（眼科学专业论文）兔骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文 签字日期 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 论文作者签 指导教师签 签字日期： 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定的研究 硕士研究生： 指导教师： 专业名称： 王卓实 何伟教授 眼科学 摘要 目的：探讨体外培养兔骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e m c e l l s m s c s ) 的方法，为进一步的实验研究打下基础。 方法：选择健康家兔，于胫骨行骨髓穿刺，提取动物骨髓，采用密 度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞，通过贴壁培养筛选、纯化获 得的m s c s ，传代培养，对第2 、3 、4 、5 、6 代m s c s 应用m t t 法测定生长 曲线，分析m s c s 的生长规律，对m s c s 进行形态学观察，通过流式细胞仪， 对c d 3 4 、c d 4 5 、c d l 0 5 三种表面抗原进行鉴定，证明所培养的细胞为 m s c s 。 结果：原代培养的m s c s 接种1 2 小时后开始贴壁生长，形态为均匀 成梭形，生长增殖迅速，符合m s c s 生长的特性，7 一1 0 天m s c s 融合接 遗8 0 ，传代培养生长良好。m s c s 生长曲线呈s 型，由生长曲线分析可 知，m s c s 在培养第3 7 天为高速生长期，m s c s 在第3 5 代生长最为旺 盛，并且培养的细胞经流式绑胞仪鉴定，c d 3 4 ( ) 、c d 4 5 ( ) 、c d l 0 5 ( + ) ， 证明所培养的细胞为较纯的m s c s 。 结论：应用本实验方法，可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞， 所培养的m s c s 体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代，可 用于m s c s 功能及应用的进一步研究。 关键词：骨髓间充质千细胞密度梯度离心细胞培养 c u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no fm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s f r o mr a b b i t sb o n em a r r o wj nv i t r o p o s t g r a d u a t e ：w a n gz h u o s h i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rh ew e i s p e c i a l i t y ：o p h t h a l m o l o g y a b s t r a e t p o p u r s e ： t oe s t a b l i s ham e t h o do fi nv i t r oi s o l a t i o n p u r i f i c a t i o na n d a m p l i f i c a t i o no fb o n em a r r o wd e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l so fa d u l t r a b b i t s ，f o raf u r t h e rs t u d y m e t h o d s ：b o n em a r r o wt i s s u ew a sh a r v e s t e df r o mt i b i a sb o n eo f r a b b i t s ，m e s e n e h y m a ls t e mc e i l sw e r ei s o l a t e db yt h em e t h o do fd e n s i t y g r a d i e n tc e n t r i f u g e t h e nm s c sw e r ep r o l i f e r a t e db ya d h e r i n gc u l t u r e g r o w t hc u r v eo f 2 “、3 柏、4 t h 5 “、6 t h g e n e r a t i o nm s c sw e r ed r a w n c d 3 4 、 c d 4 5 、c d l 0 5a n t i g e no f m s c sw e r ei d e n t i f i e db yf l o wc y t o m e t r y r e s u l t s ：p r i m a r yc u l t u r e dm s c ss t a r ta d h e r i n gt op l a t e s12h o u r sa f t e r s e e d i n g ，a n ds p i n d l e - s h a p e dm s c sw e r eo b s e r v e du n d e rm i c r o s c o p y ，a n d g r o w i n ga tar a p i ds p e e d c o n f l u e n c eo fm s c sr e a c ht o8 0 7 - 10d a y sa f t e r s e e d i n g f r o mt h em s c sg r o w t hc u r v e ，w h i c hw a sss h a p e ，i tw a sk n o w nt h a t m s c sg r e wi nar a p i ds t a g ea t3 t h 7 “g e n e r a t i o na f t e rs e e d i n g a n dm s c so f 3 t h 5 ”g e n e r a t i o np o s s e s sh i g h e ra c t i v i t y c d 3 4 ( 一) 、c d 4 5 ( ) 、c d l 0 5 ( + 、 w e r ed i r e c t e d c o n c l u s i o n ：i nt h i ss t u d y ，b yo u rc u l t u r e p r o t o c o l，m s c sw e r e i s o l a t e da n dp r o l i f e r a t e ds t a b l ya n dr a p i d l y c u l t u r e dm s c sp o s s e s s e d h i g h a c t i v i t yo fg r o w i n ga n da m p l i f i c a t i o n ，a n dw e r ea p p r o p r i a t ef o rf u r t h e r r e s e a r c h k e yw o r d s ：m e s e n c h y m a is t e mc e l l sd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g e i s o l a t i o na n dc u l t u 毡 2 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定的研究 硕士研究生： 指导教师： 专业名称： 王卓实 何伟教授 眼科学 刖罱 骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s m s c s ) 是一群中胚层来 源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。由于m s c s 具有获取途 径便利、对组织损伤小、体外扩增较容易、免疫原性低f 1 1 等特点，已经成 为间充质干细胞研究的最主要的细胞来源。m s c s 具有很强的分化潜能， 可以分化为骨细胞【2j 、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞【3 4 】等，近期的研 究表明它还可以在视网膜组织损伤局部诱导分化，整合到视网膜组织中 去【5 6 、7 】，参与视网膜损伤的修复，可以分化为感光样细胞，表达视紫 质蛋白、视蛋白等特异性标志【8 】，甚至m s c s 还可以分化为星状胶质细 胞【9 1 0 j 等细胞群，参与组织的修复与血视网膜屏障的重建【1 1 1 。因此， 对于m s c s 的研究成为近年来的热点，也为目前难以治愈的视网膜色素变 性、黄斑变性等视网膜疾病的治疗带来了希望。 然而在正常情况下，m s c s 在骨髓中的比例非常低，仅占单核细胞的 l 1 0 5 1 1 0 4 。因此体外培养、大量扩增m s c s ，并保持其干细胞生物学 特性是研究和应用m s c s 的前提。本实验联合应用密度梯度离心和贴壁筛 选的方法从骨髓中分离m s c s 并对其进行纯化，通过绘制m s c s 的生长曲 线，分析m s c s 的生长规律。观察m s c s 的形态、传代、增殖状态，并通过 流式细胞仪检测证明我们分离的细胞为骨髓闯充质干细胞，为大量地获 得生物学性状良好的骨髓m s c s ，进一步研究骨髓m s c s 的诱导分化和应 用奠定了基础。 、材料与方法 1 材料 d m e m f 1 2 液体培养基、胎牛血清、b s a 、p b s 液( g i b e o 公司) ； 胰蛋白酶、e d t a 、青霉素、链霉素( s i g m a 、北京原平皓生物技术有限 公司) ； 淋巴细胞分离液( p e r c o l l 天津灏洋生物制品科技有限责任公司) ： m t t ( s i g m a ) ，三联液( 1 0 十二烷基硫酸钠，5 异丁醇，o 0 1 2 m o l l 盐酸) ； 鼠非特异性i g o p e 、鼠抗兔c d 3 4 p e ( s a n t ac r u z 公司1 ； 鼠抗兔c d 4 5 一p e ( e a l t a g 实验室) ： 鼠抗兔c d l 0 5 一抗、羊抗鼠f i t c 二抗( b dp h a r m i n g e n 公司) ： 其他试剂均为国产分析纯。 2 仪器设备 倒置显微镜、超净台、二氧化碳培养箱、流式细胞仪、离心机、酶 联免疫检测仪 3 实验动物 选择2 k g 左右，健康新西兰白兔，约4 月龄( 购自沈阳何氏视光学院) 。 4 实验方法 4 1 骨髓间充质干细胞体外分离 本实验参考了w a k i t a n i t l 2 】等的方法，并加以改进，采用密度梯度离心 法分离提取m s c s ，通过贴壁培养来纯化扩增m s c s 。首先于净室内，将健 康新西兰白兔用2 0 浓度的乌拉坦，按5 m l k g 由兔耳缘静脉注射进行麻 醉，然后使实验动物仰卧于操作台上，并固定四肢。选取双侧胫骨结节 为穿刺点，8 硫化钠脱去穿刺点周围的兔毛，在无菌操作条件下，以1 2 号骨穿针穿刺，进针约l c m 左右，感觉骨穿针前端有突破感，刺人髓腔时， 拔出针芯，接5m l 无菌注射器，注射器内含肝素钠0 。2 m l ( 浓度为4 0 0 0 i u m 1 ) ，抽取骨髓液4m l ，将骨髓液与p b s 缓冲液1 ：1 稀释混匀。取淋巴细 胞分离液( 相对密度为1 0 7 7g l ) 约为稀释骨髓液的1 2 量放入离心管中， 将混匀稀释后的骨髓液，沿管壁缓缓加入离心管，使稀释的骨髓液轻轻 的层加于等量淋巴细胞分离液上，操作轻柔，避免冲散分离液面，或与分 离液混合而影响分离效果。2 0 0 0r m i n 离心3 0 m i n ，离心后管内液体分为 三层，上层为血浆层，含有血小板，中间层为分离液层，底层为红细胞 和多核白细胞层，在上层与中层之间的液体界面处，可见乳白色混浊的 单个核细胞层，呈白膜状( 图1 ) 。弃上层液及脂肪层，用毛细管插入自膜 层，沿管壁周缘吸取界面的单 令核细胞，用5 倍以上体积的p b s 缓冲液重新 悬浮细胞。混匀1 2 0 0r m i n 离心1 0 r a i n ，弃上清液，重复漂洗细胞2 次后，吸 尽上清，用含2 0 胎牛血清的d m e m f 1 2 培养基( 添加青霉素1 0 0 i u m l 、 链霉素1 0 0 u g m 1 ) 混匀后，用细胞计数板计数，以3 1 0 4 r a l 的密度接种 4 于7 5 m l ( 2 5 c m 2 ) 培养瓶中，置于3 7 c 、5 c 0 2 培养箱中恒温培养。 释的骨 浆和血小板 个核细胞( 白膜 r c 0 1 l 核细胞和红细胞 离心离心后分 图1 、密度梯度离心法分离示意图 4 2m s c s 原代培养及传代 原代培养2 4 h 后，半量换液，去除掉未贴壁细胞，以后每隔3 4 天换液1 次。7 1 0 天后，观察细胞可达到达8 0 融合后，进行传代培 养，加入1 ：1 的2 5 9 l 胰蛋白酶和o 2 9 le d t a 混合液进行消化。在 倒置显微镜下进行观察，发现贴壁细胞胞体回缩，细胞间隙增大时，立 即倒掉残留消化液，加入适量培养液，用无菌吸管轻柔吹打瓶壁细胞， 促进细胞脱壁。多数细胞脱离瓶壁形成细胞悬液后，按照1 ：2 或1 ：3 重新接种至7 5 m l 培养瓶中。经传代、扩增、纯化至第2 、3 、4 、5 、6 代备用。 4 3m s c s 的生长曲线测定 取生长状态良好的第2 、3 、4 、5 、6 代传代细胞消化制备单细胞悬 液，计数调整细胞浓度为2 x 1 0 4 m l ，接种于6 块9 6 孔培养板，每代 细胞接种8 孔并同时设空自对照，每孔9 0 u l ，3 d 换液1 次，从第1 天起 每隔4 8 h 取出一块培养板，在接种细胞孔和空白对照孔内加入 1 0 u l m t t ( 5 m g i t i l l 溶液，置入3 7 ，5 c 0 2 培养箱内孵育4 h 后取出， 每孑l 加入三联液1 0 0 u l ，再次置入3 7 ，5 c 0 2 培养箱内孵育1 2 h 后取 出。用酶联免疫检测仪检测每孔的吸光度( a 4 9 0 ) ，连续测6 次，取每代 细胞8 个孔吸光度的平均值r 以时间( d ) 为横坐标，吸光度( a 4 9 0 ，表示 细胞相对数量) 为纵坐标，分别绘制2 、3 、4 、5 、6 代m s c s 的生长曲线， 分析细胞生长规律。 4 4 兔m s c s 的鉴定 m s c s 通过流式细胞仪，检测特异性抗原c d 3 4 、c d 4 5 和c d l 0 5 束 鉴定其纯度14 1 。使用直接标记法标记c d 3 4 和c d 4 5 ，间接标记法标记 c d l 0 5 ，选择抗体见表l 。 表1问充质干细胞抗体标记 直接标记法( 图2 ) 室温下，用o 2 5 胰蛋白酶消化已贴壁的第4 代兔m s c s ，2 分钟， 至8 0 细胞脱壁时，加含血清培养基终止消化。将细胞移至离心管中， 1 0 i 3 0 r m i n 离心5 分钟。弃上清液，用含l b s a 无酚红d m e m 培养基混 匀细胞，加入单克隆鼠抗兔抗体( 抗c d 3 4 - p e ，抗c d 4 5 一p e ) 和非特异 性鼠抗兔i g g p e ，4 c 冰箱闭光保存4 0 r a i n 。然后用p b s 液漂洗3 次，用 1 m l p b s 液混匀，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数， 以非特异性鼠抗兔i g g p e 组为阴性对照，记录实验数据。 图2 、直接标记法 间接标记法( 图3 ) 室温下，用o 2 5 胰蛋白酶消化已贴壁的第4 代兔m s c s ，2 分钟 6 至8 0 细胞脱壁时，加含血清培养基终止消化。将细胞移至离心管中， 1 0 0 0 r l m i n 离心5 分钟。弃上清液，用含有1 b s a 无酚红d m e m 培养 基混匀细胞，加入c d l 0 5 鼠抗兔一抗( 稀释1 ：1 0 0 ) ，4 冰箱保存4 0 r a i n ， 然后用含1 b s a 无酚红d m e m 洗涤细胞3 次。弃上清液，重新用含 1 b s a 无酚红d m e m 混匀底部细胞，加入羊抗鼠含荧光标记物f i t c 的二抗，4 冰箱闭光保存4 0 r a i n 。然后用p b s 液洗涤3 次，再用1 m l p b s 液混匀，放入流式细胞仪中鉴定，以未标记的细胞设仪器参数，以非特 异性鼠抗兔i g g 代替一抗组为阴性对照，记录实验数据。 图3 、间接标记法 结果 1 m s c s 生长曲线 m s c s 的生长曲线大致呈s 型，第1 3 天细胞处于潜伏期，增殖缓慢， 第4 - 9 天处于高速生长期，第9 天处于平台期，增殖缓慢。传代细胞中 第3 、4 、5 代细胞均增殖旺盛，生长曲线形态相似，第6 代细胞增殖活 力减弱，曲线低于第3 4 、5 代，第2 代低于第六代( 图4 ) 。 图4 m s c s s 生长曲线 7 2 m s c s 鉴定 2 1 形态结果 m s c s 原代培养l2h 后细胞开始贴壁，接种2 4 h 后开始出现细胞附 壁铺伸，呈梭形。7 2 h 附壁铺伸细胞数量增多，呈多个散在分布的细胞集 落，第4 、5 天开始形成典型的，坶匀分布的骨髓m s c s 簇状增殖灶，细 胞数量增多，细胞形态呈长梭彤，紧密排列，第5 天后m s c s 数量迅速扩 增，细胞簇状增生灶数量增加，范围扩大。第7 - 9 天细胞生长即可达 8 0 9 0 的融合，呈长梭形，紧密排列类似旋涡状。非附壁细胞经多次换 液后，绝大部分己被清除。传代细胞接种4 h 后开始附壁铺伸，1 2 h 活细 胞基本完成附壁，第3 天迅速增殖，第7 天即可达到8 0 9 0 的融合， 呈比原代更均匀的长梭形( 图5 ) 。 a 原代培养的m s c s s 细胞形态b 第3 代培养的m s c s s 细胞形态x c 、第4 代培养的m s c s s 细胞形 图5 光学显微镜下观察m s c s 的形态 原： 1 2 流式细胞仪结果 通过流式细胞仪检测，分析不同抗原标记显示所培养m s c s 表面抗 表2m s c s 表面抗原检测结果 图6 流式细胞仪检测所获得的波峰图 与对照组比较柱状图( 图7 ) ：c d 3 4 荧光强度表达量为0 士0 0 0 3 ；c d 4 5 荧光强度表达量为0 + 0 0 0 5 ；c d l 0 5 荧光强度表达量为3 5 9 士0 2 6 6 ，占细 胞总数的9 6 i l 7 8 。 图7m s c s 特异性抗原荧光强度 讨论 本实验旨在探讨一种由骨髓中分离纯化、并在体外培养扩增骨髓间 充质干细胞的方法。 1 骨髓间充质干细胞的分离 目前骨髓间充质干细胞的体外培养方法主要有：密度梯度离心法、 贴壁分离法、流式细胞分离法和免疫磁珠分离法，。用上述方法所获得的 细胞经流式细胞仪或免疫组化对其表面标志的检测均可证实为骨髓间充 质干细胞，其中后两种方法可针对某些细胞表面标志对所选细胞进行富 集和分离，所获得的骨髓间充质干细胞纯度较高，但操作复杂，费用昂 贵，对细胞的活性也有一定的影响。不便甩于常觌i 搀m s c s 的制备。因此， 密度梯度离心法和贴壁分离法成为目前骨髓间充质干细胞最常用的培养 方法。本研究采用密度梯度离心法，联合贴壁培养筛选。密度梯度离心 法避免了单纯贴壁分离法会混入较多杂细胞的缺点。它的原理是：在骨 髓中红细胞、多核自细胞密度较大，为1 0 9 0 9 m l 左右，血小板为 1 0 3 0 1 0 3 5 9 m l ，而单个核细胞，即m s c s 所在的细胞群密度为 1 0 7 5 1 0 9 0 9 m l ，为此利用密度介于1 0 7 5 1 0 9 0 9 m l 的等渗溶液，即 淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，就可以使一定密度的细胞按照相 应密度梯度分布，使各种细胞成分得以分1 离，从而得到相对纯化的细胞， 避免了过多杂细胞的混入。在密度梯度离心之后采用贴壁培养，又一步 0 5寸5 3 5口5 i p b - n u r h o 4 0 2。_nu-u 廿1i廿岫o-ojr_丁 除去不能贴壁的杂细胞，进一步的纯化了细胞。 目前常用于骨髓间充质干细胞分离的分离液主要有p e r c o l l 分离液和 f i c o l l - - h y p a q u e 分离液，有研究表明，两者都能减少分离细胞中成纤维 细胞的比例，从而提高m s c s 的纯度，但由于p e r c o l l 分离液的密度( 1 0 7 3 蝇i ) 稍低，其纯化细胞的作用就更为明显，可以提高分离效果【1 6 】，而 且f i c o l l - - h y p a q u e 分离液中含有较高的碘成分，对m s c s 的培养或多或少 会造成不利影响，所以本实验分离m s c s 采用的是p e r e o l l 分离液。 2 骨髓问充质千细胞的培养 目前间充质干细胞的培养基配方并不统一，本研究采用的是f 1 2 一 d m e m 培养基，其中添加了g l u t a m a x 替代了谷氨酰胺。o l u t a m a x 最早由 g i b c o 公司发明，是谷氨酰胺的二肽衍生物，n 端的a l a 可以阻止g i n 的 脱氨反应，性质非常稳定，即使在1 2 1 ，2 0 分钟也几乎不会被降解， 并完全可以替代谷氨酰胺的功能，作为长效谷氨酰胺使用，所以勿需中 途再追加，避免了谷氨酰胺容易降解的缺点，同时避免了氨类有毒代谢 物对培养物的毒性作用。 传代的m s c s 贴壁迅速，约1 2 h 左右大部分细胞贴壁，细胞呈梭形均匀 分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速， 胞核明显，核仁清晰，核浆比例大。培养7d 即能达到8 0 9 0 融合，细 胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5 代时无明显变化。 但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，显示出老化的趋势。 、本实验对第2 、3 、4 、5 、6 代传代m s c s 绘制了生长曲线，由生长曲线 分析可知，m s c s 的生长曲线基本为s 型，传代接种后第1 3 日细胞增殖缓 慢为潜伏适应期，此期主要为m s c s 的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分 裂活动不甚活跃。从第3 日开始细胞增殖加速，相差显微镜下可以观察到 贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活 动开始变得活跃起来，第3 - 9 日这些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆 彼此相连，细胞曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为m s c s 的 对数生长期。至第9 臼达到顶点，此时细胞克隆彼此相连并铺满整个培养 孔底面的大部分，细胞生长曲线显示m s c s 生长进入一个平台期。之后， 细胞数量轻度下降。第3 、4 、5 代细胞的生长曲线趋于一致，第2 代及第6 代生长曲线均低于第3 5 代细腌。由生长曲线可知，第2 代细胞增殖能力最 弱第3 5 代细胞增殖能力最强，第6 代增殖能力开始减弱。通过观察这些 特点，将为我们后期的实验打下基础，后期实验我们将选用的都是纯度 高、增殖能力和活力最好的第3 代第5 代细胞。 在整个实验过程中，要获得活性好、形态均一的m s c s ，以下细节问 题值得注意：( 1 ) 严格的无菌操作。( 2 ) 采用密度梯度离心法时，应 注意p e r c o l l 分离液易见光分解，因密度改变而分离出的细胞发生改变， 肉眼可见分离液界面层细胞分散，不清晰。( 3 ) 注意细胞接种密度。密 度过低会影响细胞贴壁，融合。 3 间充质干细胞的鉴定 首先，观察m s c s 一般生物学特性，体外培养生长的骨髓来源的m s c s 贴壁生长，尤其容易贴附于塑料器皿，并呈现纤维细胞样生长，细胞密 度较高时会呈放射状排列，这是与悬浮生长的造血干细胞等骨髓中其他 细胞相鉴别的主要特征。本实验所培养的细胞完全符合这生长特性。 其次是通过细胞表面标记进行鉴定，最常用的m s c s 鉴定方法就是细 胞表面的免疫学表型。对于m s c s 在组织中的确切表型，目前仍没有统一 的标准，但经过十几年的研究，近年来对间充质干细胞的细胞表面标记 的研究已经取得了一些成果，间充质干细胞不表达造血干细胞的表面标 记，包括c d 3 4 、c d 4 5 、g l y 等，表达的特异标记包括c d l 0 5 、c d 7 3 等 【1 7 1 引。m s c s 表达的一些典型表面标记还包括黏附分子c d 4 4 、整联蛋白 c d l 0 4 等等。本研究所选取的是c d 3 4 、c d 4 5 、c d l 0 5 三种最具代表性 的抗原标记物，通过流式细胞仪的检测，显示c d 3 4 ( ) 、c d 4 5 ( ) 、 c d l 0 5 ( + ) ，且c d l 0 5 表达强度较高，证实本实验中所分离培养的细胞并非 骨髓中的其他细胞( c d 3 4 ( ) 、c d 4 5 ( ) ) ，正是实验目的中所要得 到的骨髓间充质干细胞( c d l 0 5 ( + ) ) 。 除了形态学及细胞表面标记进行鉴定之外，对于m s cs 的鉴定方法还 有根据多分化潜能进行鉴定，即通过诱导使m s c s 分化为骨细胞、软骨细 胞、脂肪细胞等，阻证实所检测细胞确实是具有相应多向分化能力的骨 髓间充质干细胞。此外还有对m s c s 支持造血功能的鉴定，m s c s 的低免 疫原性1 9 1 和免埴调节功能2 机2 1 2 2 】的鉴定等。由于这些鉴定方法较为复杂， 限于实验条件，本研究未予采用。 4 实验中有待解决的问题 本实验通过密度梯度离心法，联合贴壁培养法，成功分离纯化、培 养出了骨髓间充质干细胞，并成功进行了传代培养。但实验中还有许多 不足的地方，有待在未来研究中解决。首先，由于实验条件的限制，本 实验只选取了最典型的三种表面抗原进行检测，未来条件允许的情况下， 应通过做更多的表面抗原检测分析，进一步纯化所培养细胞。其次，由 于实验条件所限，没有通过诱导分化实验对细胞进行检验，未来研究中 应做补充。 5 展望 干细胞生物学与基因治疗、组织工程学并称为再生医学的三大分支， 干细胞生物学的发展为以往难治性视网膜疾病提供了新的思路。然而在 己发现的几种干细胞中，胚胎千细胞取材困难，且在囊胚来源等方面存 在伦理障碍，而视网膜干细胞、神经干细胞等干细胞，自体取材、培养 鉴定都存在不同的困难和不确定因素，而本实验所培养的骨髓间充质干 细胞( m s c s ，m e s e n e h y m a ls t e mc e l l s ) 所具有的获取途径便利、对组织 损伤小、体外扩增较容易、免疫原性低1 1 】等特点，恰恰使其成为干细胞应 用的最佳选择。近期的研究表明m s c s 还可以在视网膜组织损伤局部诱导 分化，整合到视网膜组织中去【5 “7 】，参与视网膜损伤的修复，可以分 化为感光样细胞，表达视紫质蛋白、视蛋白等特异性标志【8 1 ，甚至m s c s 还可以分化为星状胶质细胞【9 、1o j 等细胞群，参与组织的修复与血视网膜 屏障的重建】。因此，近年来m s c s 也成为眼科领域研究的热点，m s c s 视网膜移植等研究也为目前难以治愈的视网膜色素变性、黄斑变性等视 网膜疾病的治疗带来了希望。 m s c s 的研究为疾病的治疗提供了崭新的思路，m s c s 的可塑性及可能 存在的横向分化潜能有特殊的意义，它不仅使人们对干细胞发生、发育 有了更深的认识，更具有其特殊的临床应用价值，对许多难治性的眼科 疾病而言，细胞移植可能是一种行之有效的方法，将具有某种特定功能 的细胞移植到相应的受损部位，这不仅可以恢复该部位的部分功能，而 且避免了传统药物治疗引起的毒副作用。并且随着分子生物学与干细胞 生物学的结合，转基因的m s c s 移植正显示出更大潜力。虽然m s c s 在作用 机制、鉴定分离纯化、工程化等方面仍然有许多问题需要解决，但其未 来的应用价值仍值得我们期待。 结论 本实验通过密度梯度离心法成功的从兔骨髓中分离出骨髓间充质干 细胞，并通过贴壁培养法，在体外进行了m s c s 的扩增、培养，和传代， 通过m s c s 生长曲线的分析观察到第3 - 5 代的m s c s 增殖能力最旺盛。并且 通过形态学观察，流式细胞仪鉴定，证实所分离培养细胞为骨髓间充质 干细胞。 1 4 参考文献 1 t s ewt ，p e n d l e t o njd ，b e y e rwm ，e ta 1 s u p p r e s s i o no fa l l o g e n e i et - c e l l p r o l i f e r a t i o nb yh u m a nm a r r o ws t r o m a lc e l l s ：i m p l i e a t i o n si nt r a n s p l a n t a t i o n t r a n s p l a n t a t i o n ，2 0 0 3 ，7 5 ：3 8 9 - 3 9 7 2 n a u m a n na ，d e n n i sj ，s t a u d e n m a i e rr ，e ta 1 m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s an e w p a t h w a yf o rt i s se n g i n e e r i n gi n r e c o n s t r u c t i v es u r g e r y l a r y n g o r h i n o o t o i o g i e ， 2 0 0 2 8 1 ：5 2 1 5 2 7 3 j u r g e nf ，h e u b a c h ，e v amg r a f , e ta 1 e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fh u m a n m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s jp h y s i o l ，2 0 0 3 ，5 5 4 ：6 5 9 6 7 2 4 j o a c h i mo s w a l d a ，b ，s a b i n eb o x b e r g e r b ，b i r g i t t ej ，e ta 1 m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sc a n b ed i f 诧r e n t i a t e di n t oe n d o t h e l i a lc e l i si nv i t r o s t e mc e l l 2 0 0 4 ，2 2 ：3 3 7 - 3 8 4 5 k i c i ea ，s h e nwy ，wi l s o na s ，e ta 1 d f f f e r e n t i a t i o no fm a r r o ws t r o m a ic e i i s i n t op h o t o r e c e p t o r si nt h er a te y e jn e u r o s c i - 2 0 0 3 ，2 3 ：7 7 4 2 7 7 4 9 6 j a n l c k ih m e i n e rh ，k r e p p e lf e ta 1 b on em a r r o ws t r o m a l s t e mc e l l s d i f f e r e n t i a t ei n t og l i a lc e l l sa f t e rt r a n s p l a n t a t i o ni n t ot h es u b r e t i n a ls p a c eo fr c s r a t sa n dc a nb es t a b l yt r a n s d u c e db ya d e n o v i r a lv e c t o r i n v e s to p h t h a l m o1v i s s c j ，2 0 0 2 ，4 3 ：e a b s t r a c t4 6 2 8 7 m i n a m i n ok a d a c h iy y a m a d ah ，e ta 1 l o n g - - t e r ms u r v i v a lo fb o n e m a r r o w - - d e r i v e dr e t i n a ln e r v ec e i i si nt h er e t i n a n e u r o r e p or t 2 0 0 5 1 6 ： ? 1 2 5 5 1 2 5 9 8m i n o r ut o m i t a 。y a s u s h ia d a c h i 。s u s u m ui k e h a r a ，e ta i b o n e m a r r o w d e r i v e ds t e mc e l l sc a nd i f f e r e n t i a t ei n t or e t i n a lc e l l si nl n j u r e dr a t r e t i n a s t e mc e l i s ，2 0 0 2 ，2 0 ：2 7 9 - 2 8 3 9 a z i z is a ，s t o k e sd ，a u g e l l ib je ta 1 e n g r a f t m e n ta n dm i g r a t i o no fh u m a nb o n e m a r r o ws t r o m a lc e l l si m p l a n t e di nt h eb r a i n so f a l b i n or a t s - - s i m i l a r i t i e st o a s t r o c y t eg r a f t s p r o cn a t la c a ds c iu s a1 9 9 8 ；9 5 ：3 9 0 8 - 3 9 1 3 10 e g l i t i sm a ，d a w s o nd ，p a r kk we ta 1 t a r g e t i n go fm a r r o w d e r i v e da s t r o c y t e st o t h ei s c h e m i cb r a i n n e u r o r e p o r t 】9 9 9 ：1 0 ：1 2 8 9 1 2 9 2 ) 1 1 t a i l o ic h a r t - l i n g ，l o u i s eb a x t e r ，m a r i ab g r a n t ，e ta 1 h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s p r o v i d er e p a i rf u n c t i o n sa f t e rl a s e r - i n d u c e db r u c h sm e m b r a n er u p t u r em o d e l o fc h o r o i d a ln e o v a s c u l a r i z a t i o n a m e r i c a nj o u r n a lo fp a t h o l o g y 2 0 0 6 ；l6 8 ： 1 0 3 1 1 0 4 4 1 2 w a k i t a n is ，s a i t ot ，c a p l a na i m y o g e n i cc e l l sd e r i v e df r o mr a tb o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l se x p o s e dt o5 2 a z a c y t i d i n e j 】m u s c l en e r v e ，19 9 5 ； 1 8 ( 1 2 ) ：i4 12 一1 4 1 6 13 c o n g e tpa ，m i n g u e l ljj p h e n o t y p i e a la n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fh u m a nb o n e m a r r o em e s e n c h y m a lp r o g e n i t o re e l l s jc e l lp h y s i o l ，1 9 9 9 ，1 8 1 ：6 7 7 3 j 4 d e a n srj ，m o s e l e yab m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：b i o l o g ya n dp o t e n t i a lc l i n i c a l u s e s e x ph e m a t o i ，2 0 0 0 ，2 8 ( 8 ) ：8 7 5 , 8 8 4 i5 p a r ks h s i mwy p a r ks w e ta 1 a ne l e c t r o m a g n e t i cc o m p r e s s i v ef o r c eb y c e l le x c i t e rs t i m u l a t e sc h o n d r o g e n i cd i f e r e n t i a t i o no fb o n em a r o w - d e r i v e d m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s t i s s u e 、e n g2 0 0 6 ；e p u ba h e a do fp r i n 16 g u oxm ，w a n gcy ，w a n gyh ，e t a 1 e c p e r i m e n t a ls t u d y o ft h e i s o l a t i o n ，c u l t u r ea n di nc h o n d r o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fh u m a nb o n em e s e n c h y m a l s t e mc e l l 【j 】c h i njs t o m a t 0 1 2 0 0 3 ，3 8 ( 1 ) ：6 3 - 6 6 1 7 c o n g e tpa ，m i n g u e l ljj p h e n o t y p i c a la n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fh u m a nb o n e m a r r o wm e s e n e h y m a lp r o g e n i t o rc e l l s jc e l lp h y s i o l ，1 9 9 9 ，18 1 ：6 7 - 7 3 18 d e a n srj ，m o s e l e yab m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：b i o l o g ya n dp o t e n t i a lc l i n i c a l u s e s e x ph e m a t o l 2 0 0 0 ；2 8 ( 8 ) ：8 7 5 - 8 8 4 19 m a u r ok ，s a r a hg ，j u l i a nd ，e t b o n em a l t o wm e s e n c h y m a ls t e mc e i l si n h i b i t t h er e s p o n s eo fn a i v ea n dm e m o r ya n t i g e ns p e c i f i ctc e i l st ot h e i rc o g n a t e p e p t i d e j 】b l o o d ，2 0 0 3 ，1 0 1 ( 9 ) ：3 7 2 2 2 0 d in i c o t am ，c a r l o - - s t e l l ac ，m a g n im ，e t h u m a nb o n em a r r o ws t r o m a lc e i l s s u p p r e s st 一一l y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o n i n d u c e d b y c e l l u l a ro r n o n s p e c i f i e m i t o g e n i es t i m u l i j 】b l o o d ，2 0 0 2 ，9 9 ：3 8 3 8 2i b a r t h o l o m e wa ，s t u r g e o nc ，s i a t s k a sm ，e t m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ss u p p r e s s l y m p h o e y t e p r o l l f e r a t i o ni nv i t r oa