s a c c a m o e b a ) ，v e x i l l i f e r a 及 p l a t y a m o e b a 。渠县单极虫( t e r a h y m e n ap y r 删括) 与在土壤中生存的l l o n g b e a c h a e 有关( f i e l d s ，1 9 9 6 ：s t e e l e ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。原生动物宿主不仅提供 它胞内生长的营养物质，而且更重要的是当外界环境不利于生长时为其提供一个 良好的保护空间和重新生长繁殖的场所。因此，l p n e u m o p h i l a f f 9 生长状况在一 中山大学硕士学位论文嗜肺军团苗高温胁迫反应牛h 荚基冈的筛选莫凌霄 定程度上是依赖于可利用的宿主原生动物的范围( s t e i n e r t ，e t a l ，1 9 9 8 ；b a r k e r ， b r o w n ，1 9 9 9 ；f r i t s c h e ，e t a l ，1 9 9 9 ；l a n d e r s ，e t n l ，2 0 0 0 ) 。环境中的原生动物 是l p n e u m o p h i l a 在自然和人工环境中存活所必须的宿主。在一定的条件下l p n e u m o p h i l a 会进入v b n c ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a l ) 存在但不可培养的状态，这是 一些革兰氏阴性细菌的特性。在被宿主卡氏棘状阿米巴( a c a n t h a m e b ac a s t e l l a n i i ) 吞食后，l p n e u m o p h i l a 可以重新进入可培养状态( s t e i n e r t ，e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在 a c a n t h a m o e b a 内的l p n e u m o p h i l a 能够抵抗高温、各种消毒剂以及干燥等逆境 ( s t e i n e r t ，e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，在胞内生长的最后阶段，从裂解的宿主细胞中释放出 来的lp n e u m o p h i l a 与在环境中自由生长的lp n e u m o p h i l a 十n 比，也具有更高的抗 逆性( b e r k ，e ta 1 ，1 9 9 8 ；a b uk w a i k ，e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在这个意义上说，原生动 物是lp n e u m o p h i l a 传染到人类的重要而有效的途径( h a r b ，e ta 1 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3l p n e u m o p h i l a 胞内生长的生物学过程 一般情况下，当外源的病原体被细胞摄入后，细胞会将病原体包裹形成吞噬 体。随后吞噬体与溶酶体结合，溶酶体内的各种酸性水解酶( 蛋白酶，核酸酶， 糖苷酶，脂酶等) 在p h 5 左右的条件下降解并杀死病原菌。来被消化的物质残渣 在溶酶体中形成残余小体通过胞吐等方式排除到细胞外。但是某些病原菌如麻风 杆菌( m y c o b a c t e r i u ml e p r a e ) 、利什曼原虫( l e i s h m a n m ) 、lp n e u m o p h i l a 以及某 些借助受体介导侵入宿主细胞的病毒等可以避免进入正常的细胞内吞途径，在巨 噬细胞的吞噬泡中复制繁殖。l p n e u m o p h i l a 通_ 过表面补体一受体介导的方式， 在鞭毛蛋白等因子的作用下进入宿主细胞，阻断宿主体内的吞噬体一溶酶体降解 途径，与内质网融合，形成一个质膜包围的囊泡在宿主内复制。l p n e u m o p h i l a 在宿主原生动物内的黏附和侵染的信号转导仍然是正在研究的热点之一。 1 2 3 1l p n e u m o p h i l a 进入宿主的方式 对lp n e u m o p h i l a 的亚细胞结构以及分子研究进一步揭示p n e u m o p h i l a 进入 宿主的方式有两种：卷曲型进入和传统吞噬作用( a b uk w a i k ，1 9 9 8 ) 。卷曲型进 入方式比较少见，宿主细胞表面形成一个长的伪足，卷曲地盘绕细菌。已发现包 括利什曼原虫( l e i s h m a n i ad o n o c c a n i ) ，布氏疏螺旋体( b o r r e l i ab u r g d o r f e r i ) ， 中山大学硕士学位论文嗜肺军团苗高温胁迫反应相关基冈的筛选莫凌酉 各种螺旋菌以及酵母等有卷曲型的吞噬作用( c h r i s t i e ，2 0 0 0 ：r i t t i g ，e t a l ，1 9 9 8 ) 。 但是这种进入方式并非l p n e u m o p h i l a 胞内存活所必需的，而形成的吞噬体则经 过宿主胞内的运输途径被送到溶酶体( b o z u e ，j a ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。lp n e u m o p h i l a 进入巨噬细胞一般是通过传统吞噬作用。细菌表面蛋白m o m p ( m a j o r o u t e r - m e m b r a n ep r o t e i n ) 的补体组分c 3 和c 3 b i 与巨噬细胞上的补体受体c r i 辛i c r 3 结合产生吞噬作用。另外，还存在着一个不依赖调节素的进入模式( g i b s o n ， f c 酣a 1 ，1 9 9 4 ) 。 1 2 3 2l p n e u m o p h i l a 胞内生长途径 进入宿主以后，细菌重新设定吞噬体的内吞途径。首先，含有l p n e u m o p h i l a 的吞噬体囊泡逐步地与滑面的囊状结构如内质网、线粒体和粗面内质网结合，但 并不与溶酶体融合，囊泡中的酸化程度大大降低。( h a r b ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 早期的 吞噬体( 侵染后5 分钟) 缺乏m h c ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ) 家族i 和1 1 、 碱性磷酸酶以及其他的膜蛋白等内吞体和溶酶体标记，同时增加了女1 1 c d 6 3 ， i a m p 一1 ，ia m p 一2 ，溶酶体组织蛋白酶d ，铁传递蛋白受体等分子标记。到 了复制期，l p n e u m o p h i l a 吞噬体囊泡与溶酶体结合形成复制泡，复制泡持续积 累溶酶体分子标记。l p n e u m o p h i l a 逐渐适应溶酶体内的酸性环境，在复制泡内 通过二等分裂复制繁殖，这时可以观察到宿主细胞内充满lp n e u m o p h i l a 。到了 指数期后期，宿主细胞的营养被消耗完，l p n e u m o p h i l a 就会裂解宿主细胞，重 新回到环境中，寻找新的宿主( s w a n s o n ，e t 口，2 0 0 0 ) 。 目前，l p n e u m o p h i l a 的胞内生长以及复制囊泡合成的模型是：当被阿米巴 虫或者巨噬细胞等摄入后，l p n e u m o p h i l a j l 匝过d o t i c m 分泌系统输出信号效应分 子，对初生的吞噬体进行修饰，将其与吞噬体的胞内途径完全隔绝。接着，宿主 细胞内的内质网开始向吞噬体聚集包围，形成一个囊泡状的保护结构，在这个保 护泡内，l p n e u m o p h i l a 从侵染型转化成复制型，主要表现为耐酸、不依赖 d o t i c m 、不游动、具有抗逆性以及避免与溶酶体融合等。随后，宿主细胞的自 吞作用将包含病原菌的吞噬体囊泡运输到溶酶体，l p n e u m o p h i l a 能够耐受其酸 性环境，并利用溶酶体内的营养物质进行复制增殖。当细胞内的营养物质尤其是 氨基酸匮乏的时候，胞内开始积累第二信使p p g p p ，l p n e u m o p h i l a 的毒力表型被 7 中山大学硕士学位硷文嗜肺军团苗高温胁迫反应州荚批冈的筛选莫凌霄 诱导：包括接触依赖性的细胞毒素( 诱导细胞形成孔洞裂解死亡) 、对高渗透压 的抗性、游动性、逃避溶酶体融合的能力和胞外存活能力的提高等。 图1 - 2 l p n e u m o p h i l a 吞噬体的内吞途径( r o y ，c r , e t a l ，2 0 0 2 ) a 当军团苗进入巨噬细胞后，被出胞质膜衍生而成的吞噬体包含。 b d o t i o t a 分泌系统发出信号阻止包含军团苗的吞噬体与胞内细胞器融合，从而阻止吞噬体的成熟 ( 如酸化等) 。i c m s 和i c i n w 产物在这个过程中发挥重要作用。 c 吞噬体通过l c m r 的作用逐渐将内质网囊泡汇集到其附近。实际上，当军团苗进入宿主后很短时 间内内质网囊泡便开始黏附在吞噬体上。r a l f 蛋白通过d o t i o t a 分泌系统进入宿主细胞内激活宿 主蛋白a r f l ，a r f l 一g f p 在吞噬体上积累。 d 军团苗在宿主细胞内建立了一个表面汇集内质网的囊泡结构。 e 随着内质唰囊泡的建立，宿主的核糖体开始黏附在其上，军阻苗在这个复制囊泡内进行复制繁殖， 同时，复制囊泡的维持不需要d o t i e m 分泌结构的信号转导作用。( c o e r s ，e t a l ，1 9 9 9 ) f i g 1 2 ：t h ee a d o s o m a lp a t h w a yo ft h elp n e u m o p h i l a - c o n l a i n e dp h a g o c y t e 限o y , c r ，e t 口， 2 0 0 1 3 与生长期相关的毒力特征表型以及毒力因子 微生物的一个重要特征是对于生存环境的各种条件如温度，营养，细胞密度， 渗透压等的改变能够作出反应，以适应不同的环境而生存下来。如引起q 热的 立克次氏体科克斯菌属( c o e i e l l ab u r n e t i i ) 在胞内复制与环境中游离时细胞形态 大小存在明显差异( s a m u e l ，e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在游离的环境中，其细胞体积较小 并具有高度的抗逆性。作为一种淡水中的原生动物致病菌，l p n e u m o p h i l a 必须 既能够作为游离的细菌在水中生存，又能在阿米巴等原生动物、哺乳动物的肺泡 8 中山大学硕十学位论文嗜肺军团菌高温睹迫反应相关丛冈的筛选莫凌酉 细胞环境中进行胞内复制，它应当存在着相应基因表达调节机制改变细胞结构或 者代谢途径以适应环境的改变。 1 3 1 两个生长阶段的表型转换 扣原参 二曼叠。 j 焉 豳溷谚墓 离蔓耥骞：黧矗； 7 毒 i 刳1 - - 3 l p n e u m o p h i l a 的生长周期。( m a e l l em e t a l ，2 0 0 4 ) 1 在水中自由生活的lp n e u m o p h i l a 通常形成生物膜。 2 当遇到适当的宿主( 阿米巴虫或者肺部巨噬细胞) 时，被吞噬细胞吞没，能够建立一个保护l p n e u m o p h i l a 免受溶酶体消化的囊泡结构。 3 在营养以及其他条件台适时，胞内的细苗抑制侵染期表型，并激活有利于复制的各种信号途衽。 4 当胞内复制的环境开始恶化，lp n e u m o p h i l a 停止分裂复制，并且相应地表达有利丁细苗离开旧 宿主，重新侵染瓶宿主等的表型。 般时问后，l p n e u m o p h i l a 发展成为成熟的胞内形式( m i f ) ，这 时细胞具有高度的侵染性。宿主细胞被裂解l p n e u m o p h i l a 重新被释放到水环境j _ _ l 。 5 这时l p n e u r a o p h i l a 司以通过人工水道系统进入人体呼吸道，侵染人体肺部，从而导致军团病的 发生；如果不能立刻找到新的宿主，lp n e u m o p h i l a 就在水中形成生物膜，此时的细胞能够抵抗各种 生物杀虫剂。 f i 9 1 3 ：t h eg r o w t hc y c l eo f l p n e u m o p h i l a ( m o l o f s k y ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 当从指数期进入指数后期的时候，lp n e u m o p h i l a 会出现显著的表型转换 ( p h e n o t y p i cs w i t c h ) 。细胞形态上具体表现为从不能游动的丝状杆菌变成短小、 壁厚、具有高度游动性的棒状杆菌。根据其表型转换，将l p n e u m o p h i l a 的生长 周期分成复制期和侵染期。复制期的l p n e u m o p h i l a 一般是侵染宿主前期的细胞 或者人工培养条件下处于指数生长期的细胞。而在侵染宿主的末期、裂解宿主细 9 中山大学硕= = 学位论文 嗜肺军叫菌高温胁进反应十h 芙基冈的筛选莫凌霄 胞的l p n e u m o p h i l a 通常处于侵染期，相当于指数后期到稳定期的细胞。b y r n e 和s w a n s o n 等( 1 9 9 8 ) 用一系列的微生物以及细胞生物学实验对分别处于指数 生长期( 复制期) 以及指数期后期( 侵染期) 的l p n e u m o p h i l a 以人工培养以及 巨噬细胞胞内培养两种方式检测它的对钠盐敏感性、接触依赖性细胞毒性( 引起 宿主细胞坏死的能力) 、渗透压耐受性、避免吞噬体一溶酶体融合的能力、胞内生 长存活能力以及细胞游动性等六方面进行的检测。结果表明，处于指数期的l p n e u m o p h i l a 对钠盐不敏感，细胞毒力减弱并且对逆境的抗性较差；到了指数后 期到稳定期l p n e u m o p h i l a 能够耐受高渗环境，对钠盐敏感，并且能够避免与溶 酶体结合，产生杀死巨噬细胞的细胞毒性，更容易侵染宿主细胞，具有更强的胞 内存活能力。该时期的l p n e u m o p h i l a 对生物杀灭剂、过氧化物、酸、u v 以及 抗生素有很强的抵抗能力( b a k e r ，e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 3 2p p g p p 信号转导途径 表1 1l p n e u m o p h i l a 复制期和侵染期表型表达的调控因子( m o l o f s k y ，e t a i ，2 0 0 4 ) t a b 1 1 ：t h er e g u l a t i o nf a c t o r so ft h el p n e u m o p h i l at r a i t se x p r e s s i o n ( m o l o f s k y ，e ta l ，2 0 0 4 ) 1 0 中山大学硕十学位论文嗜肿车【；l 】苗高温胁迫反应相关娶田的筛选奠凌霄 t 旧n s m i s s i o n 韵i t s 图l _ 4 ：侵染型的l p n e u m o p h i l a 表型是由p p g p p 以及各种选择性的s i g m a 因子 转录后调控系统的配合进行调节i 构( m o l o f s k y ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 侵染期，氨基酸缺乏引起核糖体相关酶r e l a 产生警戒索p p g p p 。胞内的其他信号也导致s p o t 水解酶胎成 酶产生p p g p p 。p p g p p 能够激活双组分系统l e t a l e t s ，增强蛋白l e t e ，s i g m a 因子r p o s 、f l i a 以及推测 的r p o n ，这些因子一起| 办同作用促进lp n e u m o p h i l a 侵染期的表型特征得到表达。被活化的l e t a 能够与 c s r b 作用，从而解除了c s r a 对侵染表型的后转录抑制作j = | j 。t y p e i vd o t l c m 分泌系统是细胞毒性，胞内 途符逃离所必须的，估计其功能是直接地运输毒力的效应因子。 f i g l - 4 ：t h ei e p l i c a t i o np h a s ea n d t r a n s m i s s i o np h a s er e l a t e dt r a i t sa r e e x p r e s s e db y t h e t r a n s c r i p t i o n a lr e g l a t i o no fp p g p pa n dv a r i o u ss i g m af a c t o r ( m o l o f s k y ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 由于氨基酸是l p n e u m o p h i l a 的唯一能源和碳源，通过环境中的氨基酸的水 平可以测定该环境是否营养充足有利于细胞生长。当细胞生长环境中的氨基酸水 平下降，l p n e u m o p h i l a 要面临能源和碳源贫乏的环境。如果将指数期的细胞转 移到指数后期的培养物的上清，在一个代时内( 3 小时) ，细胞毒性，钠盐敏感， 游动性等都被诱导表现出来。而当对这些细胞添加氨基酸培养基( 氨基酸复合物 或者某几种氨基酸) 能够抑制这些毒力特征。说明氨基酸缺乏的培养基能够诱导 l p n e u m o p h i l a 提前进入指数后期以及毒力特征表型的出现( m o l o f s k y ，e t 以， 2 0 0 4 ) 。 l p n e u m o p h i l a 是通过什么方式感知外界的逆境环境如氨基酸贫乏的饥饿环 境，并且调控某些特殊的表型表达如毒力表型等以在各种环境中生存呢? r | i 山大学硕士学位沦文嗜舯军团苗高温胁迫反廊相关基因的筛选莫凌霄 h a m m e r 和s w a m o n 等提出了警戒素p p g p p 的信号转导途径模型( 见图1 4 ) ：当 环境中缺少氨基酸，蛋白质无法合成，使得l p n e u m o p h i l a 细胞内空载的t r n a 增加，进而激活3 ，5 一二焦磷酸鸟苷( p p g p p ) 合成酶r e l a 将g t p 转化成p p g p p ， 促使细菌进入生长稳定期( h a m m e r ，s w a n s o n ，1 9 9 9 ) 。p p g p p 是一个通用的反 应因子( g l o b a lr e s p o n s e ) ，许多不同的微生物在逆境下通过p p g p p 启动一系列的 应激反应( c h a k r a b u r t t y ，b i b b ，1 9 9 7 ；w e n d r i c h ，m a r a h i e l ，1 9 9 7 ：h a r r i s ，e t a l ， 1 9 9 8 ) 。如在黏液球菌属( m y x o c o c c u sx a n t h u s ) ，蓝色链球菌( s t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r ) ，枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 等p p g p p 能够引起抗逆性孢子形 成和成熟，抗生素以及色素的产生。p p g p p 能够改变e c o l i 细胞的生理状态，迅 速地阻碍蛋白、r n a 的合成，d n a 复制以及控制细胞周期，积累稳定期的s i g m a 因子r p o s 。而对于l p n e u m o p h i l a 来说，p p g p p 在逆境条件下作为第二信使调 控基因转录，在l e t a s 、s i g m a 因子、f l i a 、l e t e 等因子的配合下，使细胞停止 复制，诱导l p n e u m o p h i l a 的各种毒力表型表达：细胞毒性，耐渗透压，游动性， 对钠盐敏感以及避免溶酶体和吞噬体融合作用的能力。复制期与侵染期是l p n e u m o p h i l a 细胞周期互惠互利的两个不同阶段，这两个时期的表型差异正是它 充分利用有限资源的策略。在营养物