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山东大学硕士论文 利用p c r d g g e 技术检测、鉴定乳酸菌 摘要 乳酸菌广泛存在于人和动物肠道、植物表面等生境中。作为最具代表性的益 生菌，乳酸菌在食品发酵、饮品和饲料等领域有着悠久的应用历史。将分子生物 学方法引入微生物生态学领域，研究乳酸菌制品中不同乳酸菌及其菌群组成，可 以获得发酵过程中乳酸菌菌群组成的动态变化。这对于生产过程的控制、产品质 量的检验具有重要意义。本文中采用p c r - d g g e 卿o y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n d d e n a t u r i n gg l 镁l i e b tg dc l c c t r o p h o r e s i s ，p c r d g g e ) 技术，结合传统的平板分离 培养，对一些包含有乳酸菌的发酵产品进行微生物菌群分析，建立了一种快速检 测乳酸菌的方法。 对p c r d g g e 技术在分析乳酸菌制剂中的有关实验条件进行探索及优化。首 先对变性梯度凝胶浓度及电泳时间进行了研究，结果表明，在进行平行d g g e 时， 变性剂( 尿素及甲酰胺) 浓度在3 0 5 5 时，能够有效分离大小相同、碱基组 成不同的d n a 片断。时间间歇变性梯度凝胶电泳实验结果显示，对乳酸菌1 6 s r d n a 可变区的最佳分离时间为2 0 0 i m b 。通过d g g e 法分析了细菌通用引物在 p c r 扩增不同模板时的产物差异，发现扩增产物量与模板量并没有直接关系，推 测主要是引物与模板的结合效率有关。在优化的电泳条件下，选择微生物饲料添 加剂中常用的7 株益生乳酸菌，建立了它们的d g g e 指纹图谱库。 以青贮玉米秸秆饲料为实验材料，对从发酵产品中直接提取总d n a 的方法 及其效率迸行研究。结果表明，采用先分离青贮饲料中微生物，再进行溶菌酶与 s d s 共同作用裂解细胞的方法，所提取的青贮饲料总d n a 纯度较高。用p c r 和光 吸收方法对所得的d n a 质量进行检测，发现得到的d n a 中杂质含量少，可用于 后续的分子操作。通过d g g e 对提取的d n a 进行纯度及效率的验证，发现所建立 的方法能提取出青贮饲料中所有优势菌群的染色体d n a ，没有遗漏。通过向灭 菌秸秆中接种不同浓度的已知菌株干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e o ，验证上述方 法的可靠性，实验结果表明，在样品中不少于7 5 个微生物的d n a 均可被提取出 山东大学硕士论文 来，采用p c r 的方法，检测出了加入材料中的很少量的目标菌株，证明所建立的 提取d n a 的方法有较高的灵敏度。 益生菌剂e m ( e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m s ，e m ) 是一种被广泛应用于饲料加工、 生物肥料等领域的一种由多种微生物组成的活菌制剂。利用平板计数检测e m 中 的活菌数，和显微镜观察其微生物的个体形态，结果发现e m 制剂中活菌数量较 多，达到2 x 1 0 7 c f u m l ，细胞形态多样，并从m r s 、l b 平板上分离到形态有差 异的6 株细菌。利用d g g e 技术对这6 株细菌进行鉴定，其结果是6 株细菌属 于3 类，分别是蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、嗜热链球菌( s mt h e r m o p h i l u s ) 和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l o 。直接提取e m 制剂的总d n a ，利用p c r - d g g e 技术对e m 细菌多样性进行分析，结果发现，e m 中含有4 类优势乳酸菌。将益 生菌剂e m 分别在l b 培养基和m r s 培养基上培养，转接5 次后，分析乳酸菌 的组成变化，结果发现，在两种培养基分别转接培养后e m 中乳酸菌的种类大大 减少。 利用传统的平板计数、平扳分离纯化方法，对国内6 种市售酸奶的乳酸菌及 其组成进行了分析。结果表明，所有酸奶样品中的活菌数量都在l o f u m l 以上， 均达到国标中规定的要求；并且从酸奶中均分离出2 种形态明显不同的杆菌和链 球菌。对其进行1 6 sr d n a 核酸序列测定及同源性比对分析，这2 种菌被鉴定为 德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) 。利用引物l a e l g c 和h d a 2 扩增不同酸奶中乳酸菌1 6 sr r n a 基 因的可变区域，进行p c r d g g e 直接分析，结果表明，酸奶样品y l d 中含有螺 旋乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，样品j b 中只检测到德氏乳杆菌，而其它酸奶样品中 同时含有德氏乳杆菌和嗜热链球菌，而嗜热链球菌在d g g e 凝胶上的带较浅。 当用引物r 5 1 8 和f 3 5 7 进行p c r d g g e 直接分析时，除了样品y l d 外，其余样 品都得到了迁移率和亮度相同的2 条带，说明引物r 5 1 8 和1 ：3 5 7 对嗜热链球菌 模板的识别效率高于引物l a c l g c 和i - i d a 2 。 综上所述，本论文建立了一种快速检测乳酸菌混合制剂的简便方法，即采用 化学裂解的方法直接提取总d n a ，以总d n a 为模板扩增1 6 sr r n a 基因可变区， 山东大学硕士论文 通过d g g e 对样品中的乳酸菌组成进行分析及鉴定。 关键词：变性梯度凝胶电泳；乳酸菌；d n a 提取；青贮饲料；聚合酶链式 反应；1 6 sr d n a ；酸奶 山东大学硬士论文 d e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fl a bb yu s i n gp c r d g g e a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) c o m m o n l yw e s 明ti nt h ei n t e s t i n a lt r a c eo fh u m a na n d a n i m a lo rt h es u r f a c eo f 台e s hp l a n t m o s to ft h e mw e r eu s e da ss t a r t e rc u l t u r e si nt h e m a n u f a c t u r i n gp r o c e s s e so fv a r i o u sf e r m e n t e df o o d s ，b e v e r a g e s ，a n df e e dp r o d u c t s f o rt h e i rl o n gh i s t o r yo fs a f eu 眈l a bw e r ec o m m o n l yr e f e r r e dt oa st h e g e n e r a l l y r e c o g 口a z e da ss a f e ( g r a s ) ”s t r a i n s a n a l y s i so ft h es p e c i e so fl a ba n dc h a n g e si n m i c r o b i a lc o m m u n i t i e sd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sw a st r a d i t i o n a l l yr e l i e do nt h e b a c t e r i o l o g i c a lc u l t u r et e c h n i q u e sa n dm i c r o s c o p y b a c t e r i o l o g i c a lc u l t u r et e c h n i q u e s h a v eb e e ns h o w e dt h el i m i t a t i o n si nm i c r o b i a le c o l o g i c a ls t u d i e s ，p a r t i c u l a r l yd u r i n g t ot h ep r e s e n c eo ft h ec e l l st h a ta r en o td e t e c t a b l eb yc u l t u r em e t h o d s t h ea p p l i c a t i o n o fr e c e n t l y d e v e l o p e dc u l t u r e i n d e p e n d e n t m o l e c u l a rt e c h n i q u e sp e r m i t sm o r e d e t a i l e di n v e s t i g a t i o n so ft h em i e r o f l o r a d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s g g e ) h a sb e e nd e m o n s t r a t e dt ob eas u i t a b l et o o lf o rt h ea n a l y s i so fm i c r o b i a l c o m m u n i t y i nt h i st h e s i s ，p c r - d g g et e c h n i q u ec o m b i n e dw i t hc l a s s i c a l l yp l a t e c u l t u r em e t h o da n ds e q u e n c i n go fp a r t i a l1 6 sr i b o s o m a lr n a ( r r n a ) g e n e sw e r e a p p l i e dt oa n a l y z et h em i c r o b i a ld i v e r s i t y , e s p e c i a l l yl a c t i ca c i db a c t e r i ad i v e r s i t yi n t h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t sa n ds p e c i a le c o s y s t e m d g g ea n a l y s i sw a sw i d e l ya p p l i e di nt h ed e t e c t i o no fl a bi nf o o ds a m p l e sa n d e n v i r o n m e n t s d g g ec o n d i t i o n sw e r ef i r s t l yo p t i m i z e df o rd i r e c ti d e n t i f i c a t i o nl a b p o p u l a t i o n ss u c ha sg r a d i e n to fd e n a t u r a n ta n dl e n g t ho ft i m eo fe l e c t r o p h o r e s i s t h e p e r p e n d i c u l a rd g g er e v e a l e dt h a t3 0 。5 5 w a sas u i t a b l ed e n a t u r a n tr a n g eo f g r a d i e n tf o rp a r t i a l l ym e l t i n gd n af r a g m e n t s t od e t e r m i n et h el e n g t ho ft i m eo f e l e c t r o p h o r e s i s ，1 6 sr d n af r a g m e n t sw e r ea p p l i e dt op e r f o r mat i m e t r a v e ld g g e o n t oap a r a l l e lg e lw i t l lal i n e a r l yi n c r e a s i n gg r a d i e n to ff r o m3 0 t o5 5 d e n a t u r a n t , a n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta b o u t2 2 0 r a i nw a sap r o p e rl e n g t ht oo b t a i ng o o d s e p a r a t i o ni ng i v e ng e l t h ed i f f e r e n ta m p l i f i c a t i o no fe f f i c i e n c yd u r i n gp c rb yu s i n g i v 山东大学硕士论文 u n i v e r s a lp 酊i l 娜w a sa l s oa n a l y z e d w ef o u n dt h a tt h ea m p l i f i c a t i o nw a sm o t el i k e l y r e l a t e dt ot h ed e g r e eo fa n n e a l i n gt h a nt h ea m o u n to ft e m p l a t e ，o n ed g g el a d d e r c o n s i s t so fp c r p r o d u c t sf r o mf 把v e nr e f e r e n c es t r a l l 岱w h i c hw c i - ec o m m o n l yu s e di n f o o da n df e e d s t u f fw a sp r e p a r e d , t h e nd o g eb a n d so fs a m p l ec o u l db ei d e n t i f i e db y c o m p a r i n gt h em i g r a t i o nd i s t a n c ew i t ht h o s eo fl a d d e r i ne n v i r o n m e n t a l m i c r o b i o l o g y , m o l e c u l a re c o l o g ys t u d y h a sb e e n w i d e l y c o n c e r n e di nt h ew o r l d ，w h i l eh i g hq u a l i t yd n ai st h eb a s i so ft h es t u d y i nt h i ss t u d y , am e t h o do fe x t r a c t i n gt o t a ld n af r o ms i l a g ew a sd e v e l o p e d i nt h i sm e t h o d , d n a e x t r a c t i o nw a sc a r r i e do u td e p e n d i n go nt h ei s o l a t i o no fm i c r o b i a lc e l l sf r o mt h e i r e n v i r o n m e n t a lm a t r i xp r i o rt ol y s i st or e l e a s ed n a a n dt h ee f f i c i e n c yo fd n a e x t r a c t i o nw a se v a l u a t e d t h eq u a n t i t ya n dp u r i t yo fd n ai ns i l a g ee x t r a c t sw a s e s t i m a t e d d n ae x t r a c t e df r o ms i l a g ec o u l db es u b j e c t e dt oa m p l i f yi t s1 6 sr d n a ， i n d i c a t i n gt h a te x t r a c t e dd n a c o u l db ep e r f o r m e df o rf u r t h e ra n a l y s i sp r o c e d u r e ，i e ， p c r t h ee f f e c to fd n ae x t r a c t i o no l lt h er e c o v e r yo fb a c t e r i af r o ms i l a g ew a sa l s o e v a l u a t e d i nt h i sc a s e f i v ek n o w nc o m p r e h e n s i v e l yg + a n dg r e f e r e n c es t r a i n sw e l e a d d e dt oc o r ns t r a ws t e r i l i z e d ，t h e ne x t r a c t e dd n a t h ea m p l i c o n so f1 6 sr r n ag e n e v 3r e g i o ns u b s e q u e n t l yw e r ea n a l y z e db yd o g e t h ed n ae x t r a c t i o nl i m i t a t i o n so f t h em e t h o dw a sa l s od e t e r m i n e db yp r e p a r i n g1 0 f o l d s e r i a ld i l u t i o n so fap u r eb r o t h c u l t u r ei np b sb u f f e ra n da d d e dt oc o r ns t r a ws t e r i l i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m e t h o di n t r o d u c e di nt h i sp a p e rc o u l db ea ne f f i c i e n ta n dr e l i a b l em e t h o dt oe x t r a c t d n ai nm o l e c u l a re c o l o g ys t u d i e s t h ep r o b i o t i c se m ( e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m , e m ) w a sa n a l y z e db yc o n v e n t i o n a l m e t h o d s ，i e ，p l a t i n gc u l t u r ea n di s o l a t i o ns t r a i n so nl ba n dm r sm e d i a ，f o l l o w e d m o r p h o l o g yo b s e r v a t i o nb ym i c r o s c o p y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a te mp r o b i o t i c s c o n t a i n e dan u m b e ro f2 1 07 c f u m lb a c t e r i a , a n dc e l l i ne mp r e s e n t e dad i v e r s e m o r p h o l o g y d g g ea n a l y s i so fs i xs t r a i n si s o l a t e df r o me mo nl ba n dm r sp l a t e s s h o w e dt h a tt h e s ei s o l a t e sw e r ei d e n t i f i e da st h r e es p e c i e s ：b a c i l l u sc e r e u s , e s c h e r i c h i ac o i la n ds t r e p t o c c u st h e r m o p h i l l u s f o u rp a t t e r n sd o m i n a n ti ne mw e r e 山东大学硕士论文 d e t e c t e db yd g g ei ng e l b ys u b c u l t u r i n go l ll bo rm r sm e d i u m , r e s p e c t i v e l y , b a n d sr e s p e c t i v et ol a bd e c r e a s e dl a r g e l yi nd g g eg e i i nt h i ss m d f i v ec o m m e r c i a ly o g h u r t sw e r es u b j e c t e dt om i c r o b i a la n a l y s i sb y u s i n gap o l y p h a s ea p p r o a c h e sc o m b i n i n gw i t hm i c r o b i a le n u m e r a t i o nw i t hc u l t u r e m e d i a , d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) f i n g e r p r i n t i n ga n ds e q u e n c i n g o fp a r t i a l1 6 sr i b o s o m a lr n a ( r r n a ) g e n e s t h ee n u m e r a t i o no fl a ba t t a i n e d p o p u l a t i o no f1 0 6 c f u m l ，w h i c hm e tt h ec r i t e r i o no fn a t i o n a ls t a n d a r d l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i ia n ds t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sw e r ed e t e c t e di ny o g h u r td y , s la n dy lb y d g g ew i t ht h ep 酊m 盯l a c l g ca n dt o g a 2 , o n l yl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i iw a s d e t e c t e di ny o g h u r tj b ，o nt h eo t h e rh a n d , l a c t o b a c i l l u sc r i s p a t u sa n dl a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u sw e r ef o u n di ny o g h u r ty l db ys e q u e n c i n g1 6 sr d n af r a g m e n te x t r a c t e d f r o md g g eg e la n db yab l a s ts e a r c ho fg c n b a n kd a t a b a s e w h e na n a l y z e db y d g g ew i t ht h ep r i m e rr 51 8a n df 3 5 7 ，t w oi d e n t i c a lb a n d sw i t ht h es a m ed e n s i t y w e r ef o u n di ny o g h u r t sd y ，j b ，s l ，a n dy l ，w h e r e a sy o g h u r ty l dh a dt w ob a n d sw h i c h h a dd i f f e r e n tm i g r a n c ef r o mt h o s ef o u n di no t h e ry o g h u r t s i d e n t i f i c a t i o no ft h et w o i s o l a t e sb y1 6 sr d n aa n a l y s i si n d i c a t e dt h ep r c s 即c co f l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i ia n d s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u si ny o g h u r t i nc o n c l u s i o n ，w ec o n s t r u c t e da na p p r o p r i a t ea p p r o a c hf o rar a p i da n a l y s i so ft h e e c o s y s t e mo fl a bp r e s e n c ei nf e r m e n t e dp r o d u c t s t h i sa p p r o a c hc o m p r i s e st h r e e s t e p s ：( i ) d i r e c te x t r a c t i o no ft h ec o m m u n i t yd n a ，( i i ) p c ra m p l i f i c a t i o no f1 6 s r d n af r a g m e n t s ，a n d ( i i i ) a n a l y s i so f1 6 sr d n aa m p l i c o n sb yd e n a t u r i n gg r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i sf d g g e ) k e yw o r d ：d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) ；l a c t i ca c i db a c t e r i a ； d n a e x t r a c t i o n ；s i l a g e ；p c r ；1 6 sr d n a ；y o g h u r t ；i s o l a t e dc u l t u r e 原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的 研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声 明的法律贵任由本人承担。 论文作者签名：弓佑 e t 辫i ：竺k ：2 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：马丝1 2 导师签名：趱日期：型：! ：望 山东大学硕士论文 1 1 乳酸菌和益生素 1 1 1 乳酸菌 。 第一章绪论 乳酸菌( l a c t i ca c i d 蚰c f e r 妇，l a b ) 是人体肠道的正常茵群，也是食品加工和 保藏的常用菌种，广泛应用于乳制品发酵、乳酸菌饮料、发酵豆乳、肉类、腌渍 物、酸面包和饼干的加工制造。由于具有许多有益的代谢特征和人类长期安全使 用的历史1 一，被公认为安全级( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ，g r a s ) 的食品微生 物【l l 。 乳酸菌不是规范的分类学上的名词，而是指一群可发酵碳水化合物，产生大 量乳酸的革兰氏阳性球菌或秆菌的统称。乳酸菌广泛存在于自然界中，例如土壤、 水、植物表面、人体及动物肠道。它们具有一些基本特征：细胞形态呈球状或杆 状；过氧化氢酶为阴性；革兰氏阳性；消耗的葡萄糖5 0 以上转化为乳酸；不形 成芽抱；不运动或极少运动；分解蛋白质，但不产生腐败产物；脂肪分解能力较 弱【划。 对于乳酸菌的分类，涉及的科属种相当多，历来就存在争议，尚未有统一的 定论。一般主要包括乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 、乳球菌( t a z c t o c o c c u s ) 、明串珠菌 ( l e u c o n o s t o c ) 、片球菌( p e d i o c o c c u s ) 、链球菌( s t r e p t o c o c c u s ) 、肠球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 、双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 和肉食杆菌( c a r n o b a c t e r i u m ) 等属。 1 1 0 益生素 益生素( p r o b i o t i c s ) ，国内也有人将其翻译为“益生茵剂”。该词最早来自 于希腊语“益生”( f o rl i f e ) ，以后被以不同的方式引用。1 9 6 5 年l i l l y 和s t i l l w e l l 将“p r o b i o d c s ”描述为“原生动物产生的、对另一种原生动物生长有刺激作用的活 性物质”。1 9 7 4 年p a r k c r 将“p r o b i o f i c s 定义为“微生物和具有调节肠道菌群平衡的 山东大学硕士论文 产物”，意思是指对动物肠道菌群具有调整作用的饲料添加剂，但是该定义不够 确切，不能与预防作用的抗生素区别开来。1 9 8 9 年f u u e r 提出益生菌剂是指“一 种活的微生物饲料添加剂，具有调整肠道微生物菌群平衡的作用”，强调了“活 的细胞是其主要的有效成分，而不是产物”，因此与抗生素不同。1 9 9 2 年h a v e n a a r 等人将 p r o b i o f i c s 定义为“由单一或多种微生物组成的活菌制剂，通过改善宿主 土著微生物的生态平衡，促进动物的健康生长”，这个定义把益生菌剂的有效性 进一步扩大，除了调节肠道菌群平衡，还具有抵抗病原微生物入侵或促免疫作用。 随着对益生菌剂作用机制的阐明，其应用领域逐渐扩大，2 0 0 2 年美国食品和医药 管理局又批准益生菌剂可以应用于“功能食品和生物治疗的佐剂”等领域 ( m o r e u il2 0 0 2 ，f a d w h o2 0 0 2 ) 。 在人和动物体内外生活着大量的微生物，这些微生物数量巨大，相当于人体 细胞总数的1 0 倍。通常情况下，微生物的数量和种类相对稳定，与宿主间不停 地进行着物质和能量的交换，一方面宿主为微生物生存提供营养和条件，另一方 面微生物为宿主提供生物拮抗、免疫、维生素及食物消化吸收等多种生理功能， 这种与宿主和平相处，互为有利的共生菌群称作正常菌群。正常菌群之间，正常 菌群与宿主之间以及正常菌群与其环境之间存在的密切关系，构成了微生物生态 系统。在正常的微生态系统中，不同类群相互制约，共处于一种稳定、有序的平 衡体系中，这就是微生态平衡。在畜牧养殖业中应用的益生菌剂或微生态制剂， 主要是用来防治肠道疾病、促进动物生长。目前，商品化的益生菌剂种类很多， 乳酸菌类是主要选用的生产菌株。 1 2 乳酸菌的应用 1 2 1 乳酸菌发酵食品 乳酸菌作为一种益生菌，近些年在食品中的应用范围，不再限于传统的发酵 乳制品，应用领域不断拓展。乳酸菌发酵食品是经乳酸菌的发酵作用而制成的产 品，这类食品有如下主要特点： 2 山东大学硕士论文 ( 1 ) 提高酸度、改善风味。乳酸菌利用葡萄糖产生乳酸，乳酸本身酸味 柔和，常作为食品的酸味剂，有助于食品的消化吸收。乳酸菌发酵除产生乳酸 外，还可产生醋酸、丙酸等有机物质，与乳酸发酵时产生的醇、醛、酮等物质 相互作用，形成多种新的成味物质( h u g e n h o l t zc ta 1 2 0 0 0 ) 。此外，在发酵过程 中乳酸菌还可降解原料的异味如牛奶的腥味、大豆的豆腥味等。乳酸菌的产酸、 生香、脱异味作用，使乳酸菌发酵食品具有独特的风味。 ( 2 ) 增加养分，提高营养价值。乳酸菌在代谢过程中，可产生氨基酸、 维生素、蛋白酶等多种生物活性物质，提高食品的营养价值。 ( 3 ) 延长食品保存期，防止腐败。乳酸菌可发酵糖类物质产生乳酸，使 溶液p h 值降低，抑制食物腐败菌生长近几年的研究发现，有些乳酸菌可产 生抑菌物质，如乳链菌肽( n i s i n ) ，该多肽是国际公认的天然食品防腐剂，能 够抑制或杀死食物中的腐败菌和致病菌，因而提高产品的保存期限。 ( 4 ) 增强人体免疫力，减轻疾病。有些乳酸菌在代谢过程中可产生多种 生物活性物质，能够增强肌体免疫功能，提高其抵抗能力。 乳酸菌具有其独特的生理特点，被广泛地应用于乳制品、肉制品、果蔬制品 及谷物和饮料制品的发酵制作中。乳酸菌发酵食品属于营养保健食品，不仅具有 一般食品应有的营养和色、香、味，而且具有调节人体生理功能的作用。因此， 发展乳酸菌发酵食品符合时代要求，具有强大的生命力和广阔的前景。 1 2 2 乳酸菌在医药中的应用 乳酸菌在医药中的应用，起源于乳酸菌的食品保健作用。长期以来，保加利 亚农民制作的y o g h u r t 就是最早的乳酸菌制品。抗生素出现以前，欧美人普遍认 为发酵酸奶对便秘、细菌性痢疾、结肠炎、斯普鲁症的患者均具有或至少是暂时 的缓解作用，因此，酸奶在美、欧、曰等地盛行不衰。另一方面，抗生素在得到 广泛应用的同时给人类带来的忧虑也越来越明显，长期使用会引起肠道菌群紊乱 和失调，而且造成耐药菌株的产生。因此，乳酸菌的应用又重新开始受到临床医 山东大学硕士论文 学界的重视，对于由一些抗生素引起的顽症和毒副作用，人们试图求助于生物防 治方法，以菌治菌，重新建立起肠道正常菌群的平衡，调整肠道微生态环境，保 证人体正常生理功能，达到防病、治病、保健、延年益寿的目的 乳酸菌的产品主要以酸奶及其它的保健品形式出现，真正作为药品的菌种种 类和数量相对较少，许多临床资料直接来源于保健饮品或酸奶。除单一菌种外， 人们对混合菌种或复合菌种制剂产生很大兴趣，从微生态学理论来讲，复合菌种 更具优势，补入的混合菌种本身即可保持相对的稳定，在人体微生态环境中具有 更大的缓冲能力和适应能力，可以在肠道中立足( 黏附、定植和繁殖) ，发挥作 用。 ， 乳酸菌在医药上的应用主要集中于胃肠道，此外在泌尿生殖系统中的应用也 已引起重视。乳酸菌的生理功能主要表现在以下几点： ( 1 ) 对病原菌的抑制作用 乳酸菌对肠道病原菌有拮抗作用，它们能阻碍特定病原菌的黏附、定植和繁 殖，抑制方式一般有3 种：产生抗菌化合物、营养物质的竞争利用以及黏附位点 的竞争。 ( 2 ) 影响宿主或其它菌株的代谢活性 g o l d i n 和g o r b a c h ( 1 9 8 4 ) 证明了乳杆菌添加剂能够影响肠道菌群的代谢活性， 服用la c i d o p h i l u s ：舌m ，肠道内的b - 葡糖醛酸苷酶、硝酸还原酶、偶氮还原酶和脲 酶的酶活性受到抑制，降低了致癌物质的形成几率。 乳酸菌还可提高肠道有益酶的活性，如b 半乳糖苷酶、乳糖酶、蔗糖酶及葡 萄糖苷水解酶活性，这对减缓乳糖不适症有很好的疗效。乳酸菌还具有同化胆酸 盐和抑制胆酸生成的作用，从而降低宿主胆固醇的合成。 ( 3 ) 刺激肌体的免疫系统 乳酸菌具有增强机体免疫功能的作用。肠道菌群结构完整的动物比无菌动 4 山东大学硕士论文 物体内的吞噬细胞的活性和体液免疫水平高很多，饲喂酸奶的无菌小鼠，体内的 抗体永平明显提高乳酸杆菌，尤其是干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc 出回，植物乳 杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a m w l i m ) 能明显刺激吞噬细胞、自然杀伤细胞以及肿瘤细胞 的活性。 ( 4 ) 营养作用 乳酸菌产生的有机酸可促进对维生素d 、钙和铁离子的吸收，菌株本身还可 产生多种维生素，如硫胺素、核黄素、尼可酸、泛酸、叶酸等，当某种因素造成 菌群失调时，表现出维生素缺乏症。 ( 5 ) 减缓乳糖不适症、降低胆固醇、用于结肠癌的治疗 1 2 3 乳酸蘑在饲料中的应| 碍l 乳酸菌是健康畜禽肠道中的有益菌群，其主要作用是抑制病原微生物的生 长，产生有利于宿主代谢的酶和维生素、改善宿主的免疫反应、提高抗体水平、 增强巨噬绍胞的活性等。由于乳酸菌对畜禽的多种有益作用日益受到重视。其在 饲料中的应用是一个新兴领域，除古今中外常用的青贮饲料外，新的饲料品种不 断增加【工4 5 , 4 1 1 。 ( 1 ) 青贮饲料 青贮饲料是把青绿( 或半干) 作物秸秆粉碎成一定长度后装入青贮室( 窖) 内， 在厌氧条件下，靠乳酸菌发酵制成能长期保存的饲料h 升。青贮饲料能有效地保 存青绿植物的营养成分，保证原料青绿时的鲜嫩汁液，气味芳香，质地柔软，适 口性好，采食量大，消化利用率高。 青贮饲料能使家畜常年保持高水平的营养状态和生产水平，其主要优点如 下：能有效地保存青绿秸秆和饲料的营养成份、青贮能保持原料青绿时的鲜嫩汁 液、青贮可以扩大饲料来源、青贮是保存饲料经济而安全的方法、青贮可以消灭 害虫及杂草。青贮饲料在一年四季都可被家畜所采食，特别是对乳牛饲养业，青 5 山东大学硕士论文 贮饲料已成为不可缺少的重要饲料之一。 ( 2 ) 微生物饲料添加剂 饲料添加剂是基础日粮中的添加成分，其目的是为了平衡基础饲料所含有 的养分和成分，应用和研究较多的是乳酸菌类添加剂。当前，国内外对微生物 饲料添加剂的研究包括益生素和微生物促生长剂，二者都参与调整畜禽肠道生 态平衡，难以划分界线，学术界仍存在争论2 1 。 微生物饲料添加剂不仅具有与抗生素饲料添加剂相似的有益作用，而且无 毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境，所以微生物饲料添加 剂必将逐步发展，并得到广泛应用。 1 2 4 乳酸菌在工业乳酸生产中的应用 目前乳酸菌在发酵工业上的用途主要是生产乳酸。用于工业生产乳酸的菌种 一般有如下一些基本要求：一是同型发酵类型，即全部是由e m p 途径产生的丙酮 酸还原形成的乳酸，异型乳酸发酵不及e m p 途径高。二是营养要求简单，能够降 低成本。三是产酸迅速，缩短生产周期。四是能耐受工业过程中的高温等条件。 根据这些条件，最常用的菌种有德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、赖氏乳杆菌、植 物乳杆菌和于酪乳杆菌等。 乳酸生产菌在生理上既有相同处，也有明显的差别，当使用不同原料或采用 不同的发酵条件时，就应选用不同的菌种，再从菌种中选育高转化率的菌株，并 配以合适的工艺条件，才能高产。 1 3 乳酸菌的检测 1 3 1 检测乳酸菌的传统方法 与分析其它活菌制剂一样，检测乳酸菌类益生菌剂的经典方法包括依赖于培 养过程的平板计数法、显微镜直接计数法及测定微生物代谢产物法。这些方法对 6 山东大学硕士论文 于了解益生菌剂中细菌数量及性质具有重要作用，但存在工作量大，重复性低等 缺陷随地3 ”。 ( 1 ) 依赖于培养过程的平板计数法 该方法的主要操作步骤是：取一定量的益生菌剡与无菌生理盐水混合，进 行系列稀释，然后涂布或倾注平板，通过培养，统计平板上的单菌落数，可计算 益生菌剂中含有的活菌数量。将得到的单菌落进一步分离纯化，获得纯菌株，再 进行形态观察和生理生化特性实验，参照伯杰氏系统细菌学手册提供的方法 对菌株进行鉴定，通过系列实验可将菌株鉴定到属、种。这是测定样品含有的活 菌数和菌株鉴定的常用经典方法，实验操作简单、仪器设备要求低，一般实验室 均可进行。对于未知样品，为了保证检测微生物数量的准确性，通常使用几种培 养基和培养条件，以满足待测样品中多数微生物的生长需要。对于乳酸菌的测定， 通常选用选择培养基和厌氧条件进行培养。 ( 2 ) 显微镜直接计数法 r 嘲 利用计数板，光学显微镜下直接观察细胞并进行计数。此方法对于球形细胞 比较常用，缛到的数且是包括死细胞在内的细胞总数。为了将死菌、活菌区分开 来，常用适当的染料染色后再观察。例如用0 1 的美兰染液对酵母菌染色后，其 活细胞为无色，死细胞则为蓝色，故可分别计数；细菌经过吖啶橙染色后，在紫 外