（有机化学专业论文）磷酰化氨基酸的合成及性质研究.pdf

摘要 磷酰化氨基酸作为“微型化活化酶”，对解释一些生命现象、了解酶的作用 机制和探讨生命起源等具有重要意义，同时在生物技术、医药等领域也展示着越 来越广阔的应用前景。本论文分别运用了两种合成方法对二十种常见氨基酸进行 了磷酰化研究，改进了磷酰化氨基酸的制备及纯化方法。 方法一：运用赵玉芬教授研究小组改迸的a t h e r t o n t o d d 反应首次比较全面 地合成了，二+ 1 种磷酰化氨基酸。在实验过稃中通过优化反应条件和纯化条件，提 高了产率。合成路线如下： 黔蟊啦n 一柚哪! _ e t 3 n ：c c i 4 e t o w h 2 0 ，i - p r o 、，。i - n h l h 蔓删 融偈n 一舳一o n 两r 一冲h 一枷删 方法：运用n a c l 0 法对二十种常见氨基酸的磷酰化进行了普适性研究。 以亚磷酸二异丙酯为磷酰化试剂、次氯酸钠为氯代试剂首次对2 0 种常见的n 一氨 基酸进行了磷酰化。通过添加适量四丁基溴化铵为相转移催化剂，使用过量的 亚磷酸二异丙酯以补偿其在强碱环境中的水解，从而提高了反应产率。同时又利 用正交实验对磷酰化丙氨酸的n a c i o 方法的合成条件进行了较为深入的探讨， 发现反应温度、反应时间、p h 、相转移催化剂的用量对产率有较大的影响；反 应物物质的量比，萃取溶剂的选择和酸化时的酸度选择对产率有一定的影响；探 索了相对可能比较适合“规模化生产”的合成条件。 合成蹄线如下： 一奠且。h 秽 c 虬 1 所得_ 二f 。种磷酰化氨基酸均经氧谱、碳谱、磷谱、红外、旋光和质谱几 个方面对其进行了结构鉴定，并分析了谱图规律，进一步完善了熔点、旋光度、 红外、核磁和质谱数据。 2 利用培养单晶的方法来辅助对其结构进行较为深入地了解，得到了i 个 啦晶，并对其晶体结构进行了分析。 3 利用电喷雾离子阱质谱对环糊精和n 二异丙氧磷酰化氨基酸的作用进行 了探索。结果发现：b 环糊精能够催化n - 二异丙氧磷酰化氨基酸的水解反应， 并对d 一环糊精刺n - 二异丙氧磷酰化氨基酸的水解反应机制进行了推测。而且对 p 一环糊精和n 一二异丙氧磷酰化氨基酸以及氨基酸形成的复合物进行了c i d 裂解 研究，发现二者具有不同的裂解规律。 关键词：n 一磷酰化氨基酸、合成、结构、性质、合成条件、晶体、质谱、d 一环糊精、催化 a b s t r a c t t h er e s e a r c hs h o w st h a tp h o s p h o r y la m i n oa c i d sc o u l da c ta sa c t i v e m i n i e n z y m e f o rs o m ed e g r e e o b v i o u s l yt h es t u d i e so nt h ep h o s p h o r y la m i n ow i l lg i v e h e l pi nt h e p r o c e s so fr e a l i z i n gs o m el i f ep h e n o m e n o n ，m e c h a n i s m ，a n de x p l o r i n gt h eo r i g i no f l i f e m e a n w h i l e ，m o r e a n dm o r e a p p l i c a t i o np r o s p e r i t i e s a r e b e i n g s h o w n b y p h o s p h o r y la m i n oi nt h e i ra p p l i c a t i o n st on o l o g i c a lt e c h n o l o g ya n dm e d i c i n ef i e l d s i nt h ew o r kd e s c r i b e di nt h i s p a p e r , t w o m e t h o d sf o r s y n t h e s i z i n g 2 0k i n d s p h o s p h o r l a t e d a m i n oa c i d sw e r e s t u d i e d ，a l s o t h em e t h o d sf o r p r e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o nw e r e f d r t h e ri m p r o v e d m e t h o d1 ：2 0k i n d so f p h o s p h o r y la m i n oa c i d sw e r es y n t h e s i z e db yam o d i f i e d a t h e r t o n t o d dm e t h o dp r o p o s e db yp r o f e s s o rz h a o g o o dy i e l dw a so b t a i n e d 1 h e s y n t h e s i sr o u t ei ss h o w n b e l o w ： 冲r 0 乳+ 。，n l 。一l 一。! ：! ! 掣竺! ! 竺竺型呈! 竺，i r r e i n h 一埋一。h i p r o ，二p h + h 2 n c h c o h _ i _ 矗趸- 1 _ 。：+ i p r o ，p n h a 1 一c o h m e t h o d2 ：t h ea i mo ft h i s s t u d y i st of i n di fn a c i om e t h o dc o u l db e s u c c e s s f u l l yt oa p p l yt o2 0k i n d so fp h o s p h o r y la m i n o a c i ds y n t h e s i s i nt h i st h e s i s ，2 0 k i n d so fc o l l m o na m i n oa c i d sw e r ep o s p h o r y l a t e df o rt h ef i r s tt i m e b yu s i n g d i i s o p r o p y lp h o s p h i t e a n dn a c i oa s p h o s p h o r y l a t e da g e n t s g o o dy i e l d s w e r e o b t a i n e db y a d d i n ga p p r o p r i a t et e t r a b u t y l a m m o n i u mb r o m i d ea s p h a s e t r a n s f e r c a t a l y s t , a n d a l s o b ya d d i n g e x c e s s i v e d i i s o p r o p y lp h o s p h i t e t o c o m p e n s a t e t h e c o n s u m p t i o n c a u s e d b yh y d r o l y s i s u n d e rb a s i cc o n d i t i o n m e a n w h i l e ，t h e t e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so f n a c l o m e t h o dw e r ef u r t h e rd e e p l ys t u d i e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t t h ee x p e r i m e n t s h o w st h a tt h e y i e l d s w e r ea f f e c t e dn o t o n l yb y p r o p o r t i o no f r e a c t i o nm a t e r i a l s ，s e l e c t i o no fe x t r a c t i o na g e n t ，b u ta l s ob yf i n a la c i d i t y o fr e a c t i o ns o l u t i o nf o rs o m ed e g r e e f i n a l l yr e l a t i v e l y s u i t a b l ec o n d i t i o n sf o r p r o d u c t i o nw e r eo b t a i n e d _ p r o 、曰平 竹川+ h 2 n c h 1 t h es t r u c t u r e so fa l it h et a r g e tp r o d u c t sw e r ee l u c i d a t e da n dp r o v e db y1 h n m r ”cn m r “pn m r i r ，o p t i c a lr o t a t i o na n de s i - m s ，a n da l s oa l lt h e r e l a t i v es p e c t r u md a t aw e r ec o n s u m m a t e d 2 t h r e ec r y s t a l so f p h o s p h o r y la m i n oa c i d sw e r eo b t a i n e d ，a n dt h e i rs t r u c t u r e s w e r ef u r t h e rc o n f i r m e db y x - r a yd a t a ， 3 a q u e o u s s o l u t i o n s c o n t a i n i n gn - d i i s o p r o p y l o x y p h o s p h o r y l a m i n oa c i d s ( d i p p a a ) a n dp c y c l o d e x t r i n ( p c d ) h a v eb e e na n a l y z e db yu s i n ge l e c t r o s p r a y i o nt r a pm a s s s p e c t r o m e t r y ( e s i - m s ) i nc o n j u n c t i o n w i t ht a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( m s m s ) t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp - c d c o u l dc a t a l y z eh y d r o l y s i s 。拶 一 r e a c t i o no fd i p p a at o p r o d u c ef r e e a m i n oa c i d s ( a a ) d i p p a aa n d1 3 - c d c o u l df o r m1 5 - c d d i p p a a c o m p l e x i nt h ea q u e o u ss o l u t i o na m i n oa c i dr e s u l t e d i nt h e h y d r o l y s i sp r o c e s sw e r ea l s oo b s e r v e dt of o r mt h e s i n g l yc h a r g e d 1 ：1 ( p _ c d a a ) c o m p l e x e sw i t hb - c d t h ec a t a l y z e dm e c h a n i s mo fh y d r o l y s i s r e a c t i o nw a sa s s u m e d b y t h er e s u l t s k e y w o r d s ：n 。p h o s p h o r y la m i n oa c i d ，s y n t h e s i s ，s t r u c t u r e ，p r o p e r t y , t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n ，c r y s t a l ，e s i ，1 3 - c d ，c a t a l y s i s 部能大学舂m 化学专业硕士学位论文 纯学生物重点实验室 i i 磷酰化氨基酸 第一章前言 在生命化学中，磷和氨基酸具有重要地位。目前，在生命过程中还未发现不 含磷的生命体。在人体中磷的含量大约占元素总量的1 ，占d n a 分子量的9 【”。 磷之所以是生命过程中的重要元素，是蚓为绝大多数酶的催化反应是以它们的磷 酰化和去磷酰化来调控的；生物体所需能量的基本储存单元a t p 参与了生命化 学过程中的几乎每一个反应，新陈代谢过程常以含磷衍生物为中间体而进行。而 氨基酸是与生命起源和生命活动密切相关的蛋白质的基本组成单位，是合成人体 激素、酶和抗体的原料，参与人体新陈代谢和各种生理活动，在生命中显示特殊 作用。几乎所有的细胞活动皆是靠蛋白可逆磷酰化来调控的【2 】。尽管已有许多有 关化学进化过程的研究报道，但关于早期地球上蛋白质的形成与磷和氨基酸的内 在联系的研究并不多，诸如天然蛋白质的骨架为什么仅由n 一氨基酸组成等问题 也未得到很好解释。正是考虑到氨基酸是前生命化学进化中的关键分子，而磷对 现存生命活动调控起中心作用，故此我们把磷和氨基酸的有机结合物一磷酰化氨 基酸作为研究对象。经过2 0 多年的研究表明，生命起源可能与n 磷酰化n - 氨 基酸的进化有密切关系，并提出了磷酰化氨基酸是核酸和蛋白质共起源的学说。 1 2 磷原子的电子排布及化合物的配位特点 生物化学的发展已经揭示出生物体无论从构造及功能均离不开含磷化合物 以及磷酰基转移反应的参与。如果能从根本上认识这些生物化学反应的机理，对 于人类理解生命现象的本质，防治疾病和协调人与自然的关系大有裨益。诺贝尔 奖获得者，著名核酸化学家t o d d 曾指出：“磷是寻找生命的唯一标识! ”1 ，1 9 8 7 年，著名有机化学家w e s t h e i m e r 教授则提醒科学界应注意：“为什么大自然选择 了磷? ”1 4 1 。 磷元素在生物体内的特殊作用与磷原子的核外电子排布是密切相关的。让我 们先看一下磷原子的核外电子排布：l s 2 2 s 22 p 63 s 23 p 3 ，在外层有三个未成对的 电子和5 个3 d 空轨道，共有5 个价电子；而磷的电负性为2 1 ，与氢相等，即磷 l 郑抽大学确杭化学专业硕十学位论史 化学生物蕈点实验室 原子核对价电子的吸引电予能力适中，因此，磷外层电子从3 s 一3 d 的激发活化 能为1 6 5 e v ， 比相应的氮化物的2 2 9 e v 要低，因而磷原子可利用其3 d 窄轨道 参与形成杂化轨道。当磷与其它原子成键时，磷原子可分别用s p 3 d 、s p 3 d 2 杂化 轨道生成五、六配位磷化合物【5 。 生物体内的磷虽然以四配位形式存在，但从1 9 6 8 年，w e s t h e i m e r 在研究环 磷化合物水解时提出了反应是经过五配位磷过渡态的假说后f 6 l ，人们相继发现了 许多生化反应包括磷酸单酯的水解【7 j ，如蛋白质的去磷酰化反应，磷酸二酯的水 解如c a m p 水解【8 】r n a 的水解9 圳1 ，r i b o z y m e 自剪接反应等 1 0 l 均涉及到五配 位磷作为中间体的反应机理。7 0 年代r a m i r e z 等人成功地合成了一系列五配位 磷化合物 ，并提出了磷的两种立体构型( 图1 1 ) 。 s p e 卜小d a _ p - lo b t b p 幽1 1 五口e 位磷化合物的两种构型 多数五配位磷化合物是以s p 3 d z 2 杂化轨道形成的五个。键，呈三角双锥型 ( t r i g o n a lb i p y r a m i d a l ，简称t b p ) 少量以s p 3 d x 2 _ y 2 杂化的五个键形成四方锥形 ( s q u a r ep y r a m i d a l ，简称s p ) 。 近年来一系列具有稳定结构的五配位磷化合物从7 0 年代起也得到合成，而 目化学性质稳定，有些已得到单晶 4 6 1 。但无环的六配位磷化合物只能存在于溶液 中，迄今还没有分离出来，五、六配位化合物通称高配位磷化合物。 由于磷能够生成高配位化合物，磷酰基参与的反应，机理就比碳酰基的要复 杂得多。在涉及磷酸化蛋白的反应中，多个氨基酸残基的侧链可通过蛋白质在空 间上的折叠作用而接近，能够同时与磷成键形成高配位磷中间体或过渡态，从而 形成以磷为中心的酶与底物的结合；并且通过假旋转后选择性断健而发生磷酰基 的迁移反应。 郑姐大学自机化学专监酿量学位论文 化学生物蕈点实验章 1 3n 磷酰化氨基酸模型的提出 由于蛋a 质分子量大，空间立体结构复杂，反应涉及到的因素很多，直接研 究磷酰化蛋白的作用 ) t s j 在技术上困难较大，有必要设计出模型化合物来简化研 究。赵玉芬院士及其领导的科研小组在多年的研究基础上，提出了n 磷酰化氨 基酸这一模型化合物( 图1 - 2 ) 。从结构上看，该分子中同时含有磷酰基和羧基， 一- 十个磷酰化氨基酸小分子包含了磷酰蛋白的全部官能团，因此可以称作磷酰蛋 白的最简模型，这一模型可用来研究磷酰基、羧基及侧链官能团之间相互调控的 基本化学规律。此外，n 一磷酰化氨基酸分子i | 1 i 磷酸二酯及氨基酸的共同存在也为 研究蛋白质与核酸的f = | j 互作用提供了一个基本模型u 2 。研究结果表明，在分子内 羧基的催化下，n 磷酰化氨基酸分子中的磷酸二酯可发生磷上酯交换反应，而该 反应正足核酸切割与连接的本质反应。 厂n a 、 y e t o b u o i p r o ) ，n 二甲 氧基磷酰氨基酸甚至难于被纯化。而若将氨基酸的羧基酯化后再合成磷酰化氨基 酸酯，则该类化合物不再具有磷上酯交换及成肽等性质，并且即使加入少量冰乙 酸也不能发生反应。因此该反应是一个分子内羧举和磷酰基同时参与的自身活化 反应。 磷酰化氨基酸自身活化反应机理： 根据磷酰基与羧基相互活化的实验事实可以推断，反应可能经历了分子内磷 碳混酐结构的五配位磷化合物中间体( 图l - 4 ) 。 k ，一f ：嘲驭：1 罡h 2 0 纛7 懈l 6 j 成酯 i 割1 4 磷酰化氨基酸活化反应机理 为了证实上述反应机理的可能性，王倩等 3 6 1 利用硅醚化的氨基酸与磷酰氯反 应，观察到了一系列五配位磷化合物的信号。( 图1 5 ) + 鬣禚x q x 背h c 0 2 s i m 卜 图1 5 五配位磷化合物的合成 通过反应跟踪，测定了五配位磷化合物的生成速率常数，结果发现，五配位 郑地大学确机化学专业顿| i 学位论文化学生物重点实验室 磷化合物生成速度的快慢顺序与磷酰化氨基酸活化反应速率恰好一致35 1 。由 此说明假设的五配位混酐中间体的反应机制是正确的，它的生成速度决定了磷酰 化氨基酸活化及水解反应的速度。 磷酰化脯氨酸由于存在环状刚性结构而不能生成五配位磷化合物；磷酰化甘 氨酸则在四、五配位磷化合物唰存在平衡，浓度比为1 ：3 。因此，这两种磷酰化 氨基酸的活化反应速度最慢，产物也较简单。至于侧链官能团对活化反应的催化 作用，h i s 中咪哗可能是起稳定五配位磷中间体作用；s e r 、t h r 中羟基则可以与 磷结合而生成第二种五配位中间体，这已由试验证实( 图1 6 ) ；对于a s p 、g l u 、 c y s 的活化机理还需进一步研究。 0 h h 2 0 h p e n t a c o o r d i n a t ei p e n t a c o o r d i n a t ei i 蚓1 6 磷酰化丝氨酸的硼种五日d 位磷中间体 1 5 1 2 氨基酸侧链对水解及活化反应的影响 通过3 1 p - n m r 磷的积分对于n 一磷酰化氨基酸进行定量跟踪研究表明，该类 化合物的水解及丁醇中的自身活化反应均为动力学准一级反应盼3 5 1 o 通过测定 t 1 n c 的工作曲线，可求出反应速度常数k 及半衰期t l ，2 。结果发现磷酰化氨基酸 自身活化反应速度由快到慢大致可分为三组，h i s ，c y s ，s e r ，t h r ，a s p ，g l u 等包含侧链咪唑、羟基、羧基和巯基等官能团的氨基酸活性最高：g l y ，p r o 反 应最慢，它们一个为无侧链氨基酸，另个为环状氨基酸。其余侧链主要由非极 性基团构成的氨基酸，反应活性居中。由此可见，磷酰化氨基酸的侧链极性基团 参与了自身活化及水解反应。 1 5 2n 磷酰化氨基酸的生化性质 n 磷酰氨基酸除了其多样的化学性质之外，还有广泛的生物活性。单个的磷 酰化氨基酸也具有很重要的约理和生理功能。如n 一磷酰化天冬氨酸及盐用来治 7 o 彳 u高 o i p i n b。鞑峨 辩地大学舂祝化学专韭颧士学位 宅文他学生物藿点实验毫 疗神经衰弱和体虚；n 一磷酰化组氨酸和n 磷酰化赖氨酸及盐有防衰强心的功效； n - 磷酰氨基酸对胰蛋白酶具有一定的抑制活性，并且，其抑制效果随着氨基酸 种类的不同而不同；部分n - 磷酰氨基酸( 磷酰化组氨酸、磷酰化半胱氨酸等) 对 r n a 和d n a 有切割作用，在此基础上可望将其发展成为一种人工酶。 1 6 磷酰化氨基酸的合成方法 磷酰化氨基酸的合成方法目前主要有： ( 1 ) p o c i 3 法 在过量的m g o 和胺的水溶液中，滴加p o c l 3 的四氯化碳溶液，可以得到磷 酰胺的镁盐( 方法1 a ) 4 1 “6 “7 2 r n h 2 + 2 p o c l 3 + 5 m g o 一2 r n h p ( o ) 0 2 m g + 3 m g c l 2 + h 2 0 f l a ) 这方法已用于合成多种磷酰氨摹酸和小肽，对酪氨酸、半胱氨酸，反应同时 在氨基、羟基和巯基上进行，组氨酸得n h 2 和n h 、赖氨酸的c 1 和g - 氨基都可 以磷酰化，采用赖氨酸和精氨酸得铜螯合物只得到末端胺及磷酰化产品 4 9 i 。这个 反应的产率很低，对目氨酸产率大约为5 0 ，但对其他氨基酸产率就低得多。须 将m g o 换成碱性较强的n a 0 h ，产率町以得到提高。( 方法l b ) r n h 2 + p o c l 3 + 5 n a o hr n h p ( 0 ) ( o n a ) 2 + 3 n a c i + 3 h 2 0 ( 1 b ) 将p o c l 3 与保护了氨基的氨基酸反应就能得到纯粹的0 一磷酰化产物 p o lc 睁a o p ( i o ) c 1 2 ( 1 c ) 【5 0 】 h ，0 li h 2 0 。h 亡l l h c l c t p ( o ) ；z 景 一州h ) 2 ( 1 d ) 1 5 ” 典型的反应条件为2 h r 6 0 。c ，8 5 磷酸，或者不要溶剂。用h 2 0 终止反应后 用酸水解防止任何聚磷酸酯的形成，产率7 7 9 6 。 也可以加入n a o h 中和反应生成的h c l ( 方法l e ) 吲： 却瓣大学有机他学专业磺： 学位母2 - 化学生物重点实验室 r o h + p o c l 3 + 5 n a o h r o p ( o ) ( o n a ) 2 + 3 n a c l + 3 h 2 0 ( 1e ) 如果不保护氨基，反应后必须用酸去掉p - n 键，才能得到单一的o 磷酰化 产品。 此方法的优点是反应后可以直接得到磷酸单酯( r o ) p ( o ) ( o h ) 2 和磷酸酰胺 r n h p ( o ) ( o h ) 2 ，不必通过磷酸酯r x p ( o ) ( o r ) 2 降解的步骤，使所得到的磷酰氨 基酸更接近天然存在的形式。但反应的产率低和反应剧烈也很难克服，而目以前 所做的工作都小是很彻底，产物的鉴定缺乏足够的数据，此方法有待进步改进。 ( 2 ) 二烷基或二芳基磷酰氯( r o ) 2 p ( o ) c i 法 ( r o ) 2 p ( o ) c 1 直接与胺反应就得n - 烷基或二芳基磷酰氨基酸( 方法2 a ) t 5 习 r n h 2 + ( r o ) 2 p ( o ) c 1 + r ”3 n r n h p ( o ) ( o r ) 2 + r ”3 n h c l( 2 a ) 反应产率较好，7 0 - 8 0 左右，但是反应需要将氨基酸变为酯在有机溶剂中 磷酰化；氨基酸中若并存在自由o h ，s h 和n h 基团，只用l e q 的磷酰化试剂， 都只在q - n h 2 上发生磷酰化反应；l y s 和a r g 的磷酰化在a - n h 2 和末端n h 2 上均 能发生。 同p o c l 3 一样，( r o ) 2 p ( o ) c 1 在碱存在下也能与羟基发生反应e 成磷酸酯( 方 法2 b ) 【5 4 】，氨基酸中的氨基也需要保护起来。 r o h + 1 - ( r o ) 2 p ( o ) c l + 3 n r o p ( o ) ( o r ) 2 + r ，3 n h c l( 2 b ) 若r 为苄基，反应温度最好在0 以f ，因为二苄基磷酰氯很活泼，如果反 应后长时间不处理，就会生成少量的聚磷酸酯( r o ) p ( o ) ( o r ) o p ( o ) ( o r ) 2 ( ) ， 当苄基的对位被硝基取代后，活性大大降低，若在反应中加入眯唑，将酰氯转化 为磷酰咪唑中f 自j 体，反应进行的较好【5 5 。8 h x 寸( i p r o ) 2 p ( o ) o ( i p r o ) ：! p ( 0 ) f 的活性 较低。 f r o ) ：! p ( o ) c 1 既可与n h 2 ，o h 反应生成p - n ，p - o 键，也能与羧酸或羧酸 的银盐反应生成混合酸酐，成为另一种形式的磷酰氨基酸( 方法2 c ) 【5 6 】： r c o z a g + ( r o ) 2 p ( o ) c 1 一r c 0 2 p ( o ) ( o r ) 2 ( 2 c j 郑蛳大学袁视化学专监碗上学位论文 他学生物晕| 蠢蛮验摩 这种混合酸酐为一透明的，比重很大的油，由于吸湿性较高，产品不易分离 纯化，反应产率般较低。 将以上得到的各种磷酸酯r x p ( o ) ( o r ) 2 t 通过氢解或水解即可得到与天然 存在的磷酰氨基酸一样形式的r x p ( o ) ( o h h 。 当r 为苯基和苄基时，很容易用铂和钯催化氢解除去。例如n 二苄基磷酰 氨基酸酯可用p d c 催化氢解，氢解产率为7 2 7 8 ( 方法2 m 【5 3 】： r n h p ( o ) ( o c h 2 p h ) 2 + 2 h 2 旦l r n h p ( o ) ( o h ) 2 + 2 p h c h 3 ( 2 d ) 如果最终产品为n 一磷酰自由氨基酸，可以用两种方法得到，第一种方法是 磷酰氨基酸酯在醇的氢氧化钠溶液中氢解，在磷酸酯氢解的同时羧酸酯电可以皂 化，一步得到n 磷酰自由氨基酸；若羧基保护基为苄基，则可以采用第二种方 法，即氢解同时除去三酯，但是这种方法的产率较低，因为自由羧基有利于分子 内的降解反应。方法2 d 也用于p 一碘苄基或p 一硝基苄基酯的降解。 o 一磷酰氨基酸、酯和羧酸一磷酸混合酸酐的降解同氢解n 一磷酰氨基酸酯一样， 用p d c 催化氢解即可得到产物陋5 7 1 ： r c 0 2 p ( o ) ( o c h 2 p h ) 2 + 2 h 2 至l r c 0 2 p ( o ) ( o h ) 2 + 2 p h c h 3 当r 为苯基时，不能采用p d 催化氢解，若改用p t 催化氢解时，虽然反应 刚侗较长，但最终可阻得到想要的产品。( 方法2 e ) 5 8 】： r o p ( o ) ( o p h ) 2 + 4 h 2 lr o p ( o ) ( o p h ) ( o h ) + c 6 h 1 2 r o p ( o ) ( o p h ) ( o h ) + 4 王2 p d r o p ( o ) ( o h ) 2 + c 6 h 1 2 ( 2 e ) 方法2 e 已用于制备n 磷酰化g l u ，o 一磷酰化s e r 和它们的肽，反应前常常 先用p d 催化剂预处理除去羧基或氨基保护基，反应中有时也会遇到麻烦，但总 的来说，氧解还是一个较好的方法。 除了采用氢解的办法可以除去磷酸之中的r 基外，也可以用碱水解的办法 得到同样的结果。但是碱水解没有氢解用得多，因为随着r ，r 基的不同，反应 条件也不同，不如氢解反应容易掌揖。 1 0 部蜘夫学确机化学每业碗士学位论文化学生物重点实验室 二苯基磷酰氨基酸或酯在碱作用下( n a o h ，k o h ，b a ( o h ) 2 ) 分步脱去两个苯 基，同时也除去保护羧基的酯基，得到磷酰自由氨基酸。在反应中p - n 键没有发 生断裂。( 7 i 1 去2 f ) 1 5 9 】 r n h p ( o ) ( o r ) 2 +n a o h _ r n h p ( o ) ( o r 。) o n a+ r o h r n h p ( o ) ( o r ，) o n a + n a o hr n h p ( o ) ( o n a ) 2 +ro h 在强碱条件下，氨基酸一般会发生消旋反应，但至今没有实验进行这方面的 工作，因此需要进一步的实验证实此方法爿可能推广使用。 另外，烷基和苄基磷酸酯对碱较稳定，小宜用这种方法降解。降解o 一磷酰 氨基酸酯需要先将n 保护基除去，因为即使在室温的情况下也容易发生p 一消除 脱去磷酸酯。例如o 一磷酰丝氨酸和苏氨酸的二苯基酯用1 n n a o h 水解的反应：( 方法2 9 ) n h b o c o h ( p h o ) 2 p ( o ) o c h 2 c h c 0 2 e t h b r ( p h o ) 2 p ( o ) o h + c h 2 = c h h b o cn c 0 2 h ( 2 9 ) o h 。 ( p h o ) 2 p ( o ) o c h 2 c h ( n h 2 ) c 0 2 e t 一 ( h o ) 2 p ( o ) o c h 2 c h ( n h 2 ) c 0 2 h +2 p h o h 这方法已用于o ，磷酰s e r ，t 1 1 r ，s e r g l y ，s e r g l u 的合成，产率只有1 0 3 3 。 o 一磷酰丝氨酸的二苄基酯和它的二肽用n a l 在丙酮中回流可以失去一个苄 基( t j 法2 h ) ，这是唯一采用过的保留n 、o 保护基降解三烷基磷酸酯的方法。 ( r o ) p ( 0 ) ( o c h 2 p h ) 2 + n a r o p ( o ) ( o c h 2 p h ) o n a + p h c h 2 1( 2 h ) 对羧酸磷酸混合酸酐可以使用干燥的h b r 脱去苄基，同时脱去氨基保护基 防法2 i ) 川： r c 0 2 p ( o ) ( o c h 2 p h ) 2 + 2 h b r r c 0 2 p ( o ) ( o c h 2 p h ) o n a + p h c h 2 1 ( 2 i ) 羯确大学袁枫化学专业碗i 学位论文 佬学生物重点实验室 ( 3 ) 膦酰氯和硫代膦酰氯法r 2 p ( x ) c i 与( r o ) 2 p ( o ) c 1 相似，r 2 p ( o ) c i 与氨基酸酯反应可得到膦酰氨基酸酯f 方法 3a 1 6 2 】： r 2 p ( o ) c i + h 2 n h rr 2 p ( o ) h n r 。 ( 3 a ) 当硫代膦酰氯与氨基酸反应时，不需要保护分子中存在的羟基与羧基，直接 与氨基酸反应即可得到硫代膦酰胺。反应在氢氧化钠水溶液或二氧六环一三乙胺 水溶液中进行，s e r 和t 1 1 r 只得到一n h 2 磷酰化产：品，c y s 的一s h 和c t - n h 2 均发 生膦酰化反应，t y r 既可得到值一n h 2 单膦酰化产品也有n h 2 ，- - o h 双膦酰化 产品。f 方法3 b 1 6 3 】。 p h p ( s ) c l + r n h 2 + n a o h 一，p h 2 p ( s ) n h r + n a c i + h 2 0 ( 3 b ) 这个方法的优点是不需要将羧酸变为酯，减少了酯化和皂化两步反应，而且 产品较磷酰化产品易于纯化，但是膦酰氨基酸与天然的磷酰氨基酸性质差别很 大，这是个很难克服的缺点。 ( 4 ) p h o p ( o ) c 1 2 法 p h o p ( o ) c 1 2 在b a ( o h ) 2 水溶液中与胺反应可得磷酰胺单苯基酯的钡盐( 方 法4 a 1 ： 2 尺h n h 2 + 2 p h o p ( o ) c 1 2 + 3 b a ( o h ) 2 r n h p ( o ) ( o p h ) o 2 b a 十b a c l 2 + 4 h 2 0 ( 4 a ) 此方法已用于g l y ，a l a ，p h e ，v a l ，l e u 等6 4 1 ，产率6 0 8 4 ，也有人报道 这个方法不适用于g l y ，g l u ，a r g ，l e u g l y g l y 【6 5 】。 p h o p ( o ) c 1 2 与羟基反应，可得到s e r 等的羟基磷酰化产品( 方法4 b ) 【6 66 引， 反应若在水中进行或者反应完后用水处理，町得到烷基，苯基磷酸酯： ( r o ) p ( o ) ( o p h ) c l+h20 一r o p 0 ) ( o p h ) 0 h +hci 如果酰氯用其他的醇醇解，可得到二烷基苯基磷酸酯。 r o p ( o ) ( o p h ) o h + r o h + r 3 n- r o p ( o ) ( o p h ) o r r 3 n h c 郑州大学寿机毒艺学弩她碗一l 一学位论汪 化学生物重点实验章 当r o p ( o ) ( o p h ) o h 中的r 为氨基酸h , j ，苯基可用酸水解或氢解除去，若r 为蛋白质时，苯摹可自动水解除去。 ( 5 ) ( r o ) p ( o ) o a g 法 二烷基磷酸酯的银盐与卤代烷反应得到三烷基磷酸酯( 方法5 a ) e 6 7 1 ，这一反应 已用于制各一些o 一磷酰丝氨酸的衍生物，这是一个从一般有机物制备氨基酸衍 生物的方法。 r b r + ( r o ) 2 p ( o ) o a g 一( r o ) ( r o ) 2 p o + a g b r ( 5 a ) ( r o ) 2 p ( o ) o a g 还可以与n 一保护的氨基酸的酰氯反应，得到混合酸酐( 方法 5 b ) e 6 8 1 ： r c o c i + ( r o ) 2 p ( o ) o a g 一( r c 0 2 ) p ( o ) ( o r ) 2 + a g c l ( 5 b ) ( 6 ) 单烷基磷酸酯法 在脱水剂d c c i 存在下，单烷基磷酸酯同胺反应生成n 一磷酰氨基酸，烷基 很容易通过碱水解除去( 方法6 a ) 1 6 9 】： r n h 2 + r o p ( o ) ( o h ) 2 上星斗r n h p ( o ) ( o r ，) o h + h 2 0 ( 6 a ) 此反应同样能用在o 磷酰氨基酸的合成中，氨基酸的氨基和羧基均需要保 护起来，反应在吡啶溶液中进行，反应温度o ，反应时问4 0 小时以上。( 方法 6 b 、 7 0 r o h + r ，o p ( o ) ( o h ) 2 曼gr o p ( o ) ( o r ，) o h + h 2 0 ( 6 b ) 在此反应条件下，产物可以形成聚磷酸酯，若温度升高至2 0 。c ，此反应1 5 h r 即可完成。( 方法6 c ) 【7 1 1 r o p ( o ) ( o r ，) o h 咀 r o p ( o ) ( o r ，) 2 0 + h 2 0 ( 6 c ) ( 7 ) 磷酸和聚磷酸法 磷酸在脱水试剂存在下可以直接与氨基酸的羟基发生反应，生成0 一磷酰氨 基酸( 方法7 a ) t 7 2 】： 都蝇大学甫枫化学专业硕士学谴论爻 化学生物重点娶验窀 r o h + t 1 3 p 0 4 + c c l 3 c n 丛r o p ( o ) ( o h ) 2 + c c l 3 c o n h 2 ( 7 a ) 聚磷酸也能发生类似的反应( 方法7 b ) 吲 o ho h n r o h + h 十o f ) of )o _ r 百o h 。 - n r o p ( o ) ( o h ) 2 + n h 3 p 0 4 o o 反应条件依底物的小同而不同，对象s e r 这样单个的氨基酸，7 0 反应2 0 分钟就够了，对丝胶蛋白的磷酰化需要在室温反应三天。反应后用热的2 nh c i 处理，水解除去二聚、三聚磷酸酯，如果在磷酸存在下用6nh c i 处理，得不到 o 磷酰化产品。 ( 8 ) n h = p ( o ) ( o h ) o k 法 n h 2 p ( o ) ( o h ) o k 可以从二苯基磷酰胺用k o i i 水解制得，这个试剂溶丁二水， 存碱中稳定，对酸敏感，它和h i s 环中的n h 反应形成兀和t 磷酰胺氨基酸f 方 法8 0 7 4 1 r 2 n h + n h 2 p ( o ) ( o h ) o k 卜r 2 n p ( o ) ( o h ) o k 十n h 3( 8 a ) 在一定条件1 、，它也能磷酰化c 【n h 2 ，羟基，羧基和巯基对反应没有影响， 但反应产率很低，大约在2 0 5 0 范围内，很多氨基酸，蛋白质都用这种方法进 行了磷酰化。 n t t 2 p ( o ) ( o h ) o k 试剂反应时最有效的p h 值为卜8 ，但此时大多数胺仍含有 正电荷，不利于反应进行，当p h 升高，胺的反应活性增高时，n h 2 p ( o ) ( o h ) o k 义转化为不反应的双负离子。如果用眯唑取代n h 2 p ( o ) ( o h ) o k 中的n h 2 ，由于 分予具有共振结构，能分散双负离子的负电荷，而且咪唑是一个较好的离去基团， 因此试剂在较宽的p h 范副均有反应活性。 ( 9 ) 亚磷酸酯四氯化碳水相合成法： 赵玉芬院士领导的研究小组利用t o d d 反应，探索出利用三乙胺、水、乙醇 和四氯化碳作溶剂的水相合成法f j 7 j 部炳大学禹机化学专业碗? | ：学觎论文 他学生物鼋蠹实验室 冲删一奠一b祟掣型婴冲令一fhl一叫ip r o p h + h 2 n - 叫q _ o h 面茹二。+ i p 卜m 卜c h _ 卜o h 陔方法反应条件温和、选择性高、副产物少、收率高，是很好的合成磷酰化 氨基酸的方法，但由于四氯化碳是致癌物质，不利于规模化生产。 ( 1 0 ) n a c i o 法| 7 6 j o r 0 0 k 0 = 瓢h 2 nc h o 。n - - 1 n a ：c ，i 咖o 叱。- 篇卜i i 卜h c hc i i 。h 此方法简便，适合于规模化生产，但是相刑产率较低，有待进一步研究。 1 7 论文的提出 综上所述，对于磷酰化氨基酸的合成及性质研究具有一定的理论价值和应用 前景。我们希望通过本论文对其合成的进一步研究，较深入地把握其合成的特点 与规律，并刺其波潜规律进行较为系统的归纳与总结，同时在实验室中从“生产” 的角度来探索其最佳的合成条件。另外我们想通过对其单晶的培养来进一步了解 其结构情况，借助质谱来研究磷酰化氨基酸的水解。 j + j , j t i x 撕t i 化学专业硕士学位论文 化学生物重点蜜验室 2 1 仪器与试剂 第二章实验 试剂： 水为重蒸水，乙醇( 9 5 0 ) 和无水乙醇均为北京化工厂产品 四氯化碳、三乙胺、二氯甲烷、氯仿、石油醚、四丁基溴化铵、乙酸乙酯、 正己烷、甲醇、叔丁醇、正丁醇、四氢呋喃、d m s o 、d m f 等均购于北京化工 厂 碳酸钾、无水硫酸镁、氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、高氯酸、硝酸和 浓赫酸均购白天津化工一厂 所涉及的溶剂和药品都为分析纯。 新制的次氯酸钠溶液( 1 0 4 ) 购自郑州农药厂 二卜种天然常见的氨基酸购白郑i 1 1 华美生物工程公司( 进口分装) 金属盐均为分析纯级的产品 柱层析所用硅胶为国营青岛海洋化工厂 t l c 薄板为青岛海洋化工厂 仪器： 显微熔点测定仪( 温度计未校i t ) x t 4 a 北京科仪电光仪器厂 b r u k e r e s q u i r e3 0 0 0 离子阱液相色谱质