（无机化学专业论文）酸性紫色磷酸酶模拟物的合成和表征.pdf

壁茎查竺塑主兰些堡塞一 中文摘要 本文研究了酸性紫色磷酸酶模拟物的合成利表征。在合成了配体 n s i ( = h y d r o x e t h y i s a l i c y d e n e i m i n e ) _ 币oh p t b ( h p t b = b i s ( b e n z i m i d a z o l 一2 一y l m e t h y l ) ( 2 h y d r o x e h t y ) a m i n e ) ，用其合成了数种酸性紫色磷酸酶的模拟物，并对模拟物进行 了元素分析，红外紫外光谱，i c p 光谱的测定。利用x 射线衍射分析技术测定了摸 拟物的晶体结构，并对模拟物测定了变温磁化率。另外还合成和表征了一个四核铜 配合物一个铬酸根桥联的三核铜配合物以及三个单核的配合物，对它们进行了集 体结构分析，变温磁化率的测定以及各利9 匕谱表缸。 关键词：配体n s i配体h p t b 酸性紫色磷酸酶模拟物 四核铜铬酸根桥联 晶体结构磁性 南开大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，w eh a v es t u d i e dt h es y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r so f t h e m o d e lo ft h ep u r p l ea c i dp h o s p h a t a s e s a f t e rt h el i g a n d sn s ia n dh p t b h a v eb e e ns y n t h e s i z e ds e v e r a lm o d e lo ft h ep u r p l ea c i d p h o s p h a t a s e sh a v e b e e n s y n t h e s i z e d a n dh a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d b y e l e m e n t a l a n a l y s i s ， i r ，u vs p e c t r a ，i c p s p e c t r a a n d s i n g l e c r y s t a l s t r u c t u r e so fs o m e 。o m p l e x e s h a v eb e e nd e t e r m i n e d b yx - r a yd i f f r a c t i o n t h e m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t yo fc o m p l e x e sh a v eb e e nm e a s u r e di nt h er a n g e4 2 3 0 0 k i n a d d i t i o n ，f i v eo t h e r c o m p l e x e sh a v e b e e n s y n t h e s i z e da n dh a v eb e e n c h a r a c t e r i z e d b ye l e m e n t a l a n a l y s i s ，i n f r a ，u v v i s i b l es d e c t r a e t c t h ee s rs p e c t r ah a v eb e e nm e a s u r e d f o rs o m e c o m p l e x e sa n d t h e i re l e c t r o n i cs t r u c t u r e sh a v e k e y w o r d ：n s ih p t b b e e nq u a l i t a t i v e l yi n v e s t i g a t e d m o d e lo ft h e p u r p l ea c i dp h o s p h a t a s e s c r y s t a ls t r u c t u r e u c r 0 3 2 一 m a g n e t i s m y y a t l x 1b1 y t b p ec d s e u n s 1 im c r i e t t e e n d g am e e e r b ua e r v e h e se e r 1 u b t a c 1 u r r a t v d s e e r h u 1 t s a a t e s n m y o r 1 n c t e c e e a b l r g f e n f v 1 1 a s d h 南开大学硕= l ：学位论文 测试方法和仪器 1 ，元素分析 p e r k i n - e l e m e r 2 4 0 型元素分析仪 2 红外光谱 s h i m a d z ui r 一4 0 8 型红外光谱仪，波长4 0 0 0 c m 。1 6 5 0c m 一，k b r 压片 3 变温磁化率 q u a n t u md e s i g nm p n s 7s q u i d 型磁强计 4 晶体体构测定 b r u k e rs m a r t10 0 0c c d 面探衍射仪 5 i c p 等离子体发射光谱仪i c p 9 0 0 0 ( n + m ) ，美国t j a 公司 6 h n m 9 0 m ：h zi b ma c 3 0 0 h m ：z 7 原子吸收 w f x l c 型原子吸收分光光度计 8 电导 d d s - 1 1 a 型电导仪，电极常数0 9 2 9 紫外可见电子光谱 s h i m a d z uu v - 2 10 1p c 型紫外可见分光光度计 南开大学硕士论文 第一章绪论 第一章绪论 第一节引言 生物无机化学是近年来发展迅速的一门边缘科学。所谓生物无机化学就是用无 机化学，尤其是配位化学的理论和方法，去研究和阐明参与生物体( 尤其是人体) 中化学反应的痕量元素( 特别是痕量金属元素) 所起的作用，以及它们同生物功能 之间的相互关系的- - f 学科。但是由于生物体中具有生物功能的化合物，如金属蛋 白和金属酶，往往都是一些结构十分复杂的化合物，目前要人工合成这些化合物， 还存在不少的困难，研究起来有时也是很复杂的。因而，在很多的研究中采用化学 模拟的方法，即通过思维、综合、判断和推理，以人工的方法合成一种经过有意识 加以简化的模拟化合物，然后对它进行预定目的的研究。根据研究结果。再设计合 成更符合实际情况的模拟化合物，以期合成的模拟化合物逐渐接近并最终符合生 物体中的真实情况。 酸性紫色磷酸酶模拟物的合成是一个很好的例子。 酸性紫色磷酸酶是由一组具有特殊生物活性、特殊颜色和自旋耦合双核铁中心 组成的。这种中心存在两种稳定互变的状态，第一种是粉红色，具有e p r 光谱和 生物活性，还原型，反铁磁相互作用的双核铁中心f e ( i i i ) 一f e ( i i ) ；第二种是f e ( i i i ) 一f e ( i i i ) 中心，紫色，氧化型，没有e p r 光谱和生物活性。在u t e r o f e r r i n 中，酸性 紫色磷酸酶的瞬间过渡态已经被确认，u t e r o f e r r i n 中粉红色母体由于磷酸脂的作用， 使产生的中间过渡态里紫色，没有e p r 活性，从莫尔斯光谱可以证明他是顺磁性 相互作用。虽然，近年来对u t e r o f e r r i n 和酸性紫色磷酸酶的研究取得了重大进展， 但是还是有许多问题没有明白。例如：每个铁原子的配位环境以及在生物体中氧化 还原的过程还没有清楚。也许，最有意思的是生物活性的过程和氧化还原与酸性紫 色磷酸酶生物活性之间的关系以及他说扮演的生物学角色还没有被确定。 第二节酸性紫色磷酸酶研究的历史和展望 南开大学硕士论文 第一章绪论 酸性紫色磷酸酶普遍存在于生物体中，可以从它们水解磷酸脂活性的最佳p h 条件( 通常为4 9 6 o ) 加以区别。第一种与金属有关的这类酶的报道见于1 9 7 3 年，当时铁中心的酸性紫色磷酸酶从猪子宫的分泌物1 2 】和牛脾脏中【3 1 分离出来。因 为其非常深的紫颜色，所以被称为酸性紫色磷酸酶，又因为它含有铁和它的来源以 及推测其在母猪怀孕期间向胎儿传输铁的过程扮演重要角色，所以，它又获得了一 个好听的名字u t e r o f b r r i n 。 这些水解酶中铁的存在曾经被认为很特别，因为除了极少数例外【4 】，- 含铁酶的 功能基本上存在于有电子转移的反应中，更奇特的是，证实每个酸性紫色磷酸酶的 双核部位有两个铁原子口”。现在认识到在酸性紫色磷酸酶中铁的氧化还原活性在管 理酶活性方面扮演着中心角色。同时，双核结构拥有其独特的光谱性质。通过这些 回顾，我们在了解酸性紫色磷酸酶化学性质，光谱特征以及酶活性的同时，仍要强 调很多疑问和一些自相矛盾的地方依然没有被弄清楚。 除了酸性紫色磷酸酶的原型：u t e r o f e r r i n 和牛脾脏分泌物种的酸性紫色磷酸酶 ( b s p a p ) 以外，其他种类的酸性紫色磷酸酶也从老鼠的脾脏和骨骼，g a u c h e r 病 人的皮肤和白血病人的网状皮层，以及马子宫分泌物，猪的软骨，巨型细胞肿瘤， 人类的胎盘和微生物中分离出来过。从红菜豆中分离出来的植物的酸性紫色磷酸酶 其双核部位含有f e ( m ) 一z n ( i i ) 中心【5 1 ，从甜土豆块茎中分离出来的酸性紫色磷酸酶 含有f e f e 中心或m n ( t i i ) d p 心【6 刀。虽然同哺乳动物的酸性紫色磷酸酶相比缺少进 一步证实而有更多明显的不同之处，但是因为其颜色和含有铁的事实仍把它们归为 酸性紫色磷酸酶一类。 第三节酸性紫色磷酸酶的分子性质 一酸性紫色磷酸酶的分子量和碳水化合物含量 u t e r o f e r d n 也许是被研究最透彻的酸性紫色磷酸酶，因为它的含量相对丰富。 从碳水化合物的含量和氨基酸次序计算，u t e r o f e r r i n 的分子量大约为3 6 0 0 0 ，这与 通过s d s p a g e 和成丁平衡估计的基本吻合嘲。因为有明显的凝胶电泳细菌分解糖 类现象，这种蛋白质包含有单条低聚糖侧链的多肽链。这条碳水链包括5 - 6 个甘露 糖和2 个n 一乙酰基一氨基葡萄糖残基。通过最近的h 1n m r 表明，从尿液中分离出 南开大学硕士论文 第一章绪论 来的u t e r o f e r r i n e 中的一小部分低聚糖是磷酸化。子宫分泌的u t e r o f e r r i n 中也含有 磷酸，推测是以甘露糖6 磷酸脂的形式存在的。在u t e r o f e r r i n 中只有6 甘露糖甘 油才有能力进行酶的磷酸化，所以表明一个c 11 ，2 - 连接的甘露糖残基是必需的。这 种碳水链中含有的磷酸脂与紧密键合的无机磷酸脂之间的关系远没有清楚。最近， 一种高分子量( m ，z8 0 0 0 0 ) 的粉红色u t e r o f e r r i n 从猪的子宫分泌物中分离出来f 9 】， 这种形式看上去是通常形式的u t e r o f e r r i n ( m ，z3 6 0 0 0 ) 与抗原无关的多肽链( m ，= 5 0 0 0 0 ) 异向二聚非共价键合而成的。除了因为无机磷酸盐的存在而成粉红色外， 它的光学，光谱和生物活性很类似于低分子量的那类u t e r o f e r r i n 。 二酸性紫色磷酸酶的基本结构 对u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的酸性紫色磷酸酶氨基酸次序的分析，发现这两种蛋 白质超过9 0 具有同系现象【10 。这个显著的发现，连同这两种蛋白质强大的化学 免疫活性，可推断他们可能是有同一种基因所产生的。虽然如此，这些蛋白质的生 物分子还有没有得到必要的探测。 与u t e r o f e r r i n 在s d s p a g e 中分子水平产生一个可预期的运动的单键不同， 牛脾脏中的酸性紫色磷酸酶产生两个键，甚至可以从蛋白质水解的持续过程中分离 出来。然而，虽然子宫和脾脏中分泌的酸性紫色磷酸酶存在着广泛的氨基酸次序同 系现象，事实上，分离脾脏中的酸性紫色磷酸酶是通过延长酸对脾脏均匀混合物的 作用，这使脾脏中的酸性紫色磷酸酶也可能是单链蛋白质。 对脾脏中的酸性紫色磷酸酶早期分析表明有己糖和氨基己糖存在。进一步研究 表明，一种从人类毛状白血球细胞中得到的酶与酸性紫色磷酸梅完全相同，它与 c o n a 琼脂糖凝胶键合，并且能被甲基甘露糖苷稀释。因此，十分相似，脾脏中的 酶与u t e r o f e r r i n 一样，也是一种离甘露糖含量的糖蛋白。但是其碳水结构已经被确 认。在每类蛋白中，低聚糖链看上去是粘附在天冬酰胺酸残基上的( 对u t e r o f e r r i n 来说是在第9 7 位) ，因为这些残基明显的只有通过n g l y c a n s e 处理来转移n - 天冬 酰胺酸链接的低聚糖。 人类的酸性紫色磷酸酶( 根据电泳迁移率被命名为t y p e 一5 型) 能从g a u c h e r s 病人的脾脏中和毛状白血病细胞中分离出来。这些脾脏中人类酸性紫色磷酸酶的类 似物具有相似的分子大小，铁中心和酶活性。另一种在分子量，铁中心和c o n a 南开大学硕士论文 第一章绪论 琼脂糖凝胶键合与u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的酸性紫色磷酸酶类似的酶从老鼠的脾 脏中分离出来，然而，这种酶的等电热中心与u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的酸性紫色磷 酸酶有所不同，可能是因为他们之间的碳水结构不同造成的。这种蛋白质与从老鼠 骨骼中得到的酸性紫色磷酸酶看上去完全相同，也和最近从牛骨骼中提取出来的， 还未很好表征的酸性紫色磷酸酶有一些相似之处。现在有证据表明，人类的酸性紫 色磷酸酶由一组不同开端的蛋白质组成，但它们却具有相似的酶性质。 最初植物的酸性紫色磷酸酶，相对面言，具有更多的不同之处【1 1 】。甜土豆中的 酸性紫色磷酸酶，最初被认为是m n ( i i i ) 来产生活性的【1 2 】。最近研究表明，它是有 两个明显相同的5 3k d a 亚单元组成，整个酶包含两个铁原子中心。然而，含有金 属的不同正好体现出不同种类甜土豆的酸性紫色磷酸酶在分离过程中的不同作用。 m n ( i i i ) 蛋白可以从日本的“k i n t o k i ”中分离，而双核铁蛋白可以从美国本士的土 豆块茎中得到。在另一方面，至少其中一种金属原子可能与酪氨酰残基结合，这样 才能使其具有深紫颜色和与蛋白质拉曼光谱共振。现在依然没有直接证据表明双核 铁蛋白中的两个铁原子有磁相互作用，但是甜土豆和动物中的酸性紫色磷酸酶在光 谱的相似，是发生磁相互作用有了合理的推测。 另一种从菜豆中获得磷酸酶也是大约1 3 0 k d a 的二聚物，更与甜土豆中的酸性 紫色磷酸酶在氨基酸组成和可见光谱吸收上十分相似1 3 】。奇怪的是，它是f e ( i i i ) 一z n ( t i ) 中心的酶，在一些方面与重组的f e ( i i i ) 一z n ( i i ) 中心u t e r o f e r r i n 衍生物 相似。 第四节酸性紫色磷酸酶的物理化学性质 一铁中心 直到现在，关于u t e r o f e r r i n 铁结合的量仍然存在争议，有断言称每个分子中有 一个铁原子，也有断言称每个分子中有两个铁原子【1 4 】。自从模拟物和分析程序在蛋 白质研究中的运用，矛盾说法的来源已经不再出现。当分子量和被用于估计蛋白质 浓度的消光系数的差异存在时，这些对铁含量的差别来说是无足轻重的。最近对每 个分子具有一个端基磷酸酯和具有一个磷酸酯键的蛋白质样本铁元素分析的比较 4 南开大学硕士论文 第一章绪论 研究表明，早期的分析混淆了紧密键合磷酸酯的存在，这妨碍了通过酸稀释比色法 测定铁含量的结果。现在清楚，u t e r o f e r r i n 是一个具有双核铁的蛋白质，可能每个 分子中有一个紧密键合的磷酸酯。这种铁原子与磷酸酯的紧密键合在牛脾脏的酶中 也得到证实，因为其高分子量的t c a 沉淀断片( m r 2 4 0 0 0 ) 中仍有一个铁原 子和磷酸酯基团【1 5 j 。 类似u t e r o f e r r i n 的模拟物也有报道含有少于两个铁原子键的【i “，然而，现在对 未定的异金属f e z n ，f e c u 和f e h g 的u t e r o f e r r i n 成份研究表明，同从自然界中 发现的f e z n 酸性紫色磷酸酶一样，对在低铁含量的模拟物中，z n 或者别的金属 原子能够代替一部分蛋白质中的铁，这稳定了每个分子中还有少于两个铁原子的蛋 白【1 7 】。 二光谱性质 1 吸收光谱 当把u t e r o f e r r i n 和其他双核铁的酶当作类似铁氰化物和过氧化氢的氧化剂，除 去正磷酸酯和其他强相互作用的阴离子时，它的紫色成分在5 5 0 2 7 0n m 之间有个 宽的强吸收带，在近紫外的3 1 5 3 2 0n l t l 处有显著的吸收峰 1 8 , 1 9 1 。通过诸如2 巯基 乙醇，铁离子和抗坏血酸盐等还原剂产生的粉红色成分在5 0 5 5 10n n l 处有最强烈 的吸收，而在近紫外变成了在3 1 0n l t l 处有个不太明显的吸收峰m l ，正如所预料的 那样，氧化还原状态都在2 8 0n l t l 处有个很尖锐的蛋白质主导的吸收峰。对 u t e r o f e r r i n 来说，这个尖峰位于或多或少的难于确定的宽峰之间。更进一步， u t e r o f e r r i n 在2 8 0i l l n 处吸收峰的强度对阴离子成分很敏感，最显著的就是正磷酸 酯键。蛋白质的最初可见吸收带在保持结合强度( 震荡水平) 伴随着氧化还原初始 颜色的转变更加明显。这一发现为证实u t e r o f e r r i n 中只有一个铁原子是发色基团提 供了第一手线索。对异金属的( f e z n ，f e c u 和f e h g ) 蛋白质形式的研究表明， 每个分子只有少量的可见吸收损失这也证实了以上的推测。最近对一种自然界 中红菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 酸性紫色磷酸酶的研究发现其和双核铁的u t e r o f e r r i n 具有一样的吸收特征，这更加证实了以上推论。使u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的酸性紫 色磷酸酶与连二亚硫酸盐暴露在合适的螯合物中会发现蛋白质中的一个铁原子会 有选择性的被取代，形成异金属的酶的其他形式。相反，延长暴露在相同的还原剂 南开太学硕士论文 第一章绪论 中会产生无色，不具有活性的不含铁蛋白质。这证明铁原子不仅是酸性紫色磷酸酶 活性必需的，也是对氧化还原敏感的发色基团。 2 e p r 和磁化率 e p r 和磁化率只有两种酸性紫色磷酸酶u t e r o f e r r i n ( 包括高低分子量两种形式) 和牛脾脏的酶两种形式有所报道 1 6 1 9 1 。完全氧化的形式( 。5 5 0n m ) 是没有 e p r 活性和反铁磁性的。然而，可逆的单电子还原引出一个强烈的正交e p r 信 号，对u t e r o f e r r i n 来说g = 1 9 3 ，1 7 5 和1 5 9 ，脾脏中的酶也具有类似的信号。现 在清楚这个g = 1 7 4 的e p r 信号很像g = 1 。9 4 的双核铁铁氧化还原蛋白的特殊特征 1 1 9 , 2 1 1 。g = 1 7 4 的信号只有在低于3 5k 才能观测到，因为每个铁原子有一个成单电 子，结果证明这些蛋白质中的铁原子是s = l 2 自旋祸合的反铁磁中心l 悖】。这种学 说由u t e r o f e r r i n 和脾脏中酶的磁化率测定说支持。相似的反铁磁自旋耦合中心也存 在于其他铁键合的蛋白质中，特别是蚯蚓血红蛋白，核( 糖核) 苷酸还原酶，以及双 核铁的铁氧化还原蛋白中。特别的是半高铁血红蛋白产生的e p r 非常类似 u t e r o f e r r i n 的，表明在这些反铁磁中心的蛋白质中有潜在的类似结构。 从随温度变化的e p r 光谱强度( 9 1 8 k ) 可以估计自旋藕合铁原子中心的管方 性相互交换的j 值i 州。u t e r o f e r r i n 的j = 1 4 - 4 - l c m 。，脾脏酶的j = 1 2 l c m “( 交换 哈密顿h 。= + j s r s ：) 2 2 1 。最近对混合原子价的自旋耦合f e ( 1 1 1 ) 一f e o i ) 模拟物的研 究研究表明如此低的j 值同铁原予通过o h 一和苯氧基桥联相一致 2 3 】。 实际上各种含铁的磷酸酶e p r 光谱存在的差异，更特别的是，牛脾脏中的酶 是有两个重叠正交的信号组成，一个g = 1 9 4 ，1 7 8 和1 6 5 ，另一个g = 1 8 5 ，1 7 3 和1 5 8 。更进一步研究发现，光谱上各种信号的比例对p h 值和缓冲液十分敏感， 定量研究性好作为p h 的函数研究表明，从低p h 值到高p h 值的过渡是依靠蛋白 质某个基团的离子化状态。u t e r o f e r r i n 也显现出e p r 光谱的差异，它的信号能被通 过l ：1 ( v v ) 的水和甲醇的混合缓冲液凝固蛋白质实际减弱。综合考虑对这两种 蛋白质的这些发现，表明差异问题十分有趣，也还没有被完全了解，因此需要更深 入的研究。 拥有完全生物活性的u t e r o f e r d n 和脾脏中异金属f e z n 形式的酶也已被研究 过。对脾脏中f e z n 形式的酶磁化率和e p r 测定表明，其中的单个铁是高自旋的 三价铁，它的g a v e = 4 3 【2 ，完全由蛋白质中的铁产生，它还表现出对磷酸酯键敏感 南开大学硕士论文第一章绪论 的不寻常的自旋弛豫。 第五节酸性紫色磷酸酶的生物酶性质 动物界和植物界均发现有磷酸酯活性的蛋白质。酸碱磷酸酯酶是通过酶发挥 活性的最佳p h 范围来确定的，p h 在4 9 6 0 的是酸性磷酸酶口”，p h 。8 的是碱 性磷酸酶【2 “，酸性磷酸酶通过它们对酒石酸盐的敏感度可进一步分为两个子群。对 酒石酸盐敏感的酶存在于动物体除血红细胞以外的所有体细胞中，它比对酒石酸盐 有抗性的蛋白质( 分子量小于6 5 0 0 0 ) 具有更大的分子量( 大于8 5 0 0 0 ) ，而且它是 严格的单酯正磷酸的水解酶。在对酒石酸盐有抗性的酶中，酸性紫色磷酸酶以其自 旋耦舍，氧化还原活性，酶活性必要的双核铁中心而显著。虽然酶和底物的相互作 用机理和生理上底物的确定还不清楚，但是底物的特征和酸性紫色磷酸酶的的抑制 荆已经被很好的了解。 一酸性紫色磷酸酶底物的特征 第一个表明这类酶优于通常的磷酸酯酶的证据是通过研究牛脾脏中的酸性紫 色磷酸酶获得的】，发现这种磷蛋自质能够转移酪蛋白中的磷，就像焦磷酸酶一样 2 7 。虽然它对、b 一甘油磷酸和脂肪磷酸酯的活性很微弱，但对芳香磷酸酯及其衍生 物具有很高的活性，在这些层次上的研究没有发现蛋白质结合的金属。 随着u t e r o f e r r i n 和其他酸性紫色磷酸酶的发现，得出所有的这些酶都具有一 个双核金属中心，而且至少含有一个铁原子。这些蛋白质底物的特征与早期的描述 和确定接近一致2 ”，例如：三磷酸核苷酸和二磷酸核苷酸。维生素b 。焦磷酸酯， 或者无机焦磷酸酯水解成正磷酸酯底物。特别的是所有这些酶都表现出对通常用于 分析酶的p 一磷酸硝基苯基酯的相当可观的活性。u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的磷酸酶 也表现出水解含有磷酸丝氨酸残基的蛋白质中的磷酸酯能力，但对磷酸酪氨酸酶的 活性却没有预料到。酸性紫色磷酸酶对含有氨基磷的化合物和脂肪族底物只有很小 的活性【1 9 l 。 二酸性紫色磷酸酶的活化剂和抑制剂 7 南开大学硕士论文 第一章绪论 早期对牛脾脏中的酸性紫色磷酸酶的描述中提到2 一巯基乙醇既有活化酶活性 的能力，又能使酶的最大吸收从5 5 0n m 降到更低的波长1 2 ”。其他还原剂，例如： 抗坏血酸盐、谷胱甘肽、双硫代苏糖醇和巯基醋酸盐，后来也被证实能强化酶的活 性。通常来说，酸性紫色磷酸酶的还原集和活化剂能使其颜色从紫色变成粉红，以 此同时，酶的活性也好几倍的增强。在实验中，蛋白质具有e p r 活性的还原形式 通常是通过铁离子，2 一巯基乙醇或抗坏血酸盐的作用获得的，缺乏铁离子的还原对 蛋白质造成很大的变性。通过光谱研究表明：u t e r o f e r r i n 和牛脾脏的酶中的 f e ( i i i ) 一f e ( i i i ) 6 0 t l , 在还原剂的作用下的得到一个电子，变成f e ( i i i ) 一f e ( 1 1 ) 中心。目 前还不清楚还原作用，颜色变化和活性之间的关系如何。 虽然对大多数酸性紫色磷酸酶来说，还原剂和活化剂是同一类的，当时也有少 数例外，例如：u t e r o f e r r i n 和牛脾脏中的f e z n 形式的磷酸酶无需还原剂就能表现 出酶活性阱l ，f e c u ，f e h g 形式的u t e r o f e r r i n 也不需要还原剂活化，相反，f e c u 形式的酶活性还受还原剂的抑制。最近对粉红色高分子量的u t e r o f e r r i n 形式的研究 表明其有与2 巯基乙醇处理过的u t e r o f e r r i n 一样的活性。最后，甜土豆中以两个分 开的单铁中心a 2 聚合的酸性磷酸酶也无需添加还原荆来提高活性。 许多试剂都能抑制酸性磷酸酶的活性，包括：氧化剂，例如，过氧化氢和铁氰 化物；四面体氧离子，例如，磷酸盐、钼酸盐、钒酸盐、硫酸盐和砷酸盐：巯基还 原剂，例如重金属离子和p 氯汞苯甲酸：还有氯化物离子、亚砷酸盐、亚硝酸盐。 正如所预料的，异金属形式的u t e r o f e r r i n 只是轻微的受磷酸盐和过氧化氢的影响。 连二亚硫酸钠是个强抑制剂，它能从蛋白质的活性位置转移金属离子，因而也能使 蛋白质褪色。经过连二亚硫酸钠处理过的，没有金属离子或者只有单个金属离子的 u t e r o f e r r i n 形式对p 硝基苯磷酸酯只表现出很小的活性。令人惊奇的是，通常有很 强的金属离子配位能力的叠氮化物和氰化物无论对牛脾脏中的磷酸酶还是 u t e r o f e r r i n 都没有丝毫的抑制作用。 第六节酸性紫色磷酸酶存在的问题和研究展望 南开大学硕士论文 第一章绪论 目前存在的问题主要是了解u t e r o f e r r i n 和酸性紫色磷酸酶中每个金属原子配位 环境的确定，以及金属原子配位环境在生物体中的氧化还原过程中是如何变化的， 此外，酸性紫色磷酸酶在生物体中的活性机理也是十分重要的问题。 最近对一种铁键合蛋白乳铁传递蛋白的三维晶体的测定，对这些类似结构 和铁传递蛋白的功能提出了一些新的观点。对其性质的认识和铁原子配位环境的确 认，使我们明白和确定了一些早先的推论和猜测。相信这对u t e r o f e r r i n 和酸性紫色 磷酸酶的研究能起到很大的促进作用，能使酸性紫色磷酸酶的研究取得类似的重大 成果。 综上所述，酸性紫色磷酸酶的研究已引起生物无机和生物学界的广泛注意。因 此，本课题对酸性紫色磷酸酶进行模拟研究，通过合成酸性紫色磷酸酶的模拟物， 并对其各种光谱和其他性质进行测定并研究，预测酸性紫色磷酸酶的晶体结构，确 定奇配位模式和活性中心。这对酸性紫色磷酸酶在生物无机化学，配位化学及仿生 学上的研究将有重要的理论意义和应有价值。 巫型堕型塑逝型塑 第二章配体n s i 及其配合物的合成 第一节配体n s i ( n 羟乙基水杨酰胺) 的合成 合成方法按文献略有修改【8 】= 将1 5 1m l 乙醇胺和3 2 1 5g 水杨醛加入1 0 0m l 苯( 无 水) 中在1 0 0 c 的油浴下搅拌回流3 小时。然后旋转蒸发，得到黄色粘稠物，在2 2 0 及o 3 毫米汞柱的压力下减压蒸馏。收集1 2 6 的馏份，产品为黄色粘稠液体。元素 分析结果：c g h , l n 0 2 ( 实验值) c ，6 5 4 0 ；h ，5 4 7 ；n ，8 2 9 ；( 理论值) c ，6 5 4 5 ；h ，5 4 5 ；n ， 8 ，4 8 。 + h 2 n c h 2 c h 2 0 h 斗 n 弋o h 第二节镍铁五核心i f e 4 ) 配合物的合成和结构 一配合物 f e 4 n i ( n s i ) 4 0 2 p ( o p h ) 2 4 ( p - - o h ) 2 c h 3 0 h ( 1 ) 的合成 将0 0 8 3 2gn s i 配体( 0 5r e t 0 0 1 ) 溶于1 5m l 甲醇，搅拌下滴加0 1 4m l 三乙胺， 然后加入0 1 7 8 7g 高氯酸镍( 0 5m m 0 1 ) ，o 1 7 3 6g 高氯酸铁( o 5m m 0 1 ) 和0 1 2 5 1g 二苯基磷酸酯( o 5m m 0 1 ) 。搅拌1 小时后过滤，母液静置数天后析出适合x 射线单晶 分析的紫黑色晶体。 二晶体结构 有关x 射线衍射分析的实验条件、数据收集、结构解析和修正方法以及晶体学数 据在表2 一l 中列出，部分键长和键角列于表2 - 2 。配合物1 的晶体结构和金属离子配位 环境图分别如图2 1 和2 - 2 所示。 0 南开大学硕士论文 第二章配体n s i 及扎配含物的合成 图2 - 1 ：配合物1 晶体结构图，为作图清晰删去磷酸酯上的苯基 图2 - 2 ：配合物1 中金属离子配位环境图 南开大学硕士论文第二章配体n s i 及其配台物的合成 配合物1 的晶体属于单斜晶系的p 2 ( 1 ) n 空间群。四个铁和一个镍均为六配位 位于变形八面体配位环境中，其中f e l ，f e 2 和f e 4 与n i 通过配体n s 功9 链上的羟基 氧桥联。o l ，0 2 位于n i 变形八面体的两个顶点，0 2 - n i l 0 1 键角为1 6 3 1 ( 6 ) 。，0 3 ， 0 5 ，0 9 和n 1 基本位于八面体的赤道平面上，0 5 和n 1 成对角。f e l 与n i 通过0 1 桥 联，f e l 0 1 - n i l 的键角 = g n i l - 0 3 - f e 4 $ 1 1 n i l 0 5 f e 2 稍大。在配合物1 中根据磷酸酯 配位方式的不同可分为两种：桥联配体( p l ，p 2 ，p 3 ) 及端基配体( p 4 ) 。0 9 是磷酸酯上 的氧，这个磷酸酯只是作为n i 的端基配体，另一端的0 1 0 并没有$ i 】f e 3 桥联。 f e l 和f e 3 ，f e l 和f e 4 以及f e 2 和f e 4 之间通过磷酸酯桥联，这是迄今为止 同一分子中存在多个磷酸酯桥联f e f e 的第一例。f e f e 之间最短距离为3 0 1 5 a 。除此之外，f e l 、f e 2 、f e 3 和f e l 、f e 4 、f e 3 都通过羟基氧桥联形成两个扁 平的三角锥，其中0 2 5 和0 2 6 分别位于两个三角锥的锥顶。同一分子中多个f e f e 磷酸酯桥联对于模拟双核铁酸性紫色磷酸酶开启了一个新的方向，同时存在 n i 的端基配位磷酸酯也给人新的启示。 t a b l e2 - 1 c r y s t a ld a t aa n ds t r u c t u r er e f m e m e n tf o r1 i d e n t i f i c a t i o nc o d e e m p i r i c a lf o r m u l a f o r m u l aw e i g h t t e m p e r a t u r e w a v e l e n g t h c r y s t a ls y s t e m s p a e eg r o u p u n i te e l ld i m e n s i o n s v o l u m e z ，c a l c u l a t e dd e n s i t y a b s o r p t i o nc o e f f i c i e n t f m 0 0 ) c r y s t a ls i z e t h e t ar a n g ef o rd a t ac o l l e c t i o n l i m i t i n gi n d i c e s r e f l e c t i o n sc o l l e c t e d u n i q u e c o m p l e t e n e s st ot h e t a = 2 5 0 3 1 2 0 2 0 9 2 l b c s s h s 2 f e 4 n 4 n i 0 2 7 p 4 1 9 8 3 5 5 2 9 3 ( 2 ) k 0 7 1 0 7 3a m o n o c l i n i c p 2 ( 1 ) n a = 1 7 6 3 6 ( 8 ) a b = 3 0 6 1 9 ( 1 3 ) a c = 1 8 4 3 6 ( 8 ) a b21 0 5 8 4 2 ( 8 ) 。 9 5 7 8 ( 7 1a 3 4 ，1 3 7 6m g m 3 o 9 2 4 姗。l 4 0 8 8 0 3 0 x0 2 5 0 2 0 m m 1 7 9 2 5 0 3 0 - 1 4 s h 2 0 ，一3 6 s k s 3 5 ，。2 11 l s1 9 3 8 0 1 9 1 6 7 5 5 r ( i n t ) = 0 ，1 5 1i 】 9 9 1 南开大学硕士论文 第二章配体n s i 及其配台物的合成 a b s o r p t i o nc o r r e c t i o n m a x a n dm i n t r a n s m i s s i o n r e f i n e m e n tm e t l l o d d a t a | r e s t r a i n t s | p a r a m e t e r s g o o d n e s s o f - f i to nf 2 f i n a lr i n d i c e s 【i 2 0 ( d 】 r i n d i c e s ( a l ld a t a ) l a r g e s td i f f p e a ka n d1 1 0 l e w e i g h i n gs c h e m e 【p ( f 0 2 + 2 f c 2 ) 3 p r i m a r ym e t h o ds o l u t i o n c o m p u t i n gd a t ac o l l e c t i o n c o m p u t i n gc e l lm f i n e m e m c o m p u t i n gd a t ar e d u c t i o n c o m p u t i n gs t r u c t u r es o l u t i o n c o m p u t i n gs t r u c t u r em f m e m e m s e m i e m p i r i c a lf r o me q m v a l e m s 0 8 3 6 8a n d0 7 6 9 0 f u l l m a t r i xl e a s t s q u a r e so nf 2 1 6 7 5 5 4 8 1 1 0 2 1 2 1 1 r 1 = 0 1 9 1 2 w r 2 = 0 3 2 8 5 r 1 = o 3 0 5 6 w r 2 = 0 3 8 5 3 1 2 2 3a n d 0 9 8 5e a 5 1 o 2 ( f 0 2 ) + ( 0 0 6 4 9 p ) 2 + 2 4 5 0 6 * p d i r e c t b r u k e rs m a r t b r u k e rs m a r t b r u k e rs a i n t s h e l x s 一9 7 ( s h e l d r i c k ，19 9 0 ) s h e l x l 9 7 ( s h e l d r i c k ，1 9 9 7 ) t a b l e2 - 2 s e l e c t e db o n d l e n g t h s ( a 】a n da n g l e s d e g f o r1 f e ( 1 ) 一0 ( 2 5 ) 1 9 6 7 ( 1 0 ) f e ( 1 ) 0 ( 1 7 ) 2 0 1 7 ( 1 0 ) f 1 ) o ( 1 ) 2 0 4 0 ( i o ) f e ( 1 ) - o ( 2 6 ) 2 0 4 3 ( 9 ) ， f e ( 1 ) 一o ( 2 1 ) 2 0 8 6 ( 11 1 f e ( 1 ) 0 ( 8 ) 2 1 4 2 ：( 9 ) f e ( 2 ) - 0 ( 2 5 ) 1 9 6 7 ( 9 ) f e ( 2 ) o ( 6 ) 2 0 1 4 ( 10 ) f e ( 2 ) 一o ( 5 ) 2 0 1 7 ( i 1 ) f e ( 2 ) - o ( 1 4 ) 2 0 4 2 ( 1 2 ) f e ( 2 ) 0 ( 2 6 ) 2 1 0 4 ( il ) f e ( 2 ) - n ( 3 ) 2 1 5 6 ( 1 4 ) f e ( 3 ) - n ( 4 ) f e ( 3 ) - o ( 2 6 ) f e ( 3 ) - o ( 8 ) f e ( 3 ) o ( 2 2 ) f e ( 3 ) - o ( 7 ) f e ( 3 ) o ( 6 ) f e ( 4 ) - o ( 2 5 ) f e ( 4 ) - o ( 4 ) f e ( 4 ) - 0 ( 3 ) f e ( 4 ) - o ( 1 3 ) f e ( 4 ) - n ( 2 ) 1 3 2 o l1 ( 1 3 ) 2 0 5 4 ( 9 ) 2 0 5 9 ( 9 ) 2 0 9 8 ( 1 2 ) 2 1 3 0 ( 11 ) 2 1 5 0 ( i o ) l 。9 4 6 ( 9 ) 1 9 6 0 ( 1 1 、 2 0 4 9 ( 1n 2 0 8 8 ( 1 4 ) 2 1 5 2 ( 1 4 ) 南开大学硕士论文 第二章配体n s i 及其配合物的合成 f e ( 4 ) o ( 1 8 ) n i ( 1 ) - o ( 2 ) n i ( 1 ) - o ( 5 ) n i ( 1 ) 一0 ( 3 ) n i 0 ) - 0 0 ) n i ( 1 ) - o ( 9 ) n i ( 1 ) 一n ( 1 ) o ( 2 5 ) 一f e ( 1 ) - 0 ( 1 7 ) 0 ( 2 5 ) 一f e ( 1 ) - o ( 1 ) o ( 1 7 ) 一f e ( 1 ) 0 ( 1 ) 0 ( 2 5 ) f c ( 1 ) - o ( 2 6 ) 0 ( 1 7 ) f e ( 1 ) 0 ( 2 6 ) o ( 1 ) f c ( 1 ) - 0 ( 2 6 ) o ( 2 5 ) - f e ( 1 ) 一0 ( 2 1 ) o ( 1 7 ) - f e ( 1 ) - o ( 2 1 ) o ( 1 ) - f e ( 1 ) - 0 ( 2 1 ) o ( 2 6 ) - f e ( 1 ) 一o ( 2 1 ) o ( 2 5 ) f c ( 1 ) - 0 ( 8 ) o ( 1 7 ) - f e ( d - o ( 8 ) o ( 1 ) - f o ( 1 ) o ( 8 ) o ( 2 6 ) 一f c ( 1 ) 一0 ( 8 ) o ( 2 1 ) - f e ( 1 ) - o ( 8 ) o ( 2 5 ) - f e ( 2 ) - o ( 6 ) 0 ( 2 5 ) 一f e ( 2 ) 0 ( 5 ) o ( 6 ) - f e ( 2 ) - o ( 5 ) o ( 2 5 ) - f e ( 2 ) - 0 ( 1 4 ) o ( 6 ) - f e c 2 ) - o ( 1 4 ) o ( 5 ) - f e ( 2 ) - o ( 1 4 ) o ( 2 5 ) f e ( 2 ) 0 ( 2 6 ) 0 ( 6 ) - f e ( 2 ) - 0 ( 2 6 ) o ( 5 ) - f e ( 2 ) 0 ( 2 6 、 o ( 1 4 ) - f e ( 2 ) 0 ( 2 6 ) o f 2 s ) - f e ( 2 ) - n o ) 0 ( 6 ) - f e ( 2 ) - n ( 3 ) o ( 5 ) f e ( 2 ) - n ( 3 ) o ( 1 钔一f e ( 2 ) - n ( 3 ) o ( 2 6 ) 一f e ( 2 ) - n ( 3 ) n ( 4 ) 一f e ( 3 ) 一0 ( 2 6 ) n ( 4 ) - f e ( 3 ) o ( 8 ) o ( 2 6 ) f e ( 3 ) - 0 ( 8 ) n ( 4 ) - f e ( 3 ) - o ( 2 2