（生态学专业论文）全固态ph微传感器的制备及其在碳酸酐酶活力检测中的应用.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 由于当前检测碳酸酐酶活力方法的局限性，对碳酸酐酶活力大小 的研究要远少于对其结构和功能方面的研究。但碳酸酐酶活力尤其是 岩溶地区植物、微生物和土壤中碳酸酐酶活力的大小对研究生物与环 境之间的关系以及元素的地球化学循环均有着重大的意义。本研究利 用电化学传感技术结合全固态p h 微电极替代了传统测量方法中的 p h 玻璃电极，对原有方法进行改进，并运用到植物及土壤碳酸酐酶 活力的检测中。本研究的主要研究结果如下： 1 传统检测碳酸酐酶的p h 计法使用的测量p h 的工具是玻璃电 极，玻璃电极用于测量一般静态下溶液的p h 值较理想，但碳酸酐酶 催化的可逆反应是一个快速的动态过程，传统的测定方法无法客观地 反映出整个反应的p h 变化。采用电镀法可以快速简便地制备出全固 态的s b s b 2 0 3 p h 微电极，该p h 微电极稳定性好，响应速度快，重 现性高，p h 值敏感性达到4 1 7 m v p h 。与电化学方法中的开路电位 法( o c p ) 相结合，解决了传统测定方法中的不足之处。 2 为了体现出电化学法测定的优点，将该方法测定的结果与传 统p h 计法进行比较，从对标准碳酸酐酶溶液及植物提取液中碳酸酐 酶活力的测定结果比较来看，电化学法扩大了测量范围，提升了测量 准确度，解决了原有方法在这些方面的缺陷。 3 基于上述电化学法的优点，将其运用到植物碳酸酐酶活力变 化规律的研究中来。选取喀斯特先锋植物构树，广泛适生性植物桑树 江苏大学硕士学位论文 为研究对象，分别测定并绘制其碳酸酐酶活力的标准曲线，并测定出 其碳酸酐酶胞外酶的活力范围。 4 通过在室内进行光照脱水及复水实验模拟构树、桑树遭受的 干旱胁迫，测定此时碳酸酐酶活力的变化，分析两者抵抗干旱逆境的 能力。构树在光照3 小时，脱水6 0 以上仍能保持较高的碳酸酐酶活 力，并在复水后恢复至原有水平。桑树在光照2 小时内为了抵抗干旱 逆境，碳酸酐酶活力有一定的上升，复水之后下降恢复至原有水平。 在光照3 小时以上，活力下降，复水后亦难以恢复。两者在光照4 小 时后，碳酸酐酶下降至原有活力的一半左右。这可能与其叶片细胞大 量失水导致生理机能发生了不可逆的破坏有关。 5 通过不同浓度的聚乙二醇6 0 0 0 模拟水分胁迫以及同时添加 碳酸酐酶胞外酶抑制剂a z 来探讨胞外酶在植物受到干旱逆境时所起 的作用。结果表明，在聚乙二醇6 0 0 0 单独胁迫时，构树的碳酸酐酶 活力未发生显著性变化，桑树的碳酸酐酶活力在中等浓度胁迫下有一 定的上升，高浓度下有所下降。当加入a z 抑制胞外酶后，两者均不 再对干旱胁迫有所响应，但胞内酶并未发生改变，表明胞外酶可能是 调节植物在受到水分胁迫时的主要因素。 6 通过不同浓度的n a c l 溶液模拟盐分引起的渗透胁迫以及同 时添加碳酸酐酶胞外酶抑制剂a z 来探讨胞外酶在植物受到盐分逆境 时所起的作用。结果表明，在n a c l 溶液单独作用下，构树的碳酸酐 酶活力均有所下降，桑树的碳酸酐酶活力在中等浓度时上升至最高 i 峰，高浓度时有所下降。构树对n a + 、c 1 的抑制常数低于桑树。当加 h 江苏大学硕士学位论文 入a z 抑制胞外酶后，两者均不再对盐分胁迫有所响应，但胞内酶仍 不参与响应，表明胞外酶可能是调节植物在受到盐分胁迫时的主要因 素。 7 将电化学法运用到土壤碳酸酐酶活力的测定中来。以温室中 种植黄瓜的土壤为研究对象，测量黄瓜不同生育期时的土壤在不同深 度下c 0 2 浓度和碳酸酐酶活力，分析两者与土壤深度及两者互相之间 的关系。温室土壤c 0 2 浓度随土壤深度的增加而增加，碳酸酐酶活力 随土壤深度的增加而减小。土壤碳酸酐酶活力与c 0 2 浓度成反比相 关。 综上所述，电化学法测定碳酸酐酶活力优于传统的p h 计法，在 实际测定应用中取得了较好的结果，可以将该方法推广到今后各类测 定碳酸酐酶活力的研究应用中来。 关键i ：百- - - t s b s b 2 0 3 微电极，p h ，电化学，碳酸酐酶，胞外酶 i i l 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，t h es t u d i e so nt h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t ya l ef a rl e s st h a no ni t s s i z eo fs t r u c t u r ea n df u n c t i o nb e c a u s eo ft h el i m i t a t i o n so nt h ed e t e r m i n a t i o no f c a r b o n i c a n h y d r a s ea c t i v i t y b u tt h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t y , e s p e c i a l l yt h e c a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t yo fp l a n t s ，m i c r o o r g a n i s m sa n ds o i li nk a r s ta r e a sh a sg r e a t s i g n i f i c a n c ei ns t u d i e so nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nb i o l o g ya n de n v i r o n m e n ta sw e l la s t h e g e o c h e m i c a lc y c l e o fe l e m e n t s t h i ss t u d y , w h i c hw a si nt h eu s eo f e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rt e c h n o l o g yw i t ha l ls o l i d s t a t ep hm i c r o e l e c t r o d er e p l a c e dt h e g l a s sp he l e c t r o d ei nc o n v e n t i o n a lm e t h o d ，i m p r o v e dt h eo r i g i n a ld e t e r m i n a t i o na n d a p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o ni nc a r b o n i ca n h y d r a s eo f p l a n t sa n ds o i l t h em a i nr e s u l s o ft h i ss t u d yi n c l u d e st h ef o l l o w i n g ： 1 t h et o o l su s e dt od e t e r m i n ec a r b o n i ca n h y d r a s ei nc o n v e n t i o n a lm e t h o di s g l a s se l e c t r o d e ，i ti si d e a lt om e a s u r et h ep hv a la eo ft h eg e n e r a ls t a t i cs o l u t i o n s b u t t h er e v e r s i b l er e a c t i v i t yc a t a l y z e db yc a r b o n i ca n h y d r a s ei saf a s td y n a m i cp r o c e s s ，i t c a nn o to b j e c t i v e l yr e f l e c tt h er e s p o n s eo ft h ep hc h a n g eb yt h ec o n v e n t i o n a l d e t e r m i n a t i o n i tc a nb eq u i c ka n de a s yt op r e p a r ea na l ls o l i d s t a t em i c r o e l e c t r o d e u s i n ge l e c t r o p l a t i n gm e t h o dw h i c hh a st h ea d v a n t a g e so fg o o ds t a b i l i t y , f a s tr e s p o n s e a n dh i g hr e p r o d u c i b i l i t y , i t sp hs e n s i t i v i t yi s4 1 7 m v p h w i t ht h ee l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e s - - o p e nc i r c u i tp o t e n t i a l t i m e ( o c p ) ，i ts o l v e st h ed e f i c i e n c i e si nt h e c o n v e n t i o n a ld e t e r m i n a t i o n 2 i no r d e rt od e m o n s t r a t et h ea d v a n t a g e so fe l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d ，t h er e s u l t s d e t e r m i n e db yt h i sm e t h o dw a sc o m p a r e dw i t ht h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d f r o mt h e c o m p a r i s o no ft h ed e t e r m i n i n gr e s u l t sb e t w e e r 口t h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t yi n s t a n d a r dc a r b o n i ca n h y d r a s es o l u t i o n sa n dp l a n t s e x t r a c t s ，t h ee l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d e x p a n d e dd e t e r m i n i n gr a n g e ，i m p ：o v e da c c u r a c y , a n d s o l v e dt h e s h o r t c o m i n g so ft h eo r i g i n a lm e t h o di nt h e s ea r e a s 3 b a s e do nt h ea d v a n t a g e so ft h ee l e c t r o c p e m i c a lm e t h o da b o v e ，i tw a su s e dt o i v 江苏大学硕士学位论文 s t u d yo nt h ev a r i a t i o no ft h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t yi np l a n t s s e l e c tt h ek a r s t p i o n e e rp l a n tb r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r aa n dt h ee x t e n s i v ep l a n tm o r u sa l b aa st h e s t u d y i n go b j e c t s ，d e t e r m i n et h e i rc a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t i e sa n dd r a wt h es t a n d a r d c u r v e t h er a n g eo ft h e i re x t r a c e l l u l a rc a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e sw a sa l s o d e t e r m i n e d 4 s i m u l a t et h ed r o u g h ts t r e s sb yt h ee x p e r i m e n t so fd e h y d r a t i o na n dr e h y d r a t i o n t h r o u g hi l l u m i n a t i o ni nt h er o o ma tr o o mt e m p e r a t u r e ，d e t e r m i n et h ev a r i a t i o no ft h e c a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e sa n da n a l y z et h ea b i l i t yo ft h et w op l a n t st or e s i s tt h e d r o u g h ts t r e s s b r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r a c a nm a i n t a i nah i g hc a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t yw h e nl o s tm o r et h a n6 0 o ft h ew a t e ra f t e r3h o u r so fi l l u m i n a t i o na n di tc a n r e s t o r et oo r i g i n a ll e v e la f t e rr e h y d r a t i o n t or e s i s td r o u g h ts t r e s s ，m o r u sa l b a s c a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e sh a dac e r t a i ni n c r e a s ea f t e r2h o u r so fl i g h td e h y d r a t i o n a n dr e s t o r e dt oo r i g i n a ll e v e la f t e rr e h y d r a t i o n b u ti t sc a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t y w a sh a r dt or e s t o r ea f t e rr e h y d r a t i o nw h e nt h ei l l u m i n a t i o nt i m el o n g e rt h a n3h o u r s w h e na f t e r4h o u r so fl i g h td e h y d r a t i o n ，t h et w op l a n t s c a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e s w e r eb o t hd e c r e a s e dt oa b o u th a f to ft h eo r i g i n a la c t i v i t i e st h a tm a yb e 1 1 ia t e dt ot h e l a r g en u m b e ro fw a t e rl o s si nl e a fc e l l sw h i c hl e a d t oi r r e v e r s i b l ed a m a g e so n p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n 5 d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp e g 6 0 0 0w e r eu s e dt os i m u l a t et h ew a t e rs t r e s s a n dt h ee x t r a c e l l u l a rc a r b o n i ca n h y d r a s ei n h i b i t o ra zw a sa d d e da tt h es a m et i m et o d i s c u s st h ef u n c t i o no ft h ee x t r a c e l l u l a re n z y m ew h e nt h ep l a n t sw e r eu n d e rt h e d r o u g h ts t r e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r a sc a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t i e sw e r ew i t h o u ts i g n i f i c a n tc h a n g e sa n dm o r u sa l b a sc a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t i e sh a dac e r t a i ni n c r e a s ei nm i d d l ec o n c e n t r a t i o no fs t r e s sa n dd e c r e a s e di n h i g hc o n c e n t r a t i o no fs t r e s sw h e nt h e yw e r es t r e s s e db yp e g 6 0 0 0a l o n e w h e na z w a sa d d e dt oi n h i b i tt h ee x t r a c e l l u l a re n z y m e ，t h ec a r b o n i ca n h y d r a s en ol o n g e r r e s p o n d e dt od r o u g h ts t r e s s ，b u tt h ei n t r a c e l l u l a re n z y m e d i d n tc h a n g e i ts h o w e dt h a t t h ee x t r a c e l l u l a rc a r b o n i ca n h y d r a s em a yb et h em a i nf a c t o rt or e g u l a t et h ep l a n t w a t e rs t r e s s 6 d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a c lw e r eu s e dt os i m u l a t et h es a l ts t r e s sa n dt h e v 江苏大学硕士学位论文 e x t r a c e l l u l a rc a r b o n i ca n h y d r a s ei n h i b i t o ra zw a sa d d e da tt h es a m et i m et od i s c u s s t h ef u n c t i o no ft h ee x t r a c e l l u l a re n z y m ew h e nt h ep l a n t sw e r eu n d e rt h es a l ts t r e s s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb r o u s s o n e t i ap a p y r i f e r a sc a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e sw e r e a l lh a dac e r t a i nd e c l i n ea n dm o r u sa l b a sc a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e si n c r e a s e dt o t h e p e a ki nm i d d l ec o n c e n t r a t i o no fn a c l a n dh a dac e r t a i nd e c l i n ei nh i g h c o n c e n t r a t i o no fn a c lw h e n t h e yw e r es t r e s s e db yn a c l a l o n e b r o u s s o n e t i a p a p y r i f e r a si n h i b i t i o nc o n s t a n t so fn a + a n dc i 。w e r el e s st h a nm o r u sa l b a w h e na z w a sa d d e dt oi n h i b i tt h ee x t r a c e l l u l a re n z y m e ，t h ec a r b o n i ca n h y d r a s en ol o n g e r r e s p o n d e dt o s a l ts t r e s s ，b u tt h ei n t r a c e l l u l a re n z y m es t i l l d i d n tt a k ep a r ti nt h e r e s p o n s e i ts h o w e dt h a tt h ee x t r a c e l l u l a rc a r b o n i ca n h y d r a s em a yb et h em a i nf a c t o r t or e g u l a t et h ep l a n ts a l ts t r e s s 7 e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et h ec a r b o n i ca n h y d r a s e a c t i v i t i e so fs o i l t a k et h es o i lw h i c hc u c u m b e rw a sp l a n t e di na st h es t u d yo b j e c t ， m e a s u r et h ec o n c e n t r a t i o no fc 0 2a n dt h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e si nd i f f e r e n t l a y e r so fs o i l a td i f f e r e n tg r o w t hs t a g e so fc u c u m b e ra n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e ma n dw i t ht h es o i ld e p t hw e r ea n a l y z e d t h ec o n c e n t r a t i o no fc 0 2i ng r e e n h o u s e s o i li n c r e a s e dw i t ht h es o i ld e p t h ，a n dt h ec a r b o n i ca n h y d r a s ea c t i v i t i e sw e r eo p p o s i t e t h es o i lc a r b o na n h y d r a s ea c t i v i t i e sw e r ei n v e r s e l yr e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no f c 0 2 a b o v ea l l ，t h ee l e c t r o c h e m i c a lm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c a r b o n i c a n h y d r a s ea c t i v i t yi sb e a e rt h a nt h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d i th a sa c h i e v e dg o o dr e s u l t s i nr e a l a p p l i c a t i o n sa n dc a nb ep o p u l a r i z e dt o a l lk i n d so fs t u d i e so nc a r b o n i c a n h y d r a s ea c t i v i t yi nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：s b s b 2 0 3m i c r o e l e c t r o d e ，p h ，e l e c t r o c h e m i c a l ，c a r b o n i ca n h y d r a s e ， e x t r a c e l l u l a re n z y m e v i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密团。 学位论文作者签名：黼 丑扣年易月弹日 指导教师签名：头治荡 年月日 独创性申明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：施倩倩 少l q 年b 只 佃 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 碳酸酐酶催化的二氧化碳可逆水合反应是生物体中最重要的生命反应过程 之一，其种类及功能的多样性使得其对生物体尤其是喀斯特地区生物和环境具有 重大的意义。因此对碳酸酐酶活力大小的检测也是研究喀斯特地区生物和环境的 重要手段之一。由于当前常用的检测碳酸酐酶活力的方法的局限性，有必要对其 进行适当改进以提高检测的范围及精确度。 1 1 碳酸酐酶活力检测技术的研究现状 目前，对碳酸酐酶活力测定主要有以下几种方法。1 放射免疫分析法【1 】；2 p h 计法【2 】；3 同位素c o 颁谱分析法【3 】；4 比色法【4 】；5 荧光光度法【5 】；6 m r n a 钡0 定法；7 凝胶电泳法【6 】等等。但每种方法都有其各自的优缺点。放射免疫分析法 有较高的灵敏度，重现性好，但操作复杂；同位素c 0 2 质谱分析法有较高的灵敏 度，操作简单，重现性好，但设备昂贵；比色法和荧光光度法的精确度较高，但 测试成本较高。m r n a 测定法和凝胶电泳法灵敏度高，但操作烦琐；p h 计法操 作简单，便利快速，设备便宜，用得较广泛，但由于灵敏度较低，在一定活力范 围内线性较好，但超出该范围，线性较差。目前很多研究者大都采用p h 计法来 测定酶活力，因此对这种操作简便的方法也提出了新的改进要求以适应更多需要 检测碳酸酐酶的领域的需求。 1 2p h 测量技术的研究现状 p h 是水溶液中最重要的物理化学参数之一，凡涉及到水及溶液的自然现象、 化学变化以及生产过程都与p h 有关。 目前广泛使用的p h 传感器是玻璃电极，其次还有金属金属氧化物电极、醌 氢醌电极等。p h 玻璃电极测量精度和准确度高，响应快，但其内阻极高( 一般为 1 0 8 1 0 9 q ) ，且机械强度差易破损，存在酸误差和碱误差，无法测定含f 溶液 的p h ，难以微型化等缺点。随着科学和工业技术的迅速发展，尤其是现代生命 科学、生物工程、环境科学、食品科学和其它高科技领域的迅速发展，以及高温、 高压、非水溶液等特殊环境或胶体、浑浊液、土壤、固体、半固体表面及内部、 江苏大学硕士学位论文 糊状物、纤维质表面p h 的原位无破损测量和某些生产过程中的特殊条件( 如： 连续监测、自动控制) 的p h 测量等，都对p h 电极提出了越来越苛刻的要求， 已成为p h 测量技术所面临的亟待解决的课题 7 1 。 目前以p h 玻璃电极测定p h ，人们忽视了玻璃电极表面因亲水性而产生的 吸附作用所导致的p h 测量误差，同时由于其体积大，难以微型化，不适用于微 区、微环境和生物活体的原位及连续在线检测，更难适应在恶劣腐蚀环境下的应 用。因此，进行各种新的或特殊用途的p h 传感器的研究、开发、应用及其机理 的探讨引起了许多学者的兴趣【8 - 1 0 】。其中全固态p h 电极，易于微型化，适用于 生物体，生命过程及微环境分析等领域的发展要求，成为越来越多学者研究的一 个热点问题【1 0 1 1 1 。 1 3 全固态p h 电极的研究现状 全固态p h 电极主要有金属金属氧化物电极和氢离子敏场效应晶体管 ( i s f e t ) 。后者是一种新型的p h 敏感器件，i s f e t 是一块硅晶片，作为p h 电 极其具有良好的精密度与重复性，响应时间短，具有长期工作的稳定性能，但是 硅晶片电极容易被污染，寿命比玻璃电极短，需经常维护。而金属金属氧化物 p h 电极具有内阻小、响应快、机械强度高、易加工等特点，可用于p h 玻璃电 极无法适应的测试环境如高温或强搅拌体系，可以微型化以满足生命科学、医学 临床等领域的要求；不易破碎，可用在食品工业中；还可以用于含f 溶液体系， 是p h 玻璃电极的一个重要替代体系，也是目前p h 电极的一个主要研究方向。 金属金属氧化物p h 传感器所用金属一般为过渡态金属，主要集中在第4 ， 5 ，6 周期的少数元素，例如第4 周期的c o 、t i 、m n l l 2 4 1 ，第5 周期的z r 、m o 、 r - u 、r h 、p d 、s b 、s n 1 5 棚】，第6 周期的t a 、w 、i r 、p t 、p b 1 2 , 1 9 - 2 1 】，生成非化学 计量比的金属氧化物m o x ，金属氧化物对h + 有敏感性，进行有h + 参与的氧化还 原反应，该反应为可逆过程，电极反应服从n e m s t 方程。根据参与反应电子数， 以及反应历程可求出e p h 线性关系，e - p h 关系的斜率( 或 5 9 m v p h 或 5 9 m v p h ) ，依电极反应历程而定【1 9 1 。 锑金属作为一种研究历史最为悠久【勿，也是应用最为广泛的电极制作材料， 其氧化物s b 2 0 3 ，比经常用来测量p h 的铂系家族的金属氧化物例如铱、铂、钯 2 江苏大学硕士学位论文 等成本低很多且容易得到，应用于许多实际测量领域中。电极响应h + 机理： 2 s b + 3 h 2 0 = s b 2 0 3 + 6 h + + 6 e n s d h a l l a 2 3 1 等人将锑电极用于哺乳动物心肌p h 的测量；n h b a g h d a d y 【刎等利用锑微电极监测了根系周围土壤微区的p h 变化；m d c a p e l a t o 2 5 】等 人制备了锑氧化锑电极，并采用流动注射电势测定法测量了醋中的焦炭酸和乙 酸的含量。锑微电极还被广泛应用于医学领域中p h 的测量，g eh u a n g 2 6 1 和 x b z h a n 【明等人就采用了锑电极来测量1 3 腔中不同位点的牙菌斑p h 值和大鼠 胃黏膜黏液层的p h 梯度。近年来，锑微电极还被应用于半固体状体系中的p h 值测量，浙江大学的哈阳，王敏陋】发明了一种毛细管熔融法，制备出一种可 以插入半固体培养基中监测培养基p h 值变化的锑微电极，实现了连续在线监测 植物培养基中的p h 改变，为植物组培苗的生长状况提供了一定的依据。 1 4 电化学传感技术简介 在众多的分析检测技术中，电化学传感技术是最佳的实时现场检测技术， 其核心就是电化学传感器。由于电化学传感器具有实时、灵敏度高、选择性好、 成本低、样品消耗少以及不受样品浑浊度影响等优点，已被广泛地包括临床诊断、 工业过程控制和环境监测等众多领域【2 9 删。根据测定信号和方式的不同，电化学 传感器主要分为电位型、电流型以及选择性差的电导和阻抗型。电位型传感器是 在几乎没有电流通过的情况下，通过测量指示电极与参比电极或由选择渗透性膜 分开的两支参比电极之间的电位差，因此又称为离子选择性电极。而p h 电极与 电化学传感技术的相结合就是氢离子选择性电极，可将其运用于需要实时监测 p h 变化的生命过程、原位无损测量、工业过程控制等领域f 3 1 】。 1 5 碳酸酐酶及其胞外酶的研究现状 1 5 1 碳酸酐酶的研究现状 碳酸酐酶( c a r b o n i ca n h y d r a s e ) 是一种含铛金属酶。它的主要生物学功能是催 化二氧化碳的可逆水合反应：c 0 2 + h 2 0 h h 2 ( 0 3 hh c 0 3 - + h + ，是已知的催化反 应速度最快的酶之一，可以将反应速率提高，个数量级。 自从1 9 3 3 年m e l d r u m 和r o u g h t o n l 3 2 】发现牛的血红细胞中存在碳酸酐酶以 3 江苏大学硕士学位论文 来，不仅在所有哺乳动物的组织和细胞类型中发现了碳酸酐酶，而且在植物和单 细胞绿藻中也发现了丰富的碳酸酐酶。虽然碳酸酐酶存在于真核生物界所有高度 进化的生物体中，但对来自古细菌界和细菌界原核生物的碳酸酐酶关注较少，自 1 9 6 3 年在干燥奈瑟球菌中首次发现存在碳酸酐酶以来【3 3 】，便开始了对原核生物 碳酸酐酶的研究。最近的研究结果表明碳酸酐酶广泛存在于古细菌界和细菌界代 谢多样化的原核生物种类中。到目前为止，除了真菌外，其他生物体中都已发现 了该类酶的存在【3 4 1 。 根据氨基酸序列比较和晶体结构分析，人们主要将碳酸酐酶分为仅、p 、丫三 种不同类型【3 5 1 。其中a 类碳酸酐酶是了解最多的一类碳酸酐酶，存在于所有哺 乳动物【3 5 , 3 6 、一些单细胞藻类【3 7 】以及很少的细菌界原核生物中【3 8 捌，p 类碳酸酐 酶广泛分布于高等植物、多种藻类的叶绿体以及细菌界和古细菌界原核生物中 【3 5 4 0 弼】，丫类碳酸酐酶现在只发现一种，它存在于一种产甲烷的古细菌 m e t h a n o s a r c i n at h e r m o p h l i l a 中【删。 碳酸酐酶的功能是多种多样的。碳酸酐酶除为酶反应提供c o dh c 0 3 外， 还可以通过移去c 0 2 h c 0 3 来推动反应产生能量。碳酸酐酶通过将c 0 2 转换成 h c 0 3 。，移去脱羧反应产生的c 0 2 从而推动脱羧反应的进行。碳酸酐酶在植物中 催化光合作用过程中可逆的c 0 2 水合反应，促进c 0 2 向r u b i s c o 扩散。碳酸酐 酶对呼吸作用、酸碱平衡和离子运输、钙化作用等也是必需的【4 5 , 4 6 1 。 碳酸酐酶还可催化一些其他的反应，如乙醛的水化和各种卤素衍生物的水 解，甲烷八叠球菌属的产甲烷，某些细菌将氰酸盐分解成氨以及某些植物对碳酰 硫( c o s ) 的吸收，羧酸酯类、酚类、磺酸酯、磷酸酯也可用作碳酸酐酶的底物 4 5 ，4 7 5 0 】 o 国外有关碳酸酐酶的研究大多集中在碳酸酐酶在动物尤其是人体器官中的 功能作用上，h i r o y o s h i 等人研究了碳酸酐酶活性的抑制对白血球转移的影唰5 1 】； m a r c u sm a u 等人则证明了三种反刍动物和狒狒的唾液分泌物中含有碳酸酐酶同 功酶【5 2 1 ；也有部分关于植物、微生物碳酸酐酶的研究，如在微藻生长过程中， 碳的固定和碳酸酐酶活性受光强的影响【5 3 1 ，以及关于碳酸酐酶和光合作用之间 关系的研究，碳酸酐酶抑制剂方面的研究等等。 国内近年来有关碳酸酐酶的研究主要集中在以喀斯特地形特征为主的岩溶 4 江苏大学硕士学位论文 地区的植物和微生物碳酸酐酶活力及作用上。吴沿友【5 4 】等研究喀斯特地区适生 植物诸葛菜的碳酸酐酶活力及其对石灰岩的溶解和风化作用，通过与油菜的碳酸 酐酶活力和其对岩石溶解风化作用的比较发现，喀斯特适生植物诸葛菜的碳酸酐 酶活力及对岩石溶解风化的程度远大于生长在一般地区的油菜。而刑德科【5 5 l 等 则以藤本植物金银花、牵牛花和爬山虎为例，研究证实了在高p h 和低营养浓度 下，金银花作为喀斯特适生植物表现出了对岩溶地区高p h 和低营养浓度的适应 性要好于牵牛花和爬山虎。 另据研究【5 6 】，藻类、苔藓、蕨类植物、裸子植物以及被子植物都有碳酸酐 酶活力，各种碳酸酐酶活力相差很大。草本植物中，诸葛菜酶活性较好，木本植 物中，椿和贵州榕活性也较高，而这些植物都是喀斯特地区常见植物种群，较高 的碳酸酐酶活性可以为植物在岩溶地区的水分逆境条件下加速石灰岩的溶解 1 5 7 1 ，更好地获得h c 0 3 。，另一方面，碳酸酐酶可以快速地将h c 0 3 - 转化成h 2 0 和c 0 2 ，弥补植物在水分逆境下的缺水和c 0 2 ，使得这些植物在喀斯特干旱的环 境下仍能维持正常代谢水平。 另外，李为，余龙江等人【5 8 】研究报道了不同岩溶生态系统的表层土壤中都 能检测到不同程度的碳酸酐酶活性，在非碳酸盐岩的砂页岩对照区土壤中也检 测到了碳酸酐酶活性，并发现其中植被覆盖率低的土壤碳酸酐酶活性最低，植被 种类丰富的且生长较好的土壤碳酸酐酶活性较高。这说明广泛存在于动植物和原 核生物中的碳酸酐酶可以通过生物的腐烂或分泌，存在于生物所处的周围环境例 如土壤中。由于碳酸酐酶具有高效快速催化c 0 2 和h c 0 3 。之间相互转化反应的 功能，因而可能对周围的环境产生影响，如对大气c 0 2 沉降、碳酸盐岩的溶解 等产生影响。其研究还表明土壤碳酸酐酶活性与岩溶生态系统的地球化学背景、 岩溶地形和植被类型及生长状况高度相关。 1 5 2 碳酸酐酶胞外酶的研究现状 对于碳酸酐酶胞外酶国内外的研究主要集中在了微生物和藻类中，其中以藻 类研究得最为详细。 就微生物而言，岩溶地区土壤中分离出的微生物胞外碳酸酐酶成为了典型的 研究对象。余龙江，吴云等【5 9 】从西南岩溶地区筛选的一株产胞外碳酸酐酶的细 菌g l c a l 0 2 为例，借助室内模拟实验来研究其胞外碳酸酐酶对石灰岩的溶蚀驱 5 江苏大学硕士学位论文 动作用。结果表明，微生物胞外碳酸酐酶在岩溶环境下的离子浓度和偏碱性的土 壤环境中保持良好的稳定性，对石灰岩有显著的酶促溶蚀驱动作用。a n j a n a s h a r m a 6 0 等人第一次从非喀斯特岩溶地区的富含c a c 0 3 的土壤中分离净化出一 种假单胞菌加譬f ，研究了其胞外碳酸酐酶的结构及活力。结果表明，该假单胞 菌胞外碳酸酐酶耐热性好，适于碱性p h 条件，并对碳酸盐的转化及无机碳的固 定起了重要的作用。 对微藻( m i c r o a l g a e ) 的碳酸酐酶细胞内定位研究指出，碳酸酐酶可以分两 类，一类仅存在于细胞内( 某些小球藻如c h l o r e l l a v u l g a r i s ) ，而在细胞内的分布也 同c 3 植物类似，大部分存在于叶绿体内；另一类如衣藻( c h l a m v d o m o n a s ) 则 仅有少量存在于细胞内，而8 0 以上则存在原生质膜外面，可能存在于周质空间 ( p e r i p l a s m i cs p a c e ) 或附在细胞壁上，也有相当部分分泌到介质中。 由于水体中只有1 的无机碳是以c 0 2 形式存在，9 9 的无机碳是以h c 0 3 。 形式存在的，因此水中的植物大军藻类，便进化出了一种将h c 0 3 - 转变成到细胞 内c 0 2 的功能，这种功能就是碳酸酐酶的作用。在众多浮游藻类，诸如蓝藻、 红藻、绿藻、隐藻、色植藻和裸藻【6 1 】等以及每藻【6 2 。叫中都发现有碳酸酐酶。而 胞外碳酸酐酶则在藻类兀机碳的转换中起着重要的作用。这主要是由于h c 0 3 带负电荷，在脂质中溶解性差，而c 0 2 可自由地溶解在脂质和水相中，对于脂 质的细胞膜，c 0 2 进出自由，h c 0 3 转移较差。对于高效光合作用的藻类，进化 了胞外碳酸酐酶( 细胞质膜外) ，无疑可以起到c 0 2 浓缩作用。所以，对于藻 类来说，无机碳可以以h c 0 3