（海洋生物学专业论文）深海沉积物中甲醛降解菌多样性分析和相关基因的克隆.pdf

摘要 摘要 深海、南极等极端环境中蕴藏着丰富的资源，其中微生物资源是国内外研究 的热点。它们经过长期的进化、选择，在各种极端的环境条件下形成了独特的组 织结构、酶系统及代谢机制以进行生存和繁衍。对适冷酶独特的生理结构及机能 进行研究，探讨生物适应恶劣的生存环境而产生的解毒机制，无论在科学上还是 实际开发应用上都具有重大的意义。由于极端环境样品采集方面的限制，目前大 部分的极端微生物仍未得到认识和研究。 本文对东太平洋深海沉积物、印度洋深海沉积物、南极普里兹湾沉积物样品 开展研究。采用传统分离微生物手段获得可培养微生物共3 2 3 株，并从中筛选到 8 3 株耐受甲醛浓度在5 0 m g l 以上的甲醛耐受菌株及7 株产适冷脂肪酶的菌株。 在甲醛耐受菌中，f a l 5 菌的甲醛耐受能力最强，其在完全生长的条件下， 能耐受至少4 0 0 0 m g l 浓度的甲醛，大大高于多数现有文献的记载。同时，f a l 5 菌能在以甲醇或乙醇为唯一碳源的m 9 培养基上生长，显示了部分“甲基营养菌” 的特征。并且将f a l 5 菌体破碎后，其破碎液在3 h 内能完全降解1 0 0 m g l 的甲 醛。说明f a l 5 菌株发酵产生能够降解甲醛的物质，用于降解甲醛时，不需要f a l 5 活菌，这为实际开发应用提供了极大便利。 同中温酶相比，适冷脂肪酶具有极高的催化常数( k c a t ) 值，同时有较低和 较稳定的米氏常数( 砌) 值，特别是具有较低的活化能和低温下的酶活力，使 其在许多领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性，因此在洗涤业、食品加工、 生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景。本文以7 株产脂肪酶菌株 为研究对象，应用1 6 sr d n a 作为分子指标对其进行分类鉴定，并对其生长与产 酶特性、酶学性质进行初步研究，为今后极地微生物适冷酶的低温适应机制研究 及其应用打下基础。 关键词：极端微生物；甲醛；降解；适冷脂肪酶 a b s t r a c t a b s t r a c t e x t r e m ee n v i r o n m e n t , s u c ha sd e e ps e aa n da n t a r c t i c a , i sr i c hi n p l e n t yo f r e s o u r c e s ，e s p e c i a l l ym i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e s ，t h es t u d yo fw h i c hi sh o ta l lo v e rt h e w o r l d a f t e rl o n g t e r me v o l u t i o na n ds e l e c t i o n ，t h e s em i c r o o r g a n i s m sh a v ed e v e l o p e d p a r t i c u l a rc h a r a c t e r i s t i c st h a ta l l o wt h e mt os u r v i v ea ts u c he n v i r o n m e n t t h es t u d yo f p h y s i o l o g i c a ls t r u c t u r eo fc o l d a d a p t e de n z y m ea n dt h ed e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s mo f t h e s em i c r o o r g a n i s mi se s s e n t i a ln o to n l yi ns c i e n t i f i cr e s e a r c hb u ta l s oi nc o m m e r c i a l d e v e l o p m e n t h o w e v e r ，p a r t i a l l yd u et ot h eg r e a td i f f i c u l t i e si nc o l l e c t i n gs a m p l e s ，i t r e m a i n sa so n eo ft h em o s tu n k n o w nf i e l d s i n t h i sp a p e r , d e e p - s e as e d i m e n t so fe a s t e r np a c i f i c ，t h ei n d i a no c e a nd e e p s e a s e d i m e n t s ，s e d i m e n ts a m p l e so fp r y d zb a yi nt h ea n t a r c t i c aw e r er e s e a r c h e d at o t a l o f3 2 3b a c t e r i aw e r ec u l t u r e db yt r a d i t i o n a ls e p a r a t i o nm e t h o d ，a m o n gw h i c hw e r e8 3 b a c t e r i at h a tc a nt o l e r a t ea tl e a s t5 0 m g lo ff o r m a l d e h y d ea n d7b a c t e r i at h a t p r o d u c e dc o l d - a d a p t e dl i p a s e c o m p a r e dw i t hm e d i u m - t e m p e r a t u r ee n z y m e ，c o l d a d a p t e dl i p a s eh a sav e r yh i g h c a t a l y t i cc o n s t a n t ( k c a t ) v a l u e s ，w h i l el o w e ra n dm o r es t a b l em i c h a e l i sc o n s t a n t ( k i n ) v a l u e s ，e s p e c i a l l yl o w e ra c t i v a t i o ne n e r g ya n dt h ee n z y m ea c t i v i t yi nl o wt e m p e r a t u r e ， w h i c he n d u ei tu n p a r a l l e l e ds u p e r i o r i t yi nm a n yf i e l d s t h e r e f o r e ，c o l d - a d a p t e dl i p a s e h a s h a sb r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t si nt h ew a s h i n gi n d u s t r y , f o o d p r o c e s s i n g ， b i o p h a r m a c e u t i c a l ，b i o t e c h n o l o g ya n do t h e ra r e a so ft h ee n v i r o n m e n t i nt h i sp a p e r , 7 l i p a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i aw e r ec l a s s i f i e da n di d e n t i f i e db ym o l e c u l a rm a r k e ro f16 s r d n a ，a n dt h e i rc h a r a c t e r i s t i c so fg r o w t h ，e n z y m ep r o d u c t i o n ，e n z y m a t i cn a t u r ew e r e p r e l i m i n a r i l ys t u d i e d ，w h i c he s t a b l i s h e daf o u n d a t i o nf o rf u t u r es t u d yo fm e c h a n i s m o fc o l d - a d a p a t e de n z y m ea n di t sa p p l i c a t i o n a m o n gt h e s ef o r m a l d e h y d e - t o l e r a n tb a c t e r i a ，f a15s t r a i np o s s e s s e ss t r o n g e s t f o r m a l d e h y d et o l e r a n c e ，a tl e a s t4 0 0 0 m g lo ff o r m a l d e h y d ew h e ni tc o m p l e t e l y g r o w s ，w h i c hi sm u c hh i g h e rt h a nm o s to ft h ee x i s t i n gp a p e rr e c o r d e d a tt h es a m e i i i t i m e f ai5s t r a i nc a ng r o wi nm 9m e d i u mw i t hm e t h a n o lo re t h a n o la ss o l ec a r b o n s o u r c e ，i n d i c a t i n gs o m ec h a r a c t e r i s t i c so fm e t h y l o t r o p h f u r t h e r m o r e ，w h e nf a 15 c e l l sw e r eb r o k e nb yu l t r a s o n i c ，t h ei n t r a c e l l u l a rc e l l f r e ee x t r a c t sc a nd e g r a d e lo o m g lo ff o r m a l d e h y d ew i t h i nt h r e eh o u r s t h i sm e a n st h a tc e l l - f r e ee x t r a c t so f f ai5s t r a i nc a nd e g r a d ef o r m a l d e h y d ei n d e p e n d e n t l ya n dl i v i n gf a15s t r a i n ，o f c o u r s e ，i sn o tn e e d e d ，w h i c hp r o v i d e sag r e a tc o n v e n i e n c ef o ra c t u a la p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：e x t r e m em i c r o o r g a n i s m ；f o r m a l d e h y d e ；d e g r a d a t i o n ；c o l d a d a p t e d l i p a s e i v 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位做作者躲砑、景励 e t 期：即d 罗年7 月 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解国家海洋局第三海洋研究所有关保 留、使用学位论文的规定，同意本所保留并向国家有关部门或机构送 交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权国家海 洋局第三海洋研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于： 保密口，在 年解密后适用本授权书。 不保密囤。 ( 请在以上方框内打“ ) 论文作者签名：逮墨越日期：加7 年7 月吵日 指导老师签名：星三磁 日期：一夕年7 月，t 卢 第一章前言 第一章、前言 1 1 深海环境与微生物研究进展 1 1 1 深海概况 地球是太阳系中唯一生意盎然的蓝色行星，海洋覆盖了地球表面的7 0 8 。 海洋与陆地在地球表面上的分布并不平均，以北半球来说，海洋覆盖了6 1 的面 积，而在南半球则占了8 l ；陆地表面的平均高度约8 5 0m ，海洋的平均水深则 为3 , 7 0 0m ；陆地上最高峰珠穆朗玛峰海拔8 , 8 5 8m ，而海洋最深处的马里亚纳海 沟的深度则超过11 , 0 0 0m ；由板块分离所形成的洋中脊绵延超过7 4 ，0 0 0k m ，是 地球上最显著的地貌。此外，从生物可存活的空间来看，绝大部分陆上生物集中 于狭小的的土壤、地面与空气中，而海洋生物的活动空间却超过1 , 3 7 5 ，0 0 0 ，0 0 0 k m 3 ：根据估计，能够得到阳光照耀的表层仅占生物可存活空间的不到3 ，其 他的9 7 都位于海面下终年暗无天日的深处。 海洋中阳光可穿透的水体称为透光带，一般介于1 0 0m 2 0 0m 的深度范围内。 而透光带以下到1 , 0 0 0m 的深度区域内，由于动物和化能有机异养微生物的作用， 仍存在相当多的生物活动。相比较而言，1 , 0 0 0m 以下的水域生物活动相对较少， 这就是所说的“深海”【l ，2 1 。深海区域超过地球表面积的5 0 ，长期以来一直被 认为是生命无法生存的极端环境。根据传统的概念，首先是强大的静水压足以将 任何生物体压得粉碎，其次，“万物生长靠太阳是长久以来人们对生命活动的 认识，而在深海长年的低温、黑暗环境下，作为能量来源的光合作用无法进行， 仅靠上层海水浮游颗粒及动植物尸体的沉降而输入的能量来维持生态系统的运 行是十分困难的。第三，在深海的某些区域存在着所谓的“热液”区，不时喷发 的热泉使得该区域内的温度有时可以高达3 0 0 4 c 以上【3 】。 1 2 2 深海微生物研究进展 极端自然环境是指存在有某些普通生物无法适应的特殊物理化学条件的环 境，这些特殊的物理化学条件包括恒定的低温、高温、高压、强碱、强酸、干燥、 第一章前言 辐射、高盐、低营养、黑暗等。各种深海环境中所具有的极端条件包括了上述的 大部分类型。在微生物的进化过程中，“自然选择”规律决定了一些微生物对极 端环境有较强的适应性，这些微生物被称为极端微生物【4 铜。它们具有一般微生 物所没有的特殊生理和遗传功能。近年来，对极端微生物的研究日益引起人们的 重视。 深海中的极端微生物包括嗜热菌超嗜热菌、嗜冷菌、嗜压菌【、嗜盐菌、嗜 酸菌和嗜碱菌等几种类型。 许多极端微生物通过1 6 sr r n a 序列的比较都鉴定为古菌，也有部分极端 微生物属于最原始的细菌种类，它们在进化树上的位置可能位于根部。 极端微生物具有独特的基因类型、特殊的生理机制以及特殊的代谢产物，作 为地球上的边缘生命现象，极端微生物颇为耐人寻味。它在生命起源、系统进化 等方面将给人们许多重要的启示，在生命行为的原理上也将拓展人们的概念【8 】。 极端微生物存在的原理，又具有极大的应用价值。如在使分子生物学研究得到飞 速发展的聚合酶链式反应( p c r ) 中使用的t a q d n a 聚合酶就是从分离自温泉的 水生嗜热菌t h e r m u sa q u a t i c u s 中得到的，每年仅此酶的销售额就达8 , 0 0 0 万美 元。极端微生物的特殊机制及特殊产物，将使某些新的生物技术手段成为可能， 是奠定高效率、低成本生物技术新工艺的基础。极端微生物的应用将改变整个生 物技术的面貌。因此，极端微生物为更好地认识生命现象，发展生物技术提供了 新的机会，是微生物科学发展的新生长点。目前，极端微生物已成为国际研究的 热门领域，日本、美国、欧洲等国都启动了极端微生物的研究计划，在揭示极端 生命形式的奥秘，并利用其特殊机制与特殊产物方面的努力和竞争，已形成国际 趋势。主要研究工作包括新物种的发现、新产物的研究与生产、极端酶的结构与 功能及其基因的克隆表达、适应机理的分子基础及遗传原理、基因组的分析等。 1 2 南极环境与微生物研究进展 1 2 1 南极概况 南极洲，位于南极点四周，为冰雪覆盖的大陆，周围岛屿星罗棋布。南极洲 的面积，包括南极大陆及其岛屿面积共约1 ，4 0 0 ，0 0 0k m z ，占世界陆地面积的 2 第一章前言 l o ，与美国和墨西哥面积之和相当，是中国陆地面积的1 4 5 倍，是澳大利亚 陆地面积的2 倍，为世界第五大陆。南极洲四周围绕着多风暴且易结冰的南大洋， 为大西洋、太平洋和印度洋的延伸，面积约3 8 ，0 0 0 ，0 0 0k m 2 ，为方便研究， 被称为世界第五大洋。南极洲距离南美洲最近，中间隔着只有9 7 0k m 的德雷克 海峡；距离澳大利亚约有3 ，5 0 0k m ；距离非洲约有4 ，0 0 0k m , 与中国北京的 距离约有1 2 ，0 0 0k m 。南极洲是由冈瓦纳大陆分离解体而成，是世界上最高的 大陆，平均海拔2 ，3 5 0m 。横贯南极山脉将南极大陆分成东西两部分。这两部 分在地理和地质上差别很大。东南极洲是一块很古老的大陆，据科学家推算，已 有几亿年的历史。它的中心位于难接近点，从任何海边到难接近点的距离都很远。 东南极洲平均海拔高度2 ，5 0 0m ，最大高度4 ，8 0 0m 。在东南极洲有南极大陆 最大的活火山，即位于罗斯岛上的埃里伯斯火山，海拔高度3 ，7 9 5m ，有四个 喷火口。西南极洲面积只有东南极洲面积的一半，是个群岛，其中有些小岛位于 海平面以下。但所有的岛屿都被大陆冰盖所覆盖。较古老的部分( 包括有玛丽伯 德地南部、埃尔斯沃思地、罗斯冰架和毛德皇后地) 有一由花冈岩和沉积岩组成 的山系。该山系向南延伸至向北突出的南极半岛的中部。西南极洲的北部，即较 高的部分是由第三纪地质时期的火山运动所造成的。南极洲的最高处一文森山地 ( 5 ，1 4 0m ) 位于西南极洲阴。 1 2 2 南极微生物研究进展 在南极这个相对简单的生态系统中，生物的种类较少，只有微生物具有较强 的适应性，保存着丰富的微生物种类和较多的数量，成为该地区生态结构和物质 能量循环中的重要环节。自e k e l o f 首次报道在南极分离出微生物后，各国的微生 物学家相继在南极地区进行了大量的研究工作，不仅证实了在南极冰、雪、水、 土壤及岩石样品中广泛存在着各种类型的微生物，其中包括大量嗜冷和耐冷微生 物，同时还证明微生物在南极自然环境下的物质循环、生物地球化学过程中担负 着重要作用n 引。南极微生物，包括细菌、酵母及丝状真菌等，不但在南极有机物 质的矿化过程中起重要作用，而且在湖泊、海洋等食物链中本身也是许多原生动 物、浮游动物和底栖动物的食物。南极微生物参与了南极陆地、湖泊及海洋的营 养循环过程和生物生产过程，因而在南极生态与环境系统中具有重要的地位和作 3 第一章前言 用。中国南北极微生物考察研究的成果为掌握极地微生物的基本状况，及研究全 球变化对该特定生态环境系统的影响奠定了初步基础n 。研究结果表明，虽然极 地环境总体上温度较低，但不同环境、时空间差异较大，包括采样季节等，时间 以及人为环境温度差异。不同生存状态、生态环境中，尤其是小微生境造成的 千差万别变化，使得环境中既有大量嗜冷耐冷者，也有相当数量的中温甚至耐 高温菌类的极端微生物，它们在极地的物质迁移和流动、转化和循环中多起着不 可忽视的作用n 引。 南极特殊的环境决定了南极微生物的研究大部分局限在南极考察站附近的 土壤、排污口、湖泊、冰盖等地方。目前，已从南极环境中分离到的微生物大多 属于嗜冷或者耐冷菌。r e d d y 等【1 3 】从南极m c m u r d o 站附近的湖泊中分离到1 3 株橙色产生菌，属于p l a n o c o c u sp s y c h r o p h i l u ss p p 和p l a n o c o c u sa n t a r c t i c u ss p p ， 并利用1 6 sr d n a 序列、细菌形态、脂肪酸组成等方面证明它们属于新的种。 m i l l e r 等【1 4 j 在南极土壤中分离到一株嗜碱嗜冷的细菌，研究了它的基本细菌学性 质。m a u r o 等【1 5 】贝4 研究了南极附近海域沉积物中的酶活性，细菌分布和无机物组 成之间的关系。b e r n h a r d 等【1 6 】认为仅和i 5 - p r o t e o b a c t e r i a 细菌控制着南极湖泊雪 层的氨基酸的释放。有关南极土壤微生物学的大量研究结果显示，南极土壤微生 物群系中的大多数微生物属于全球性物种。这些物种被发现同样生活在世界的其 它地区n h 。反言之，世界其它地区的全球性微生物物种也能在南极地区的土壤 环境中生存。 然而，南极具有独特的地理及气候特征，除短暂的夏季部分地区有冰雪融化 外，其余均被常年的冰雪所覆盖。变化极大的光照辐射、季节性的光照时间、极 低的温度造就了极地微生物特殊的生理特征和适应机制。因此南极微生物不但在 南极的生态系统及物质的生物地球化学循环中扮演了重要角色，在基础研究和开 发应用方面也具有广阔的前景口2 吨们。南极是一个潜在的、重要的微生物资源库， 它不仅是微生物新种属的生存繁衍地，也是具有独特生态系统微生物的生存繁衍 地乜5 1 ，更是产新型生物活性物质和先导化合物( 如酶、抗生素、多糖及脂类等) 菌株的潜在种源地瞳6 1 。因此，进入2 0 世纪9 0 年代以来，极地微生物资源引起了 各国科研工作者的极大兴趣，如何合理开发利用南极的微生物资源，丰富可供人 类利用的微生物种类，发现新型南极微生物活性物质已成为国际研究的热门领 4 第一章前言 域。 1 3 甲醛的微生物降解现象及其研究进展 甲醛是一种广泛使用的重要化工原材料，但常造成空气污染，给人们的身体 健康带来很大的威胁【2 7 2 8 1 。室内空气甲醛污染主要来自家具和装修用的各种人 造板材，它易发生加成、氧化、还原、聚合反应，有高度的水溶性和生物大分子 的高度反应性，甲醛在接触部位吸收或降解，进入人体后，主要与人体的蛋白质 和核酸反应，损害d n a 2 9 1 ，引起细胞核的基因突变 3 0 1 、d n a 单链内交连【3 1 1 、 d n a 与蛋白质交连【3 2 1 、抑制d n a 损伤的修复p 3 ，3 4 1 ；与氨基结合，改变蛋白质 的内部结构并凝固，扰乱人体细胞的正常代谢 3 5 - 3 7 】。它致畸、致癌，在我国有毒 化学品优先控制的名单上居第2 位。统计显示，中国每年有1 l 万人死于与室内 污染有关的疾病，北京儿童医院经过半年问诊调查发现：近9 0 的d , j l 白血患者 家中近期都曾经装修过【3 8 。4 0 】。人一生中约有8 0 的时间是在室内度过，因此找 到甲醛污染防治对策刻不容缓，对人类健康意义重大。 甲醛降解效果研究总的来说是一个从低浓度到高浓度过程，早期人们着手于 低浓度甲醛降解的研究，近年来高浓度甲醛降解时有报道。a d o e r 等人【4 l 】分离了 旦p u t i d aa 2 能降解甲醛2 5 0 m g l ，a z a c h i 等人【4 2 】分离了的h a l o m o n a ss p m a c 能 耐受甲醛7 5 0 0m g l ，d o r o i l i n a 等人【4 3 l 研究的只a l c a l i g e n e s 能降解甲醛2 0 0m g l ， p p u t i d aj 3 能降解甲醛4 5 0m g l ，肱e x t o r q u e n s 能降解甲醛5 0 0 - 一1 0 0 0m g l ；一 株pa l c a l i g e n e s 培养3 d 后能降解甲醛2 0 0 0m g l ，s a e e dm i r d a m a d i 等人1 4 4 1 报道 m e x t o r q u e n s ( e s s 和p s s ) 和4 株户p s e u d o a l c a l i g e n e s ( l s w , s s w , n s w , o s s ) 能降 解甲醛1 8 5 0m g l ，其中pp s e u d o a l c a l i g e n e so s s 培养2 4 h 将3 7 0 0m g l 的甲醛 1 0 0 消耗，培养7 2 h 消耗5 9 2 0m g l 甲醛7 0 ，肱e x t o r q u e n se s s 和肱e x t o r q u e n s p s s 还能完全降解甲醛2 9 6 0m g l 。b o n a s t r e 报道【4 5 】在甲醛浓度为2 3 0 0m g l 的 活性淤泥做基质的实验里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧条件下被好氧菌降 解。p s e u d o m o n a sp u t i d aa 2 【4 1 】当以甲醛为碳源时降解甲醛4 0 0 m g l 。z a g o m a y a 报道1 4 6 在活性淤泥的废水处理中完全降解甲醛2 3 0 0 m g l 和苯酚2 4 0 0 m g l 。 y a m a z a k i 等人 4 7 1 从海水中分离了一株甲醛耐受细菌，发现它在3 的氯化钠里能 降解甲醛4 0 0m g l ，在m a r t ae i r o a t 4 8 】设计的模型里，指出硝化作用可以降解甲 5 第一章前言 醛，当甲醛为碳源和甲醇为伴生碳源，硝化细菌可以降解甲醛的的浓度是 3 0 - 3 8 9 0 m g l ，而反硝化细菌在甲醛和甲醇存在时可以降解甲醛1 3 6 0m g l 4 9 】。 在真菌的研究方面，t e t s u y ak o n d o 等人【5 0 】从土壤中分离了一株甲醛耐受真菌( 可 以称甲醛降解菌) a s p e r g i l l u sn o m i u si r l 0 1 3 ，它能生长在最高甲醛浓度为 4 5 0 0 m g l 里并把它完全消耗掉。 目前，在国内甲醛降解微生物的研究很少。黄赛花等【5 l 】从家具厂出水口淤泥 里分离了一株甲醛降解真菌a s p e r g i l l u ss p p h 4 ，能降解甲醛浓度达1 2 4 1m g l 。 殷飞、陈丽梅等【5 2 】从污水沟里分离了能耐受甲醛浓度为4 5 0m g l 的k l e b s m l a s p ，并构建了基因组文库以进一步研究。 综上所述，尽管深海蕴藏的生物资源极为丰富，目前甲醛降解菌的研究多集 中于陆地及近海，尚未有涉及深海( 水深超过1 0 0 0 米) 的。 1 4 微生物脂肪酶的研究进展 脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) ，又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植 物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸( 其中 的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸) ，并且能催化 水解反应的逆反应酯化反应 5 3 1 。目前脂肪酶生产主要有提取法和微生物 发酵法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及p h ：范围比动植物脂肪酶广、 底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶 已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来越多， 目前工业化生产的微生物脂肪酶有近2 0 种【5 4 】。 微生物脂肪酶的前期研究主要包括产酶微生物的筛选、常规诱变育种、产酶 发酵工艺条件优化、酶的分离纯化、酶学性质研究和工业化应用等。在酶学上脂 肪酶有其独特的催化特性，其催化反应发生在异相系统，即油+ 水界面上，常规 的酶动力学并不能适用于脂肪酶，因此发展了研究界面酶作用的“界面酶学”，这 对生物学研究膜上酶催化反应有很重要的模拟意义。从已知结构的几种脂肪酶来 看，分子量在2 0 0 0 0 6 0 0 0 0 之间，脂肪酶作用在体系的亲水+ 疏水界面层，这是 区别于酯酶的一个特征。各种脂肪酶基因片段长度大多数是大约1 3k b ，只有个 别脂肪酶基因片段长达6k b ，g c 的含量比例很高，且大多数是出现在第三密码 第一章前言 子上。脂肪酶基因都编码信号序列肽，大多数信号序列肽氨基酸数目在2 3 2 6 个 和4 0 - 4 4 个之间，编码的脂肪酶氨基酸数目在2 6 9 3 2 0 个之间和4 6 0 个左右。脂 肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分约占分子量的2 。15 ，以甘露糖为主( 整个分子 由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端盼5 6 1 。脂肪酶的催化 部位含有亲核催化三联体( s e r - h i s a s p ) 或( s e r - h i s g 1 y ) ，催化部位被埋在分子中， 活性部位的丝氨酸残基被a 螺旋掩盖，对三联体催化部位起保护作用口7 巧9 1 。当脂 肪酶与界面接触时a 螺旋打开，这导致脂肪酶通过在丝氨酸周围创造一亲电区 域，暴露疏水残基，增加与脂类底物的亲和力并保持催化过程中过渡中间产物 6 0 1 。界面的存在，还可以使酶形成不完全的水化层，这有利于疏水性底物的脂 肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行【6 。 脂肪酶分子生物学研究使脂肪酶基因、酶的结构与功能等方面有了更全面的 认识。到目前为止已测定和克隆了假单孢茵、葡萄球菌、链霉菌、枯草杆菌等众 多的细菌脂肪酶基因序列以及数十种真菌脂肪酶的基因序列，确定了这些酶的氨 基酸一级结构【6 2 6 3 1 。并且通过对脂肪酶基因产生片段和其表达系统的研究，更 好地高效表达微生物脂肪酶，从而改变脂肪酶只能通过传统育种来生产的面貌。 与国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发较晚，而且工业化的微生物脂肪酶 制剂种类有限，因此，筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种， 同时开发脂肪酶新的应用领域是十分必要的。随着遗传工程的应用，酶的固定化 技术及界面酶学和非水酶学的研究与应用，微生物脂肪酶将使诸多的传统产业面 临新的挑战。 1 5 细菌1 6 sr d n a 及限制性片段长度多态性分析 1 6 sr d n a 广泛存在原核生物中，其功能恒定、进化速度缓慢( 既有高度保 守的区域又有相对可变的区域) 而且大小适中( 约1 5 2 0 b p ) ，存储的信息量能较 为客观地反映生物间的进化关系，适用于各级分类单元，因而成为目前研究原核 生物分类和进化最理想的材料【6 4 1 。 限制性片段长度多态性分析( r f l p ，r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) -r f l p 是发展最早的分子标记技术【6 5 1 。r f l p 技术的原理是检 测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特定d n a 片段的大小。因此凡是可以引 7 第一章前言 起酶切位点变异的突变如点突变( 新产生和去除酶切位点) 和一段d n a 的重新 组织( 如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可导致r f l p 的产生。 这种方法在基因组比较，新物种鉴定分类，流行病学检测，动植物遗传育种等方 面已经得到广泛的应用【6 6 1 。 将r f l p 分析与p c r 技术相结合，即p c r - r f l p 方法，用于检测某种环境 中微生物的群落结构，具体方法是采用特定的引物，如1 6 sr d n a 通用引物对某 个环境样品的宏基因组d n a 进行p c r 扩增，将扩增产物用不同的限制性内切酶 酶切，酶切产物经电泳比较分析，对特殊谱型的序列进行测定，进而了解该样品 中所包含的微生物信息【6 7 石9 1 。该方法广泛用于环境微生物多样性及群落结构的研 究。 1 6 本论文的思路、目的和意义 极端微生物具有独特的基因类型、特殊的生理机制以及特殊的代谢产物，作 为地球上的边缘生命现象，极端微生物颇为耐人寻味。它在生命起源、系统进化 等方面将给人们许多重要的启示，在生命行为的原理上也将拓展人们的概念。极 端微生物存在的原理，又具有极大的应用价值。 深海和极地存在很多新的极端微生物，微生物资源的应用潜力是研究的巨大 动力，在其他矿产资源的开发前景尚不明朗的情况下，深海和极地微生物资源是 目前唯一已经得到开发的商业资源。因此，本文针对具有较好应用前景的甲醛降 解和脂肪水解开展研究，试图通过新资源的筛选研究为极端微生物的工业化应用 奠定基础。 本论文是在国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划，2 0 0 7 a a 0 9 1 4 0 7 ) 和中国大 洋协会项目( d y 】( m 一1 1 5 0 2 2 0 4 ) 资助下完成的。 8 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选 2 1 研究背景 及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 本人于2 0 0 7 年5 月至8 月随d y - 1 1 5 1 9 航次出海科考并于东太平洋( 1 6 0 。 4 l ”2 47 e ，2 1 。5 3 ”0 87 n 及1 5 7 。2 4 ”3 17 e ，1 9 。3 0 ”3 0 n ) 采集水深超过5 0 0 0 米的深海沉积物。 从该沉积物中分离得到2 3 种不同1 6 sr d n a 类型的甲醛耐受菌，能耐受甲醛 浓度1 0 0 m g l 以上，其中一株细菌( 命名为f a l 5 ) 能耐受5 0 0 m g l 浓度的甲醛。 本文对其进行进一步的生理生化研究及基因分析。 本课题组获得d y - 1 1 5 2 0 航次采集的印度洋底沉积物，现场用含5 0 m g l 甲 醛浓度的2 2 1 6 e 培养基富集。本文从中分离纯化出一批甲醛耐受菌，筛选出有 更高甲醛耐受浓度的细菌，并将对其生理生化性质做进一步研究： 9 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 2 2 材料与方法 2 2 1实验材料 2 2 1 1 样品采集与前处理 2 2 1 1 1太平洋样品采集与前处理 沉积物是采集于d y - 1 1 5 1 9 航次第五、六航段。取2 9 沉积物予3 0 m l2 2 1 6 e 培养基中，4 。c 富集。样品采集站位信息见表2 1 。 表2 - 1 样品采集站位信息 2 2 1 1 2 印度洋样品采集与前处理 沉积物是采集于d y - 1 1 5 2 0 航次第六、七航段。采样位点描述如表3 1 。取 2 9 沉积物，放入5 0 m l 离心管中，并加入3 0 m l 添n t5 0 m g l 甲醛的2 2 1 6 e 液 体培养基，在1 6 。c 富集1 0 d ，后转入4 。c 保存。 表2 - 2 样品采集站位信息 1 0 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 2 2 1 2 引物 ( 1 ) 用于1 6 sr d n a 扩增的引物 2 7 f ：5 a g ag t tt g a t c ct g gc t ca g 3 1 4 9 2 r ：5 g g t t a cc t tg t t a c g a c t t - 3 ( 2 ) 用于验证克隆子的引物 t 3 ：5 a t ta a cc c t c a ct a aa g 一3 t 7 ：5 t a at a c ( 认ct c a c t at a gg g 3 2 2 1 3 主要试剂 p t a 一2 ( t o y o b o ) 溶菌酶( 上海生工) ； t 4d n a l i g a s e 、t a qd n ap o l y m e r a s e ( 1 a k a r a ) 多聚甲醛，购自s i g m a 公司。 醋酸铵、醋酸、乙酰丙酮为国产分析纯试剂。 g e le x t r a c t i o nk i t ( 泰京) 质粒抽提试剂盒( o m e g a 公司) f o s m i dl i b r a r yp r o d u c t i o nk i t ( e p i c e n t r e 公司) 细菌基因组d n a 提取试剂盒( 百泰克) 2 2 1 4 培养基 l b 培养基： 1 1 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 n a c l y e a s te x t r a c t t r y p t o n e 琼脂 2 2 1 6 e 基本培养基： y e a s te x t r a c t t r y p t o n e 琼脂 由原位海水配制 m 9 培养基： k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 n a c l n h a n 0 3 琼脂 甲醛富集培养基： y e a s te x t r a c t t r y p t o n e 甲醛 由原位海水配制 甲醛筛选培养基： 1 o 5 1 1 5 ( 固体培养基) 0 2 1 1 5 ( 固体培养基) 1 2 8 o 3 o 0 5 0 0 5 1 5 ( 固体培养基) 0 2 1 5 0 m g l 2 2 1 6 e 培养基，并添加甲醛至终浓度为5 0 - 2 0 0 m g l ； m 9 培养基，并添加甲醛至终浓度为2 0 0 - 5 0 0m g l 。 2 2 1 5 仪器 超纯水制备装置( h p l c 加f ) l a b c o n c o 公司 制冰机s c o t s m a n 公司 8 0 。c 超低温冰箱r e v c o 公司 水平凝胶电泳仪( j m 一2 5 0 )大连捷迈科贸有限公司 台式离心机labnet公司 电子分析天平 m e t t l e r 公司 超净工作台苏州净化安泰设备厂 1 2 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 p h 计( d e l t a ) 冷冻干燥机 生化培养箱( s l i p 2 5 0 ) 恒温培养摇床( z h w v 2 1 1 ) 电热恒温水槽( d k 一8 d ) 旋转蒸发仪( i 迮5 2 a a ) 台式冷冻离心机( 5 8 0 4 r ) 高压蒸汽灭菌锅( r 垣5 0 ) 凝胶成像分析系统( b i o s e n ss c s l 0 ) p c r 扩增仪( p t c 2 0 0 ) 1 3 m e r r i e r 公司 北京博医康有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海智诚分析仪器制造有限公司 上海一恒科技仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 e p p e n d o r f h i r a y a m a 公司 上海三富公司 b i o r a d 公司 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 2 2 2 实验方法 2 2 2 1聚合酶链式反应( p c r ) ( 1 ) p c r 反应系统包括： d n a 模板 正向及反向引物 1 0 x p c r 缓冲液 t a qd n a 聚合酶 无菌水 p c r 程序： 9 4 9 4 5 5 7 2 7 2 1 6 ( 2 ) 菌落p c r 8 0 1 0 0 n g 各0 5 1 x m 2 p l 1 u 补至2 0 1 t l 1 m 1 m i n i n l - 2 m i n c 翟嚣，卜循环 ( 视引物退火温度而定)i 气n 个循环 ( 视片段大小而定) i 在p c r 反应系统中加入所需组分，挑取一茵落在反应液中搅匀，然后 按以下程序进行p c r 扩增。 p c r 程序： 9 5 5 m i n 9 4 c l m i n j 7 i 5 5 。cl m i n ( 视引物退火温度而定) 3 0 个循环 7 2 1 - 2 m i n ( 视片段大小而定) 1 ) 7 2 1 0 m i n 16pause 1 4 第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及f a l 5 菌降解甲醛特性的研究 2 2 2 2 从琼脂糖凝胶中回收d n a 片段 ( 1 ) 将单一目的d n a 条带从琼脂糖凝胶中切下( g 量切除多余部分) 放入干 净的离心管中，称取重量； ( 2 ) 向胶块中加入3 倍体积溶胶液( 如果胶重量是o 1 9 ，其体积可视为1 0 0 肛l ， 则加入3 0 0 9 l 溶胶液) ，5 0 c 水浴放置1 0 m i n ，其间不断温和的上下翻转 离心管，以确保胶块充分溶解； ( 3 ) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱c a 2 中，1 3 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中； ( 4 ) 向吸附柱中加入7 0 0 p l 漂洗液( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ， 1 3 0 0 0r p m 离心3 0 s ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中； ( 5 ) 向吸附柱中加入7 0 0 肛l 漂洗液，1 3 0 0 0r p m 离心3 0 s ，倒掉收集管中的废液。 将离心吸附柱c a 2 放回收集管中，1 3 0 0 0r p m 离心2 m i n ，尽量除去漂洗