（微生物学专业论文）曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究.pdf

南京师范大学硕士毕业论文 曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究 曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究 摘要 果胶酶具有广阔的商业用途，在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、 提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。a s p e r g i l l u sf u n g i 是生 产果胶酶最常用的菌种，一直用于传统发酵食品的生产，自然条件下其果胶酶的 产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少，且活性较低。果胶酸 裂解酶( p e c t a t el y a s e ) 和果胶酸水解酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ) 在生物界中来源 广泛，在植物，真菌和细菌中都有报道。从一系列不同的植物组织中，如萌发的 种子，花粉，植物细胞发酵液，成熟的水果等，研究人员获得到多种p e c t a t el y a s e 和p o l y g a l a c t u r o n a s e 基因。p e c t a t el y a s e a ( p e l a ) 来自于a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ， p o i y g a i a c l u r o n a s ea ( p g a ) 来自于a s p e n 2 i l l u so r y z a e 。本文成功地构建了 a s p e r g i l l u sn i d u l a n sp e | a 和a s p e r g i l l u so r y z a ep g a 原核高效表达体系。 通过r t - p c r 扩增得到不含信号肽的p e l ac d n a ，它的序列被连接至r j p m d 1 8 一tv e c t o r ( t a k a r a ) ，用d n a 限制性内切酶n d ei 和e c o ri 将不含信号肽 i 拘p e l ac d n a 从p m d l 8 一t - p e l a 切下，连至j j p e t - 2 8 a ( + ) 表达载体( n o v a g e n ) 构建 p e t - 2 8 a ( + ) 一p e l a ，转化e c o # t u r n e r ( d e 3 ) p l a ci 细胞( n o v a g e n ) 。 p e t - 2 8 a ( + ) 一p e l a - t u r n e r ( d e 3 ) p l a ci 重组菌采用0 5 m mi p t g 诱导，2 0 。c 低温 表达6 0 h ，0 c 条件下超声破碎细胞后离心得到上清，上清用n i n t ah i s - b i n d r e s i n s ( n o v a g e n ) 进行一步纯化，在5 0m mt r i s h c i ，p h 8 5 的缓冲液中进行 透析。重组酶活力可达3 6 0u m l - 1 ，是自然条件下产酶量的3 6 0 0 倍。p e la 仅对 果胶酸和3 0 酯化度的果胶有裂解能力，对其它细胞壁多聚物没有作用。对果胶 的裂解活性随甲基化程度上升和酸性化程度下降而变小，反之，随甲基化程度下 南京师范大学硕士毕业论文 曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究 降和酸性化程度上升而变强。p e i a 的最适酶反应条件p h7 5 1 0 ，5 0 c 。m n 2 + ， c a 2 + ，f e 2 + ，m 9 2 + 和f e 3 + 对酶活力有不同程度的激活作用，而c u 2 + 和z n 2 + 对酶活 力有部分抑制作用。用不同浓度的果胶酸作底物，检测该酶的酶动力学常数， v m 。为7 7p m o lr a i n 1 m g ，_ i ( m 为o 5 0m 9m l 1 。p e i a 对植物组织的尝试性研 究发现该酶能有效解离绿豆等双予叶植物组织。 同样通过r t - p c r 扩增得到不含信号肽的p g ac d n a ，它的序列被连接到 p m d1 8 一tv e c t o r ( t a k a r a ) ，用d n a 限制性内切酶n d ei 和e c o ri 将不含信 号肽的p g ac d n a 从p m d l 8 - t - p e l a $ 刀t ，连至l j p e t - 2 8 a ( + ) 表达载体( n o v a g e n ) 构建p e t - 2 8 a ( + ) - p g a ，转化e c o i l - r u i n e r ( d e 3 ) p l a ci 细胞( n o v a g e n ) 。转化子 p e t - 2 8 a ( + ) - p g a t u r n e r ( d e 3 ) p l a ci 的构建首次实现了米曲霉p g a 在大肠杆 菌系统中过表达，进一步对p g a 在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在 3 7 c 条件，2 2 0r p m ，培养p e t - 2 8 a ( + ) 一p g a - t u r n e r ( d e 3 ) p l a ci 细胞，o d 6 0 0 至 o 8 左右时，用5 0 0p mi s o p r o p y li t d 坩1 i o g a i a c t o g a f a c t o p y r a n o s i d e ( i p t g ) 进 行诱导表达，在1 5 c 和1 7 0r p m 条件下继续培养2 4h ，表达效果最好，相对于每 毫升培养基而言，产酶可达到7 0u m ，是米曲霉自然条件产酶量的8 7 5 倍，远 优于文献报道的重组表达的p g a 酶活。p g a 对果胶底物的降解能力同p e la 。 p g a 的最适酶反应条件p h5 o 5 5 ，5 0 ，c u 2 + 和z n 2 + 对酶活力有部分抑制 作用。p g a 对植物组织的尝试性研究发现该酶也能有效解离绿豆等双予叶植物 组织。 关键词：构巢曲霉；米曲霉；果胶酸裂解酶a ( p e la ) ；果胶酸水解酶( p g a ) ； 大肠杆菌；原核表达；纯化；酶学性质；解离 鸯泰帮藏大学疆士毕鼗瓷殳叠l 霉暴获辩强大弱杼蕊串熬熬维表运觋究 e x p r e s s i o no fp e c t i n a s e so fa s p e r g i l l u si n e s c h e r i c h i ac o i l a b s t r a c t p e c f i n a s e sa r em a i n l yu s e di nt h e 耙o di n d u s t r yt oc l a r i f yf r u i tj u i c e sa n d w i n e ，i m p r o v eo i le x t r a c t i o n r e m o v et h ep e e lf r o mt h ec i t r u sf r u i t ，i n c r e a s et h e f i r m n e s so fs o m ef r u i t sa n dd e g u mf i b r e s a s p e r g n u s f u n g i ，a st h ef a m i l i a r f u n g i c o u l d p r o d u c ep e c t i n a s e s ，u s e d f o rt h e p r o d u c t i o n o ft r a d i t i o n a l f e r m e n t e df o o d s ，o n l yc o u l dp r o d u c el e s sp e c t i n a s e su n d e rn a t u r a lc o n d i t i o n s s of a ro n l yaf e wo fp e c t i n a s e se x p r e s s e di ny e a s to re c o l iw e r er e p o s e db u t t h e yd i dn o ts h o wh i g h e ra c t i v i t y 。p e c t a t el y a s ea n dp o l y g a l a c t u r o n a s eh a v ea n e x t e n s i v es o u r c e n e p o r c e di nt h ep l a n t ，f u n g ia n db a c t e r i a p e c t a t el y a s ea ( p e i a ) o fa s p e r g i l l u sn i d u a n s a n dp o l y g a l a c t u r o n a s ea ( p g a )o f a s p e r g i l t u so t y 2 a ew e r es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne s c h e h c h i ac o i l t h ec d n ao fm a t u r ep e l a ( w i t h o u ts i g n a lp e p t i d e 、w a ss y n t h e s i z e dw i t h s p e c i f i cp r i m e r sf r o mt o t a lr n ao f a s p e r g i l l u sn i d u l a n sb yr t - p c r p e l ac d n a w a s l i g a t e d i n t o p e t - 2 8 a ( + e x p r e s s i o nv e c t o r , c r e a t i n gp l a s m i d p e t - 2 8 a ( + ) 一p e l a t h ep l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oec o i lt u r n e r ( d e 3 ) p l a c ic e l l st oe x p r e s sp e l ah e t e r o g e n e o u s l y f o ri m p r o v i n gt h ee f f i c i e n c yo fp e l a e x p r e s s i o ni ne 。c o i i , t h ec o n d i t i o n sf o re x p r e s s i o no ft h ep e i ai ne c o l iw e r e o p t i m i z e d ec o l it u r n e r ( d e 3 ) p l a cic e l l sw i t hp e t - 2 8 a ( + ) p e l aw e r ef i r s t c u l t i v a t e da t3 7 cr2 2 0r p mu n t i lo d 6 0 0 n mr e a c h e da b o u t0 8 t h e n ，c u l t i v a t i o n b r o t hw a sa d d e dw i t h0 5m mi p t ga n di n c u b a t e da t2 0 c ，1 7 0r p mf o ro t h e r 6 0hf o ri n d u c e d - e x p r e s s i o no fp e l a t h er e c o m b i n a n tp e i aw a se f f e c t i v e l y p u r i f i e du s i n gan i 2 + - nt ro t ra c e t a t e ：a g a r o s ec o l u m n e n z y m ea c t i v i t yo ft h e r e c o m b i n a n tp e 浚c o u l dr e a c h3 6 00 m 0 m e d i u m ，w h i c hi s3 8 0 0 粕韬o ft h e a c t i v i t yo fp e l ap r o d u c e di nc u l t u r eo fa n i d u l a n sa n da l s os u p e r i o rt h a n k n o w nr e c o m b i n a n te x p r e s s i o na m o u n to fp e l ar e p o s e db yo t h e rr e s e a r c h e r s l o w - e s t e r i f i e dp e c t i n p e c t i ne s t e r i f i e da p p r o x3 0 o rp l o y g a l a c t u r o n i ca c i d ) w a st h eo p t i m u ms u b s t r a t ef o rt h ep e l a ，w h e r e a sh i g h e r - e s t e r i f i e dp e c t i nw a s 玎t 南京师范大学硕士毕业论定曲霉栗胶酶在大肠杆菌中的熏组表达研究 h a r d l yc l e a v e db yi t t h ee x p r e s s e dp e l a e x h i b i t e di t so p t i m u ml e v e lo fa c t i v i t y o v e rt h er a n g eo fp 瓣7 蚕1 0a t5 0 c 。m n z + ，c a z * ，f e 2 + ，m 9 2 + ，a n df e 3 + i o n s s t i m u l a t e dt h ep e c t a t el y a s ea c t i v i t y ，b u tc u 2 + a n dz n 2 + i n h i b i t e di t t h e r e c o m b i n a n tp e l ah a da x0 f7 7p m o lm i n l m 9 1a n da na p p a r e n t 心，o fo 5 0 m gm l f o rp o l y g a l a c t u r o n i ca c i d 。p e l ae f f i c i e n t l ym a c e r a t e dm u n gb e a n h y p o c o t y l sa n dp o t a t ot u b e rt i s s u e si n t os i n g l ec e l l s t h ec d n ao fm a t u r ep g a ( w i t h o u ts i g n a lp e p t i d e ) w e r es y n t h e s i z e dw i t h s p e c i f i cp r i m e r sf r o mt o t a lr n a o fa s p e r g i l l u so r y z a eb yr t - p c r p g ac d n a w a s l i g a t e d i n t o p e t - 2 8 a ( + )e x p r e s s i o nv e c t o r , c r e a t i n gp l a s m i d p e t - 2 8 a ( + ) - p g a t h ep l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o i lt u r n e r ( d e 3 ) p l a c lc e l l st oe x p r e s sp g ah e t e r o g e n e o u s l y 。f o ri m p r o v i n gt h ee f f i c i e n c yo fp g a e x p r e s s i o ni ne c o l i t h ec o n d i t i o n sf o le x p r e s s i o no ft h ep g a i ne c o i lw e r e o p t i m i z e d ec o i lt u r n e r ( d e 3 ) p l a c ic e l l sw i t hp e t - 2 8 a ( + ) 一p g aw e r ef i r s t c u l t i v a t e da t3 7 ，2 2 0r p mu n t i lo d e o o mr e a c h e da b o u t0 8 。t h e n ，c u l t i v a t i o n b r o t hw a sa d d e dw i t h0 5m mi p t ga n di n c u b a t e da t l 5 c 1 7 0r p mf o ro t h e r 2 4h f o ri n d u c e d - e x p r e s s i o no fp g a o u rd a t as h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo f r e c o m b i n a n te x p r e s s e dp g ac o u l dr e a c ht o7 0u m l m e d i u m ，矗h i c hi s 8 7 5 - f o l do ft h ea c t i v i t yo fp g ap r o d u c e di nc u l t u r eo fa o r y z a ea n ds u p e r i o r t h a nk n o w nr e c o m b i n a n te x p r e s s i o na m o u n to fp g ar e p o s e db yo t h e r r e s e a r c h e r s 。a ss a m ea sp e i a ，i o w - e s t e r i f i e dp e c t i n ( p e c t i ne s t e r i f i e da p p r o x 3 0 o rp l o y g a l a c t u r o n i ca c i d ) w a st h eo p t i m u ms u b s t r a t ef o rt h ep g a ， w h e r e a sh i g h e r - e s t e r i f i e dp e c t i nw a sh a r d l yc l e a v e db yi l p g ae x h i b i t e di t s o p t i m u ml e v e lo fa c t i v i t yo v e rt h er a n g eo fp 瓣5 o 5 5a t5 0 。c 。e 茁+ a n dz n 2 + i n hbt e dt h ep g aa c t i v i t y p g aa l s o e f f i c i e n t l ym a c e r a t e dm u n gb e a n h y p o c o t y l sa n dp o r t ot u b e rt i s s u e si n t os i n g l ec e l l s k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ：a s p e r g i l l u so r y z a e ；p e c t a t el y a s ea ( p e t a ) p o l y g a l a c t u r o n a s e ( p g a ) ：e s c h e f i c h i ac o i l ；e x p r e s s i o n ；p u r i f i c a t i o n c h a r a c t e r i z a t i o n ；m a c e r a t i o n i v 学位论文独创性声明 本人郑重声踞； l 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工件。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文巾除弓| 文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他离志对本研究所做豹贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保馨学位论文并向图家主管部门或其指定机构送交论文的电 子舨和纸质版；有权将学位论文用于非赢荦j 嚣豹的少量复材并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学馕论文在 解密后逶用本规定。 作者签名： 日期： 南京师范大学硕士毕业论文 曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究 第一章绪论 1 果胶和果胶酶 1 1 果胶 1 8 2 5 年，b r a c o n n o t ( t a k a n oe t a l l 9 9 3 ) 首次从胡萝h 中提取出一种水溶 性物质，可形成凝胶，于是他将该物质命名为“p e c t i n ”( p e c t i n 源于希腊语，有 凝固、凝结之意) 并用此果胶制成了“人造胶冻”。从此，众多学者致力于果胶的 研究，并使果胶在食品、饲料添加剂、医药众多领域中得到了广泛应用。 果胶类物质是存在于高等植物初生壁和细胞间隙中的一组密切相关的基质 多糖，又称果胶多糖，果胶类物质主要存在于中胶层和双子叶植物的初生细胞壁 中，而单子叶植物细胞壁中果胶含量较少。在初生壁中与不同含量的纤维素、半 纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白( e x t e n s i n ) ( p e r e z 和m a z e a ue t a l 2 0 0 0 ) 相互交联，在植物生长和果实成熟过程中，对细胞组织起着软化和粘 合作用，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态，同时构成抵御病原体微 生物入侵的天然屏障。 就化学组成和生物合成而言，果胶类多糖是植物细胞壁多糖类家族中最为复 杂的一员。2 0 世纪8 0 年代初，p a l b e r s h e i m e ta 1 ( p a l b e r s h e i me ta 1 19 7 6 ) 用高纯的内切聚半乳糖醛酸酶水解悬铃木细胞，释放出各种多糖片段，并推断 d 半乳糖醛酸残基在4 位连接的占优势，l - 鼠李糖残基在2 位和2 ，4 位连接的 约各占一半。鼠李糖残基以2 ，4 糖苷键连接在d 一半乳糖醛酸残基上，由此分支 的侧链，主要含l - 5 可拉伯糖和d 半乳糖残基。1 9 8 5 年，pa l b e r s h e i m 进一步 应用h p l c 色谱、g c 色谱和1 h n m r 分析了各种多糖碎片，证实了以上推测。 一个世纪以来，众多科学家在果胶类多糖领域进行着细致而深入的研究，使对果 胶多糖的结构、化学组成的认识越来越趋于系统和完善。 果胶类多糖的分子量介于1 0 0 0 0 _ 4 0 0 0 0 0 之间，是一类含有a 一1 ，4 一键相连 的d 半乳糖醛酸残基( g a l p a ) ( 主) 复杂多糖，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳 糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠 离子，特别是与硼的化合物结合在一起( p e m ze ta 1 2 0 0 3 ) 。同型半乳糖醛酸聚 糖( h a m o g a l a c t u r o n a n ，h g a ) ，鼠李半乳糖醛酸聚糖i ( r h a m n o g a l a c t u r o n a n i ，r gi ) 和鼠李半乳糖醛酸聚糖i i ( r h a m n o g a l a c t u r o n a ni i ，r g ) 等果胶 南京帮鞯大学硕士荜鼗论文曲霉果胺酶在大肠秆菌中的麓组表达研究 多糖忍经从细胞盛中被提取出来( o n e i l l e t a l l 9 9 0 ；v i s s e r 和v o r a g e n ，1 9 9 6 ) 。 h g 楚由a ，4 。键相连酶昏警攀l 糖醛酸残藻缝残豹线黧多耱，半李耱醛酸兹羧 基有不同程度的甲基化，因植物种类的不同，h g 的半乳糖醛酸残基的c 一2 ，c 3 可以被乙基化( i s h i i ，1 9 9 5 和1 9 9 7 a ) 。r gi 是其骨架为禽有【_ 4 1 - a d - g a l p a 一( 1 ， 2 ) - a 一1 r h a p - ( 1 - 瓣二糖摹耋笈翡一类采荻多糖，其夤檠上静半嚣耱懿敬残基静 c - 2 ，c - 3 可以被己基化。r gi i 是一类多态的多糖群体，含有线形的a 一1 ，4 一 键捅迤的d 半乳糖醛酸残基缎成的骨架 0 ne ；l le ta l ，1 9 9 0 ) 。r gl i 出现在目前 磅究貔掰有毒等穗杨豹裙生缨貔壁孛( o n e i l le ta l l 9 9 0 ) 。r gi i 窘够毅酶金餍 离予( p e l l e r i ne t a l 1 9 9 7 ；p e l l e r i n 和o n e i l l ，1 9 9 8 ；s z p u n a r e t a l l 9 9 9 ；t a h i r i e ta k 2 0 0 0 ) ，在葡萄酒和其它饮料中含量技勰( 2 0 2 5 0 m g t l ) ( d o c o ，1 9 9 7 ) ， 有一定静免疫学渤耗( s h i ne t a l1 9 9 8 ) ，瓣入类翦营养耧健簇有一定瓣蠹义。r g i i 在结构上不会和r gl 相连，因为r gi i 的骨架是1 ，4 * 连接的a ，d 。g a l p a 基 团两不是【- 4 】- a - d g b i p a - ( 1 ，2 卜a 一1 r h a p - ( 1 w 3 豹二糖基照复单位组成( o n e i ue t a 1 9 9 0 ) 。 果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大 致的缝构如图1 1 所示。总体w 分为光滑区( s m o o t hr e g i o n ) 和须状区( h a i r y r e g i o n ) 两帮；分，童要由h g a ( 半巍糖醛酸浆耱h o m o g a t a c t u r o n a n s ) 、r gl ( 鼠攀半乳糖醛酸聚糖ir h a m n o g a l a c t u r o n a n si ) 和r gi i ( 鼠攀半乳糖醛 酸聚糖i ir h a m n o g a l a c t u r o n a n s i i ) 三个结构区域构成，其中r gl 常以二聚 体鹃形式存在。弼其它植戆多耱一样，果驳嘏是多分子鹩、多分散酶、多结构煞、 有高级空间构象的和一定的相对分子质量分布的。 2 南京师菇大学硕士毕业论文曲霉果胶酶在大肠杆菌中的重组表达研究 图1 1 果胶的结构简图 f i g u r e1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fp e c t i n s 鉴于果胶类多糖的复杂性，美国化工协会( a m e r i c a nc h e m i c a ls o c i e t y ) 于1 9 9 8 年将果胶类多糖分为以下四大主要类别： ( 1 ) 原果胶( p r o t o p e c t i n ) ：存在于完整植物组织中的不溶于水的果胶类 物质，经过严格的水解反应可生成胶质果胶或果胶酸( p e n t i no rp e c t i ca c i d ) ； ( 2 ) 果胶酸( p e c t i ca c i d ) ：可溶于水的多聚半乳糖醛酸，含有微量可忽略 不计的甲基化成分。其盐类称之为果胶酸盐( p e c t a t e s ) ； ( 3 ) 果胶酯酸( p e c t i n i ca c i d ) ：多聚半乳糖醛酸链中耋7 5 的多聚半乳糖 醛酸单位被甲基化，其盐类也被称为果胶酸盐( p e c t i n a t e s ) ； ( 4 ) 果胶酯( p e c t i no rp o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t e ) = 其多聚半乳糖醛酸链 中至少有7 5 的多聚半乳糖醛酸单位的羧基被甲醇( 或乙醇) 酯化，它被证实同 纤维素交联后对植物的细胞壁起到了硬化的作用。 1 2 果胶酶及其研究概况 微生物作为自然界中最为广泛的酶源，由其产生的许多酶今天已经可以商业 化生产并应用到社会生活的各个领域。果胶酶作为其中的一员，从工业应用的角 度来看有着重要的和巨大的潜力。果胶酶被广泛地应用于果汁榨取和澄清、棉布 壅塞墅篓奎茎鎏圭笺錾鎏塞叁曼墨墼黧垄堑堑蔓皇墼薹簦耋姿堡茎 脱浆、植物纤维脱胶、废水处理、植物油类提取、茶叶和咖啡发酵、纸张漂白、 动物镄辩添翅剩、灌糖饮辩等众多露韭。霆瓣在维持生态乎鬻( 麴植甥滚弃秘豹 降解和循环) 方耐也起到了功不可没的作用。 果胶酶( p e c l i n a s e s ) 是指分解果胶物质的一类酶，贝有广泛的微缴物来源， 缨藏，真莛和数线蔻都可班产黛莱胶酶。攥缀道，嚣翦微生物来源的聚胶酶已经 在全球食品用酶巾占到了2 5 的比例，几乎所有已经商渡化的果胶酶均产自真 菌( s i n g hs ae ta l1 9 9 9 ) 。 麸广泛意义上讲采藏酶大钵戳分菇三类( s a k a i ，2 0 0 0 ；p a l o m a u k ie t a f l 9 9 7 ) ： ( 1 ) 原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e s ) ：降解不溶的原果胶为可溶的胶质果胶 或鬃毅羧( p e n t i no rp e c t i ca c i d ) ： ( 2 ) 果胶酯酶( e s t e m s e s ) = 通过转移甲基或乙基使果胶去酯化； ( 3 ) 果胶降解酶( d e p o l y m e r a s e s ) , 催化果胶半乳糖醛酸二聚体a 1 ，4 糖芬键懿瑟裂。 骐中果胶降解酶( d e p o l y m e r a s e s ) 通过两种不同的机制作用予粜胶底物： 一魑在水分子的参与下，通过水解( h y d r o l y s i s ) 的方式偻化糖营的断裂；二是 在没鸯窳分子参与魏馕琵_ f ，运遗一消豫( 一e l i m i n a t i o n ) 靛方式催像耱蜚键载 断裂( c o d n e rr c ，2 0 0 1 ) ，即作用于半乳糖醛酸第5 位的p 碳原子，使p 一碳原 子上的h 转移到了糖苷键的氧原子上，糖替键断裂，在半乳糖醛酸的c 4 和c 一5 之阁形成了一个澉键。它翻耱髂建方式垮蠢内穗秘羚落之分。稷摆聚羧洚簿酶 ( d e p o i y m e r a s e s ) 作用的底物、降解机制和作用键位的不同，又可将其分为四 类：果胶酸水解酶( p o l y g a l a c t u r o n a s ep g ) 绷果胶酸酝水解酶 ( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a s ep m g ) 敬泰解靛方式降辩瘫镑；莱黢酸爱簿酶 ( p e c t a t el y a s e 成p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s ep l ) 和果胶酸酯裂解酶( p e c t i n l y a s e 或p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t el y a s e ，p m l p g l ) 以b 消除的方式降解底 耱。麓着霹这类酶耢究翡深入，越来越缀敷翡分类方浚被提出( k a s h y a pe t a l 2 0 0 1 ：w h i t a k e re ta l l 9 9 0 # w a r de ta l , 1 9 8 9 ；r e x o v a - b e n k o v a le t 越19 7 6 ) 。详见表：a ne x t e n s i v ec l a s s i f i c a t i o no fp e c t i n o l y t i ce n z y m e s 。 。 4 南索郫稼大学硕士毕业论文趣霉栗腔辩在大肠杆菌中的麓缀表达研究 果胶是一种复杂的多糖，与果胶降解有关的整个酶系统包含3 0 多种酶，如 暴蔽主链簧链降瓣瓣簿拉稳蒙蕤酶，弼羧讴蕤瞢夔，肇嚣聚糖酶，半季t 耱营 酶，甲基酯酶，乙基酯酶，果胶_ 主链降解酶果胶酸醑裂解酶( p e c t i nl y a s e ， p m u p g l ) ，果胶酸裂解酶( p e c t a t el y a s e ，p l ) ，果胶陂水解酶 p o l y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) ，还磷遴一多分淹努切酶，魂锈薅帮寡糖酶。 1 2 1 果胶酸酯裂解酶 粜胶酸酯裂嬲酶( p e c t i nl y a s e ) 是果胶蹲解过程中墓要的酶，它能够断裂 离菠擎基纯荣获内部静藉营毽，苓嚣要粟获薅酶静预先佟建。在没有本分子参与 的情况下，通过0 一消旋( b e l i m i n a t i o n ) 的方式作用于半乳糖醛酸第5 位的p 一 碳原予，使1 3 碳暇子上的h 转移到了糖营键的氧原子上，糖瞢键断裂，在半乳 糖醛酸的e 4 翻c 一5 之阕形袋了一个双键，产生半襞舔醛酸寡聚耱，箕产裼一 端有双键为非还原端，另一端为还原端( 如图1 2 ) 。根据其作用的镳位的不同 可以分为；e n d o p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t el y a s e s ( e n d o p m l ，e c 4 。2 ，2 1 0 ) 耧e x o p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t el y a s e s ( e x o p m l ) ： 催化的反应简示如下： p m l p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t e _ u n s a t u r a t e dm e t h y l g a l a c t u r o n a t e s 粜胶酸酯裂解酶( p e c t i nl y a s e ) 主要来自真菌，主骚是高等真菌子囊菌和 半知麓被报道产生p e c t i nl y a s e 。产生p e c t i nl y a s e 鹤细麓从专性嚣缎越和专性 厌氧麓都有分布，部分产生p e c t i nl y a s e 的缀菌( x a n t h o m o n a sp s e u d o m o n a s ， c o r y n e b a c t e d u ma n da c i n e t o b a c t e r ) 和真筒是植物病原菌( a s p e r g f l l u sn i g e r ) 。 真菌a s p e r g i l l u sn i g e r 和a s p e r g i l l u so r y a z e 串的p e c t i nt y a s e 被广泛躺磺究。 真菌瀚p e c t i nl y a s e 可以分为内切和外切二种，这些酶都蹙细胞井酶，通过离子 交换和分子筛色谱进行分离纯化，很多来自a s p e r g i l l u s 的p e c t i nl y a s e s 已经被 广泛磺究。来自a s p e d i l l u s j a p o n i c u s ，a s p e r j i l l u ss o j a e ，帮a s p e r j i l l u so r y z a e 的p e c t i nl y a s e 分予量楣近，农酸性条停下较稳定，最佼p h 接近中能，这些酶 大部分为内切酶，对钙离子没有矮求，果胶外切酶只是谯t e r a c h a e t u m e l e g a n s 和v e r t i c i l l i u ma t b o - a t r u m 孛露缀道，唯一蠢热稳定性懿p e c t i nl y a s e 是来自 和c 打。所e c i u mr o s e u m 。 6 南索繇花大学硬圭毕娩论文燕霉果蔽辩在大骆轩釜孛翁麓缝表达研究 协+ 母 图 2p u p 酗l 佟糟模式匿 f i g u r e1 2m o d eo fa c t i o no fp u p m l r = h f o r p l a n dc h 3 f o r p 酝l 1 2 2 梁胶酸裂解酶 果胶酸裂解酶( p e c t a t el y a s e ) 催化脱酯果胶酸的裂解，催化反应需要c a 2 + 辕秘。在没寿痰分予参与的薅熬下，遥过一游旋( 1 3 - e l i m i n a t i o n ) 静方式终矮予 半乳糖醛酸第5 位的p 碳原予，使p - 碳原予上的h 转移到了耱昔键的氧原子上，糖 苷键断裂，在半乳糖醛酸的c q 和c 一5 之间形成了一个双键( 如图1 2 ) 。根据其 终爰懿键蕴静不爨胃以分秀；e n d o p o l y g a i a c t u r o n a t el y a s e s ( e d o p g l ， e c 4 2 2 2 ) 和e x o p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e s ( e x o p g l ，e c ，4 2 2 9 ) 。 催化的反应简示麴f ： p l p o l y g a l a c t u r o n a t e _ 众4 ：5u n s a t u r a t e dg a l a c t u r o n a t e s 果胶酸裂解酶已经从与食品腐败、果实软化、植物瘸辔有关的细菌 和真菌中 分裹褥裂，瑟在擦携孛发理豹壤遂较少，茭逡韬酶要魄终凌酶更热鬻凳。嚣兹 已缀在c o l l e t o t f i c h u ml i n d e m u t h i o n u m ( w i j e s u n d e r ar l ce ta l1 9 8 4 ) 、 b a c t e r o i d e s t h e t a i o t a o m i c r o ( m c c a r t h y r e e t a l1 9 8 5 ) 、e r w i n i a c a r o t o v o r a ( k o t o u j a n s k ya ，e ta l g 卯) 、a m u c a l as p 。( b r u h l m a n nfe ta l1 9 9 5 ) ， p s e u d o m o n a s s y f i n g a ep v g l y c i n e a ( m a r g o pe ta l1 9 9 4 ) 、 c o l l e t o t r i c h u m m a g n a ( w a f f a dc e t a l19 9 5 ) 、ec h r y s a n t h e m i ( f a v e yse t 鼓1 9 9 2 ；s h e v c h i k v e e t a l 9 9 7 ) 秘b a c i l l u s s p 。( k o b o y a s h i t e t a l 9 9 9 ： s i n g hs ae ta l1 9 9 9 ；t a k a om e ta 2 0 0 0 ；2 0 0 1 ) 等中报道发现。微生物来源 的果胶酸裂解酶我微生物系统中的克隆表达，目前在a s p e r g i l t u s j a p o n i c u s ( 1 s h i i se a 1 1 9 7 5 ) 、p e n i c i l l i u mp a x i l l i ( s z a j e rl 拼a 1 9 8 5 ， 9 8 2 ) 、p y t h i u m s p l e n d e n s ( c h e n 、，讥c e f a l1 9 9 8 ) 、p i c h 糟p i n u s ( m o h a r i b s a e t a l2 0 0 0 ) 、 7 南索筛范大学硕士攀她论文曲霉果胶跨在大肠秆菌串的耋组表达研究 a s p e r g i l l u ss d ( s u n n o t e lo e ta 1 2 0 0 2 ) 、t h e r m o a s c u sa u r a t n i a c u s ( m a r t i n s e se t a