（营养与食品卫生学专业论文）微波辅助水解制备骨胶原肽及其抗皮肤uvb损伤的研究.pdf

摘要 微波辅助水解制备骨胶原肽及其抗皮肤u v b 损伤的研究 学科、专业：医学、营养与食品卫生学入学时间：2 0 0 7 0 9 0 1 硕士研究生姓名：王洁昀答辩时间：2 0 0 9 0 7 1 7 指导教师：施用晖教授授予学位时间： 摘要 本文以猪骨胶原蛋白为原料，通过微波辅助水解法制备骨胶原抗氧化肽，优化水解 条件。通过体内实验研究水解产物对小鼠皮肤中波紫外线( u v b ) 老化损伤的修复作用、 对体内抗氧化能力及钙吸收的影响。 首先，采用微波辅助酸水解预处理及酶解相结合的水解方法，以产物的水解度及 a b t s 、d p p h 清除率为指标，通过单因素实验及正交实验优化并确定最佳微波辅助 水解条件为：采用4 m o l l 磷酸，原料与磷酸料液比1 ：5 ，微波功率5 1 0 w 下作用2 7 0 s ； 随后采用中性蛋白酶水解，前水解产物浓度4 ，酶底比4 7 6 0 u g ，反应温度5 5 1 2 ，p h 7 0 ， 水解度达到2 1 5 。与常规酶解相比，达到水解终点的反应时间缩短一半以上，产物的 a b t s 、d p p h 清除率分别提高8 7 和3 1 。 其次，以u v b 照射建立小鼠皮肤损伤模型，日粮添加不同剂量水解产物肽( 5 - 2 5 9 k g ) 饲喂八周。结果表明中、高剂i ( 1 0 - - - 2 5 9 k g ) 骨胶原肽能显著提高模型小鼠血液及皮肤中 总抗氧化能力及超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h ix ) 、过氧化物酶 ( c a t ) 活力俨 0 0 5 ) ，显著降低体内总自由基( r o s ) 水平及丙二醛( m d a ) 含量，效果略 优于o 1 硫辛酸( l a ) 。相关性分析显示各氧化指标与皮肤厚度、水分及羟脯氨酸( n y p ) 含量显著相关。研究同时表明，水解产物具有促进模型小鼠钙表观吸收率、存留率的作 用( p 0 0 5 ) ，并显著提高股骨长度及重量伊 0 0 5 ) 。 关键词：微波；水解；抗氧化；皮肤u v b 损伤；骨胶原肽 a b s t r a c t m i c r o w a v e a s s i s t e dp r e p a r a t i o no fc o l l a g e nh y d r o l y s a t e a n di t sp r o t e c t i v ee f f e c to ns k i no fm i c ei r r a d i a t e db yu v b s u b j e c t ，s p e c i a l t y ：m e d i c i n e , n u t r i t i o na n d f o o dh y g i e n et i m eo f e n r o l l m e n t ：0 1 0 9 2 0 0 7 m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：w a n gj i e y u n t i m eo fo r a ld e f e n s e ：17 0 7 2 0 0 9 f a c u l t ya d v i s e r ：s h iy o n g h u ip roftime o fc o n f e r r i n gd e g r e e ： a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , a n t i o x i d a n tp e p t i d e sw e r ep r e p a r e df r o mc o l l a g e nt h r o u g ht h em e t h o do f m i c r o w a v e a s s i s t e dh y d r o l y s i s h y d r , , o l y s i sc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d , t h ee f f e c t so ft h e h y d r o l s r s a t eo l ls k i n a n da n t i o x i d a n ts y s t e mi nm i c ei r r a d i a t e db yu l t r a v i o l e tb ( u v b ) w e r e s t u d i e dt h r o u g ha n i m a le x p e r i m e n t s a n di t se f f e c to nc a l c i u ma b s o r p t i o nw a ss t u d i e d 硒w e l l f i r s t 】t y , t h em e t h o dc o m p o s e do fm i c r o w a v e a s s i s t e da c i dh y d r o l y s i sa n de n z y m o l y s i s w a su s e df o rh y d r o l y s i s w i t i ld e g r e eo fh y d r o l y s i sa n da b t s ，d p p h + s c a v e n g i n ga c t i v i t y 器 i n d e x s ，h y d r o l y s i s c o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e dt h r o u g hs i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t s a n d o r t h o g o n a lt e s t 。w h i c hw e r ea sf o l l o w p h o s p h , o r i ca c i dc o n c e n t a t i o no f4 m o l l ，s o l i d 1 i q u i d r a t i o1 ：5 ，m i c r o w a v ep o w e r5l0 wf o r2 7 0 s ；f o l l o w e dw a sh y d r o l y s i sw i t hn e u t r a lp r o t e a s e ， p r e - h y d r o l y s a t ec o n c e n t r a t i o no f4 ，e n z y m e - s u b s t r a t er a t i o4 7 6 0 u g , ，t e m p e r a t u r e5 5 1 2 a n d p h 7 0 t h em a x i m u md e g r e eo fh y d r o l y s i sw a sa c h i , e v e d 雒21 5 c o m p a r e dw i t h c o n v e n t i o n a le n z y m o l y s i s ，h y d r o l y s i st i m ew a sd e c r e a s e db ym o r et h a n1 5h o u r s ，a b t s a n dd p p i - i s c a v e n g i n ga c t i v i t yw e r ei n c r e a s e db y8 7 a n d3 1 r e s p e c t i v e l y s e c o n d l y , u v bi r r a d i a t e dm i c es k i nm o d e lw a sc o n s t r u c t e d 硼1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e a d d i t i o no fc o l l a g e nh y d r o l y s a t ei nd i e t ( 1 0t o2 5 9 k g d i e t ) c o u l ds i g n i f i c a n t l yi m p r o v et o t a l a n t i o x i d a n tc a p a c i t y ( t o a o c ) a n da c i v i t i e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e ( 6 s h - a x ) a n dp e r o x i d a s e ( c a t ) b c , t hi ns k i na n db l o o d , p 0 0 5 ；s i g n i f i c a n t r e d u c t i o ni nr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n dm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) c o n t e n tw e r e s h o w e d 懿w e l l p o 0 5 t h er e s u l t sw e r es i m i l a r 觞0 1 l a 1 1 舱o x i d a t i o ni n d i c a t o r sw e r e s i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e d 丽t l ls k i nt h i c k n e s s ，w a t e rc o n t e n ta n dh y d r o x y p r o l i n e ( h y p ) c o n t e n t 1 1 1 er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h eh y d r o l y ：s a t ec o u l dr e s u l ti np r o m o t i o n so fa p p a r e n tc a l c i u m a b s o r p t i o nr a t ea n dr e t e n t i o nr a t ei nm i c e p 磷酸浓 度 料液比。通过方差分析，磷酸浓度、微波功率、作用时间因素具有显著性( 尸 微波功 率 作用时间 料液比。通过方差分析，磷酸浓度因素具有显著性( p 作用时间 料液比。 1 ：5 ，柠檬酸浓度 柠檬酸浓度 微波 以综合评分为评价指标的最佳水平组合为a 3 8 2 c 3 d 3 ，即料液比l ：6 ，柠檬酸浓度 1 s m o l l ，微波功率7 0 0 w ，作用时间2 1 0 s 。影响因素的主次顺序为：柠檬酸浓度 微波 功率 作用时间 料液比。 3 1 3 6 优化结果的验证 由表3 5 可知两种最佳水平组合水解产物的水解度及综合评分达到最高。 1 4 口雹q 5 4 3 2 1 o 笱 加 ：2 m 5 o 逞瓣篮磐 誉q 5 4 3 2 1 o 笛 加 ：2 m 5 0 逞诗笾蜓 结果与讨论 表3 - 4 微波辅助柠檬酸水解正交实验设计及结果 t a b 3 - 4o r t h o g o n a lt e s ta n dr e s u l t so fm i c r o w a v e - a s s i s t e dc i t r i ca c i dh y d r o l y s i s a b cd a b t s + d p p h 综合 实验号 料液比 柠檬酸浓微波功 水解时d h 清除率清除率 评分 ( g ：m l )度m o l l 1 率w间s ，1 最佳水解产物d h a b t s - + 清除率嬲d p p h 清除率燃 综合评分 3 2 预水解产物酶解条件的确定 3 2 1 不同底物及酶对酶解效果的影响 微波辅助酸水解因其作用时间短，反应迅速的特点，不失为一种良好的预水解方法。 由表3 - 6 可知，以不同微波酸水解产物为底物所得最终酶解产物的水解度及自由基清除 活性不尽相同。最终产物水解度随预水解产物水解度的提高而上升。四种预水解产物中 以水解度最高的磷酸水解d h 最佳水解产物为底物的酶解效果最佳，其酶解产物具有最 高的水解度、a b t s + 清除率，及较高的d p p h 清除率。因此选择微波辅助磷酸水解d h 最佳水解产物为进一步酶解的底物。 表3 石不同预水解产物的酶解结果比较 t a b 3 6c o m p a r i s o no fp r e - h y d r o l y s a t eu s e df o re n z y m o l y s i s 微波预水解+d h m 1 7 5 1 7 21 5 71 5 8 酶解 a b t s + 清除率慌 3 7 。63 6 。l3 2 4 3 3 6 d p p h 清除率 1 7 91 8 2 1 6 81 5 8 由表3 7 可知，酸性酶、中性酶及木瓜蛋白酶以微波预水解产物为底物酶解，所得 产物水解度及自由基清除率均高于相同条件下单独酶解。这可能因为微波辅助水解可快 江南大学硕士学位论文 速打开胶原蛋白大分子中的肽键，从而增加酶的作用位点，利于酶与底物之间的结合， 使酶解过程趋于快速和高效。同时可知，中性酶水解产物的水解度及a b t s 、d p p h 清 除率均高于其他酶解产物，酸性酶次之，木瓜蛋白酶最次，碱性酶单独酶解与经微波预 水解相比反而略降低。因此选择对酸性蛋白酶及中性蛋白酶进一步研究其水解条件。 表3 7 不同酶的水解结果比较 t a b 3 7c o m p a r i s o no fe n z y m e su s e df o rh y d r o l y s i s 3 2 2 酸性蛋白酶解条件的确定 罨 甏 2 04 0 3 5 1 8 3 0 麓静 1 2 1 0 5 l oo 1 8 9 62 5 2 8 3 1 6 0 3 7 9 24 4 2 45 0 5 6 图圈a 酐s + 清除摺盘裱清除率一_ d h ( a ) ： 4 55 05 56 06 5 温度 图墨& a b t s + 清除率口d p p h 清除率+ d h 荤 蓬 2 0 1 8 1 6 摹 1 4q 1 2 1 0 123456 【s i r e 区墨鹜a b t s + 清除率口d p p h - 清除率+ d h ( b ) 2 0 1 8 凑 1 2 1 0 2 533 5 44 5 匿图a b t s + 清除率r - - - - - 。- - idpph-清除率+dhph ( d ) 图3 - 3 各因素对酸性蛋白酶水解的影响( a ) 不同料液比对水解效果影响( b ) 不同磷酸浓度对水解 效果影响( c ) 不同微波功率比对水解效果影响( d ) 不同作用时问对水解效果影响 f i g 3 3e f f e c to fe a c hf a c t o r so nh y d r o l y s i sw i t ha c i dp r o t e a s e ( a ) e f f e c to fe n z y m e - s u b s t r a t er a t i oo n h y d r o l i s i s ( b ) e f f e c to fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no nh y d r o l i s i s ( c ) e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nh y d r o l i s i s ( d ) e f f e c to fp ho nh y d r o l i s i s 3 2 2 1 酶底比对水解效果的影响 酶的加入量增加到一定阶段，酶与底物的作用达到饱和，此时酶的增加对水解速度 影响不大，水解度变化趋于缓慢，且过高浓度的酶反而可能抑制酶解的进行。根据图 1 6 ”如筋加”m 5 o 弱如”加：2 m 5 o 站如笛加b m 5 o 述得篷旗 结果与讨论 3 3 ( a ) ，选择3 1 6 0 - - 4 4 2 4 u g 为酸性酶水解的最佳酶底比范围。 3 2 2 2 底物浓度对水解效果的影响 根据图3 3 ( b ) ，选择最佳底物浓度范围为：3 5 。 底物浓度过低，酶浓度随之下降；底物浓度过高，体系有效水浓度低，溶液流动性 下降，酶与底物发生有效碰撞的几率降低，同时过量的底物遮蔽了酶的作用位点，反应 速率减慢。这两种情况均会造成水解速率下降。 3 2 2 3 温度对水解效果的影响 在适宜的温度范围内，酶的活性随着温度上升而逐渐升高，而当温度过高，酶的活 性受到抑制，甚至失活。因此根据图3 - 3 ( c ) ，选择5 0 6 0 。c 为反应最适温度范围。 3 2 2 4p h 对水解效果的影响 根据图3 3 ( c ) ，选择酶的最适作用p h 范围为3 o 。 酶活性部位的可解离基团需要在特定的p h 范围内才能充分解离，此时酶的构象处 于活性状态。底物蛋白的构象在不同的p h 下也有不同，当p h 同时满足酶和底物的需 要，才能使酶的活性中心与底物蛋白最大程度地结合。 3 2 2 5 酸性蛋白酶酶解条件的优化 表3 - 8 酸性蛋白酶水解正交实验设计及结果 t a b 3 8o r t h o g o n a lt e s ta n dr e s u l t so fa c i dp r o t e a s eh y d r o l y s i s a b 一 a b t s + d p p h 清综合 她号嚣臀温漩揖一肾解舶鼢 1 1 ( 31 6 0 )1 ( 3 )1 ( 5 0 )1 ( 3 0 ) 1 2 32 8 31 3 97 5 3 21 2 ( 4 )2 ( 5 5 )2 ( 3 5 ) 1 3 33 2 41 3 27 9 7 31 3 ( 5 )3 ( 6 0 )3 ( 4 0 ) 1 3 52 7 51 2 07 3 7 4 2 ( 3 7 9 2 ) 1231 2 42 6 21 6 77 8 7 5223l1 4 52 6 11 3 77 7 6 6 2 312 1 5 4 3 0 8 1 1 6 7 9 8 7 3 ( 4 4 2 4 ) 1321 5 23 2 71 2 18 1 9 832131 6 63 4 41 3 78 9 2 933211 9 22 8 91 5 49 2 9 k 1 1 1 3 01 3 31 4 81 5 3 d h k 1 2 1 4 11 4 81 5 01 4 6 k 1 3 1 7 01 6 01 4 41 4 2 r a 4 02 70 61 1 k 2 1 7 6 27 8 68 1 48 1 9 综合k 2 2 7 8 78 2 28 3 88 0 5 评分 k 2 3 8 8 08 2 17 7 78 0 5 r ，1 1 83 66 11 4 正交实验结果见表3 8 。以水解度为分析指标的最佳水平组合为a 3 8 3 c 2 d 1 ，即酶底 比4 4 2 4 u g ，底物浓度5 ，温度5 5 ，p h 3 0 。影响因素的主次顺序为：酶底比 底物 浓度 p h 温度。通过方差分析，酶底比、底物浓度因素具有显著性( p 温度 底物浓度 p h 。通过方 差分析，酶底比因素具有显著性( p 底物浓度 酶底比。 以综合评分为评价指标的最佳水平组合为a 2 8 3 c 3 d 2 ，即酶底比3 8 0 8 u g ，底物浓度 5 ，温度5 5 c ，p h 7 0 。影响因素的主次顺序为：酶底比 温度 底物浓度 p h 。通过方 差分析，温度因素具有显著性p 0 0 5 ) ，而各组间体增重存在显著差异( 尸 0 0 5 ) 。 表3 1 4 水解产物对u v b 损伤小鼠体重的影响( n = 1 0 ，x x + s d ) t a b 3 - 1 4e f f e c to ft h eh y d r o l y s a t eo i lw e i g h to fu v bi r r a d i a t e dm i c e ( n = 1 0 ，x x 士s d ) 组别初始体重鹰 末体重僖 增长率脱 对照组 2 0 5 0 4 - 1 0 4 3 3 5 3 5 士2 1 6 37 2 4 4 d 模型组 2 0 5 2 4 - 1 0 4 8 3 3 3 4 士1 9 7 8 6 2 4 8 3 低肽组 2 0 3 9 4 - 1 1 0 4 3 4 7 0 - a ：2 2 8 4 7 0 18 。 中肽组 2 0 4 3 4 - 1 1 0 8 3 5 3 5 士1 8 3 8 7 3 0 3 。 高肽组2 0 4 9 4 - 1 1 8 4 3 5 6 3 4 - 2 3 2 4 7 3 8 9 l a 组 2 0 4 9 4 - 0 9 8 8 3 4 7 7 士2 3 0 3 6 9 6 9 6 注：同列不同小写字母表示差异显著( p o 0 5 ) ，以下各表同。 n o t e ：i nt h es a m et i e rt h ed i f f e r e n tl e t t e r sm e a np 0 0 5 t h ef o l l o w i n gt a b l e sr i mt h es a l n e 2 1 江南大学硕士学位论文 3 4 2 骨胶原肽对小鼠免疫器官脏器指数的影响 脾脏和胸腺是体内重要的免疫器官，胸腺为中枢器官，脾脏为外周免疫器官，与体 液免疫和细胞免疫均有密切联系。由表3 1 5 结果可知，与对照组相比，模型组脾脏、 胸腺指数显著降低( 尸 0 0 5 ) 。各胶原肽组脾脏、胸腺指数与模型组相比均有显著提高 ( 尸 o 0 5 ) ，其中中肽组的脾脏指数与高肽组的胸腺指数分别达到最高，比模型组平均分 别升高2 6 9 8 及4 9 8 0 。表明骨胶原肽可提高u v b 损伤小鼠机体免疫水平。 表3 1 5 水解产物对u v b 损伤小鼠免疫器官脏器指数的影响( n = l o ，x x 士s d ) t a b 3 - 1 5e f f e c to f t h eh y d r o l y s a t eo ni n d e xo fi m m u n eo r g a n si nu v bi r r a d i a t e dm i c e ( n = l o ，x = x 士s d ) 组别 脾脏指数m g 邸w 1 胸腺指数m g g b w l 对照组3 8 7 4 0 4 6 9 。 1 8 7 3 0 4 6 3 0 模型组3 3 9 9 4 - 0 3 2 1 4 1 5 1 2 4 - 0 2 1 0 8 低肽组4 0 2 4 4 - 0 4 6 2 1 8 2 9 4 - 0 3 0 2 b 中肽组4 3 1 6 4 - 0 2 7 5 。 1 9 2 6 o 2 4 3 0 高肽组 4 1 5 3 4 - 0 5 3 8 2 2 6 5 4 - 0 3 4 4 。 l a 组 4 1 2 6 4 - 0 4 9 1 b c2 0 9 14 - 0 4 3 8 b c 3 4 3 骨胶原肽对小鼠耳指数的影响 光照引起鼠耳表面血管充血、水肿、皮肤厚度增加，耳指数大小反映光敏反应的强 弱。图3 8 实验结果：与对照组相比，模型组耳指数显著升高俨 0 0 5 ) 。 正常组模型组低肽组中肽组高肽组l a 组 图3 - 8 水解产物对u - v b 损伤小鼠耳指数的影响( n = 1 0 ，x = x 士s d ) f i g 3 - 8e f f e c to f t h eh y d r o l y s a t eo ni n d e xo f e a rp u n c hw e i g h to fu v bi r r a d i a t e dm i c e ( n = 1 0 x = x 士s d ) 3 4 4 骨胶原肽对小鼠皮肤表面损伤的影响 在体式显微镜下观察小鼠表皮，结果见图3 9 。正常组小鼠皮肤纹理清晰整齐，表 面平整，无红肿及病理表现。模型组小鼠皮肤粗糙，颜色加深，表面出现红肿、脱屑、 7 6 5 4 3 2 l o n o o 0 o o o 兮h8s星籁茸丰时 堕墨苎望苎 乳头样增生，损伤及老化现象明显。低肽组有轻微红肿，伴随少量脱屑，较模型组有所 改善。中、高肽组及l a 组皮肤表面较为平整、光滑，局部损伤较为少见，程度较轻， 较模型组有明显改善。 田3 - 9 俸或显微镜下各组小鼠皮肤表面观察( x1 0 ，右下角字母分别表示：a _ 正常姐，嘣型姐， c _ 低雎组，n 中肤组，b 高肤纽，f - l a 组) l e i g 3 - 9 0 b 6 0 耻o f s k i ns u f f a f o r e a c hg r o u “。1 q g m “p 辜o f d i f f e n n t l e “e n ： 啪t m 啦m o d e 啦御蚰e 1j ) - 脚蜘e ，哳p 枷e ，f - l a ) 3 4 5 骨肢原肽对小鼠皮肤厚度的影响 皮肤受到紫外照射等外界刺激，上皮细胞受到损伤，表皮增生。图3 1 0 表明，与 对照组相比，模型组双层皮肤厚度显著升高( p o 0 5 ) ；而中、高肽组双层皮肤厚度分别降低1 78 5 及1 62 6 ， 显著降低表皮增生程度( p ( 0 0 5 ) 。中肽组、高肽组与l a 组相比无显著差异旧 o0 5 ) 。 目3 一1 0 水解产物时u v b 援伤小鼠双层皮肤厚度酌影响( n = l 叽i o 士s n ) f i g 3 - 1 0 e f f e c t o f f l z e h y d r o l y s a t e o qb i - f o l ds k i n t h i n l m e s s o f u v b i r r a d i a t e d m i c e ( n - l o , x ；n 、 黑慰阏圈点闲阏图土闷闲圈忐阏霞怎阏闲圈。惑圈m igg* 江雨大学硕士学位论文 3 4 6 骨胶原肽对小鼠皮肤水分含量的影响 皮肤在老化和损伤的过程中，水分逐渐流失，导致易皱褶、松弛。如图3 1 1 所示， 中、高肽组皮肤水分含量比模型组显著升高( p 0 0 5 ) 。其中高肽组为对照组的1 1 0 5 1 ； 为l a 组的1 0 7 1 1 。 6 0 逞5 5 咖 缸 求5 0 * 誊4 5 4 0 正常组模型组低肽组中肽组高肽组l a 组 图3 - 1 1 水解产物对u v b 损伤小鼠皮肤水分含量的影响( n = 1 0 ，x lx + s d ) f i g 3 1 1e f f e c to f t h eh y d r o b r s a t eo nw a t e rc o n t e n t o fs k i ni nu v bi r r a d i a t e dm i c e ( n = 1 0 ，x = x 士s d ) 3 4 7 骨胶原肽对小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响 羟脯氨酸含量是胶原蛋白的特征氨基酸，是反应皮肤衰老程度的敏感指标之一。如 图3 - 1 2 所示，低肽组羟脯氨酸含量比模型组显著升高妒 o 0 5 ) 。 而中、高肽组平均分别较模型组提高4 9 6 7 及5 1 1 3 ，差异显著( 尸 0 0 5 ) ；并显著高 于正常组( p 0 0 5 ) 。表明中、高剂量的骨胶原肽可显著提高小鼠皮肤羟脯氨酸含量。 錾s 基2 j 咖 钮1 h z 耄o 正常组模型组低肽组中肽组高肽组l a 1 1 图3 1 2 水解产物对u v b 损伤小鼠皮肤h y p 含量的影- l j ( n = 1 0 ，x x 士s d ) f i g 3 1 2e f f e c to f t h eh y d r o l y s a t eo nh y pc o n t e n to fs k i ni nu v b i r r a d i a t e dm i c e ( n = 1 0 ，x2 工士s d ) 紫外线可导致皮肤老化损伤，是皮肤衰老的重要原因之一。朱彦君等( 2 0 0 4 ) 建立无 毛鼠u v b 照射模型，2 0 周后皮肤增厚，表皮增生、伴有角化过度及角化不全。真皮水 肿，纤维母细胞增生，弥漫性单核细胞、肥大细胞、嗜中性白细胞侵润。基底膜不规则 增厚。胶原含量减少，染色变浅，胶原纤维明显变性，均质化，形成片、块状，变性的 胶原纤维延伸至真皮深层。弹性纤维增多变粗，部分增生的弹性纤维聚集、断裂、缠结 州j 。表明u v b 照射后的小鼠皮肤所发生的变化与临床皮肤光老化疾病一致。 2 4 结果与讨论 本研究结果表明，u v b 皮肤损伤模型建立成功，骨胶原蛋白水解产物可减轻小鼠 皮肤老化损伤程度，减少皮肤增厚，提高皮肤中水分及羟脯氨酸含量，说明骨胶原肽对 u v b 造成的皮肤损伤有良好的修复作用。 3 4 8 骨胶原肽对小鼠血液及皮肤生成r o s 水平及t a o c 的影响 由表3 1 6 可知，与正常组相比，模型组的血液及皮肤r o s 水平显著升高俨 o 0 5 ) ， t - a o c 含量显著降低( p 0 0 5 ) 。日粮中添加骨胶原肽后，血液及皮肤r o s 水平依剂量 显著降低( 尸 o 0 5 ) ，其中高肽组的全血r o s 水平显著低于中、低肽组俨 o 0 5 ) ；皮肤r o s 水平显著低于l a 、中、低肽组泸 0 0 5 ) 。高、中肽及l a 组血清及皮肤t - a o c 值接近，且均显著高于模型、低肽 组妒 0 。0 5 ) 。添加骨胶原肽对血液、皮肤自由基及抗氧化能力作用与l a 的作用一致。 皇 表3 1 6 小鼠血液及皮肤中r o s 水平与t - a o c 的测定结果( n = l o x 。x 士s d ) t a b _ 3 1 6r e s u l t so fr o sa n dt - a o co fb l o o da n ds k i ni nm i c e ( n = 1 0 ，x x 士s d ) 组别r o s 水平c d 江，1t - a o c u n i t m g p r o f l 全血皮肤血清皮肤 正常组 5 5 9 5 士3 1 5 8 5 0 7 4 士5 4 5 0 曲2 2 5 4 - 0 1 5d0 4 5 ：生- 0 0 2 。 模型组7 3 3 0 4 - 2 9 1 。6 8 5 4 + 2 5 5 0 0 1 1 4 4 - 0 1 2 30 2 8 4 - 0 0 3 8 低肽组 6 9 4 5 4 - 3 0 6 d 6 1 9 3 4 - 1 8 6 0 c1 4 5 4 - 0 1 6 。0 3 3 ：圭- 0 0 3 。 中肽组 6 5 4 9 4 - 3 2 4 。5 2 5 0 a ：3 7 7 0 b1 8 3 士- 0 11 。0 4 1 4 - 0 0 2 0 高肽组 6 0 9 2 4 - 3 6 2 “4 8 7 6 + 4 3 2 0 81 9 5 士0 1 4 。0 4 1 4 - 0 0 2 4 l a 组 5 9 4 6 士4 6 1 0 5 2 8 9 4 - 3 5 2 0 b1 8 9 4 - 0 1 2 。0 3 8 ： 0 0 2 。 3 4 9 骨胶原肽对小鼠血清及皮肤中s o d 、g s h p x 、c a t 活力的影响 在日粮中添加骨胶原肽可提高小旧损伤小鼠皮肤中s o d 、g s h - p x 、c a t 等机体 抗氧化体系中相关酶的活力。 图3 1 3 表明，模型组和低肽组皮肤s o d 活力均显著低于正常组p o 0 5 ) 。中、高 肽组s o d 活力接近，均显著高于模型组、低肽组、l a 组口 0 0 5 ) ；显著高于l a 组妒 o 0 5 ) 。中、高肽组各指标与正常组 差异均不显著沪 0 0 5 ) 。 表3 1 7 小鼠血清及皮肤中g s h - p x 及c a t 活力测定结果( n = 1 0 ，x x 士s d ) t a b 3 1 7r e s u l t so fg s h - p xa n dc a ta c t i v i t yo fs e r u ma n ds k i ni nm i c e ( n = 1 0 ，x - x 士s d ) 组别g s h p x 活力c a t 活力 血清u m l 1 皮肤u m g p r o f l 血清u m l d 皮肤u m g p r o f i 正常组 1 9 4 8 士6 o o3 5 3 8 士3 0 5 03 0 2 - 士0 4 2 。2 4 l 士o 3 5 曲 模型组 1 7 5 0 士1 0 4 32 9 6 8 + 2 9 6 42 1 l i - 0 2 8 81 9 蛀0 4 0 4 低肽组 1 8 0 8 士1 3 5 33 0 5 1 土3 5 1 4 2 6 3 士- 0 3 6 5 2 3 1 士0 3 1 曲 中肽组 1 8 8 o 圭7 0 63 3 1 0 士2 3 1 曲 2 9 4 士0 2 7 。2 3 4 士0 3 8 曲 高肽组 1 9 0 1 士4 2 b 3 4 5 6 - 士2 9 7 “2 9 1 士- 0 2 8 。2 7 8 - 士0 4 2 6 l a 组 1 9 0 0 士4 3 63 4 6 3 士2 6 5 62 8 7 1 - 0 1 9 2 6 3 i - 0 6 0 b 3 4 1 0 骨胶原肽对小鼠血清及皮肤中m d a 含量的影响 如表3 1 8 ，模型组小鼠皮肤及血清中m d a 含量明显高于正常组口 o 0 5 ) ；比低肽组降低1 4 7 ( p 0 0 5 ) 。模型组小鼠皮肤m d a 含量高出正常组 9 0 1 0 ( p 0 0 5 ) 。中肽组皮肤m d a 含量较模型组与l a 组分别降低3 3 1 6 及 1 4 2 5 ( p o 0 5 ) 。 表3 1 8 小鼠血清及皮肤中m d a 含量测定结果( n = 1 0 ，x x 士s d ) t a b 3 1 8r e s u l t so fm d ac o n t e n to fs e r u ma n ds k i ni nm i c e ( n = 1 0 ，x = x + s d ) 正常组 3 7 9 i - 0 3 9 8 0 6 1 i - 0 0 6 a 模型组 5 0 9 - i - 0 5 6 。1 1 5 士- 0 1 7 e 低肽组4 9 2 i - 0 4 0 。 1 0 1 士- 0 11 8 中肽组4 2 7 i - 0 4 3 6 0 7 7 士- 0 1 0 6 高肽组4 2 2 士0 3 1曲085+007 l a 组 4 1 9 - 1 - 0 3 4 6 0 9 0 - 土- 0 1 0 。 长期u v b 照射造成小鼠体内自由基水平显著升高，引起机体氧化应激，使血液及 皮肤中血清及组织中的s o d 、g s h p x 、c a t 等抗氧化相关酶的活性受到显著的影响， 导致t - a o c 下降。同时自由基攻击细胞膜上多不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化产物m d a 含量升高等一系列不良反应。王奕等( 2 0 0 8 ) 以风味酶水解日本刺参胶原，产物具有较高 的体外抗氧化活性，将其以2 5 、5 0 、1 0 0 m g k g 剂量灌胃紫外线诱导的光老化模型小鼠， 发现与模型对照组比较，剂量组小鼠血清s o d 、g s h p x 和c a t 活性分别平均增加了 1 6 9 、4 3 7 和3 2 1 ，m d a 含量平均降低了1 2 3 。皮肤组织中s o d 、g s h p x 和 c a t 活性分别平均增加了2 1 8 、3 2 4 和4 4 8 ，m d a 含量降低了3 4 7 纠6 1 】。林琳 等( 2 0 0 6 ) 采用1 0 0m g ( k gd ) 鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物灌胃d 一半乳糖致衰老的模型小鼠， 结果与讨论 鱿鱼皮胶原蛋白多肽分子量小于2 0 0 0 d a 组分对o - 之和o h 具有较好的清除效果，该活 性多肽组分可以提高小鼠血液及皮肤中s o d 和g s h - p x 的活力，降低m d a 含量，并能 提高小鼠皮肤组织中h y p 的含量。鱿鱼皮胶原蛋白水解肽在试验动物体内与肌肽具有同 样的抗氧化作用【6 2 】。 本研究结果显示本研究的制备方法所得骨胶原肽可降低体内自由基水平，说明其具 有抗自由基产生及清除自由基的作用；各抗氧化相关酶活力升高，说明在当时氧化应激 状态下，机体抗氧化系统正处在活跃阶段，有较强的清除自由基的能力；t - a o c 升高， 说明机体防御体系的酶系统与非酶系统发挥了良好的抗氧化作用；m d a 含量降低，说 明组织细胞损伤程度下降。因而，骨胶原蛋白水解产物具有较强的清除体内自由基、减 轻氧化应激损伤的作用。 3 4 1 1 皮肤中各抗氧化指标与皮肤相关指标的相关性分析 对皮肤各指标分析结果显示，皮肤厚度与r o s 水平、t - a o c 、s o d 、g s h p x 活力、 m d a 含量相关性极显著( p o 0 1 ) ，皮肤水分含量与r o s 水平、t - a o c 呈显著相关 口 o 0 5 ) ，皮肤羟脯氨酸含量与r o s 水平、t - a o c 、s o d 、c a t 活力、m d a 含量呈极 显著相关( p 0 0 1 ) ，如表3 1 9 ，说明指标间相互影响明显，相关系数大小表明指标问影 响程度高低。其中皮肤厚度与m d a 相关系数达到0 8 1 ，表明氧化损伤产生的脂质氧化 物与皮肤增厚、炎症有直接关系。机体抗氧化体系状态与皮肤状态极显著相关，骨胶原 肽修复皮肤损伤的能力极有可能源于其体内抗氧化活性。 表3 1 9 小鼠皮肤中各抗氧化指标与理化指标相关性分析结果( x 士s ) t a b 3 1 9t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ni n d i c a t o r so ns k i ni nm i c e ( x 士s ) 注：宰表不相关性显著妒 0 0 5 ) ，表示相关性极显著p 0 0 1 ) 。 n o t e ：幸m e a n sp 0 0 5 ，w h i l e m e a l l sp 0 0 1 3 4 1 2 骨胶原肽对u v b 照射小鼠股骨参数及钙代谢的影响 紫外照射可促进皮肤的7 脱氢胆固醇转化为维生素d 3 ，促进钙吸收及骨骼生长。 但同时，由于大剂量紫外照射可导致体内自由基大量生成，从整体、细胞和基因不同水 平层次上影响骨的代谢过程，影响骨骼生长发育。胶原蛋白是骨构成过程中重要组成部 分，自由基可以破坏其形成，导致骨中钙、磷、镁、锰等元素流失，造成骨质疏松。 由图3 1 4 及3 1 5 可知，模型组与正常组差异显著伊 o 0 5 ) ，u v b 照射增加了小鼠 的股骨长度及重量。摄入不同剂量的骨胶原肽均有利于骨骼的生长，图中显示中肽组股 骨长及股骨重