（植物学专业论文）排硫硫杆菌亚硫酸盐受体氧化还原酶的纯化和性质.pdf

内蒙古师范大学硕士学位论文 中文摘要 从烟气生物脱硫系统的好氧产硫磁性稳态流化床反应器中取磁性多 孔珠固定化生物膜，采用排硫硫杆菌培养基在好氧条件下富集、反复分 离纯化获得分离菌，经过细菌、菌落形态的观察以及一系列生理生化指 标，对应伯杰氏细菌鉴定手册，初步鉴定该分离菌为硫杆菌属 ( t h i o b a c i l l u s ) 的排硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ) 。 将分离纯化得到的排硫硫杆菌细胞超声波破碎、脱盐浓缩、d e a e 5 2 离子交换层析、s e p h a d e xg 1 5 0 分子排阻层析分离纯化得到亚硫酸盐受 体氧化还原酶，并对其进行性质表征。光谱分析表明该酶除了在2 8 0 n m 外无其他特征吸收峰；s d s p a g e 结果显示该酶是一种0 【d 异二聚体，由 分子量3 3 9 k d a 和4 2 2 k d a 的两个亚基构成；活力分析发现有9 2 的酶 活存在于细胞膜部分，该酶属于膜蛋白。其最适p h 为7 5 ，最适温度为 4 0 。c ，在3 7 5 较宽的p h 范围内酶活力具有很好的稳定性，温度在3 0 c - - 5 0 之间酶活力能保持在7 0 以上。该酶对亚硫酸钠的v m a x 为2 2 1 5 肛m m i n ，k m 为8 6 0 9 i t m ；底物专一性强，该酶基本不受n a + 、k + 、m 9 2 + 、 f e 2 + 、f e ”、c a 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 和b a 2 + 等金属离子的影响，e d t a 和 氢氧化钠对该酶有明显的抑制作用。其氧化产物为硫酸盐。 对可能参与分离菌硫氧化代谢途径中的酶采用酶活分析方法进行了 测定，并参考相关文献，提出了分离菌硫氧化代谢途径的可能模型。 关键词：排硫硫杆菌，亚硫酸盐受体氧化还原酶，硫氧化代谢途径 内蒙古师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h eb i o f i l mi m m o b i l i z e do nt h em a g n e t i cp o r o u sb e a d so b t a i n e df r o m t h ea e r o b i cm a g n e t i c a l l ys t a b i l i z e db e d ( a m s f b ) w a se n r i c h e dc u l t u r e d u n d e rt h ea e r o b i cc o n d i t i o nb yu s i n gc u l t u r em e d i u mf o rt h i o b a c i l l u s t h i o p a r u s ， a n di s o l a t e da n dp u r i f i e dr e p e a t e d l yt og e tt h ei s o l a t e db a c t e r i a t h ei s o l a t e db a c t e r i aw a si d e n t i f i e da st h i o b a c i l l u st h i o p a r u so ft h i o b a c i l l u s a c c o r d i n gt o ( ( b e r g e y s m a n u a lo fs y s t e m a i cb a c t e r i o l o g y ) ) t h r o u g ht h e o b s e r v eo ft h eb a c t e r i aa n dt h em o r p h o l o g yo ft h eb a c t e r i ac l o n ea n das e r i e s o fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li n d e x t h ei s o l a t e da n dp u r i f i e dt h i o b a c i l l u st h i o p a f u sb a c t e r i aw e r eb r o k e nb y u s i n gu l t r a s o n i c ，a n dt h e nd e s a l t e dc o n d e n s e d s u i f i t ea c c e p t o ro x i d o r e d u c t a s e w a so b t a i n e d t h r o u g h i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n b yu s i n g d e a e 一5 2 i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e x g - 15 0m o l e c u l a r - e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h ya n dw a sc h a r a c t e r i z e df o ri t sp r o p e r t i e s t h es p e c t r aa n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h ee n z y m eh a dn oo t h e rc h a r a c t e r i s t i ca d s o r p t i o np e a ke x c e p t i n2 8 0 n m s d s - p a g es h o w e dt h a tt h ee n z y m ew a saq ph e t e r o d i m e r c o n s t i t u t e db yt w os u b u n i t sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t s3 3 9 k d aa n d4 2 2k d a a c t i v i t ya n a l y s i si n d i c a t e dt h a t9 2 o fe n z y m ee x i s t e di nt h ec e l lm e m b r a n e a n dt h ee n z y m ew a sam e m b r a n ep r o t e i n t h eo p t i m u mp ho ft h ee n z y m e w a s7 5 ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h ee n z y m ew a s4 0 。ca n dt h ee n z y m e 内蒙古师范大学硕士学位论文 a c t i v i t yh a dg o o ds t a b i l i t ya n dt h ee n z y m ea c t i v i t yc o u l dm a i n t a i nu pt o7 0 w i t h i nt h et e m p e r a t u r er a n g eo f3 c 一5 0 t h ev m a xa n dk mo ft h e e n z y m et os o d i u ms u l f i t e a ss u b s t r a t ew e r e2 2 15i - t m m i na n d8 6 0 9 肛m r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m eh a dh i g hs u b s t r a t es p e c i f i c i t ya n dc o u l dn o tb e i n f l u e n c e db ym e t a li o n s e d t aa n dn a o hh a do b v i o u si n h i b i t i o nt ot h e e n z y m ea n dt h eo x i d a t i v ep r o d u c tw a ss u l p h a t e a c c o r d i n gt ot h el a t e s ts t u d yo fs u l p h u ro x i d a t i v eb a c t e r i a ，t h e c y t o p l a s m e x t r a c t sa n dt h em e m b r a n ee x t r a c t so ft h ei s o l a t e db a c t e r i aw e r e f e t c h e da n dt h ea c t i v i t yo ft h ek e ye n z y m e si nt h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lm e t a b o l i s mw a sd e t e r m i n e dt oj u d g et h el o c a t i o no ft h ee n z y m e s t h ep o s s i b l es u l p h u rm e t a b o l i cp a t hi nt h i o b a c i l l u st h i o p a r u sw a sc o n f e r r e d t h r o u g ht h ea n a l y s i so f t h er e a c t i v ep a t h sc a t a l y z e db yd i f f e r e n te n z y m e sa n d t h er e f e r e n c et ot h er e l a t i v el i t e r a t u r e t h es u l p h u ro x i d a t i v es y s t e mm o d e lo f t h i o b a c i l l u st h i o p a r u sw a sp u tf o r w a r db a s e do nt h ea b o v ef a c t s k e yw o r d s - t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ，s u l f i t e ：a c c e p t o ro x i d o r e d u c t a s e ， s u l p h u ro x i d a t i v ep a t h w a y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师邱广亮教授指导 下进行的研究工作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含本人为获得内蒙古师范大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 签名： ：隘查羔 日期：1 醇年月珂日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解内蒙古师范大学有关保留、使用学 位论文的规定：内蒙古师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：黼兄 导师签名： 卸于勿 日期：芦g 年f 月订日 第一章前言 1 前言 1 1 硫氧化细菌的研究概况 1 1 1 硫氧化细菌在自然界硫生物循环中的地位 硫是一种重要的生物营养元素，硫元素以有机硫化物r s h 和无机硫化合物h 2 s 、 s 0 3 2 。和s 0 4 2 等存在。自然界中的硫循环是一个重要的地球化学循环，其中硫的生 物循环是最重要的环节，包括下面几个部分：( 1 ) 在厌氧环境条件下，硫酸盐经硫 酸盐还原菌作用，被还原为硫化物的过程，这个过程称为异化还原过程( 图1 1 中) ； ( 2 ) 硫化物在好氧硫杆菌的作用下被氧化为单质硫和硫酸盐的过程，这个过程称为 生物氧化过程( 见图1 1 中) ；( 3 ) 硫酸盐在细菌的作用下被转化为有机硫 的过程，这个过程被称为硫的同化还原过程( 见图1 - 1 中1 1 、1 2 ) 。 图1 1 自然界中的硫循环过程 f i g u r e1 - 1t h ec i r c l eo f s u l f u ri nn a t u r e 这些硫的生物循环过程与物化过程紧密结合，共同构成了硫的自然循环n 1 。硫的 自然循环主要是通过硫的生物循环来实现的心删。硫氧化细菌是自然界中硫元素循环 中不可缺少的一环，在生物循环体系中起着十分关键的作用。 1 1 2 硫氧化细菌的应用 硫氧化细菌主要为需氧无机化能营养型和厌氧光能营养型真细菌以及古生菌中 的s u t f o l o b a z e s ( f d e d n c he t a l ，2 0 0 1 ) ，其中优势种群为硫杆菌属、硫发菌属、贝氏 内蒙古师范大学硕士学位论文 硫细菌属、辫硫菌属、硫微螺菌属、卵硫菌属、着色菌属和绿菌属等( w i r s e ne ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。硫氧化菌氧化的底物种类很多，包括单质硫、硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸 盐和各种多硫酸盐，这些有机体生长在含硫丰富的环境里，它们能氧化硫化氢形成元 素硫，也可以进一步氧化，其最终产物为硫磺或硫酸盐。在氧化无机硫化物过程中获 得能量，并以二氧化碳为主要碳源来合成细胞成分。硫氧化细菌中除了硫杆菌属和硫 化叶菌属以外，其余四个属尚未得到纯培养。由于该类菌的生理代谢特性，现今在生 物脱臭以及脱硫工艺1 中得到广泛应用。 1 1 2 1 煤炭脱硫 应用微生物脱硫的研究是伴随着利用微生物选矿的研究而开始的。1 9 4 7 年， c o l m e r 和h i n l d e n 2 1 发现并证实化能自养细菌能够促进氧化并溶解煤炭中存在的黄铁 矿，这被认为是生物湿法冶金研究的开始。5 0 年代到6 0 年代，l e a t h a n 等“3 1 首先将 该类菌用于脱硫研究。s i l v e r m a n n 4 1 研究了t f 菌氧化黄铁矿的机制及生理特性，证实 了其能加速黄铁矿的氧化。7 0 年代末，k a r g i n 钔发现了一种嗜热硫叶菌用于脱硫效果 更好，可以脱除1 0 0 的黄铁矿硫和4 0 的有机硫。9 0 年代初，在意大利托雷斯 ( t o r r e s ) 港建成一个5 0 k g ( 干煤) 的微生物脱除黄铁矿硫的中试厂，已投入运转， 为工业放大提供了基础数据。9 0 年代，我国徐毅、钟慧芳等n 6 。1 7 1 用氧化亚铁硫杆菌 t f 4 菌株脱除黄铁矿硫也取得了较好的效果。 1 1 2 2 生物脱硫 h 2 s 的生物脱硫是8 0 年代开始引起人们注意的。目前应用最成熟的代表是氧化 亚铁硫杆菌。它首次应用于r 本钡化学品小阪制作所。我国郑士民等n 8 1 在实验室条件 下，用该菌对炼油厂干气和工业沼气进行处理，h 2 s 脱除率分别达7 1 5 和4 6 9 。 表1 1 中列出常见的脱硫细菌。 1 1 2 3 有机硫脱除 目前，由于有机硫对环境造成的污染同益严重，传统的加氢脱硫法成本较高，而 且难以脱除化石燃料中的含硫杂环化合物，随着对脱硫细菌研究的不断深入，生物脱 硫方法因其条件温和、设备简单、且具有高度的专一性，展现出广阔的应用前景。 1 9 8 8 年美国气体技术研究院( i g t ) 分离到紫红红球菌( r h o d o c o c c u sr h o & - 2 c h r o u s ) i g t s 8 ，可选择性地从二苯并噻吩( d b t ) 中脱除有机硫，并不损失有机物的热值， 2 第一章前言 表1 1 几种常见脱硫细菌 t a b l e l 1 d i s u l f u rb a c t e r i a 。垒整壁夔垒丝墨堡! 里墨重量堕! 兰生量出垡量重幽笪 硫杆菌屉 丁扣能诎掰 2 - 4 02 5 - 3 5 1 2 _ s o 2 - 3 f 跏幽蒯叫t t l f u h i d a r e胪， t a d & p h i b a竹单质硫j ， ， 出唧 泌 无机硫化物 细小螺旋荫属l 胁洳昭舻， 2 - 4 0 f 却婶i 诹册j 无机硫化物 假单胞菌羼 p 旧豫西啪 有机硫化物盈2 5 - 3 5 f p m jp 坷撕 凹i 埃希氏菌屠 e c 蜥 有机硫化物 弘 r 鼬j 红球菌属有机硫化物 剪 f g h t a c l 埘r a ) 芽孢杆菌属有机硫化物 嚣 f b 硎瞄j 硫化叶菌属 s a t d a n d a 也妒争4 0 - - 舡铂 r 跚，批j 5 撕口柳 硫化物 助砌咄铲 1 0 0 捧漉球菌属妒。鹦 5 0 - 硫化物 甲烷轩荫属舻s o , s t ) - 舳 r 麒讥明西叫拥肌j 硫化物 捧硫酸轩菌无机磕化物 压 f r 帅j l 肌1 5 z o - & 5 7 - 0z o 7 o zo & 5 1 o - 5 8l5 _ 25 q6 _ 1 6 lo - 4 o i 0 - 4 0 7 0 脱氮磕轩苗硫化物 2 0 - 3 0 11 ：塑塑! 竺21 垡 于1 9 9 2 年获美国专利。i z u m i 等叫从土壤中分离到的红平红球菌( r e r y t h r o p o l i s ) d 2 1 是已报道的脱硫效果最好的菌株，通过4 s 途径降解为二羟基联苯( 2 一h b p ) 和硫酸 盐。而o m o r i 啪1 发现的红球菌( r h o d o c o c c u s ) s y i 既能将d b t 分解为2 一h b p 和s 0 4 2 ， 也能利用二甲基硫化物( d m s ) ，二甲基亚砜( d m s o ) 代谢为甲烷和s 0 4 厶。另据报 道，r h e e 口发现的戈登氏菌( g o r d o n a ) c y k s i 可以在非水相体系中进行脱硫反应， 可脱除柴油中的各种有机硫，被认为很有希望用于化石燃料的脱硫。 1 1 2 4 烟气脱硫 微生物烟气脱硫通常是和湿法脱硫相结合，使烟气中的s 0 2 通过水膜除尘器或吸 3 内蒙古师范大学硕士学位论文 收塔溶解于水并转化为亚硫酸盐、硫酸盐，利用自然界已存在的各种脱硫菌，在厌氧 环境及有外加碳源的条件下，利用硫酸盐还原菌( s i m ) 将亚硫酸盐、硫酸盐还原 成硫化物，然后再利用光合细菌或无色硫细菌等硫氧化菌氧化硫化物为单质硫，从而 将硫从系统中去除，通过高效生物反应器达到单质硫回收和吸收液循环利用，有效解 决s 0 2 的污染，实现废物资源化。微生物脱硫充分利用了生物硫循环机理，达到环境 效益和经济效益的统一，现在微生物烟气脱硫的应用研究正受到越来越多学者的关 注。 1 1 3 硫氧化细菌的研究现状 自然界中能氧化硫化物的硫氧化细菌种类很多，大部分属于化能自养型，主要可 分为3 大类：丝状硫细菌，光合硫细菌，无色硫细菌。 丝状硫细菌生活在含硫化物的水中，能在有氧环境中把水中h 2 s 氧化为单质硫， 并从中获得生长和活动所需的能量，生成的单质硫则以硫粒的形式沉积在细胞体内， 单质硫还可以被进一步氧化为硫酸盐( 习惯称硫磺细菌) 。丝状硫细菌主要包括两个 属乜2 i ，即贝氏硫菌属( b e g g i a t o a ) 和发硫菌属( t h i o t h r i x ) 。贝氏硫菌是一种可滑行 的丝状细菌，发硫菌则固着生长。由于这类细菌将产生的单质硫贮存在细胞体内，给 分离和提纯带来困难，在实际生产中应用较少。 光合硫细菌是一类光能营养细菌瞳3 嗡1 ，主要分为两大类：( 1 ) 严格光能自养型， 包括着色菌科( c h r o m a t i a c e a e ) 的着色菌属和绿菌科( c h l o r o b i a c e a e ) 的绿菌属；( 2 ) 兼性光能自养型，主要包括红螺菌科( r h o d o p i r i l l a c e a e ) 的红螺菌属、红假单胞菌属、 红微菌属以及绿菌科( c h l o r o f l e x a c a e ) ，它们能以有机物( 简单的有机酸类或醇类) 作为电子供体和碳源。 由于光合细菌可迅速利用低分子有机物，其中的一些种还具有反硝化活性和积磷 的特性，有较好的脱硫效果，可用于处理有机废水，因其细胞结构及独特的物质、能 量代谢使之能在有机废水处理中显示出其他菌种无法比拟的优越性。其细胞内具有能 进行光合作用的载色体。这些载色体是由细胞膜分化而成的直径约6 0 0 1 0 0 0 a 的球状 或胞状体，颗粒中密集包含着细菌叶绿素和类胡萝卜素，可进行光合磷酸化反应和光 氧化还原反应。在好氧黑暗的条件下，细菌缺少这种载色体，此时它通过三羧酸循环 来进行有机酸代谢；在厌氧光照时，又很快形成载色体，上述循环受阻，迅速转换代 谢途径，并把有机酸异化和同化的氧化还原反应和光氧化还原反应紧密结合起来。 这种可随生长条件改变而灵活改变代谢途径的能力，使光合硫细菌在自然界硫的 4 第一章前言 转化过程中起着重要的作用，是自然界中单质硫沉积的主要作用者，但只有紫色硫细 菌和绿色硫细菌的一些种能代谢硫化物，到目前为止，光合硫细菌应用于生物脱硫工 艺的例子不多。主要原因是光合硫细菌生长和活动需要光照，工艺控制复杂，增加运 行成本，而且有些菌也在体内贮存硫，其次光合硫细菌氧化硫化物的过程与c 0 2 的还 原和细胞物质的生长相藕联，其氧化速率和能力受到细菌细胞物质的生长速率和总量 的限制。 无色硫细菌( c o l o u r l e s ss u t f u ，b a c t e r i a ) 是一个生理学惯用词呦嗡1 ，不是分类学 名词。实际上，有些无色硫细菌的纯培养菌苔呈粉红色或棕色，说明其体内含有细 胞色素。无色硫细菌的种类繁多，且各自具有不同的生理学、形态学和生态学特征， 不同类型的无色硫细菌对环境条件的要求也有差异。 如表1 2 所示。大多数无色硫细菌都在p h 中性、中温条件下生活但也有研究表 明，无色硫细菌可生活的环境范围很广，在p h2 0 - 1 0 0 ，温度4 9 5 的条件下都 有无色硫细菌生长和活动；对溶解氧( d o ) 的要求很宽松，在高至饱和浓度低至完 全无氧状态下，都有无色硫细菌生存。研究还发现乜7 1 ，环境条件的改变会引起某些无 色硫细菌营养方式的改变，如：a c i d i a n u s 在好氧条件下，氧化硫化物生成单质硫；而 在厌氧条件下，则以h 2 作为电子供体，将单质硫还原为硫化物，即这种细菌随着环境 条件的改变，会由硫氧化菌转变为硫还原菌。 表1 2 几种无色硫细菌的培养条件 t a b l e1 2c u l t u r ec o n d i t i o n sf o rc o l o r l e s ss u l f u rb a c t e r i a 内蒙古师范大学硕士学位论文 无色硫细菌的共同特征是能氧化还原态硫化物并从中获取生长和活动所需的能 量，其主要氧化反应为： h 2 s + 2 0 2 一h 2 s 0 4 2 h 2 s + 0 2 2 s u + 2 h 2 0 2 s u + 0 2 + 2 h 2 0 2 h 2 s 0 4 n a 2 s 2 0 3 + 2 0 2 + h 2 0 n a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 ， 4 n a 2 s 2 0 3 + 0 2 + 2 h 2 0 2 n a 2 8 4 0 6 + 4 n a o h 2 n a 2 s 4 0 6 + 7 0 2 + 6 h 2 0 2 n a 2 s 0 4 + 6 h 2 s 0 4 2 k s c n + 4 0 2 + 4 h 2 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 + k - 2 s 0 4 + 2 c 0 2 ， 5 h 2 s + 8 k n 0 3 4 k 2 s 0 4 + h 2 8 0 4 + 4 n 2 + 4 h 2 0 5 s u + 6 k n 0 3 + 2 h 2 0 3 k 2 s 0 4 + 2 h 2 s 0 4 + 3 n 2 对无色硫细菌代谢途径的研究表明，碳的代谢途径较为简单和统一，即多数无色 硫细菌都通过c a l v i n 循环进行二氧化碳的固定；但不同种类的无色硫细菌对硫的代谢 途径不同，电子传递系统与参与代谢的酶也有所差异，反应所发生的部位也可能有所 变化。大多数无色硫细菌以0 2 作为电子受体，因而多数无色硫细菌是好氧菌。但某些 无色硫细菌可在厌氧条件下以n 0 3 或n 0 2 。作为电子受体，将其还原为n 2 ，如 t d e n t r i f i c a n s 研究表明很多严格好氧的无色硫细菌也可在厌氧状态中存活或生长。多 数无色硫细菌是体外排硫的。所以氧化速率和能力不像光合硫细菌那样受细胞生长的 限制一3 拍1 。 不是每一种无色硫细菌都能氧化所有的无机硫化物，其中s 2 0 3 2 - 是他们的共同底 物，仅氧化过程有差异。k u e n e n 等人乜钔研究发现，无色硫细菌在营养物质受限制而有 足够硫化物时，可在几乎无明显生长的情况下，高效地将硫化物甚至胞外的单质硫氧 化。与光合硫细菌每增长1 克细菌细胞能产生l 2 克硫单质相比，无色硫细菌的氧化 能力更强，每增长1 克细菌细胞至少可产生2 0 克单质硫。因此可见无色硫细菌在脱硫 方面的能力远高于其它脱硫菌，适合于生物脱硫工艺啪1 。 常见的化能自养无色硫细菌有氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 、排硫硫 杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s ) 、氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 及脱氮硫 杆菌( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) 。它们都属于硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) ，硫杆菌属是 化能白养型细菌类的典型代表，大多营严格化能自养型生活，也是目前应用最广的菌 种。 6 第一章前言 1 2 硫杆菌的生物学特性 1 2 1 硫杆菌的概述 硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 是硫化细菌的主要代表，是一类自养微生物，硫杆菌是 革兰氏阴性、不生芽孢、极生鞭毛的短杆菌，适宜生长温度为2 5 - 3 0 ，p h 值范围 较宽，所测定种的d n a 的g + c 含量范围是5 0 6 8 克分子汹1 。在二氧化碳及碳酸 盐的培养液中生长，当硫杆菌生长旺盛时，可使其生长环境的p h 值降至3 5 以下。 硫杆菌种类较多，广泛分布于海水、淡水、池泥及其他土壤中，在含有还原态硫和还 原铁的各种环境中，如河沟、湖底、海滩的淤泥和沉淀物中均能检测到它的存在。硫 杆菌可以氧化硫和硫化物，通过纯粹的化学作用使硫或硫酸的不完全氧化物转化成硫 酸，并能参与水或土壤中的硫循环作用，使土壤和水质得以改良。特别是它使水中积 累的硫化氢等有毒物质转化为无毒的物质，起到净化水质作用。 1 2 2 硫杆菌的分类学地位 伯杰氏细菌分类学手册中对硫杆菌的分类已建立了三个型，其差别为已测定 的脂肪酸甲基脂的脂含量，还可以分为三个群，其差别在于d n a 的g + c 含量。据 不完全统计，目前发现的硫杆菌属细菌至少有1 4 种，代表的种类有排硫硫杆菌、氧 化硫杆菌、脱硫杆菌等。 硫杆菌属中各类硫杆菌的酸化能力存在着很大的差异。根据它们的酸化表现可以 将它们分为两类：微嗜酸硫杆菌和嗜酸硫杆菌。嗜酸硫杆菌在含s o 的培养基上能以 s o 为氧化底物在1 0 d 内将p h 降低到1 4 1 6 ，嗜酸硫杆菌主要由排硫硫杆菌组成。微 嗜酸硫杆菌的酸化能力相对要差一些，大部分是氧化硫硫杆菌，在含s o 或$ 2 0 3 2 - 的培 养基上只能将p h 降低到2 3 之间。 1 2 3 硫杆菌的代谢机理研究 硫杆菌属的能量代谢的研究近年来有很大进展。由于所有的硫杆菌都能在中性条 件下以易溶于水且易测定的硫代硫酸盐作为能源，所以有利于开展对其代谢机制的研 究。表1 3 中列出了脱硫细菌代谢过程中进行的一些生化反应陆川。 硫杆菌一般并不存在底物水平的磷酸化，即使存在磷酸腺苷硫酸盐或a p s 途径， 也不起主要作用。它们氧化无机硫化物的主要方式是通过呼吸链的氧化磷酸化途径。 硫杆菌呼吸链的组成基本上与线粒体和原核生物中的脱氮副球菌 ( p a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s ) 等革兰氏阴性异养细菌相似，即n a d h 2 脱氢酶、琥珀酸 7 内蒙古师范大学硕士学位论文 脱氢酶、黄素蛋白( f p ) 、泛醌( c o q ) 、细胞色素b ( 有的含2 种) 、细胞色素氧化 酶a a 3 等。在大多数硫杆菌中，从硫化物或硫代硫酸盐底物上脱下的电子经细胞色素 c 进入呼吸链，但在t d e n i t r i f i c a n s 中却例外地从黄素蛋白或细胞色素b 水平上进入的， 能产生l 个a t p 。与硝化细菌等其他自养菌一样，硫杆菌还原c 0 2 所需要的还原力【h 】， 也是通过耗a t p 的逆呼吸链传递而产生的。 在硫杆菌中，无机硫化合物的氧化途经最可能如下口： h s 。一膜附着硫【s o 】一s o膜附着硫【s 0 】一s 0 3 2 。一s 0 4 2 硫化物氧化成硫酸分两步进行，第一步快，硫化物失去两个电子，膜附着聚合硫 形成；第二步慢，单质硫进一步被氧化为亚硫酸、硫酸。但不同种类的无色硫细菌对 硫的代谢途径却差异很大，不仅代谢所涉及的酶和电子传递系统大不一样，而且反应 所发生的部位也不相同。 表1 3 脱硫细菌酶催生化代谢反应 t a b l e1 3b i o c h e m i c a lr e a c t i o no fs u l f u rb a c t e r i a e n z y m ea c t i v i t y r e a c t i o nc a t a l y z e d 曲3 紫? 印t o t s 0 3 2 一+ 2f e ( c n ) 6 3 - 一s 0 4 2 一+ 2f e ( c n ) 6 4 - o x l d o r e d u c t 乏i s e 1 鼍：刚2 钯m c 印衙 s s 0 3 2 - + 2f e ( c n ) 6 3 - 一0 3 s s s - s o 广+ 2f e ( c n ) 6 4 - o x l d 删u c a s e r h o d a n e s e s s 0 3 2 一+ c n - + h + 一s c n - + h s 0 3 一 a p sr e d u c t a s ea m p + h s 0 3 - + 2 f e ( c ! n ) 6 3 一一a p s + 2 f e ( c n ) m + h + r e v e r s er e a c t i o na p s + 2 f e ( c n ) p + 一一脚+ h s o 产+ 2 f e ( c n ) 6 3 - a p a t a p s + h p 0 4 2 一一a d p + s o 4 2 一十h + r e v e r s er e a c t i o n a d p + s 0 4 2 一+ h + - - a p s + h p 0 4 2 一 a t ps u l f u r y l a s e a p s + h p 2 0 ， 一a t p + s 0 4 2 一+ h + r e v e r s er e a c t i o n e a t p + s 0 4 2 一+ h + 一a p s + h p 2 0 7 卜 a d e n y l a t ek i n a s e a m p + a t p - - - 2a d p a p sp h o s p h o k i n a s ea p s + a t p - 1 p a p s + a d p p a p sr e d u c t a s ep a p s + 2 f e ( c n ) 。+ h s o f + 3 l p - a m p + 2 f e ( c n ) 6 3 - a l m as y n t h a s ea p s + a t p a l m a + s 0 4 2 一 a p 4 a a p 4 a 上h 2 0 2 a d p p y r o p h o s p h o h y d r o l a s e 第一章前言 1 3 硫杆菌的酶学研究 硫杆菌属散布于p r o t e o b a c t e r i a 的b 亚类。有关硫杆菌属对还原性硫化物氧化的生 理生化研究说明对于不同菌种的硫代谢途径尚无定论。 自然界硫循环可以完全由微生物完成，也就是说可以在没有其它高等生物的参与 下完成，换言之，如果使用适当的微生物和相应的环境条件，各种含硫化合物在微生 物作用下相互转化是可能的别。近年来从酶学和遗传学角度研究生物脱硫过程的分子 机理取得了一定的进展，已证明在菌株中存在特定的催化硫转化的酶基因，它们已被 克隆和测序，并获得了纯化的表达产物1 。但关于硫杆菌体内催化各种形态的硫化物 之间相互转化的氧化机制的研究十分缺乏，因此负责这些化合物s 2 。一s o s 0 3 2 。一 8 0 4 2 。反应转变的关键酶和酶复合物的研究得到广泛的关注，以下就硫杆菌硫代谢过程 中起关键作用的酶进行综述。 1 3 1 亚硫酸盐受体氧化还原酶 亚硫酸受体氧化还原酶( s u l f i t e ：a c c e p t o ro x i d o r e d u c t a s es a o r ) 是硫杆菌酶催代 谢中的关键酶，具有催化亚硫酸盐氧化成硫酸盐的特性，关于该酶的生物学特性研究 在国内外未见详尽报道。但是，有关亚硫酸盐氧化酶的研究在国外文献中已有描述。 j r v e s t a l 等m 1 发现彳f e r r o o x i d a n s d o 的亚硫酸盐氧化酶含有细胞色素c ，但是不含血红 素和非血红素铁中心。t s u g i o 等1 眦f e r r o o x i d a n sa p l 9 3 中分离到了一种膜结合亚 硫酸盐氧化酶，其催化活性位点位于细胞周质，含有分子量分别为5 9 k d a 和6 1 k d a 的 两个亚基，该酶以f e 3 + 为电子受体，而不是以细胞色素c 或铁氰化物作) e j s 0 3 2 氧化后 的电子受体，这种亚硫酸氧化酶在有氧和无氧条件下都能快速地氧化s 0 3 。k n a k a m u r a 等啪1 和ga h d ej o n g 等口力分别从彳t h i o o x i d a n s 和t h i o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 中分离到了利用细胞色素c 的亚硫酸盐氧化酶膜蛋白，体外试验表明其活性最优p h 值 为中性，暗示其活性中心位于细胞质中。还有研究发现，t h i o b a c i l l u sn o v e l l u s 啪棚1 ， t h i o b a c i l l u st h i o p a r u s 剐，t h i o b a c i l l u sv e r s u t u s 删和t h i o b a c i l l u sc o n c r e t i v o r u s n l3 中存 在亚硫酸盐氧化酶，这些酶含有钼元素，具有和哺乳动物亚硫酸盐氧化酶相似的特性， 利用细胞色素c 或铁氰化物作茭t j s 0 3 2 - 氧化后的电子受体嘲1 。 亚硫酸受体氧化还原酶途径中能量产生储存靠电子传递来实现，电子经s a o r 传 递给细胞色素c ，最后由细胞色素氧化酶接受。至今还没有关于亚硫酸盐氧化和细胞 色素b 、辅酶q 相偶联的证据纠。 9 内蒙古师范大学硕士学位论文 1 3 2 硫氧化酶 硫氧化酶的种类多，目前相关研究也比较多，主要催化单质硫反应生成亚硫酸盐， 这些酶系蛋白主要包括硫加双氧酶、硫加氧还原酶、硫加氧酶、硫化物一辅酶q 氧化 还原酶等，前两者的底物为单质硫，第三者的底物为单质硫活化过程中产生的少量 h 2 s 。i s u z u k i h 3 一町和m s i l v e r 等h 钔分别对彳t h i o o x i d a n s 和a f e r r o o x i d a n s 的硫氧化酶进 行了研究，其中关于硫双加氧酶的研究较多。 硫双加氧酶( s u l f u rd i o x y g e n a s e ) 是嗜酸硫氧化细菌元素硫转化的关键酶( 实施 催化元素硫氧化首步反应的氧化酶) 。最近_ s u g i 等h 叼首次眦t h i o o x i d a n s 中分离纯化 出硫双加氧酶，该研究报道硫双加氧酶为单聚体酶，分子量为1 9 5 k d a ，最适p h 为7 5 。 也有相关报道称分离得到的硫双加氧酶是大分子量多亚基蛋白，与s u g i 等报道的结果 相差甚远，嗜酸硫杆菌的硫双加氧酶究竟是单聚体酶还是多聚体酶，最适p h 值是在中 性还是与其反应环境一致的酸性，值得进一步研究和确证。 目前还没有关于硫加双氧酶的活性反应中心和催化反应机理的报道。采用物理学 的方法分析，发现该酶没有典型氧化还原酶的辅助因子( 如细胞色素和核黄素) 参与 催化反应。另外，有关硫双加氧酶分子生物学方面的信息和结构特征并未见报道，也 因缺乏有关环境因素对硫双加氧酶活性和表达的影响、以及其反应活性中心或催化作 用位点等的研究，所以有关该酶的活性与表达的调节机制仍不清楚。 1 3 3 硫代硫酸盐受体氧化还原酶 硫代硫酸盐是硫氧化菌的共同代谢底物，也是硫氧化菌的重要能源物质，代谢硫 代硫酸盐的关键酶是硫代硫酸盐受体氧化还原酶( t h i o s u l f a t e ：a c c e p t o r o x i d o r e d u c t a s e t a o r ) 。从古生菌a a m b i v a l e n s 中分离的膜结合t a o r 在铁氰化物做为电子受体时能 氧化s 2 0 3 2 - 成为s 4 0 6 2 。t a o r 含有两个由含双顺反子的d o x d a 操纵子编码而来的亚基 d o x a 和d o x d ( 2 8k d a 和1 6k d a ) 。二级结构预钡： d o x d 含有五个跨膜螺旋，d o x a 含 有一个跨膜螺旋。t a o r 活性能被巯基结合试剂( 如乙基马来酰亚胺和z n 2 + ) 所抑制。 枷f e r r o o x i d a n s 中没有与古生菌a a m b i v a l e n s 中s o t 同源相似的基因，但有与a a m b i v a l e n s 中编码t a o r 的基因相似的双拷贝d o x d a 基因。d o x d a 在嗜酸硫杆菌5 2 0 3 氧化中的作用机制虽然还不清楚，但是从已有研究看，d o x d a 基因编码的产物可能在 硫氧化过程中起到十分重要的作用n 引。 l o 第一章前言 1 3 4 硫氰酸酶 硫氰酸酶( r h o d a n e s e ) 是一种硫代硫酸盐硫转移酶( t h i o s u l f a t et h i o t r a n s f e r a s e ，” t s t ) ，专门打断s 2 0 3 2 中的s s 化学键，产生s 和s 0 3 2 羽7 1 。m n g a r d n e r 和d e ， r a w l i n g s n 羽枷t h i o o x i d a n s 和a c a l d u s 细胞内和细胞提取物中都检测到了t s t 活 性，然而，在能氧化亚铁而不能氧化含硫化合物的细菌l f e r r o o x i d a n s 中没有检测到 有t s t 活性。a f e r r o o x i d a n s 在以黄铁矿和s 为基质的酸性环境中生长时有s 2 0 3 2 - 的生 成，而且s 2 0 3 2 是黄铁矿中硫元素生物浸出的主要中间物质。e r a m i r e z 等n 们研究发现 a f e r r o o x i d a n s 在黄铁矿和s 基质中生长时，细胞体内有一种类t s t 蛋白高度表达，在 f e 2 + 基质中生长时，该蛋白质只是微量表达，在进一步对比，4 f e r r o o x i d a n s 在s 和f e 2 + 基质中生长时细胞体内的蛋白质表达差异时发现，在s 基质中生长的细胞体内有几种 蛋白质被诱导表达，包括一种外膜蛋白，一种类t s t 蛋白，一种类s 2 0 3 2 - s 0 4 2 。结合蛋 白，一种类微囊多聚糖运输蛋白以及其它几种功能未知蛋白，其中类t s t 蛋白，类 s 2 0 3 2 - s 0 4 2 结合蛋白的出现显然是和硫的氧化代谢相关。 1 3 5 硫代硫酸盐脱氢酶 硫代硫酸盐脱氢酶( t h i o