（植物学专业论文）黑曲霉hg1固态发酵苹果渣和棉粕生产果胶酶的工艺研究.pdf

甘肃农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 果胶酶( p e c t i n a s e ) 是世界四大酶制剂之一，是分解果胶质酶类的总称，在 食品、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂等行业应用十分广泛。果胶酶通常包括 聚半乳糖醛酸酶( p g ) 、果胶质酶( p e ) 、果胶裂解酶( p l ) 等主要成分。不同 组分的作用机理和酶学特性存在差异。黑曲霉是果胶酶工业化生产的主要菌种。 为了进一步开发黑曲霉产果胶酶酶能力，本论文研究了以黑曲霉h g 1 固态发酵 苹果渣和棉粕生产果胶酶的工艺研究。 本文是采用价格低廉的农业废弃物苹果渣和棉粕为主要原料生产果胶酶，优 化其生产工艺，并对果胶酶的部分酶学性质进行研究。研究中，以黑曲霉h g 1 为生产菌种，采用单因子试验和正交试验进行固态发酵。试验结果表明，培养基 为苹果渣1 0 9 、棉粕1 0 9 、( n h 4 ) 2 s 0 40 2 9 、k 2 h p 0 40 0 6 9 、初始水分含量6 0 ， 及最适发酵条件为装料量2 0 9 干料2 5 0 m l 三角瓶、3 0 ( 2 恒温培养4 8 h 时，所得果 胶酶酶活力可达2 2 2 4 8u g 。 果胶酶酶促反应最适温度为4 5 ，最适p h 为5 0 ；在5 0 以下，p h3 0 - - 6 0 时稳定性良好；c a 2 + 、m g + 、f e 2 + 对该酶有激活作用，而b a 2 + 、l v l n 2 + 、z n 2 + 有抑 制作用。 结果表明苹果渣和棉粕代替麸皮作为黑曲霉h g 一1 固态发酵生产果胶酶的主 要原料在技术上具有可行性，还可以部分解决苹果渣和棉粕的综合利用问题。 关键词：苹果渣；棉粕；固态发酵；黑曲霉；果胶酶 甘肃农业大学硕士学位论文 s u m m a r y p e c t i n a s ei so n eo ft h ef o u r t ho ft h ee n z y m ep r e p a r a t i o n si nt h ew o r l da n di s c o l l e c t i v ec a l lf o ra n ya i z y m ew h i c hb r e a k sd o w np e c t i cs u b s t a n c ea n dp e c t i n a s ei s w i d e l yu s e d i nf o o d s ，m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o n , t e x t i l e , b r e w i n g ， d e t e r g e n tf i e l d p r i m a r i l y , i t s o n t a i n sc o m p o n e n t ss u c ha s p o l y g a l a c t u r o n a s e , p e c t i n e s t e r a s ea n dp e c t i n l y a s e e a c hc o m p o n e n td i f f e r sf r o mo t h e r si nt h em e c h a n i s m o fr e a c t i o na n di t s c h a r a c t e r i s t i c s a s p e r g i l l u s n i g e r w a st h e m a j o rg e n e r a o f m i c r o o r g a n i s m sp r o d u c i n gt h ep e c t i n a s ei ni n d u s t r y i no r d e rt oe x p l o i tt h ec a p a c i t yo f a s p e r g i l l u sn i g e ri np r o d u c i n gt h ee n z y m e ，i ti ss t u d y i n go np r o c e s so fp r o d u c t i n g p e c t i n a s ef r o ma p p l ep o m a c ea n dc o t t o n s e e dm e a lb ya s p e r g i l l u sn i g e rh g - 1i ns o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o ni nt h i sp a p e r i ti so no p t i m i z i n gt h ec u l t u r em e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f a s p e r g i l l u s n i g e rh g - lt op r o d u c ep e c t i n a s ef r o ma p p l ep o m a c ea n dc o t t o n s e e dm e a li ns o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n ，a n dt or e v e a ls o m ep r i m ec h a r a c t e r i s t i co ft h ep e c t i n a s ei nt h i sp a p e r i n t h i ss t u d y , m o n o f a c t o r i a la n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ea d o p t e di ns o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ea c t i v i t yo fp e c t i n a s er e a c h e d2 2 2 4 8u gw h e n a s p e r g i l l u sn i g e rh g 1w a sc u l t u r e da t3 0 cf o r4 8 hi nt h eo p t i m i z e dm e d i u m c o n t a i n i n g 10 9a p p l ep o m a c e ，1 0 9c o t t o n s e e dm e a l ，o 2 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4a n d0 0 6 9 k h 2 p 0 4a tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n si n c l u d i n gm o i s t u r ec o n t e n to fs o l i ds u b s t r a t e6 0 ( w w ) a n d2 0 9d r ys u b s t r a t e 2 5 0 m lf l a s k t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp ho fp e c t i n a s er e a c t i o nw e r ea t4 5 。ca n dp h 5 0 p e c t i n a s ew a ss t a b l eb e l o w5 0 。ca n db e t w e e np h 3 0a n dp h 6 0 c a 2 + ，m 9 2 + a n df e + i n c r e a s e dp e c t i n a s ea c t i v i t yw h e r e a sb a 2 + ，m n 2 + ，z n 2 + o b v i o u s l yi n h i b i t e di t t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti tw a st e c h n i c a l l ya n de c o n o m i c a l l yf e a s i b l et op r o d u c e p e c t i n a s ef r o ma p p l ep o m a c eb ya s p e r g i l l u sn i g e rh g 一1i ns o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n i t w a sa l s oa ne f f e c t i v ew a yt om a k et h eb e s to fa p p l ep o m a c e ，a na g r i c u l t u r a lw a s t e p r o d u c e di nl a r g e rq u a n t i t i e si nc h i n a k e yw o r d s ：a p p l ep o m a c e ；c o t t o n s e e dm e a l ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；s o l i d - s t a t e f e r m e n t a t i o n ；p e c t i n a s e 甘肃农业大学硕士学位论文 导师简介 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 论文作者签名：叼够莠 日期：雕莎月& 归 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 第一章文献综述 我国是苹果生产大国，年产鲜果超过2 0 0 0 万吨，加工过程中可排出苹果渣1 0 0 多万吨。目前除少数进行深加工外，大部分因无法利用而废弃，几天内就腐烂变 质，发出酸臭味，严重污染环境1 3 糊。苹果渣不仅含有丰富的糖类、粳脂肪、粗蛋 白和无机盐，而且其果胶含量高达l o 一1 5 ，可诱导微生物产生果胶酶，因此， 可以作为固态发酵生产果胶酶的原料。 果胶酶是世界四大酶制剂之一，在食晶、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂 行业应用十分广泛。目前果胶酶的生产原料依然以麸皮为主，大量消耗了优良的 饲料资源，以苹果渣取代麸皮作为生产果胶酶的主要原料，开始受到国内外学者 的关注。卫春会等对以苹果渣为碳源液态发酵生产果胶酶的工艺进行了研究，酶 活力为3 7 9 1 u m l 3 翘；杨辉等对以苹果渣为主要原料固态发酵生产果胶酶的工艺进 行了优化，酶活力为1 7 4 5 4 u m l 4 0 4 1 1 ；国外学者也采用苹果渣为主要原料，选用 各种微生物进行因态发酵生产果胶酶，其产酶水平也在2 0 0 0u 勉l 以下 4 2 ，矧，仅 为以麸皮为主要原料的生产水平的2 0 - - 3 0 1 “一5 1 ，这是制约其工业化的主要原 因。 本文采用适合在苹果渣上生长的果胶酶高产菌株黑曲霉h g 1 ，以苹果渣为主 要原料进行霹态发酵生产采胶酶，产酶能力不仅远高于其他同类报道潞翱，也略 高于以麸皮为原料的产酶水平【4 5 4 6 1 ，这意味着在果胶酶的工业化生产中，以苹果 渣取代麸皮作为主要原料成为可能。 1 1 本课题的研究背景 一 1 1 1 苹栗渣 1 1 1 1 苹果渣资源 我图是世界上最大的苹采生产国，年产鲜果约1 1 0 0 万吨，除鲜食井，其余均 进行加工。2 0 世纪8 0 年代以来，我国从国外引进了一批较先进的具有一定规模的 浓缩果汁生产线，主要集中在陕西、由东、河南三省。苹果在榨汁的同时产生大 量的果渣，而这些果渣还没有进行适当的开发利用。果汁生产厂家一般是花钱请 当地的农民运走，当垃圾处理。这不但给企遭带来一定的经济负担，两且还造成 有用物质的浪费、大量场地的占用和环境污染。因此，为了充分利用资源、净化 环境，增加果汁企业的经济效益，迫切需要对票渣进行开发。 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 1 1 1 2 苹果渣酌营养成分和营养价值 表1 1 渣的营养成分和营养价值 据有关专家分析，苹果渣中含有丰富的营养成分，由表1 看出，苹果渣的粗 蛋自含量较低，丽粗脂肪和无氮浸出物则含量较高。此外，还含有较丰富的钙、 磷、钾、铁、锰、硫等矿物质宏量元素和微量元素，其中干果渣的铁含量是玉米 的4 。9 倍；赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸的含量分别是玉米的l 。7 倍、重。2 倍和2 。7 5 倍，维 生素b 2 是玉米的3 5 倍，在无氮浸出物中总糖占1 5 以上【n 。 l 。1 1 。3 苹果渣利用方式及效果 ( 1 ) 鲜果渣直接饲喂动物 鲜果渣含水分大，能值低，与精料混合可饲喂奶牛、奶山羊及肥育猪，占日 粮的比例不应超过1 3 ( 以干物质计) 。据相关报道花奶牛日粮中添) ) f 1 2 1k g ( d 头) 鲜 苹果渣，代替部分干草和麸皮，与来添加组相比，平均日产奶量提黼3 6 ，分别 为1 7 1 5 k g 和1 6 5 3 k g ，乳脂率下降0 1 ，差异不显著，试验期4 0 d l 肉降低成本5 0 8 0 元头，经济效益良好【2 1 。 ( 2 ) 干燥处理 将鲜果渣干燥后制成渣粉，可延长其贮存和饲用范围，每l o o k g 鲜渣可得到 2 0 - 一3 0 k g 渣粉，渣粉中含有糖、脂肪、粗蛋白、维生素和微量元素，可取代部分 玉米和麸皮，不同动物的取代量大致为：仔猪3 7 ，肥育猪1 0 2 5 ，雏鸡 2 4 育成鸡5 l o ，蛋鸡3 5 ，牛羊精料补充料1 0 - - - , 2 5 2 7 1 。 有试验证明，雏鸡日粮中添加l 。5 3 0 干渣粉，可提高增重2 6 - - - 2 7 。苏 联学者研究表明，用干粉取代部分浓缩料喂猪，平均目增重可达5 5 0 9 ，每千克增 重耗料量为4 4 k g ，比对照组减少0 6 k g 。据相关报道在肥育猪日粮中添加l o 混合 果渣( 苹果渣、出楂渣、梨渣等) 经3 0 d 试验，结采与未添加组相比，试验组圜增重 为6 4 2 2g ，提高了2 7 5 ；重量比3 2 7 ：1 ，与对照组相当；平均获利提高1 4 3 4 ； 用2 姆果渣代替l 堍奶牛糖料，连续饲喂3 0 d ，发现试验用4 5 岁德系蘅斯坦奶牛采 食量和排粪正常，日产乳18 5 3 k g ，比未添加组提高7 8 6 ，差异显著；每消耗1 k g 精料多产乳0 。4 9 k g ，提高饲料报酬2 2 6 8 ，提高经济效益1 6 8 6 赞。 值得注意的是：若渣粉中含籽食过多会提高单宁含量，影响适阴性，应适当 2 甘肃农业大学硕士学位论文 文献综述 降低添加比例；另外果渣生产季节性强，集中在当年9 月份至来年2 月份，这段时 间大部分地区气温低光照时间短，早晚湿度大，用自然干燥法费工费时，易被杂 菌污染，难以保证果渣质量：采用入工干燥法不受气候影响，可与榨汁同时进行， 果渣品质好，但一次性投资大。 ( 3 ) 食用菌 平菇、金针菇、灵芝等食用菌是一类高蛋白、低脂肪、低热量、营养成份齐 全、风味独特的保健食晶，西前主要以褊籽壳、木藩为原料，利用囱然条件进行 人工栽培，生产和供应受原料、季节变化影响较大，难以满足市场需求。经分析， 果渣中的碳氮比适宣于生长平菇等，且菌丝生长快，出菇多，其接种量一般为培 养料的1 0 - - 一1 5 ，最适温度为2 5 , - , 2 7 c ，空气相对湿度7 0 。 ( 4 ) 柠檬酸 柠檬酸在食品、农业、医药等行业广泛应用，工业上通常用发酵法生产柠檬 酸。其生产原料多为淀粉类、糖液等。剥用果渣发酵生产柠檬酸，不仅有效地剩 用了资源，而且可降低生产成本。1 9 9 5 年，t r a n c t 、m i t c h e l l 。d a 等人报道了利 用菠萝渣通过露态发酵生产柠檬酸，他们在菠萝渣中接入么s p e r g i l l u sf o e t i d u s a c m 3 9 9 6 菌株发酵，其最高产量可达n 1 6 1 9 1 0 0 9 ( 干渣) ，产品中含有7 0 水分和 3 甲醇。据统计，这相当于6 2 4 糖消耗得到的柠檬酸。苹果渣也可用作制取柠檬 酸的原料，在1 2 - - 1 4 的果渣浆液糊中接入1 0 的种母醪，在3 3 一, 3 4 “c 发酵5 6 d ， 再经提纯，冷却，结晶，予燥，就可得到柠檬酸产i l i i f 4 】用果渣生产柠檬酸有一定的 发展前景。 ( 5 ) 果胶 果胶是一种】以半乳糖醛酸为主的复合多糖物质，由于其良好的凝胶特性在食 品、制药、纺织等行业内广泛应用，在国际市场上非常紧俏。近年来，我国果胶 用量屠高不下，主要靠从国外进口满足市场需求，因此开发新的采胶资源势在必 行。苹果渣中也含有较丰富的果胶质。近年来，国内利用苹果渣生产的工艺技术 已形成，僵规模化生产的企业尚且少见。主要原因是投资大，得率不高，质量有 待提高。 ( 6 ) 低聚糖 低聚糖是一类分子中含有单糖数为2 1 0 个的寡糖，因其热值低，甜味纯正、爽 髓，代谢不会影响胰岛素水平，可促进双岐杆菌在肠道增殪，保护牙齿等独特的 保健功能，在食晶中的应用范围非常广泛，已引起世界各个国家的关注。日本青 3 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 森县产业技术开发中心利用苹果渣，成功制造出果渣低聚糖。把微生物所含的果 胶质分解酶固定在树脂上，制成生物反应器，将反应器与果渣接触后就可把残存 在果渣里的果胶转换成低聚糖。1 9 9 5 年，r e n a r d - c mg c 等人研究用碱液处理脱除 果胶的苹果渣，从中提取出了低聚糖。低聚木糖具有良好的增稠性和胶凝特性， 提取所用的碱液为l 。4 m 的k o h 或n a o h 溶液，提取时间为2 1 醯，温度为0 - 4 0 。c ， 并且碱液浓度和提取时间对产品得率的影响最为重要，随着提取时间和碱液浓度 的增加，提取率随之增加【鄹。 ( 7 ) 酶 默栗渣中生产酶的研究，已取得了一定的进展，生产王艺大多为霾态发酵。 b e r o v i e - m ( 1 9 9 7 ) 应用黑曲霉( as p e r g i l l u sn i g e r ) 通过固态发酵苹果渣制取果胶酶 僻铭埝l g t i ce n z g m e ) ，健在发酵基质中混合予适量的豆粉、麸皮、无机盐，调配至 发酵适宜水分，酶最大得率为2 0 0 m g k g 培养基【6 】。h a n g - y d 等人分别使用彳 s p e r g i l l u s f o e t i d u s 、黑蓝霉和米曲酶翟s p e r g i l l u s 。o r g z a e ) 在3 0 。c 下发酵果渣9 6 h 生 产b 呋喃果聚糖酶，分析发现af o e t i e l u s 发酵得到的酶活性最强，产率最高 ( 9 0 0 u k g 果渣) ，在p i - i 3 4 - - 6 。0 之闻具有较高的稳定性，并采用超滤和凝胶过滤措 施对酶进行了纯化，纯化后酶在6 5 、p n 为4 6 时活力最高。h a n g y d 还以a f o e t i d u s n r l3 3 7 为发酵菌种，逶过固态发酵，从果渣中制备出了胞铃果糖苷转移 酶( e x t r a c e c l u t a rf r a c t o s y l t r a n s f e r a s e ) ，发酵温度为3 0 ，经过1 2 0 h 的发酵后，酶活 力可超过1 1 4 0 u ，所得酶作用的适宣温度和p h 值分别为4 0 - 4 5 * c 和5 。0 6 0 ，这种酶 可以实现将蔗糖转化为含有5 0 以上蔗果三糖的糖浆【7 g ow i a c e k - z y c h i l i ns k a - a 等研究人员仍以固态发酵方式，分别接入亳霉和黑曲霉生产木聚糖酶( x y l a n a s e s ) ， 培养基配方为麸皮7 5 ，苹果渣5 ，甜菜废粕2 0 ，在一定条件下发酵，分别得 到酶产率为1 7 。5 u m l 和2 4 m 1 1 9 。以黑曲霉系列n r r l 2 2 7 0 、n r r l 2 0 0 1 、n r r l 5 9 9 、 n r r l 3 7 8 、n r r l 5 6 7 为发酵菌种，苹果渣为发酵基质，制备聚半乳糖醛酸酶，其 中黑曲霉m r l l 5 9 9 在3 0 下培养7 2 h ，可得到具有最高活性的聚半乳糖醛酸酶，酶 的最佳作用条件为4 0 * c 温度下，p h 值为4 5 ( 1 9 9 4 ，h a n g - y d ) 瓣弼。 ( 8 ) 香精和色素 献果渣中提取的香精油是具有天然香味的保健食用油，富含多种维生素，可 用以调配饮料、酒类和糕点等食品的风味。日本弘前大学农学生命科学部与曰本 果品加工公司共同研究从苹果渣中提取浓缩天然香料。将苹果渣离心分离、过滤、 除渣，利用酵母发酵除去糖分，再过滤，浓缩，得到的产品富含天然果香味，使 4 甘肃农业大学硕士学位论文 文献综述 入有愉悦感，用于果汁饮料、化妆品、芳香剂和保健食品中。s a n d h u - o k 以苹果渣 为基础培养基，尝试添加不同的氮源，以红酵母( r h o d ot or u l a ) 为发酵菌种，从中 提取色素，经研究认为使用0 3 的亚铁硫酸铵、自然p n 值，培养7 2 h 可得到较高产 量的色素，并在已烷和丙酮溶液中稳定性好，在水中和盐酸溶液中的溶解性较差 明。al m o s n i n o - a m 等人利用苹果渣中的酶系统，采用固定化酶技术，由多不饱和 脂肪酸( p uf a ) 转化为挥发性香味物质( 如乙醛、2 ，4 - 癸- - 烯等) u 2 1 。 董1 。1 4 萆采渣的发展前景 苹果渣含水量高、可溶性物质多，在很短时间内极易腐败变质，很难贮存利 用或远距离输送。所以，果汁生产厂家应在榨汁的同时，对生产过程中得到的果 渣及时进行烘干处理。这样一方面便于贮存、输送，另一方面也减小了体积，提 高了产晶的商品性。苹果渣中含有多种营养成分，对苹果渣进行合理的开发利用 既可以提高果汁生产厂家的经济效益，向社会提供产品，又保护了环境。但由于 农民对苹果渣利用的效果和其营养成分不了解，霉加上果汁生产厂家缺乏切实可 行的开发计划和技术资料，因此，目前在对苹果渣的开发利用这方面基本上是空 自。现在最紧迫的任务是加紧这方露的系统研究，使其尽快地得到推广及应用。 1 1 2 棉粕 l 。1 2 1 棉粕资源及营养成分 我国是产棉大国，棉籽饼粕产量大( 约3 0 0 万吨年) ，是丰富的蛋白来源。围 绕如何麓效合理地利用好这一资源，近年国内外已做了大量工作，并取得了定 进展。 棉籽饼粕是重要的植物蛋白资源，棉籽不仅含有丰富的油脂，而且含有丰富 的蛋白质。剥绒后的棉籽含蛋白质2 2 一2 5 。棉籽提取棉油后的棉籽饼粕，含有 3 0 4 0 的蛋白质，是重要的植物蛋白资源。 棉籽饼粕的营养价值，因棉花种籽的质量和榨油工艺的不同而有差别。般 地讲，棉籽饼粕中蛋白质含量越商，蛋白质中有效赖氨酸的成分越多，含壳量越 少，含残油越低，营养价值越好。根据中国农科院畜牧研究所的分析资料，目前 我国棉籽饼粕的化学组成见表1 ，2 。 表1 2 枫榨棉籽浸出粕蛋白质、氨基羧含量( ) ( 风干) 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 普通棉花的棉籽，含有带毒饿的棉酚及其衍生物，俗称棉毒素。游离状态的 棉酚，对单胃动物有毒害。一般加工的棉籽饼粕，因带有棉酚毒素，除可用作反 刍动物的精饲料( 棉酚可被反刍动物霄里分泌出来的酵素分解) ，对于猪、鸡等畜 禽，特易发生棉酚中毒。因此，隐前我国绝大部分棉籽饼粕，都不作饲料用，而 作为肥料直接下暖，使褥棉籽饼粕中酶高蛋自得不到合理使用而损失，分可惜。 充分地、合理地利用棉籽饼粕蛋白资源，对发展养殖业和发酵工业，有着重要的 经济意义和作用【栩。捣予饼粕孛的有毒有害物质棉籽饼粕中存在着一些特殊的有 毒有害物质，主要有以下两种。 ( 1 ) 褊酚 是存在于棉子色素腺体中的一种有毒物质，存在形式有两种即结合棉酚和游 离棉酚，游离棉酚由于活性基团游离，对动物其有毒害作用结合樵酚活性基团和 氨基酸、磷脂等结合，形成一般不溶于有机溶剂、难被动物消化吸收的物质，对 动物不构成影响。 ( 2 ) 丙烯脂肪酸 它可以改变鸡、及单胃动物的脂类代谢，对鸡蛋品质有三方面的影响，是 贮存后，蛋清会变成桃红色，二是使蛋黄变硬，鸡蛋加热后会形成像海绵似的“海 绵蛋”，三是可降低产蛋率和孵化率。 1 1 2 2 合理利用棉籽粕 棉籽粕是种来源广、价格低的蛋白质饲料，因含有毒物质，特别是游离棉 酚，其利用受到定限制，但只要科学、合理利用，就可以广泛应用于畜禽饲料 中，发挥其饲用价值。 ( 1 ) 品质鉴定 感官检查棉籽粕外观颜色呈黄褐、暗褐或暗红色，一般淡褐色的品质较好， 储存太久或加热过度均会加深其颜色。棉籽粕应新鲜一致，无发霉变质，无异味 及过热之焦味。棉籽粕中不可有过量的棉壳和棉绒，带壳棉的棉籽粕品质较差， 蛋自质含量较低，蛋自质含量随脱壳程度的提高两增加。棉绒较多的棉籽糈蛋白 质含量皱然较高，但其品质较差，利用率较低，同时在生产配料时易堵塞筛孔。 优验检测棉籽粕蛋嘲质含量一般在3 8 左右，但棉籽制油过程中，垒糯混 入量及黑色棉壳含量对棉籽粕成分影响较大。棉壳含蛋白质5 1 0 ，而棉籽本 身含5 5 的粗蛋白质，因此在化验时，应将样品粉细混合均匀后再测定，以免产 生误差。棉籽粕中游离棉酚含量不允许超过1 2 0 0 m g k g ，其测定方法以苯胺法为 6 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 好。棉酚分为结合棉酚和游离棉酚，前者在消化系统中不被动物机体吸收，可很 快随粪便排出体外，毒性很低甚至无毒；质者毒性很大，且易被肠道吸收，在体 内毙较稳定，不易被破坏，有蓄积性。含量超过安全量将导致畜禽生长缓慢、中 毒甚至死亡。中毒症状表现为精神萎靡，呼吸困难。剖检可见体内广泛出血及水 肿。棉籽粕也易感染黄曲霉，必要时应进行检测。 1 1 2 3 脱毒利用 ( 1 ) 脱毒处理 最好是培育无腺体体棉种。因棉籽中色素腺体的数量与棉酚含量有直接的关 系，腺体越少，棉酚量越低。二是改进制油王艺。铡油工艺对棉籽粕的质量影响 很大。因此，要改进制油工艺，使之尽可能将饼粕中游离棉酚含量降低到安全限 度内，并尽可熊将饼粕中游离棉酚含量降低到安全限度内，并尽可能保持蛋囊质 的品质。三是硫酸亚铁脱毒。因为铁离子可与游离棉酚按1 ：1 结合成“棉酚铁， 使其失灞薅解毒。棉酚铁在肠中吸收不良，同时铁离子毙降低棉酚在肝内蓄积， 可减轻或预防游离棉酚在体内积累而引起中毒。其脱毒剂量一般以游离棉酚含量 的5 倍，或以饼粕重的2 j j l 入硫酸亚铁。 ( 2 ) 合理利用。 奶牛，由于瘤胃特殊的消化环境，游离棉酚可转化为结食棉酚，使其毒性减 弱。因此，棉籽粕在奶牛精料补充料中可大量饲用，但用量过多，会影响适口性。 一般以不超过1 6 为宜。对瘤胃功能发育不全的幼犊，棉酚对其仍有一定的毒性， 用量应酌减，并添加v a 及钙，以弥补棉籽粕的不足。生长猪配合饲料中游离棉 酚允许量可达6 0 m g k g ，一般品质优良的棉籽粕在生长猪配合饲料中可用到8 左 右，但需补充其所缺乏的赖氨酸，如在日粮中添加0 2 一0 。3 赖氨酸。鉴于棉籽 粕质量不稳定和棉酚毒性问题，一般在仔猪前后期配合料中不宜使用。产蛋鸡配 合料中游离棉酚允许量不超过2 0 m g k g ，否则蛋鸡的生产性能和蛋晶质量受到影 响。一般用量为1 0 左右，但需补充不足的赖氨酸。对于生长鸡用量酌增，但最 好与其宅饼粕搭配使震，饲用效果较好。肉鸡饲料中尽量避免使用，因含壳太多 的棉籽粕，热能较低。成年鲤鱼颗粒饲料中用量2 0 左右，成年草鱼颗粒饲料中 以1 5 为宣否则革鱼易患出血瘸。长期大童饲喂棉绒含量高的棉籽粕，棉绒会转 积累到鱼腮之中，鱼呼吸困难而死亡。 1 董2 4 提高棒子饼粕营养价值的途径 ( 1 ) 改进棉籽油工艺 7 甘肃农业大学硕士学位论文 文献综述 我国现行的棉子取油工艺，对蛋白质、氨基酸的利用率影响较大，而且残油 率、粗纤维含量、有毒有害物质含量高，必须予以改进。主要改进方法有三：是 用低温直接溶剂浸出，以防止蛋囱质破坏降低棉酚含量；是采用特殊的工艺，分 离棉籽的腺体，以降低有毒有害物质含量；是改高水分蒸炒为低水分蒸炒，以减 少色素腺的破裂，保护赖氨酸。 ( 2 ) 脱毒处理目前较普遍的脱毒处理办法有以下几种。 化学去毒法：其原理是剩用某些化学制荆和游离棉酚、环丙烯脂肪酸结合， 使其破坏而失去毒害作用。最常用的是硫酸亚铁溶液法，适用于对饼粕的直接处 理。具体方法是：焉o 2 - 0 5 的硫酸亚铁水溶液，按饼、水比例1 ：2 5 浸泡2 4 h 或 水煮3 0 m i n 耳p 可，脱毒率可达8 1 。作为脱毒试剂的还有尿素、碱、芳香胺、石灰 水等。 棉饼膨化脱毒( 宜于在取油工艺中结合应用) ：棉饼在膨化过程中，由于受 高温、高压、高剪切力的作用，蛋自质复杂结构裂解，利于消化吸收。采用漫法 膨化，可使棉酚、环丙烯脂肪酸大幅度降低。如果在膨化前加人硫酸亚铁和石灰 水、尿素等，脱毒率可在9 0 ，效果良好。同时膨化还可使荣体脂肪酶全部失活， 对防止饼粕脂肪氧化作用明显，值得推广。 微生物脱毒；传统的棉子饼坑埋法就是利用厌氧微生物的发酵，使棉酚和环 丙烯脂肪酸破坏而去除毒性的。 ( 3 ) 限量饲喂 未脱毒的棉籽饼粕用量，产蛋鸡 3 、雏鸡、生长鸡 8 。脱毒后，游离棉 酚含量大大降低，因而可提高棉籽的用量，猪的用量可提高到2 0 3 0 ，蛋鸡用 量宜 1 0 ，肉鸡用量宜 2 0 。对种公畜，使用棉子饼要特别慎重，有许多报道 称棉籽饼使用不当时会严重影响公畜的繁殖能力。 ( 4 ) 平稳饲粮氨基酸 提高饲粮中必需氨基酸蛋白水平，可以降低棉酚的毒性，因氨基酸可和游离 棉酚的活性基结合，降低其毒性。 ( 5 ) 推广应用低酚棉品种 国内外已育出许多低酚棉品； 孛，要注意其推广和应用。 1 1 3 果胶酶 果胶酶( p e e t i n a s e s ) 是指分解采胶物质的多种酶的总称，在食品加工、饲料 加工、造纸、环境保护、诱导植物抗病等方面都有很大的应用价值【1 4 】。 8 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 薹1 3 1 果胶酶的分类 ( 1 ) 通常情况下，可根据以下标准对果胶酶进行分类果胶、果胶酸、原果胶 是否为其优先底物；( 2 ) 底物是被反式消去作用还是永解；( 3 ) 切割方式是随意 的( 内切酶) 还是发生在末端方向的( 外切酶) 。根据以上分类标准，果胶酶一般 可分为以下三大类【阁。 ( a ) 果胶酯酶( f e c t i n e s t e m s e ，p e ) 随机切割甲酯化果胶分子中的甲氧基，产 生甲醇和游离羧基。 ( b ) 解聚酶( d e p o l y m e r i z i n ge n z y m e s ) 水解酶专一水解底物的糖瞥键，可分为： 聚甲基半乳糖醛酸酶( p o l y m e t h y g a l a c t u r o n a s e ，p m g ) ，可分为内切酶( e n d o p m g ) 与外切酶( e x o p m g ) 。聚半乳糖醛酸酶( p o l y m e t h y g a l a e t u r o n a s e ，p g ) ；也可分 为内切酶( e n d o p g ) 与外切酶( e x o p c ) 。另一类解聚酶则通过反式消去作用切割 底物的a 。1 ，4 糖苷键，降解产物带有还原基团和双键，双键位于产物非还原末端 c 4 、c 5 之闻，并在2 3 5 n m 处产生最大紫夕 吸收。此类酶称为裂解酶，可分为聚甲 基半乳糖醛酸裂解酶( p o l y m e t h y l g a l a e t u r o n a t e l y a s e ，p m g l ) ：俗称果胶裂解酶 ( p h i l ) ，可分为内切酶( e n d o - p m g l ) 与外切酶( e x o - p m g l ) ；聚半乳糖醛酸裂解酶 ( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t e l y a s e ，p g l ) ；又称果胶酸裂解酶( p l ) ，也可分为内切酶 ( e n d o p g l ) 与外切酶( e x o p g l ) 。 ( c ) 原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e ，p p a s e ) 原采胶酶是种可以催化原果胶水解的胞 外酶类，可将原果胶分解为水溶性的高聚合度果胶。根据其作用方式可分为( 1 ) a - 型原果胶酶( a p p a s e ) ：作厢于原果胶内部区域的聚半乳糖醛酸部位；( 2 ) b 一型原果 胶酶( b p p a s e ) 作用于与聚半乳糖醛酸链和细胞壁组份( 如纤维素等) 相连的多糖链。 1 9 7 8 年，日本学者s a k a i 等从酵母中发现了具有释放高聚合粟胶能力的原果胶酶产 生菌株。2 0 多年来，他们对各种微生物原果胶酶的酶学性质，作用机理及工业应 用等方面做了大量的研究。现己从细菌，酵母和霉菌中筛选出产该酶的菌株黔6 ”。 1 1 3 2 果胶酶的来源 果胶酶可源予动物、植物和微生物。由于动、植物及天然来源的果胶酶产量 低且提取困难，不能满足生产的需要而微生物因生长速度快，生长条件简单，代 谢过程特殊和分布广因而成为果股酶的重要来源。随着果胶酶用量的增加及发酵 工业的发展，国内外学者对微生物果胶酶进行了深入地研究，并已有多种微生物 来源的果胶酶商晶酶制裁缀售。 微生物果胶酶来源近年来的研究，l t m d b m 等【1 6 】在研究果蔬腐坏瘸过程中发现 9 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 了微生物采胶酶。在以后的几十年里，研究者对微生物果胶酶进行了较为全面的 研究并获得子决速发展。微生物果胶酶来源极其广泛，包括细菌、真菌，放线菌。 如欧文氏菌属( e r w i n i a ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、无枝 酸菌属( a m y c o l a t a ) 、螺孢菌属( s p i r i l l o s p o r a ) 、酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) 、克鲁维酵 母属( k l u y v e r o m y c e s ) 、越霉属( a s p e r g i l l u s ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、侧孢霉 ( s p o r o t r i c h u m ) 、核盘菌属( s c l e r o t i n i a ) 、黑星菌属( 聊加，胁) 等【5 5 5 6 1 。 聚半乳糖醛酸酶( p g ) 催化果胶酸降解，可来源于黑蘸霉、自地霉、克鲁氏 酵母、斋藤曲霉等聚半乳糖醛酸裂解酶( p g l ) 可裂解低甲氧基果胶或果胶酸，来源 于假单胞菌、荧光稷单胞菌、多粘芽孢轷菌果胶酯酶( p e ) 催化果胶脱去甲酯基， 生成果胶酸和甲醇【6 2 1 。 1 1 3 3 果胶酶的研究进展 ( 1 ) 果胶酶的测定方法 果胶酶的测定方法同其链酶类相类似，目前常用的主要有以下尼种主要焦于 测定果胶酯酶活力的滴定法，反映内切酶酶活的黏度下降法，反映内切水解酶和 内切裂解酶综合能力的脱胶作用时闻法，还原糖测定法( 3 ，5 二磷基水杨酸法) ， 紫外吸收测定法等。各种酶活的测定依据自己的情况选定测定的方法。 ( 2 ) 微生物果胶酶的性质 微生物果胶酶的酶学性质国内外学者利用层析，电泳等手段对果胶酶的酶学 性质进行了广泛研究，明确了一些果胶酶的分子量，动力学性质及其影响因素。 常用的采胶酶纯化方法有硫酸铵沉淀，丙酮沉淀，离子交换层析以及凝胶过滤色 谱等。果胶酶分子量一般在2 0 6 0 k d 之间，以单体存在，个别以多聚体形式存在， 如海栖热袍菌果胶酸裂解酶的分子量为1 1 5 2 k d ，结构为四聚体。通常果胶酶的活 性范围在p i - i 3 0 9 0 之间，等电点在p h 4 0 9 。0 之间。 ( 3 ) 果胶酶的分子生物学研究 近年来，果胶酶分子生物学研究进展迅速，已从许多种属微生物中克隆了果 胶酶基因并测序，对果胶酶基因的结构、功能、调控等方面进行了深入研究。已 克隆的微生物以黑曲霉和欧文氏菌为主；克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶基 因和果胶裂解酶基因为主。采胶酶前体一般都含有n 端信号区和糖基纯位点。n 端 信号区一般由1 6 1 7 个氨基酸组成，果胶酶多为糖蛋白，低聚糖以糖替键的形式与 酶蛋自的n 端结合。据报道，果胶酶一般为分泌型胞辨酶，且多力诱导酶，即有 诱导物存在时菌株才能分泌果胶酶，可作为诱导物的有：果胶，聚半乳糖醛酸， l o 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 低浓度的半乳糖醛酸及其寡聚体【翊。 1 1 3 4 果胶酶在生产中的应用 ( 1 ) 果胶酶在栗蔬加工中的应用 新鲜水果和蔬菜果胶质含量约0 5 ，有的高达l 以上，很多水果、蔬菜加工， 比如苹果汁、称猴桃汁、黑加仑、葡萄汁、出渣汁等果汁和葡萄酒、苹果酒等果 酒生产，在生产过程中，应设法提高出汁率以降低成本，要求加快澄清速度和提 高澄清度以提高设备利用率，改善产品质量。然两采胶质的存在影响了出汁率， 并使汁液浑浊，不易过滤和难于澄清，因此果胶成了多余的物质。果胶酶扮演的 角色则是分解这些果胶物质【甥。由东、河北、河南、东北一些生产厂家的实践表 明，添加果胶酶后，提高了出汁率和澄清效果，产品放置数年，未发生浑浊沉淀 的现象。目前，避有一些科学工作者对果胶酶在果汁生产中的具体工艺参数进行 了研究。在苹果汁加工中使用果胶酶的作用是促使果汁中悬浮的粒子絮凝沉淀， 从丽分离，减轻提取果汁的困难，可得到澄清的苹果汁。两在葡萄汁生产中引用 果胶酶制剂则可降低葡萄汁液的粘稠度，提高出汁率，获得清亮的葡萄汁。糖水 橘子加工中，在橘子去皮去络分瓣后，必须去除囊衣。我们可以利用果胶酶液， 控锘l j p h 在1 5 2 0 ，温度3 0 4 0 ，将橘瓣浸入其中，瓤囊内外表皮之间的果胶物质 在果胶酶作用下分解为可溶性果胶，使细胞粘着力减弱，外表皮软化，经冲洗后 去除囊衣。黑曲霉生长的橙皮苷酶，可解决橘子罐头的白色混浊，而黑曲霉。1 3 葡萄糖苷酶对果酒具有增香作用1 9 1 。 ( 2 ) 在医疗上的应用 山楂、柿子中含有大量的鞣酸、果胶和树胶，食用山楂、柿子后，鞣酸和胃 酸可以与蛋自质结合成不溶于水的鞣酸蛋融而沉淀予胃内，果胶和树胶遇酸即形 成凝胶，可将沉淀的鞣酸蛋白黏合成块，也可与食物残渣聚合，愈积愈大形成巨 大块状，鄄所谓的胃石癍。研究证明，通过服用果胶酶治疗霄石症具有广阔的应 前景【2 0 】。 ( 3 ) 在植物病毒纯化中的应用 要对种植物病毒进行生物学研究，需要对病毒进行纯化。根据病毒侵染植 物部位的不同，可以采取不同的纯化方法。研究发现，对予侵入植物木质部的病 毒，一些特定的酶类如果胶酶和纤维素酶就可以使其从植物组织中释放出来【2 i 】。 ( 4 ) 天然产物的提取 果胶物质的存在不同程度的影响或阻碍着天然产物的释放。在适宜条件下， 甘肃农业大学硕士学位论文文献综述 植物细胞会发生盘溶也可产生包括果胶酶在内的分孵酶类，但这会使待分离产物 发生结构改变，甚至产生一些大多数情况下不利于分离的小分子副产物，因此， 靠植物细胞的自身酶系并不利于天然产物的提取。一般应先热失活钝纯脆内酶系， 再有选择地进行酶处理。 天然色素翔葡萄紫、番茄经、紫苏紫、萝b 红等均可使用酶法提取，但所用 果胶酶不得含有花青素酶等杂酶以免影响某些产品色泽。 其次，天然生物活性物质提取物是冒前中药进入莺际市场的一种理想方式， 出口比例已超过中药，并呈上升趋势。可利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提 取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、人参浆、当归浸膏、甘荤液等。另外，在金 耳多糖【嬲、香菇多糖口3 1 、金针菇多糖、山楂叶总黄酮【2 4 1 等的提取中也使用了果胶 酶。剩用酶类提取，不仅可提高萃取率，还霹提高纯度。 另外，在油料萃取方面，按照传统的生产工艺，菜籽油、棕桐油、葵花籽油、 橄榄油等一般是由正己烷等脂溶性溶剂萃取制得，两正己烷是一种致癌物质。将 果胶酶和纤维素酶、半纤维素酶结合使用，可破坏油料作物的细胞壁，便于油料 的释放，从面提嵩萃取率【2 5 1 。由于酶法提取条件温和，油料中多酚物质和v 琶都有 所增加，从而提高油料的稳定性。 ( 5 ) 纺织品的生物脱胶 用碱性果胶酶处理，代替碱对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工艺，以去 除初生胞壁中的果胶物质，在比较缓和的p h 值和温度条件下使处理后的织物手感 柔软，强度高，取代了耗能大、污染严重的传统热碱脱胶工艺。另外，可避免因 微生物处理造成的纤维素的降解 2 6 矗7 】。 ( 6 ) 造纸业的生物制浆 造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似，都是通过果胶酶等酶处理 降解植物纤维原料中的采胶、半纤维素及本质素，使其分散成满足造纸工业不同 要求的束纤维或单纤维，以生产柔软、均一、有弹性的高品质材料。由于纸浆中 高分子果胶带负电荷，经酶降解至六糖以下即可将其除去，避免了成品纸的静电 现象【2 8 】。 1 1 3 5 部分分解细胞阚质中酶果胶物质 ( 1 ) 带果肉食品的生产 一般常规加工所得到鸵果虑在必要的高温处理或机械泵出后，成型颗粒量唆 显减少，硬度降低，直接影响了产品品质。果胶质在p e 作用下脱去甲氧基，在钙 1 2 甘肃农业大