（生态学专业论文）模拟酸雨对调控气孔运动的ca2信号途径影响的初步研究.pdf

兰州大学研究生学位论文 摘要 钙调素( c a m ) 是一种普遍存在于真核细胞中的多功能钙受体蛋白，并在细 胞的胞内信号转导途径中处于重要地位。钙调素做为c a 2 + 的受体，在c a “信号系 统传导中起着关键的作用，它通过和c a 2 + 的结合而激活一系列的靶酶和非酶蛋白 质，从而调控生理代谢及基因表达。气孔是植物与外界进行气体交换的门户，在植 物的生命活动中起着重要作用。气孔的运动受多种信号分子调节，保卫细胞胞外 的c a m 很可能也是调节气孔运动的一种信号分子。近年有关酸雨伤害植物机理的 研究已见诸报道，但对酸雨导致植物损伤的生理、生化研究尚不够深入和系统。 由于保卫细胞外钙调素本身是蛋白质，我们假设其本身或相关的酶的活性可能会 受到细胞外p h 值的影响，进一步会影响保卫细胞调控气孔关闭的c a ”信号途径。 酸雨作为一种胁迫因子，是如何影响保卫细胞c a “信号调控途径? 并进一步对植 物造成何种伤害? 我们利用蚕豆下表皮为实验材料，用不同p h 缓冲液处理表皮 条保卫细胞，同时用1 0u m o l l 三氟拉嗪( 特异性钙调素拮抗剂t f p ) 及0 i m t o l ll a c l 。( 细胞质膜钙离子通道阻塞剂) 分别处理表皮条，然后用不同浓度 c a c l ：诱导气孔关闭。通过观察细胞外p h 对气孔关闭的影响，试图进一步探讨酸 雨对调控气孔开闭的c a 2 + 信号途径的影响。结果发现，一定范围内的细胞外p h 可 激活”内流通道，促进气孔张开；1 0u m o l lt f p 和0 im m o l ll a c i 。都能抑 制细胞外c a 2 + 浓度升高引起的气孔关闭，同时细胞外p h 可能会抑制胞外c a 2 + 与 细胞外c a m 结合导致细胞内钙浓度缓慢升高或不升高而影响气孔关闭；p h 值为3 时可能造成保卫细胞质膜透性增大，电解质渗漏增强，气孔正常开闭调节失调 兰州大学研究生学位论文 p h4 - 6 的范围内，随着p h 值的降低，对钙离子诱导的气孔的关闭的抑制增加 同时增加细胞外c a 2 + 浓度对此影响有一定的逆转作用。这些问题的澄清对揭示酸 雨危害的生态学机制，认识酸雨伤害的生理学基础，拓展防治酸雨伤害的技术途 径，乃至衍生出酸雨防治的分子生物学技术均至关重要。 关键词：蚕豆；保卫细胞；钙调素；c a ”；酸雨；气孔关闭；水孔蛋白 兰州人学研究生学位论文 a b s t r a c t c a l m o d u l i n ( c a m ) i sac a 2 + s e n s i n gp r o t e i nw i t hm a n yf u n c t i o n s ，w h i c he x i s t s e x t e n s i v e l yi ne u k a r y o t e sa n dp l a y sak e yr o l ei nc e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o n s a st h e r e c e p t o ro fc d + ，i ta l s o f u n c t i o n si nt h ep a t h w a yo fc e + s i g n a lc o n d u c t i o na n d r e g u l a t e sp h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s ma n dg e n ee x p r e s s i o nb yb i n d i n gc e + w i t h c a m t o a c t i v a t eas e r i e so ft a r g e te n z y m e sa n dp r o t e i n s s t o m a t a li st h eg a t ef o rp l a n t st o e x c h a n g eg a s e s w i t hi t ss u r r o u n d i n g sa n dt a k e sas i g n i f i c a n tp o s i t i o ni nm e t a b o l i s mo f p l a n t s t h eo p e n i n ga n dc l o s u r eo f s t o m a t a li sr e g u l a t e db ym a n ys i g n a lm o l e c u l e s ， o n eo fw h i c ht h ee x t r a c e l l u l a rc a mi s i nr e c e n ty e a r s ，s o m es t u d i e so nh o wa c i dr a i n d a m a g e sp l a n t s a r ep u b l i s h e d b u tt h e r ei sf e wf u r t h e rr e s e a r c h e sf o c u s i n go nt h e m e c h a n i s mh o wa c i dr a i na f f e c t st h em e t a b o l i s mo f p l a n t s b e c a u s ee x t r a c e l l u t a rc a m i sp r o t e i ni nn a t u r e ，s ow e s u p p o s et h a te x t r a c e l l u l a rp h s h o u l da f f e c tc a mo rs o m eo f i t sc o r r e l a t i v ee n z y m e sa n df u r t h e ra f f e c tt h ec a 2 + s i g n a lp a t h w a yi nw h i c hs t o m a t a l m o v e m e n ti sr e g u l a t e d a sap r e s s i n gf a c t o gh o wd o e sa c i dr a i na f f e c tt h ec e + s i g n a l p a t h w a ya n dh o wd o e sa c i dr a i nb r i n ga b o u t d a m a g et op l a n t s ? u s i n gt h el o w e r e p i d e r m i so fl , t c i af a b al t ob ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sa n di n c u b a t i n gr e s p e c t i v e l y e p i d e r m i si nc 0 2 一f r e ek c l - m e sc o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o fh + ，t f po r l a c l 3 ，t h e ni n d u c i n g s t o m a t a lc l o s u r e b yc a c l 2 w e a t t e n d e dt od e t e r m i n et h e p o s s i b l ee f f e c t so f a c i dr a i no nt h ec a ”s i g n a lp a t h w a yr e g u l a t i n gs t o m a t a lm o v e m e n t b ys u r v e y i n g t h es t o m a t a lm o v e m e n tc a u s e db ye x t r a c e l l u l a rp h t h er e s u hi n d i c a t e d t h a te x t r a c e l l u l a rp hc o u l da c t i v a t ei n w a r dk 十c h a n n e la n dp r o m o t es t o m a t a lo p e n i n g 兰州大学研究生学位论文 b o t h10 m o l 1t f pa n d0 1m m o l ll a c l 3r e s t r a i n e ds t o m a t a lc l o s u r ei n d u c e db y i n c r e a s i n ge x t r a c e l l u l a rc a 2 + e x t r a c e l l u l a rp ha f f e c t e d t h er e g u l a t i o no fs t o m a t a l m o v e m e n tt h r o u g hi t s r e s t r a i n i n gt h eb i n d i n go fc a 2 + w i t hc a m e x t r a c e l l u l a rp h 3 c o u l dd a m a g et h ei n t e g r i t yo fm e m b r a n ea n dr e s u l ti na na b n o r m a l i t yo fs t o m a t a l m o v e m e n t i nt h er a n g eo f p h4 - 6 1 ，t h ef u r t h e rr e s t r a i n to fs t o m a t a lc l o s u r ew o u l d r e a c hw h i l ee x t r a c e l l u l a rp hb e c a m el o w e ra n dl o w e r m o r e o v e r ，a ni n c r e a s i n gc a 抖 c o u l dr e v e r s et h ee f f e c t t h e s ec o u l db ei m p o r t a n tf o rd i s c o v e r i n gt h ed a m a g i n g m e c h a n i s mo f a c i dr a i na n dd e v e l o p i n gt e c h n i q u e st op r e v e n ta c i dr a i n k e yw o r d s ：阳c 缸f a b al ：g u a r dc e l l ；c a m ；c a 2 + ；a c i dr a i n ；s t o m a t a i c l o s u r e ；a q u a p o r i n 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：墟。1 丝 日 论文作者签名：垒函! 经 日期：型! 妄墨宜卯 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：芝至! 辈导师签 i ， 日期：喇馥6 司2 日 嬲 ，名 兰州1 人学研究生学位论文 1 前言 钙调素( c a l m o d u l i n ，简称c a m ) 是一种普遍存在于真核细胞中的多功能钙 受体蛋白，并在细胞的胞内信号转导途径中处于重要地位。c a m 不仅存在于植 物胞外，而且还具有重要的生物学功能。钙调素做为c a 2 + 的受体，在c a n 信号 系统传导中起着关键的作用，它通过和c a 2 + 的结合而激活一系列的靶酶和非酶 蛋白质，从而调控生理代谢及基因表达。 1 1 钙调素 1 1 1 钙调素的发现 传统上认为植物体细胞中不存在多肽信使，而钙调素自2 0 世纪6 0 年代末发 现( c h e n gw y ，1 9 7 0 ) 以来，也一直被认为是细胞内c a 2 + 信使的多功能受体蛋 白，在调节多种胞内酶活性、生理功能，以至基因表达上起重要作用。非常意外 的是，2 0 世纪8 0 年代初开始陆续发现，它不仅普遍存在于人、动物或植物细胞 外，在胞外位点产生多种重要的生物学功能，而且具有跨质膜及胞内信号转导机 制。 2 0 世纪8 0 年代初，b o y n t o n 等人( 1 9 8 0 ) 就曾报道，在t s l b 鼠肝培养细胞 体系中，被c a m 拮抗剂抑制的d n a 合成( 增殖指标之一) ，可被外加纯化c a m 所恢复。随后，g o r b a c h e r s k a y a 等人( 1 9 8 3 ) 也指出外源纯化c a m 可以刺激人 淋巴细胞增殖。w o n g 等人( 1 9 8 0 ) 则报道，外源c a m 可刺激人的血小板细胞分 泌凝血嗯烷。m a c n e i l 等人( m a c n e i l ，1 9 8 4 ) 在b 1 6 黑色素瘤细胞的增殖研究中， 开始推测外源c a m 的作用发生在细胞外，提出“e x t r a c e l l u l a rc a m ”的概念。 1 9 8 8 年，该实验室的c r o c k e r 等人( 1 9 8 8 ) 在动物方面首次报道，在人、兔、鼠 兰州大学研究生学位论文 等多种无血清培养细胞介质中都检出了c a m ，同时通过用不能过膜进人细胞内 的c a m 拈抗剂与c a m 抗体，指出：c a m 可以在细胞外促进k 5 6 2 白血病淋巴细 胞增殖。 植物方面，b i r o 等人( 1 9 8 4 ) 在s r o u x 首次报道从植物细胞外检出c a m 。 植物上证明存在c a m ( 1 9 8 0 年) 之后，白1 9 8 2 年来，r o u x 实验室即丌始从重要 的实验植物材制一燕麦中分离纯化c a m ，并用放射免疫法测定c a m 在亚细胞结 构中包括细胞核、线粒体、黄化质体等各部分的定位。b o n n e r 实验室的t e r r y ( 1 9 8 0 ) 报道了用离心分离法制备细胞外溶液后，访问了r o u x 实验室，用他分离 的细胞壁溶液顺便与其他亚细胞部分一起进行了测定，令人意外的是，在细胞壁 溶液中也检出了c a m ，其含量按单位蛋白质计算，远远高于细胞内部分。次年 j o s e f i n a 等人f 1 9 8 5 ) 也报道过在鹰咀豆胚轴细胞壁检出c a m 。 从1 9 8 7 年开始，孙大业以小麦芽鞘为材料，以真空渗入离心方法提取的细 胞壁可溶住蛋白、b i r e k 法提取的细胞壁盐溶性蛋白为样品，用磷酸二醋酶( p d e 、 法测出细胞壁中存在可溶性及盐键结合态两种形式的c a m ( 叶正华，1 9 8 8 ) 。在 制备植物特异性抗c a m 抗体之后，用余标或酶标免疫电镜法，在玉米根尖细胞 壁区定位了c a m ( l ij x ，1 9 9 3 ；李家旭，1 9 9 2 ) 。此外，用疏水亲和层析方法 在小麦芽鞘中部分纯化了细胞壁盐浴性c a m ；根据疏水性、耐热性、紫外吸收 光潜、s d s 电泳分子量、有c a 2 + 或无c a 2 - 条件下电泳迁移率、p d e 酶激活特性 及其对c 矿依赖性等特征，证明了小麦细胞壁c a m 与胞内c a m 基本相同( 叶正 华，1 9 8 9 ) 。同时他们先后用放射免疫测定法、酶联免疫测定法( e l i s a ) 、p d e 酶法、n a d 激酶法以及免疫电镜定位等，在已检测过的所有植物种类中，包括 燕麦、小麦、玉米、白芷、花椰菜、胡萝h 、烟草、西红柿等都检测到细胞外( 或 兰州大学研究生学位论文 质体内) c a m ( b i r o ，1 9 8 4 ；叶n 三华，1 9 8 8 ：l ij x ，1 9 9 3 ；李家旭，1 9 9 2 ；叶正 华，1 9 8 9 ；孙大业，1 9 9 5 ；崔素娟，1 9 9 8 ) 证实了细胞外c a m 存在的普遍性。 不同生物细胞种类的c a m 浓度有很大的变化，据c r o c k e 等人的测定，在动 物与人的1 0 多种培养细胞中，胞外c a m 的浓度可相差3 个数量级f 约1 0 。o 1 0 。7 m o l 1 ) 。此外，在培养过程中胞外c a m 浓度有明显的动态变化。例如在烟草培养 初期，至增殖率平台期前后，浓度有数倍的变化。人的k 5 6 2 培养细胞也是如此。 钙调素可被分泌出细胞是无疑的，如r e m g a r d 等人( 1 9 9 5 ) 用3 h - t h y m i n e 处理 蛙坐骨神经，其新合成的标记c a m 可由该神经外生长区非神经细胞分泌。张明 志等人( 1 9 9 2 ) 也指出，在兔胰腺细胞中，c a m 在分泌颗粒中大量存在，表明 其可作为分泌性蛋白被排出胞外。 1 1 2c a ：+ c a m 的结构 钙调素作为一种c a 2 + 受体，它的活性受c a 2 十调控，所以最初研究c a m 结 构均为c a 2 + _ c a m 复合体的结构，最早对c a 2 + c a m 结构进行研究的是g e h r i g 等 ( 1 9 8 4 ) ，但他们并未解析出c a 2 + 一c a m 的结构，只是获得了c a 2 + c a m t f p 的蛋白 晶体及由此晶体获得的部分x 光衍射数据。随后b a b u 等( 1 9 8 5 ) 首次报道了用 x 光衍射得到的大鼠c a 2 + c a m 在分辨率为0 3n l t l 空间结构，但在该分辨率f ， 能看到多肽链的走向，还可在一级结构帮助下推测氨基酸种类，但并不能分辨氨 基酸的侧链及多肽链的整个构象。不久之后，他们( 1 9 8 8 ) 又用同样的方法报道 了该蛋白在分辨率为0 2 2n l n 的结构，从该结构中可以发现钙调素分子为一哑铃 形结构，n 端及c 端为两个球形结构域，由中央2 8 个氨基酸构成的螺旋区连接， 整个分子的总长度为6 5a m 。分子中包括七段c 【螺旋分别由5 1 9 ，2 9 - 3 8 ，4 5 5 5 ， 兰州大学研究生学位论文 6 5 - 9 2 ，1 0 2 1 1 1 ，1 1 8 1 2 8 和1 3 8 一t 4 7 氨基酸残基构成，在n 端和c 端半分子分 别含有两个l o o p 区，分别由2 0 3 1 ，5 6 6 7 ，9 3 1 0 4 ，1 2 9 1 4 0 氨基酸残基构成， 由这四个l o o p 区与位于两头部的六个旺螺旋区共形成四个典型的e f 手形结构即 c a 2 + 结合区，并分别结合一个c a 2 + 。另外由3 9 4 4 及1 1 2 1 1 7 氨基酸分别在n 端 及c 端形成一个l o o p 区，并与两个a 螺旋相连接。在n 端和c 端的两个c a 2 + 结合区之间分别构成一一对短的反平行b 折叠片，分别由2 6 - 2 8 ，6 2 - 6 4 ，9 9 1 0 1 和 1 3 5 1 3 7 氨基酸残基构成。另外，在n 端和c 端每一半分子中均含有个疏水 穴，每一疏水穴面积为1 0 0m 1 2 5n l y l ，深度为o 9 5n l r l ，每一疏水穴由在一级 结构上不连续的1 4 个氨基酸残基构成，其中n 端疏水穴由第1 9 、2 7 、3 2 、3 5 、 3 6 、4 3 、4 8 、5 1 、5 2 、5 5 、6 3 、6 8 、7 1 和7 2 氨基酸残基构成，c 端疏水穴由第 9 2 j1 0 0 ，1 0 5 、1 0 8 、1 0 9 ，1 1 6 、1 2 1 ，1 2 4 、1 2 5 、1 2 8 ，1 3 6 ，1 4 1 、1 4 4 、1 4 5 氨 基酸残基构成，这两个疏水穴将与中心螺旋共同负责与靶酶及拮抗剂的结合。随 后不久，利用小角x 光散射及中子散射技术，h e i d o m 和t r e w h e e i a ( 1 9 8 8 ) 观 察到与上述晶体结构相比，钙调素的中央螺旋易于弯曲从而使两球形头部距离比 上述晶体结构靠近1n n q ，表明中央螺旋可能并不是一个完整的。螺旋结构。随 后，i k u r a 等( 1 9 9 1 ) 利用n m r 进一步解析了c a 2 + c a m 的结构，发现在由6 5 9 2 氨基酸残基构成的中央q 螺旋中由7 8 培1 氨基酸残基构成的一段序列为非螺旋 区，并且他们进一步证实这一段非螺旋区有很强的柔性，当钙调素与其靶酶结合 时，具有柔性的中央螺旋变得更加伸展，以使钙调素能够与不同分子质量( 空间 结构1 大小的靶酶相互适合( 1 k u r a ，1 9 9 2 ；m e a d o r ，1 9 9 3 ) ，以至于有人指出应将 中央螺旋称为中央索链更准确( f i n n ，1 9 9 5 ) 。 自从1 9 8 5 年解析大鼠c a 2 + c a m 空间结构以后，又有源于入( c h a t t o p a d h y a t a ，1 9 9 2 ) 、果蝇( t a r l o r ，1 9 9 1 ) 、草履 y - - , ) 、h 大学研究生学忙论文 虫( r a o ，1 9 9 3 ) 、牛( v a n d o n s e l a a r ，1 9 9 4 ；c o o k ，1 9 9 4 ) 以及爪蟾( z h a n gm ，1 9 9 5 ) 等物种c a 2 + 一c a m 空间结构被解析，其中人c a 2 + _ c a m 空间结构的分辨率已达0 1 7 m ( 图1 ) ，在该分辨率下，已基本可分辨除h 之外的其他几种构成蛋白质的原子 如c 、n 、o 、s 等的空间位置。 圈1c - m 的空问皤掏 q 十喇伴代表c - ” 图lc a m 的卒间结构 1 1 3 钙调素的作用彰l 理 c a m 作用机理的要点是：c a 2 + 与c a m 结合而激活c a m ，活化了的c a 2 + c a m 再与多种酶结合，从而调节酶的活力，最终引起生理生化反应( 孙大业，1 9 8 6 ) 。 整个过程可以分为3 个连续的步骤：( 1 ) c a 2 + 与c a m 的钙结合区结合。c a m 有 4 个钙结合区，可能有1 6 种结合方式，这与c a m 的多种功能有关。最新观点认 为，c a 2 十与c a m 的结合是一个渐进性的协同反应，即1 分子c a m 首先与2 分 了的c a 2 t 结合，进而促进另2 个c a 2 + 结合；( 2 c a m 的构象发生变化。当c a m s 兰州大学研究生学位论文 与c e + 结合后，其螺旋度增加，酪氨酸荧光增强，分子变得致密，疏水区暴露 ( 3 ) c a m 与靶蛋白( 酶) 结合，酶被激活，从而触发各种相应的生理生化反应。c a m 与c a 2 + 的结合与否取决于细胞内外c a 2 + 的浓度差。通常细胞液c a 2 + 水平存 1o 8 1 0 。6m o l l 以下，而胞外可达1 0 m o l l 。 c a 2 + 可以通过质膜上的钙通道f 有 电势通道与受体通道) 和钙泵进出细胞，也可以贮存于胞内的钙库( 内质网、线 粒体等细胞器) 。在1 个细胞体系中，当某个刺激到达时，质膜上的c 矿通道打 丌，c a 2 + 内流使细胞液c a 2 + 浓度瞬间增加，达阈值( 常为1 0 击m o l l ) 时即与 c a m 相结合，形成c a ”c a m 复合体，这种激活状的c a m 即可进而与其靶酶结 合而使之激活( 李晓东，1 9 9 3 ) 。由于这些酶中也包括了跨膜运输的c a 2 + a t p 酶， 所以到一定程度( 信息传递完毕) 时，c a 2 + 又被反馈泵泵出细胞或泵入胞内钙 库，至细胞液中c d + 水平低于闽值叫，c a 2 + 一c a m 复合体解体，c a m 与靶酶均四】 复到原来无活性的状态。据推测，c a 2 + 浓度的改变，可引起c a m 构象定量地改 变，从而产生不同的c a 2 + 一c a m 构象体，使得c a z + _ c a m 能与不同靶酶相互作用。 1 2 植物钙调素研究进展 1 2 1 植物c a m 的基因结构及其多型性 将得自丁| 小麦、大麦、酋蓿、马铃薯和拟南芥的c a m 的蛋白序列和c d n a 序列间菠菜的序列相比较，发现其氮基酸序列同源性很高( 对于小麦、大麦 c a m 一1 、苜蓿、拟南芥菜为9 7 一9 9 ，对于马铃薯为9 2 ) ( r o b e r t s 和h a r m o n 1 9 9 2 ) ，表明单子叶植物和双子叶植物的c a m 有高度的保守性。另外，将分离自 不同植物的编码c a m 的c d n a 所导出的氨基酸序列同鼠的c a m 氨基酸序列相比 较，可以发现c a m 的氨基酸序列在动、植物之间也有极高的保守性( p o o v a i a h 兰州大学研究生学位论文 和r e d d y ，1 9 9 3 ) 。最近发现了在基因结构上存在差异的异型c a md n a 克隆。 z i e l i n s k i 等( 1 9 9 0 ) 对大麦的一个基因组d n a 克隆进行了鉴定和测序，发现它 编码的蛋白( 大麦c a m 一2 ) 同大麦c a m - 1 有较高的同源性( 7 6 ) 。这个蛋白在 序列上的位置替换有6 9 位的t h r ，7 0 位的m e t ，8 5 位的i l e ，8 6 位的a r g 和1 4 3 位的g l u 等等。但是用n o r t h e r n 印迹法没有检测到编码大麦c a m 一2 的m r n a ， 所以这个d n a 在体内能否表达仍未确定，可能是个不表达的假基因，或者它的 表达水平非常低，以至于检测不到相应的m r n a 和蛋白。另外，对拟南芥和其 它高等植物的研究表明它们含有编码c a m 的多拷贝基因。在拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 中存在多拷贝的c a m 基因( a c a m 1 ，a c a m 2 和a c a m 一3 1 ( p o o v a i a h 和r e d d y ， 1 9 9 3 ) ，它们在核苷酸序列上是有差异的( 同源性大约为8 6 ) 。a c a m 2 和 a c a m 3 编码相同的蛋白质，这个蛋白和a c a m 。1 所编码的蛋白在c a 2 + 结合区域 之外的四个保守位置上存在区别。这三个基因的体内表达也有差异，例如在根部 只检测到了a c a m - 1 的m r n a ，说明a c a m 一1 可在体内正常表达，而a c a m 2 和a c a m 3 是不表达的或表达水平极低。这些表达程度不一的异型c a md n a 所 编码的蛋白在体内的生理意义仍有待进一步研究。在上述的a c a m 一3 中，基因编 码区被一个位于第2 5 位氨基酸之后的4 9 1b p 的内含子所间断。类似的情况在水 稻中办被发现。从水稻中克隆得到两种c a m 基因( c a m 一1 ，c a m 一2 ) ，它们推导 出的氨基酸序列高度同源，只是在1 3 9 位氨基酸被替换。在水稻c a m 一1 中存在 一个1 4 0 0b p 的内含子，在c a m 2 中存在个7 7 0b p 的内含子，它们都位于第 2 5 位氨基酸之后。同样，在苹果的c a m 基因中2 5 位氨基酸之后也有一个8 6 0b p 的内含子，而衣藻的c a m 基因中有血个内含子，其中第一个内含子也是位于第 2 5 位氨基酸之后( p o o v a i a h 和r e d d y ，1 9 9 3 ) 。叫见在高等植物的c a m 基因中， 兰州大学研究生学位论文 内含子的位胃和数量似乎是保守的，但是这种内含子在c a m 基因的表达中起何 种作用目前仍不清楚。此外，克隆得到的另一种拟南芥菜c d n a a p 2 1 ( z i e l i n s k i 等，1 9 9 0 ) ，编码1 个c a m 类似物，它与c a m 序列有6 7 的同源性， 且有四个e f 手型结构。除了序列上的替换外，这个蛋白明显地不同于其它c a m 和类似c a m 的序列，它在中央螺旋区缺失三个残基( 7 4 7 6 位) ，而且在羧基端 有一段4 5 个氨基酸残基的延伸。同样地，分离自矮牵牛的一种c a m 相关的 ( c a m - r e l a t e d ) c d n a 序列在羧基端也有一段3 5 个氨基酸残基的延伸( p o o v a i a h 和r e d d y ，1 9 9 3 ) ，而且在这段残基中4 0 是带电荷的。目前为止，对这些类似 c a m 的蛋白质的功能尚不了解。 1 2 2 c a m 三甲基化l y s 的功能 在c a m 的氨基酸组成中，一个显著的特征是1 1 5 位赖氨酸的三甲基化( 孙大 业，郭艳林，1 9 9 1 ) ，它是由特异的c a m n - 甲基转移酶催化的翻译后修饰的结果。 甲基化和非甲基化的c a m 在对n a d 激酶( n a d k a s e ) 的激活性质是有区别的。 衣藻c a m 中不含有三甲基一l y s ，在体外对这种c a m 进行甲基化( p o o v a i a h 和 r e d d y ，1 9 9 3 ) ，结果它激活n a d k a s e 的能力同非甲基化的衣藻c a m 相比至少降 低了三倍，而甲基化并未影响这种c a m 对哺乳动物p d e 酶的激活性质。进一步 地，通过基因工程得到了一种在1 1 5 位由a r g 代替了l y s 的衣藻c a m ，它可以 有效地激活n a d k a s e ，而且它的激活作用不受甲基转移酶的影响。另外，在豆 科植物中c a m 甲基化的水平可依不同组织的发育情况而变化，在胡萝hv u 一1 植株同对照相比无明显区别，所以可以认为v u - 3 所表现的不同是由于c a m 甲 基化突变的结果。 兰州大学研究生学位论文 1 2 3c a m 与c a 2 + 的结合 同c a 2 + 的结合是c a m 活化的重要条件。普遍认为c a m 的四个c a 2 + 结合区 中，n 端的i 、i i 区为低亲和力区，c 端的h i 、区为高亲和力区( 孙大业， 郭艳林，1 9 9 1 ) ，两者的半饱和浓度分别是1 1 0g m o l 1 及3 0 “t o o l 1 ，高亲和力区 结合c a 2 + 会使低亲和力区对c a 斗的亲和力增加。进一步研究表明两个成对的结 合区之间也存在协同作用( w i l l i a m s ，1 9 9 2 ) 。通过对c a m 溶液的晶体学分析和 核磁共振研究可知道，c a m 分子端的两个c 2 + 结合手形结构是相互关联的， 在这两个结合区中，相互对应的结合c a 2 + 的环结构的肽段之间形成了反平行的 b 片层结构，这样二者之问不可避免地表现对c 2 + 结合的协同性，即两个手形 结构同时结合c a 2 + 时对c a 2 + 的亲和力要大大高于单独一个手形结构对c a 2 + 的 亲和力。这种协同性可能和c a m 结合c j + 的构象变化有关。y a o 等( 1 9 9 4 ) 用 频域荧光光谱学方法分析了麦茎c a m 和c a 2 卞结合后构象变化的具体细节。用于 检测构象变化的荧光来自于在c j + 结合区中1 3 9 位的t y r 以及共价结合在c a 2 + 结合区中2 7 位c y s 上的n 一1 ( 1 - 芘基) 顺丁烯乙酰亚胺( p m ) 或者4 - 碘乙酰胺基 水杨酸f i a s a ) 。结果表明随着c a 2 + 的结合，( 1 ) 结合于2 7 位c y s 的p m 和 i a s a 以及1 3 9 位t y r 的旋光性增加，( 2 ) 整个蛋白分子的旋光性降低，( 3 ) 2 7 位c y s 和1 3 9 位t y r 之间的分隔距离减小，( 4 ) 中央螺旋构象的柔韧性降低，因 此c a 2 十结合后中央螺旋变得伸展而且有刚性。这种依赖c a 2 十的构象变化可使定 位于球状区域中的疏水结合位点暴露。由于完整的c a m 分子两端的e f 手形结 构对c a 2 + 的亲和力不同，结合了c a 2 + 的c a m 分子n 端i 、i i 区中c d + 的解 离速率比c 端的1 1 1 、区要快，所以被c a 2 + 激活的完整的c a m 分予很可能通 兰州大学研究生学位论文 过n 端c 2 + 的交换来敏感地反映环境中c a 2 + 的浓度变化，进而调节整个c a m 分子对c d + 的结合状念，来完成激活向失活的转化。c a m 分子的整体的构象变 化是其执行生理功能的必要条件。 1 2 4c a m 的基因表达 通过对c a m 和c a m 相关基因的研究，可以直接或间接地说明c a m 在生理过 程中的作用。不同的物理和化学信号可以诱导出对应于c a m 和c a m 相关基因的 不同的m r n a 。j e n a 等( 1 9 8 9 ) 用马铃薯c a mc d n a 做探针，分别研究了在生 长素敏感的草莓果实和光敏感的玉米根部中生长素和光信号对c a m 基因表达的 影响。生长素处理过的草莓果实同对照相比c a mm r n a 水平升高，而且将暗处 生长的玉米根尖暴露至光下也使c a mm r n a 水平有所增加。b r a a m ( 1 9 9 2 ) 在对 拟南芥菜的研究中发现，触摸、风、雨、伤害刺激可迅速( 1 0 - 3 0 分钟内) 诱导 出对应于四种不同的c a mc d n a ( t c h l ，t c h 2 ，t c h 3 ，t c h 4 ) 的l n r n a 。伤 害同样可以诱导苹果c a m 基因的表达。另外的研究表明触摸和风信号能提高细 胞质c a 2 + 浓度，而且c a 2 + 可以调控一些触摸基因的表达( b r a a m ，1 9 9 2 ) 。因此， 触摸信号传导的可能过程首先是细胞质c 扩浓度升高，进而它可顺次地调控特 定基因的表达，当然也包括编码它的受体c a m 的基因( p o o v a i a h 和r e d d y 1 9 9 3 ) 。可见，至少在某些信号的传导过程中，调幅机制和调敏机制( 孙大业， 郭艳林，1 9 9 1 ) 是协同作用的，即首先由于细胞内c a 2 + 增加而通过调幅机制起 作用，接着由于c a 2 + 增加引起c a m 基因的表达使c a m 增加，调敏机制开始作 用，从而完成个信号传导所产生的完整的生理变化。有趣的是，这些对应于不 同物理、化学信号的c a m 基因的表达很可能并非是专一于某一种信号的传导过 兰州人学研究生学位论文 程中。b o t e l l a 和a r t e c a ( 1 9 9 4 ) 用拟南芥菜的t c h 1 做探针，从红豆 r a d i a t e l a m b d a g t i i 基因文库中分离出了两种不同的c a me d n a f m b c a m - 1 和m b c a m - 2 ) ，它们所编码的多肽链只在第7 位和第1 0 位氨基酸有差别。s o u t h e r n 法 分析表明它们由不同的基因所编码。它们对应于触摸信号的表达也有差异，m b c a m 一1 的m r n a 水平在触摸反应中有一个明显的瞬时增加，而m bc a m 一2 的 m r n a 水平则表现一种比较小的但却是稳定的增加。这两种c a mc d n a 同光信 号的传导也有关系。当植株在完全黑暗下生长时，m bc a m 1 是不表达的，m b c a m 一2 的表达水平也非常低。将这样的黄化苗暴露至光下一小时后，m bc a m 一2 的表达有所增加，而m bc a m 1 没有变化；在光下生长六小时后，m bc a m 一1 和m bc a m 2 的表达都有增加。当植株生长在1 6 小时光期8 小时暗期的周期中 时，m bc a m 1 的m r n a 水平在光期比较低，但在暗期的丌始有所增加，而m b c a m 一2 则没有这种变化。这两种c a m 基因还同盐胁迫的信号传导有关。当植株 处于盐胁迫状态下时，m bc a m 一1 在处理2 小时后表达增加，并在处理4 小时后 达到最大值，而m bc a m 2 在整个时间过程中不发生变化。这些结果说明了c a m 基因表达的调控并非是一种c a m 基因对应于一种信号那样简举，同时这也是 c a m 生理功能复杂性的一种表现。转基因植物也被应用于c a m 基因表达的研究。 p o o v a i a h 等( 1 9 9 3 ) 利用一种携带有水稻c a m 2 的启动子和c a 2 + t ( 氯震素乙酰 转移酶) 受体的融合基因的转基因植物，对水稻c a m 基因表达进行了研究， c a m 2 启动子的活性可通过“报告基因”c a 2 + t 活性的分析测定来反映。这种 c a 2 + t 受体基因在所有被检测的营养器官和生殖器官中都可表达，说明c a m 一2 启动予在所有植物器官中都是有活性的。但是它在茎、叶柄、叶脉组织中表达较 高，而在叶片中则较低。同时，幼龄叶片的不同部位和老龄叶片的对应部位相比， 兰州大学研究生学位论文 幼龄叶片中的c j + t 活性较高。另外，在所有被检测的不同部位中，花药具有最 强的c a 2 + t 活性。这些都说明了在植物体的不同组织、器官中，c a m 基凶表达 的调控机理不同，因而c a m 基因的表达是有区别的，亦即不同组织、器官中含 量不同，这可能和执行不同的生理功能有关。p o o v a i a h 等( 1 9 9 3 ) 还设计了其它 一些转基因烟草，它们分别含有马铃薯c a mc d n a 的表达链和反义链，并由c a m v 3 5 s 启动子所启动。同对照相比，含有表达链结构的转基因烟草中c a mm r n a 水平提高了5 0 倍，而含有反义链结构的转基因烟草中c a mm r n a 水平普遍降 低。同时，c a m 反义链m r n a 的稳定程度也要低于由c a m v 3 5 s 启动子所启动 的c a m m r n a 。但是对c a m 活性和w e s t e r n 印迹法的检测结果表明，这些转基 凶植物在c a m 的蛋白总量上同对照相比并无明显区别。z i e l i n s k i 等( 1 9 9 0 ) 对携 带有c a mv 3 5 s 启动子和大麦c a me d n a 表达链或反义链两种取向的融合基凼 转基因植物进行了研究，得到的结果和p o o v a i n l 的结果大致相同。因此，在植 物细胞中除了c a m 基因的表达外，很可能还存在有其它可在翻译或翻译后水平 上调控c a m 的存在数量的因子。 1 3c a m 生理功能的研究 c a m 生理功能的研究涉及面相当广泛，在酶活性调节，细胞分裂与分化，细 胞骨架与细胞运动，光合作用，孢子、种子、花粉萌发，激素反应，核内酶系统 及基因表达等等生理过程中，都有c a m 的参与( 孙大业，郭艳林，1 9 9 1 ) 。g u n t h e r 等( 1 9 9 3 ) 在对光敏素调控基因表达的研究中发现了光敏素信号传导系统中c a 2 + 和c a m 的作用。他们巧妙地利用了细胞微注入技术，即用缺乏活性光敏素( p h y a ) 番茄突变a u r e a 做受体，将小麦c a b 基因( 编码p s 的叶绿素a ，b 结合蛋白) 的扁 兰州大学研究生学位论文 动子和报告基因g u s ( 编码d 一葡萄糖苷酶) 的融合基因注入，在注入燕麦p h y a 时，可以观察到在红光照射下，a u r e a 植株中有c a b g u s 基因的表达，而在瞬间 红光之后给予远红光照射则c a b g u s 不表达，这说明外源加入的p h y a 可以在转 录水平上调控c a b 基因的表达。另外，他们将c a b g u s 基因和有ca _ 2 + 结合的活 性牛脑c a m 注入a u r e a 植株，发现活性c a m 也可使c a b g u s 基因表达，而且这 种表达只发生在c a m 注入的细胞中，而在临近细胞则不表达，但是用没有结合 c a 2 + 的非活性c a m 注入细胞并不能启动c a b g u s 基因的表达。同样用纯化的矮 牵牛c a m 也可有效地启动c a b g u s 基因的表达。这说明c a m 参与了光敏素调 控的基因表达过程。龚明等人对c a m 在花粉萌发中的作用进行了一系列的研究。 他们从松树中纯化了c a m ( g o n g m i n gy a n g ，z h o n g - h a n ，t s a o ，1 9 9 3 ) ，并进行 了序列分析，发现在氨基酸组成上这种c a m 同菠菜c a m 有很高的同源性。接着 用e g t a ，a 2 3 1 8 7 ，w 7 ，g p z 等c a 2