（营养与食品卫生学专业论文）大豆肽的酶解制备与抗疲劳、抗氧化功能研究.pdf

摘要 摘要 已有研究表明，运动时的氧化应激反应是疲劳形成的重要原因。抗氧化剂能够缓解 氧化应激、抗疲劳。大豆肽作为一种良好的外源性抗氧化剂，具有加工工艺简便、成本 低廉、吸收迅速等特点。本实验主要研究大豆肽在实验动物体内抗疲劳与抗氧化活性， 并讨论二者之间的关系。 本文首先进行了大豆肽酶解工艺的选择。分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶 n e u t r a s e 、中性蛋白酶( 夏盛牌) 、木瓜蛋白酶四种酶在其最适条件下进行水解，以水 解度和清除自由基能力作为评价指标进行讨论。选择清除自由基能力最高的两种酶( 碱 性蛋白酶、中性蛋白酶) 进行双酶同步、分步水解，得到两种大豆肽( a 和b ) 。 分别按照o 8 9 d d k g 1 灌喂小鼠两种大豆肽、大豆分离蛋白，对照组灌喂等量生 理盐水。每日一次，2 周后进行负重游泳实验，讨论力竭游泳时间，并检测肝糖原、肌 肉乳酸、乳酸脱氢酶、血尿氮、肝组织s o d 等生理指标，比较其抗氧化和抗疲劳效果， 并研究抗氧化指标与抗疲劳指标之间的关系。灌喂分子量较小的b 组力竭游泳时间明显 长于其它组，乳酸脱氢酶含量、肌肉乳酸生成量、血尿氮含量明显低于其他组，肝糖原、 s o d 活力明显高于其他组。s o d 活力与力竭游泳时间之间具有线性关系。 5 0 只小鼠分成五组，分别按照0 5 9 d d k g 1 灌喂两种大豆肽、鹿血肽、大豆分离 蛋白，对照组灌喂等量生理盐水。每日一次，3 周后进行水迷宫实验、强迫游泳实验和 定时游泳实验。结果表明大豆肽b 组小鼠绝望游泳时间最短，肝糖原含量最高、血尿氮 含量最低，氧合血红蛋白含量最高，s o d 活力最高；表明大豆肽b 体内抗氧化活性最 好，可以有效地减少能源物质消耗，并且减轻脑部疲劳。大豆肽a 抗疲劳效果其次，与 鹿血肽近似。但都显著高于大豆蛋白组和生理盐水组。 在大豆肽脱苦方面，本文采用活性炭吸附与有机酸、葡萄糖掩盖结合的方法。经正 交试验确定，酶解液经2 活性炭处理后，最佳添加比例为：柠檬酸0 3 ，苹果酸0 1 ， 葡萄糖3 。此时水解液苦味基本被掩盖，具有酸甜的口味并带有淡淡苹果香气。 关键词：大豆肽抗疲劳抗氧化风味调节 a b s u a e r a b s t r a c t o x i d a t i v es t r e s st h a to c c u r r e di ne x e r c i s ei sa ne s s e n t i a lc a u s eo ff a t i g u e t h ea n t i o x i d a n t s c a na l l e v i a t et h eo x i d a t i v es t r e s sa n dl e s s e nf a t i g u e ，n ks o y b c a np e p t i d ei sak i n do fg o o d e x o t i ca n t i o x i d a n tw h i c hh a sf e a t u r e ss u c ha ss i m p l e - c r a f t , l o w - c o s t , a n df a s ta b s o r b e d t h i s e x p e r i m e n ti n v e s t i g a t e dt h ea n t i - f a t i g u ea n da n t i - o x i d a t i o ne f f e c t so fs o y b e a np e p t i d ei nm i c e ， a n dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e m a tf i r s t ，w ec h o s et h ec r a f to fs o yp r o t e i ne n z y m o l y s i s 啊托e f f e c t so f4k i n d so fp r o t e a s e s ( t h ea l k a l i n i t yp r o t e i n a s e ，t h en e u t r a lp r o t e i n a s e ，n e u t r a s e ，p a p a i n ) o nt h eh y d r o l y s i so fs o y p r o t e i nw e r ec o m p a r e db yt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sa n dt h ea b i l i t yo fe l i m i n a t i n gf r e er a d i c a l t h eh y d r o l y s a t eo fa l k a l i n i t yp r o t e i n a s ea n dn e u t r a lp r o t e i n a s eh a dt h eh i g h e s ta b i l i t yo f e l i m i n a t i n gf r e er a d i c a l d o u b l e - e n z y m eh y d r o l y s i s e sw e r ec a r r i e do nw i t ht h i st w ok i n d so f p r o t e a s e s , a n dt h ep r o d u c t sw e r en a m e ds o y b e a np e p t i d ea & b i nf i r s tt e s t ，4 0m i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ，s o y p e p t i d ea & b g r o u p ， s o yp r o t e i ng r o u pw h i c hw e r eg i v e nr e s p e c t i v e l y 谢也p h y s i o l o g i c a ls a l i n e ，s o y p e p t i d ea & b a n ds o yp r o t e i ni g a t0 8 9 ，d k g a f t e r2w e e k s ，w e i g h t - l o a d e ds w i m m i n gt e s tw a sp e r f o r m e d t oo b s e r v et h ed e a t ht i m ea n dt h eo t h e rb i o c h e m i c a li n d i c a t o r s ，s u c ha st h ea c t i v i t i e so fl d h a n ds o d ，t h ec o n t e n to fh e p a t i cg l y c o g e na n db u n t h ee x h a u s t e dt i m eo fs o y p e p t i d eb g r o u pw a go b v i o u s l yl o n g e rt h a nt h eo t h e rg r o u p s ；t h ea c t i v i t yo fl d h i ns o y p e p t i d eb g r o u p w a so b v i o u s l yl o w e rt h a nt h eo t h e rg r o u p s ；s o yp e p t i d ebi n c r e a s e dt h ec o n t e n to fh e p a t i c g l y c o g e n , a n dd e c r e a s e dt h el e v e lo fb u n ；t h ea c t i v i t yo f s o di ng r o u pbw a st h eh i g h e s t i t i sc l e a rt h a ts o yp e p t i d ebw h i c hi ss m a l l e ri nm o l e c u l a rw e i g h ti n c r e a s e dt h ea b i l i t i e so f a n t i f a t i g u ea n da n t i - o x i d a t i o no fm i c e ，a n dt h ea n t i - f a t i g u ea n da n t i - o x i d a t i o na c t i v i t yo fs o y o l i g o p e p t i d e sa l eo b v i o u s l yr e l a t e d i ns e c o n dt e s t , 5 0m i c ew e r er a n d o m l ya n de q u a l l yd i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ，s o y p e p t i d e a & bg r o u p ，s o yp r o t e i ng r o u p ，a n dv e l v e tb l o o dp e p t i d ew h i c h w e r eg i v e nr e s p e c t i v e l yw i t h p h y s i o l o g i c a ls a l i n e ，s o y p e p t i d ea & b a n ds o yp r o t e i ni g a t0 5 e g d k g a f t e r3w e e k s ，m o r r i s w a t e rm a z et e s ta n dd e s p a i rs w i m m i gt e s tw e r ep e r f o r m e dt oo b s e r v et h es u c c e s sr a t i oa n d d e s p a i rt i m e t h er e s u l t sw e r et h a tt h es o y b e a np e p t i d ebg r o u ph a d t h es h o r t e s td e s p a i rt i m e ， t h eh i g h t e s tc o n t e n to fh e p a t i cg l y c o g e na n dt h ea c t i v i t yo fs o d s o y b e a np e p t i d ebc a l l a l l e v i a t em e n t a lf a t i g u ea n dd e c r e a s et h el e v e lo fb u n ，n l ea n t i - f a t i g u ea c t i v i t yo fs o y b e a n p e p t i d ea w a sal i t t l el o w e rt h a np e p t i d eb ，s od i dv e l v e tb l o o dp e p t i d e a c t i v a t e dc h a r c o a l a d s o r p t i o na n dt h eo r g a n i ca c i d ，t h eg l u c o s ew e r eu s e dt o g e t h e rt oc o v e ru pt h eb i t t e rt a s t e t h e b e s tp r o p o r t i o ni s ：2 a c t i v a t e dc h a r c o a l ，o 3 c i t r i c ，0 1 m a l i c ，a n d3 g l u c o s e b i t t e rt a s t e i sc o v e r e db a s i c a l l ya n dt h es o l u t i o nh a st h ef r a g r a n c eo fa p p l e k e y w o r d s ：s o yo l i g o p e p t i d e s ；a n t i f a t i g u e ；a n t i - o x i d a t i o n ；f l a v o ra d j u s t m e n t 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：盗旦亟 日 期：巡：亟：! z 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：1 豫亟亟 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 我国种植大豆、食用大豆及其制品已有几千年历史。大豆中蛋白质的含量约为 3 0 , - - , 4 0 ，大豆蛋白是一种优质的植物蛋白，其氨基酸组成良好，除蛋氨酸略显不足 外，其他人体必需的氨基酸含量均比较丰富，与肉、蛋、奶等优质动物蛋白质近似，并 且可以避免由于动物性食品摄入过多所引起的肥胖、心脑血管疾病、高血脂及高胆固醇 症等。大豆蛋白还具有价格低廉的特点，是欠发达国家和地区理想的蛋白来源。 大豆蛋白存在着不容忽视的缺点。大豆蛋白的平均分子量大，溶解性差，且受p r i 影响较大，在酸性条件下易变性沉淀，无法作为功能性成分应用于乳制品、饮料等食品 中。大豆蛋白的消化率和生物效价远不及乳、蛋等，营养特性较难实现。在生物科技迅 猛发展的时代，人们不仅仅满足于对大豆蛋白质分子结构和作用的认识，而是不断探求 新的功能性成分。因此，改善大豆蛋白的加工及营养性能，使其得到更好、更广泛地应 用，成为诸多食品科技工作者研究的热点【旧。 1 2 大豆肽的定义与抗氧化活性 1 2 1 大豆肽的概述 蛋白质是由多种氨基酸组成，氨基酸之间以酰胺键( t g 称为肽键) 相互连接形成肽。 肽是分子量介于氨基酸于蛋白质之间的一类化合物。一般含有少于1 0 个氨基酸的肽被 称为寡肽，多于十个氨基酸的肽被称为多肽，但两者的界定并不严格。包含超过5 0 个 氨基酸残基的大分子即被称为蛋白质。 人们结合二十世纪8 0 年代后对活性肽类物质的研究，利用大豆蛋白经酶水解后， 得到由多种肽分子组成的混合水解产物，称其为大豆肽。大豆肽与大豆蛋白具有完全相 同的氨基酸组成，一般由2 1 0 个氨基酸残基构成【3 1 ，必需氨基酸平衡良好。与大豆蛋 白相比，大豆肽具备良好的加工特性和独特的生理活性，可用于多种食品乃至化妆品的 生产t 4 j 。 1 2 2 国内外对大豆肽研究现状及发展趋势 大豆蛋白水解物的研究起始于二十世纪6 0 年代。最初采用酸碱化学试剂在一定温 度下进行水解反应，但在研究中发现，化学法制备大豆肽存在种种弊端，如水解过程不 易控制、水解无特异性、副反应多、营养成分损失及水解产物感官性能差、苦臭味等问 题未能解决等，大豆低聚肽的研究进展缓慢。 二十世纪八十年代，随着酶学工业的发展，酶法水解大豆蛋白逐渐成为了研究的主 流。酶法制备大豆多肽的工艺条件一般都比较温和，但因酶理化特性的差异，其反应条 件必须限制在某个最适温度和p h 范围内，否则酶就会失活，而且不同酶水解时的作用 位点和作用机理也不一样。如国内外研究最多的a l c a l a s e 是一种非特异性碱性蛋白酶， 江南大学硕士学位论文 属于内切酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键，催化部位是丝氨酸；复合蛋白酶p r o t a m e x 的活性中心是丝氨酸残基，同时具有内切酶和外切酶的特性，在大豆肽酶解中使用较多； 研究发现，f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶可减少疏水性氨基酸所引起的苦味，可以使大 豆肽在食品工业生产中获得更为广泛的应用。并且，来源不同的蛋白酶，其经济成本存 在很大差别。一般来说，动物蛋白酶来源有限，提取工艺相对复杂，因此价格较高；植 物蛋白酶的来源较为丰富，从一些植物的成熟果实中就可以提取，且工艺较为简便，因 而价格比较低廉；而微生物蛋白酶是通过微生物发酵生产得到的，随着基因工程菌株的 大量应用，发酵法产酶的效率连年提高，微生物蛋白酶的价格也随之下降。在工业生产 中，除了保证一定的水解度，获得一定分子量范围的大豆肽以外，合理选择酶的种类， 可以降低生产成本，获得较高收益1 5 】。 国外对于大豆肽的研究起步较早，其中以美国和日本尤为领先，在基础研究与工业 化应用方面都处于世界前列。二十世纪6 0 年代，美国首先研制出大豆肽。7 0 年代初就 开始研究新型大豆深加工产品大豆多肽，d e l t o w ns p e c i a t i o n 公司建成了年产5 0 0 0 吨的食用大豆蛋白肽生产工厂。9 0 年代初，大豆肽被美国食品药品管理局( f d a ) 批准 为肠道营养剂，大豆肽产品在美国年销售额达上亿美元。日本于二十世纪八十年代开始 了大豆肽的研究，不二制油公司、雪印、森永等乳业公司已成功将大豆肽应用于食品工 业领域。如今，在日本仅运动员食用的大豆肽产品，年销售额就达3 0 亿日元，且呈现 上升趋势旧。 我国对大豆肽的研究起步较晚，于二十世纪八十年代末才开始兴起。近年来，许多 有关大豆肽生产工艺、活性以及工业应用方面的研究层出不穷。1 9 9 3 年盛国华等报道了 大豆多肽的功能及应用研究 7 1 ，1 9 9 6 年赵新淮用蛋白酶水解大豆蛋白并将其水解产物应 用于酸性饮料的生产中。1 9 9 7 年郭凯等发明并申请了大豆肽氨基酸口服液及其制各方法 的专利，制备方法为利用完全脱腥大豆蛋白粉作为原料，使用a s l 3 9 8 蛋白酶、胰蛋白 酶、菠萝蛋白酶中的一种，于3 0 - - 5 0 c 、不同p h 下处理，取上清液再与氨基酸、蛋白 质等复合成氨基酸口服液。1 9 9 9 年李雄辉等提出采用中性蛋白酶a s l 3 9 8 与木瓜蛋白酶 双酶复合水解的方法，可获得比单独使用一种酶更高的水解度，获得分子量在2 0 0 0 以 下的大豆肽网。2 0 0 1 年李书国等采用胰蛋白酶与中性蛋白酶a s l 3 9 8 复合水解大豆分离 蛋白，也获得了良好的效果1 9 1 ，水解度可达到3 0 以上，大豆肽平均链长为2 - 4 个氨基 酸，相对分子量小于1 0 0 0 。 在人们研究优化大豆肽生产工艺条件的同时，对于大豆肽的活性研究也蓬勃发展起 来。刘明提出，大豆抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒 体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的产生，在预防和治疗自由基诱发的疾病和抗衰 老方面有广泛的应用前景【1 0 】。刘忆梅等人的实验表明用高( 1 5 m g k g 1 d 1 ) 、中( 1 0 m g k 9 1 d 以) 剂量组大豆蛋白肽灌胃的小鼠其高密度脂蛋白的浓度明显增高，与高脂 组对照比较，分别增加了4 8 6 和6 7 4 。同时减少了低密度脂蛋白胆固醇的浓度， 使动脉硬化指数a i 值明显降低l l 。这说明大豆蛋白肽降低血清胆固醇的效应，主要表 现在升高高密度脂蛋白胆固醇，降低低密度脂蛋白胆固醇。刘健敏【1 2 】发现，c 末端是 2 第一章绪论 p r o ，p h c ，t y r 或序列中含有疏水性氨基酸是维持高a c e 抑制活性所必需的。此外还有 研究结果表明，具a c e 抑制活性的多肽主要集中在相对分子质量较小的组分。王启荣等 通过使长跑运动员口服大豆肽后进行生理指标的测定，补肽组运动后的体重、瘦体重、 血清睾酮水平比对照组明显提高r p e 等级和血清肌酸激酶显著下降，证实大豆肽在抗 疲劳方面具有良好的作用i l 习。 1 2 3 大豆肽的抗氧化功能性质及其应用 二十世纪中叶以来，生物细胞的氧化损伤，以及进一步诱发疾病和引起机体衰老逐 渐被科学工作者所重视，研究者一直致力于开发有效而安全的天然抗氧化剂。实验证实， 大豆肽具有清除羟自由基、清除超氧阴离子自由基、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过 氧化链式反应等功效【1 4 1 。c h e n 等认为相对分子质量分布在6 0 0 1 7 0 0 之间的多肽具有 高抗氧化能力。并提取出6 个由5 1 6 个氨基酸组成的抗氧化肽分别是：p 1 ： v a l - a s n - p r o - h i s - a s p - h i s - g i n - a m ；p 2 ：l e u - v a l - a s n - p r o h i s - a s p - h i s - g i n - a m ；p 3 ： l e u - l e u - p r o - h i s h i s ；p 4 ：l e u - l e u - p r o - h i s - a 1 a - 脚t y r ；p 5 ：v a l - i i e p r o - a l a - g l y - t y r - p r o ； p 6 ：l c u - g l n - s c r - g l y - a s p - a l a - l e u - a r g - v a l - p r o s e r - o l y t h r - t h r - t y r - t y r 。 大豆肽不仅可以作为抗氧化剂添加到油脂和煎炸类食品中，防止食品自动氧化，提 高品质，还可以作为功能性食品，有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线 粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，在预防和治疗自由基诱发的疾病和抗 衰老方面有广泛的应用前景【1 5 1 。 1 3 对于抗疲劳的研究 1 3 1 疲劳的定义 疲劳( f a t i g u e ) 、是机体复杂的生理生化变化过程。1 9 8 2 年第五届国际运动生化会议 对疲劳概念的定义为：“机体生理过程不能将其机能持续在一特定水平或器官不能维持 其预定的运动强度。一机体活动达到一定强度，糖、蛋白质等能源物质大量消耗，乳酸 等代谢产物堆积，内环境稳定性失调，自由基大量产生，破坏生物膜进而损伤线粒体， 造成a t p 酶活性降低，能量供应不足，此时疲劳的产生可以防止机体发生威胁生命的过 度机能衰竭，提醒工作者应减低工作强度或终止运动以免机体损伤。 广义的疲劳不仅仅指机体的疲惫和运动能力下降，还包括精神上的萎靡不振、抑郁、 焦虑、记忆力下降、意志力消退等等。随着现代社会生活节奏的逐步加快，人们生活和 工作压力的不断增加，精神疲劳已成为不可忽视的问题。尤其是学生和脑力劳动者，他 们的疲劳与体力劳动者以及运动员不同，而是更多地体现在精神方面。在一天的工作和 学习后，虽然体力上并无极大的消耗，但总会有精疲力尽的感觉，经过睡眠休息后，有 时并不能得到良好的改善，因而形成“积劳，久而久之，身体免疫力下降，会引起各 类疾病，甚至对心理健康造成不良的影响。 1 3 2 疲劳产生的机理 江南大学硕士学位论文 疲劳主要包括运动疲劳和精神疲劳两方面。对于造成运动疲劳的原因有许多种学 说，但最主要原因是运动时的自由基损伤。自由基学说认为运动时人体组织因缺血和血 液再灌会大量产生的自由基是造成运动疲劳的重要原因。自由基直接影响c a m g a t p 酶的脱氢，造成胞浆内c a2 + 的浓度升高，从而诱发线粒体对c a 2 + 的大量摄取、堆 积，抑制细胞呼吸，降低a t p 再合成供能速率，最后导致疲劳；当自由基影响细胞膜， 使磷脂发生脂质过氧化作用，微环境发生改变，膜的液态性、流动性改变，通透性升高。 含双键的脂肪酸过氧化可以生成丙二醛，能够使膜成分之间形成交联和聚合，使膜的基 本特征如变构、离子转运、酶活性能等发生改变。 自由基所诱发的脂质过氧化作用不仅影响细胞膜，同时也影响亚细胞结构，这是由 于亚细胞器的膜中磷脂成分比细胞膜含有更多的不饱和脂肪酸，对过氧化作用更加敏 感。根据文献报道，在进行运动时骨骼肌、心肌、肝脏的线粒体、微体和过氧化物酶体 都易受到脂质过氧化的损伤，这些器官的细胞膜及红细胞膜也易产生过氧化【1 6 1 ，所以必 然要影响器官的功能和整体的运动能力。细胞膜通透性的升高使一些内酶及肌红蛋白释 放到血液当中，如肌酸激酶、乳酸脱氢酶等。导致钠泵的功能受到损害，不能有效的维 持细胞内钾离子浓度高以及细胞外钠离子浓度高的正常分布状态，也有损于细胞膜动作 电位的形成及兴奋收缩偶联过程。肌质网钙泵的功能受到损害又将影响对细胞浆内钙离 子浓度的正常调节，进一步也将影响肌肉细胞的收缩和舒张过程【l 刀。此时就将引起肌肉 痉挛等症状。线粒体膜的脂质过氧化反应势必影响线粒体的呼吸功能及a t p 的有氧合 成。这些都将明显地影响肌肉、心肌、肝脏和红细胞以及其他器官的正常功能，与运动 疲劳的发生有密切的联系。 运动时的延迟性肌肉酸痛现象也与自由基密不可分。如前所述，运动时自由基对细 胞膜造成氧化损伤，进而对肌纤维造成微创。而氧化产物丙二醛迅速从产生部位扩散进 入体液，若不能在运动过程中及时在肝脏中得以廓清，更具有潜在的危害性。因此，自 由基的大量生成是运动疲劳产生的主要原因。 由于现代生活压力的不断加大，精神疲劳困扰着越来越多的人。资料显示，近年来 抑郁症和焦虑症的发病几率越来越大，且呈连年上升趋势。在受到心理刺激且不能宣泄 压力时，机体产生应激反应，会发生中枢单胺类神经递质异常，神经系统分泌异常，或 免疫应激异常等。精神疲劳的危害不容小视i l 引。而精神疲劳的产生与自由基也直接相关。 当自由基破坏细胞膜功能，使得机体运送氧气的能力下降，必然会造成大脑供氧不足， 引起记忆力低下等症状。有研究显示精神压力大以及长时间焦虑也是造成自由基大量生 成的原因。 1 3 3 运动时自由基的生成 在有机体内自由基的生成主要来源于氧的运输过程( 如血红蛋白和肌红蛋白的自动 氧化作用) 和细胞内线粒体中氧的利用过程。所以运动时自由基的生成和防护成为人们 特别关注的问题。在进行大强度的有氧运动时消耗氧气比静息状态增加1 0 1 5 倍，自由 基的生成速率必然会增多。1 9 8 2 年d a v i e s 等报道，未训练鼠在跑台运动进行到精疲力 4 第一章绪论 竭时，肝脏和骨骼肌中自由基的产生率增多2 3 倍，丙二醛含量显著增多，肌内质网及 肌肉肌质网潜力降低，反映线粒体氧化磷酸化偶联参数的呼吸控制指数降低。我国许豪 文等首先研究了体育系大学生8 0 0 m 和3 0 0 0 m 赛跑前后血液中丙二醛、各种抗氧化酶、 抗氧化剂的变化特点，发现8 0 0 m 赛跑前后血液中丙二醛浓度未见显著升高，3 0 0 0 m 跑 后丙二醛浓度显著高于运动前水平，两种不同距离跑后及恢复期中超氧化物歧化酶、谷 胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的活性倾向于显著升高，6 磷酸葡萄糖脱氢酶和过 氧化氢酶的活性降低。 运动时自由基生成增多引起脂质过氧化反应以及其他毒性反应的机制目前可以归 纳为以下几方面：运动时机体氧消耗量增多，增加了血红蛋白的载氧负荷，氧合血红蛋 白的自氧化以及骨骼肌、心肌等部位线粒体呼吸作用增强，泛半醌转运率加快等都可以 形成自由基。 儿茶酚胺的大量分泌也可以自氧化形成自由基。缺血后再灌注。氧化过程突然进行 极易引起氧化损伤导致细胞机能出现一系列紊乱。可以产生膜通透性增大，钙离子进入 肌质网减慢，线粒体肿胀，呼吸机能减弱，溶血，以及形成一些毒性产物。在进行动力 性运动时体内血液重新分配内脏区域供血量减少，进行静力性运动骨骼肌暂时中止血流 供应后血流再灌注都可能导致自由基的生成。 能源物质消耗，如葡萄糖、糖原。细胞氧化还原状态紊乱。氧化还原酶系的活性变 化和大量乳酸的生成与廓清过程都可以引起细胞内n a d h n a d p h 比值变化，对于自由 基的生成有一定的作用。 体温升高以及训练水平不足。在运动训练时可以改善机体抗氧化酶系的机能，可以 保证在低强度运动和静息状态时更有效地清除自由基以及衍生物，但是这些抗氧化酶系 活性的提高仍相对小于线粒体有氧代谢能力，因此当机体长时间进行最大能力有氧运动 时自有机的生成率必然会超过自由基的清除率，引起自由基及有关衍生物的代谢堆积， 对细胞产生毒性作用，与这一类型的运动性疲劳的发生必然会有密切的联系。 1 3 4 国内外抗疲劳活性物质的研究现状 国内外对于具有抗疲劳功能的物质的研究可谓多种多样，主要集中在肽类物质以及 抗氧化物质两大类。现代营养学研究发现，肽具有比游离氨基酸吸收快、吸收率好、生 物效价高等特点，是具有多种生理功能的活性物质。其中，抗疲劳肽具有明显提高人体 工作能力，增强肌肉含量和力量，维持或提高机体的运动能力，并且快速消除疲劳，迅 速恢复和增强体力1 1 9 】等功效，有助于在运动环境下维持人体健康。“高f 值寡肽”是指 氨基酸混合物中支链氨基酸与芳香族氨基酸比值远高于人体中这两类氨基酸比值模式 的寡肽。据研究证实，高f 值寡肽混合物显著延长实验动物负重游泳力竭时间，具有延 缓疲劳的作用【2 啦l 】利用玉米蛋白经复合酶水解后制备出玉米高f 值寡肽，除了对其抗疲 劳作用进行评价以外，还讨论了其在饮料方面的应用。在高强度劳动者和运动员食品营 养强化剂等方面具有很好的应用前景。 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，在生物体中可以清除自由基， 江甫大学硕士学位论文 消除过氧化带来的伤害。在体内主要参与三羧酸循环及糖代谢使动物体获得高能量，并 且还能激活各种酶，从而促进碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢供能，迅速缓解运动型疲 劳。 肌肽、鹅肌肽是大量存在于动物尤其是水产品肌肉中的两种结构相似的天然小分子 二肽，均具有抗疲劳、抗氧化、抗贫血以及增强记忆力等功能 2 2 1 ，海洋高速回游鱼类的 肌肉中含有大量的抗疲劳因子，因而海参肽、鲑鱼肽有明显降低人体乳酸及尿酸作用 是缓解现代人紧张、疲劳、高尿酸的新材料。 在肽类研究如火如荼的同时，抗氧化物质的抗疲劳活性越来越受到人们的重视。杨 艳晖等团】证实番茄红素可作为生物抗氧化剂，在对体内单线态氧的淬灭、捕获自由基等 方面发挥积极作用，能够消除体内因运动而产生的过氧自由基，从而延缓疲劳的产生或 有助于运动后疲劳的消除。同时，也提出了抗疲劳与抗氧化的关系问题，再一次验证了 自由基理论中有关疲劳生成的自由基影响学说。 此外，如牛磺酸、中药复合制剂以及一些多糖类物质也被证实具有抗疲劳活性。为 抗疲劳的研究开拓了新的思路 2 4 - 2 0 3 。 1 4 本实验研究意义 大豆肽作为一种优质的蛋白质水解产物，其氨基酸组成与配比均非常适合作为营养 添加剂，且原料来源广泛，廉价易得，生产工艺纯熟，因此具有广阔的开发和应用前景。 在现有的大豆肽制备工艺中，选择了双酶水解的方法以求得到具有更高水解度和抗 氧化活性的肽段。通过小鼠游泳实验，考察大豆肽的抗疲劳与抗氧化活性并且探求两者 之间的关系。 目前，关于蛋白质消化吸收的观念，倾向于认为膳食中的蛋白质在消化道( 主要是 小肠) 中的消化液作用下，分解成低聚肽( 占2 3 ) 和游离氨基酸，低聚肽再由小肠绒毛刷 状缘膜的肽酶( 主要为氨基肽酶) 进一步分解为短肽，通过小肠绒毛刷状缘膜上的肽载 体直接进入血液循环，进入组织参与蛋白质代谢。因此，可以认为短肽的直接吸收是机 体摄入蛋白质的主要形式。相对分子量在1 0 0 0 以下的小分子大豆肽可以不通过载体直 接被吸收，因此与氨基酸吸收相比，小分子大豆肽吸收具有速度快、耗能低、可以消除 以游离氨基酸形式吸收时氨基酸之间的相互竞争的特点【2 1 7 1 。大豆多肽与大豆蛋白相比， 不仅具有与大豆蛋白相同的必需氨基酸，而且其消化吸收比大豆蛋白快，能迅速供能， 具有加速运动员肌肉疲劳恢复的作用。 已有研究者利用外源性抗氧化剂饲喂实验动物达到抗疲劳的功效。因此，抗疲劳与 抗氧化的关系问题变得十分令人瞩目。在生活节奏日益加快、竞争日益激烈的现代社会， 研究和开发抗疲劳产品具有十分重要而深远的意义。通过添加外源性抗氧化剂的方式达 到抗疲劳的目的，并且可以同时抵抗衰老与自由基引起的疾病，起到一举多得的效果。 大豆肽体外抗氧化的能力已被人们所认可，但国内关于大豆肽体内抗氧化活性的研 究较少。在研究大豆肽体内抗氧化能力的同时，我们将其良好的抗疲劳活性与抗氧化活 性联系起来，探求两者之间的联系；与此同时，研究不同分子量大豆低聚肽的抗氧化能 第一章绪论 力与抗疲劳能力，有助于认识肽类的生理功能和指导大豆肽类的生产。 除了运动型疲劳以外，通过m o m s 水迷宫实验、强迫游泳实验等提出了抗氧化与抗 精神疲劳的关系这一问题，并对大豆肽的抗精神疲劳活性进行了初步探讨。 通过活性炭吸附与有机酸掩盖协同作用，降低大豆肽的苦昧，可以使其在功能性 食品中得到更广泛的应用。 江南大学硕士学位论文 2 1 前言 第二章大豆蛋白酶解制备大豆肽 大豆蛋白作为一种优质的植物蛋白，其氨基酸含量与配比均非常好，但其加工性能 远不及大豆肽，并且在蛋白质的多肽链内部存在着多功能区，是生物活性肽的前体，选 择合适的蛋白酶水解这些多肽链，可以把其有生物活性的肽链片段释放出来，从而可制 各出具有各种各样生理功能的生物活性肽。目前国内外对大豆肽的酶解工艺方面的研究 已较为成熟。碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶都是较常用的酶【2 引。 刘健敏 2 9 1 等利用碱性蛋白酶a l e a l a s e 和中性蛋白酶a s l 3 9 8 分别水解得到了水解度在 2 0 以上的大豆肽；张玲华 3 0 l 等利用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行双酶水解，得到了比 单一酶水解更好的效果。 大豆蛋白及其低聚肽都发现具有抗氧化活性【3 l 删，其抗氧化活性与分子量大小密切 相关。c h e r t 等研究表明，由5 , - , 1 6 个氨基酸残基组成的大豆低聚肽具有良好的抗氧化活 性，相对分子量分布在约6 0 0 , - - 1 7 0 0 范围内。另一方面，由于肽类分子大小与其吸收、 转运间存在密切的关系，可能影响到其抗氧化性质的发挥。抗氧化性还与肽中含有的某 些能与自由基反应的特殊基团供氢基团有关，只有水解达到一定程度，肽在适当的 分子量范围时，这些基团才能够得到充分的暴露，与自由基作用阳。 此外，大豆肽的抗氧化能力还受氨基酸的种类、数量以及排列顺序的影响。张英等 研究表明，谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等具有清除 羟自由基的能力。e h e n 等【3 5 】和n i r a n j a n t 3 6 等认为肽的抗氧化活性与肽链中含有的疏水性 氨基酸有关，当n - 端为疏水性氨基酸缬氨酸和亮氨酸时，抗氧化活性最高。 本章旨在选取不同酶在各自最适条件下水解出的水解液，比较其水解度和清除自由 基能力，选择合适的酶解工艺条件。并测定其氨基酸组成和体外清除自由基能力，为下 一步体内抗氧化活性和抗疲劳活性的研究奠定基础。 2 2 实验材料和设备 2 2 1 主要仪器及设备 酶反应器 9 0 2 定时恒温磁力搅拌器 p h s 3 c 精密p h 计 7 2 2 分光光度计 x w 二8 0 a 微型旋涡混合仪 h h s l l - 2 1 3 型电热恒温水浴锅 上海精科实业有限公司 上海沪西分析仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海沪西分析仪器厂 上海医疗器械五厂 第二章大豆蛋白酶解制各大豆肽 2 2 2 主要试剂与材料 大豆分离蛋白，蛋白质含量为8 8 ，木瓜蛋白酶，1x1 0 6u g - 1 ，无锡雪梅酶制剂 有限公司；a l e a l a s e 2 4 l 碱性蛋白酶，1 1 0 0 0 u m l 1 ，n o v o 公司；中性蛋白酶蛋白酶i n e u t r a s e 丹麦n o v o 公司，活力0 5 a u g - 1 ；中性蛋白酶i i ：夏盛实业集团有限公司， 5 1 0 4u g - 1 ；二苯基苦基苯肼( d p p h ) ，分析纯，美国s i g m a 公司；其它试剂如氮菲 罗林、n a o h 、i - 1 2 0 2 、f e s 0 4 、d p p h 等均为a r 级试剂。 2 3 实验方法 2 3 1 大豆蛋白的酶解工艺 按一定的底物浓度准确称取大豆分离蛋白粉于酶反应器中，加入去离子水搅拌均 匀，9 0 c 预处理1 5 m i n ，迅速降温至酶解反应温度保温5 m i n 左右，用1 0 m o l l - 1n a o h 调p h 至酶的最适值后加酶，采用p h - s t a t 法控制反应体系的p h 值，确保反应液的p h 在设 定p h 的o 0 2 之间，反应结束后，沸水浴灭酶1 0 m i n ，添加1 0m o l l - 1h c l 调p h 至4 3 ， 4 0 0 0r r a i n 1 离，f i q 0r a i n ，取上清液进行冷冻干燥备用。 2 3 2 单一酶水解 本实验选择常用的几种蛋白酶分别在其最适条件下对大豆分离蛋白进行酶解。酶解 条件见表2 - 1 表2 - 1 各种酶的反应条件 t a b 2 1c o n d i t i o n so fd i f f e r e n te n z y m er e a c t i o n 2 3 3 双酶同步水解 采用中性蛋白酶i i 和碱性蛋白酶a l c a l a s e 复合，底物浓度为8 ，加酶量为4 ( 碱 性蛋白酶：中性蛋白酶= 1 ：1 ) 水解温度为5 50 c ，p h = 7 5 ，水解时间为3 小时。水解完 成后测定水解度及产物清除自由基能力。 2 3 4 双酶分步水解 先用2 碱性蛋白酶在5 5 。c ，p h 8 0 条件下水解，底物浓度仍为8 ，2 小时后将p h 9 江南大学硕士学位论文 调整到7 o ，加2 e e 性蛋白酶i i 继续水解- d , 时。结束后测定水解度及产物清除自由基 能力。 2 3 5 蛋白质水解度的测定 蛋白质的水解度( d e g r e eo f h y d r o l y s i s ，d h ) 是指在蛋白质水解反应过程中被裂解的肽 键占蛋白质总肽键的百分数。 在碱性或中性条件下水解时，水解度的测定采用p i t s t a t 法： d h c 胁糍筹x 1 0 0 = b x 石1 石1 石1 枷。 式中：b 一水解过程中所消耗的碱液量( m l ) 矾一碱液的摩尔浓度； 口一氨基的解离度( 可查表) ； m v 一底物中蛋白质的总量( g ) ； k 一底物中蛋白质肽键总数( r e t o o l g ) 约为7 7 5 2 3 6 酶解后产物清除羟自由基活性的测定 袁2 - 2 清除羟自由基活性测定 t a b 2 - 2d e t e r m i n a t i o no fh y d r o x y lr a d i c a l sa v e n g i n gr a t e 按照表2 - 2 加样，混匀后，于3 7 1 2 水浴6 0 m i n ，于5 3 6 n m 波长处测定吸光度。 计算：清除率( ) ：( a 样品- a 损伤组) ( a 未损伤组织- a 蝴) x 1 0 0 2 3 7 酶解后产物清除d p p h 自由基活性的测定 采用d p p h 法f 3 7 1 。将酶解产物配成浓度为2 m g m l 的溶液，另配制浓度为l x l 0 _ 4 m o l l 1 d p p h 无水乙醇溶液，避光保存。取2m l 试样与2m ld p p h 无水乙醇溶液混 合，并剧烈振荡，在室温下避光反应2 0m i n ，然后在5 1 7a m 处测定吸光值a i 。空白组 以等体积无水乙醇溶液代替d p p h 溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。d p p h 自由基的清除率用下式计算： 1 0 第二章大豆蛋白酶解制各大豆肽 d p p h 自由基的清除靴= ( 1 一型a o x l o 。 l， 式中：一对照组吸光度； 加一样品组吸光度； 局一空白组吸光度。 2 3 8 氨基酸的测定 氨基酸组成：安捷伦液相色谱( 紫外检测器) ，江南大学分析测试中心。 2 3 9 分子量分布范围测定 采用高效液相色谱法。色谱柱采用s e p h o d e xp r o t e i nk w 8 0 2 5 ，流动相为5 0 m m o l l p b s ( p h 7 0 ) + 0 0 3 m o f ln a c l ，流速为0 s m l m i n ，柱温3 0 c 。 2 4 结果与讨论 2 4 1 选用不同蛋白酶水解进程以及产物清除自由基效果 3 0 2 5 2 0 辞 1 5 o 1 0 5 0 05 01 0 01 5 02 0 0 时间m i n 卜碱性蛋白酶 十木瓜蛋白酶 + 中性蛋白酶in e u t r a s e + 中性蛋白酶i i 图2 - 1 不同蛋白酶水解进程图 f i g 2 - 1p r o c e s so fd i f f e r e n tp r o t a i ne n z y m o l y s i s 用四种备用酶在各自最佳条件下分别对大豆蛋白进行催化酶解。大豆蛋白在酶解过 程中，水解度可以量化地反映酶解的进程。但是，水解度不同的条件下，由于蛋白酶对 肽键的切割程度不同，