（微生物学专业论文）杜氏盐藻纯化及生物学特性研究.pdf

摘要 本文系统研究了杜氏热藻的生物学特性，主要内容包括杜氏盐藻无菌纯化、杜氏 盐藻生理学特性、杜氏盐藻遗传学特性等三部分。 采用抗生素结合离心技术、离心洗涤结合稀释技术以及盐藻耐盐特性等三种1 i 川 方法对杜氏热藻进行无菌纯化，获得无菌杜氏盐藻藻株a l 、a 7 、a 1 3 ，a 1 4 和a 2 1 。 经过不同方法检测，确证该5 藻株属无菌藻株。 利用无菌藻株a 1 研究了影响杜氏盐藻生长的营养因子，如赫度、维生素、激察、 有机碳源、有机氮源、动植物抽提液等。结果表明：该盐藻藻株i 适应0 2 9 2 5 9 l “n a c l 浓度，n a c i 浓度的突增会使杜氏赫藻的生长出现停滞，停滞期的长短 与终n a c l 浓度有关：添加1 5 0 p g l 。v b l 、1 6 0 g l 。v b 6 、0 5 g l “v b l 2 3 2 0 m g 一v c 及2 ，o 斗g l v h 可在一定程度上促进藻的生长：液体培养发现葡萄糖的促长效果比醋 酸钾好，以1 肛1 5 9 l “浓度为最佳，而固体培养时则以1 0 3 0 9 l 。效果最佳：尿素的 促长效果要好于甘氨酸，以o 1 9 - l 4 浓度为最佳； n a a 、肌醇、6 一b a 、k t 和g a 促进藻细胞生长的最佳浓度分别为3 、5 5 、4 o 、o 1 和0 2 m g l _ l ；2 0 4 0 m l l 1 龟汤 可强烈地促进藻细胞分裂，建议在盐藻培养基中添加一定裱度的鱼汤作为献藻完全培 养基，以用于筛选营养缺陷型藻株；1 0 0 m l l - 1 土豆汁和l o o m l - l 1 豆芽汁均可以在 定程度上促进藻落的生长；蛋白胨以4 两g l o 效果最佳。选取四种促长效果最佳的营 养因子进行_ _ i _ f 交，结果表明以5 8 5 9 l “n a c l 、3 2 0 m g l “v c 、o 2 9 l 。尿素和1 5 9 一 葡萄糖为最优组合。 杜氏赫藻对抗生素、除草剂和代谢产物类似物敏感程度因抗生素、除草剂和代谢 产物种类不同而有所差异。液体培养中c m 、e m 和p p t 对盐藻的最低抑制浓度分别 为1 2 0 、2 8 和5 i n g l ；固体培养c m 、e m 、p p t 和a c t 对赫藻的最低抑制浓度6 0 、 1 6 、3 和o 2 m g 乙- ：固体培养中盐藻对s m 、k m 、a m p 和n m 均不敏感，甚至浓度 达1 0 0 0 m g l 1 胡i 不能产生任何抑制作用。液体培养中刀豆氨酸、异烟肼、玲监氨酸平 6 - 毓基嘌呤对盐藻的最低抑制浓度均超过2 0 0 m g l i ，而p 氟苯丙氨酸最低抑制浓度 则为1 8 0 m g l 。 盐藻无完整的纤维质细胞壁，有一层糖蛋白包裹于外层。研究发现以5 m m o 【l 一一 h e p e sp h 7 ，5 为缓冲液和o 5 m o l l 山梨醇为稳渗剂，采用4 0 0 m g ，l “的链霉蛋向酶， 3 0 ，酶解l 小时可以获得较高的原生质体形成率，且效果要略好f 蛋白酶k 、术瓜 蛋白酶和胃蛋白酶。 和其它一砦微藻相比，杜氏盐藻对紫外线抵抗能力较强。紫外线致死削景略人j j 6 0 j m 五。9 0 致死剂量为1 3 9 2j n 1 t 2 ，该剂量适于作为诱变剂量。 采用不同方法对盐藻进行保种研究，结果表明盐藻适宜于液体、平板和斜面保种。 关键词：杜氏盐藻无菌纯化营养因子抗生素原生质体 a b s t r a c t i nm i st h e s i s ，t h eb i o i o g i c a lc h a r a c t e r i s t i co fm 胛棚已肋s 劬门口，w h i c hi n c i u d e dt h e a x e n i cp u r i f i c a t i o n ，p h y s i o i o g yc h a r a c t e r i s t i c sa n dg e n e t i c sc h a r a c t e r i s t i c s ，w a ss t u d i e d s y s t e m a t i c a l l y t h r e ed i f f e r e mm e t l l o d si n c l u d i n gt h ec o m b i n 砒i o no fa n t i b i o t i c sa n dc e n t r i f u g a l t e c h n j q u e ，l ec o m b i n a t i o no f c t r i 地a l 、v a s h i n gt e c h n i q u ea 1 1 dd i l u t i o nm e t h o d ，a n dh i 曲 c o n c e n t r a t i o no fs a 】tw e r ed e s i g n e dt op m c e e df o rp u r i 矗c a t i o no fd 阳z f ”“f j v ea x e n i c 啦a i n so fd s 甜f 胛口w e r eo b t a i n e d ，a i l da x e n i cs t a t u sw a sc o n f i r n l e db yd i a e r e n tm e t h o d s t h ei n f l u e n c eo f d i 仃b r e n tn u t r i t i o nf a c t o r s ，t h es a i tc o n c e n 仃a t i o n ，v “a m i n s ，h o n l l o n e s o r g a n i cc a r b o ns o u r c e s ，0 唱a n i cn i 仃o g e ns o u r c e sa n de x t r a c t so fa 1 1 i m a la n dp l a l l t ，o nt h e 伊o w mo fs t r a i na lo fd s 耐泐w e r ei n v e s t i g a t e d ，t h er e s u h ss h o w e dt h a td 期加口c a n a d a p tt o0 2 9 2 5 9 l - ln a c l ，a n da b r u p ti n c r e a s eo fn a c lw o u l di n d u c el a gp h a s eo ft h e g r o w t l lo fds 棚肝口，a n dt h el e n g mo ft h ep e r i o dh a sb e e nr e l a t e dw i t hc o n c e n t r a t i o no f n a c l t h eg r o 州ho f d 硼z 泐w a sp r o m o t e di ns o m e 啪yb yv b i ，v b 6 ，v b l 2 ，v co rv h a n dt h eb e s tc o n c e n 仃a t i o n sw e r e1 5 0 “g l ，1 6 0 扯g l ，o 5 “g l - 。，3 2 0 m g l 。a n d2 o “g l ， r e s p e c t j v e j y 确ep r o m o t i n ge a e c to fg l u c o s ew a sb e 托e rt h a l lp o t a s s i u ma c e t a t e ia n dt h e m o s ts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n si n l i q u i d 锄ds o l j dm e d i 啪w e r e10 15 9 l - l a n d l o 3 0 9 l 1 r e s p e c t i v e l y t h ep r o i n o t i n ge 仃e c to f u r e a 啪sb e t c e rt h a ng l y c i n e ，a 1 1 dt h em o s t s u i t a b l ec o n c e n t r a t i o ni n l i q u i dm e d i u m 、v a s0 1 9 + l i n o s i t o l ，n a a ，6 一b a ，k ta n dg a c o u l da l s op r o m o t e 廿1 eg r o m ho fd5 口，加吼a n dt h eb e s tc o n c e n t r a t i o n sw e r e5 5 3 ，4 ，0 1 a n do 2 m g l “r e s p e c t i v e l y 2 0 4 0 m i l 叫f i s hs o u p ，1 0 0 m l l - 。b e a ns p m u tj u i c e ， l0 0 m l l p o t a t oj u i c ea n d4 石g l q p e p t o n ec o u l dp r o m o t et h ed i v i s i o no fd 占口z f 门口t h e j o h n s o n sm e d i u m 埘t b6 s hs o 印c a nb er e g a r d e da sac o m p 】e t em e d j u m0 fd _ m ，胁口a 订d m i 曲tb eu s e dt os e l e c tt l l e 撇o t m p h s 打a i no fds 口，胁口t h eo 吡o n o g a lt e s tw a sd e s i g n e d t os e a r c ht h eo p t i m 啪c o n c e n t r a t j o no fm a j o ra f f e c t i n gf a c t o r so fn a c l v c u r e a ，a n d g l u c o s e t h er e s u l ts h o w e dt h eo p t i m 啪m e d i u mf o rm i x o t r o p h i c 伊o 、v t ho fs t r a i na 1w a s n a c l5 8 5 9 l - 。，v c3 2 0 m g l i ，u r e ao 2 9 l 。1a n d g l u c o s e1 5 9 - l t h es e n s i t i v ed e g r e eo fd 船，加口t oa n t i b i o t i c s ，h e r b i c i d ea 1 1 dm e t a b o i i t ea n a l o g 、a s d i f f e r e n t t h em i n i m u mi n h i b i t e dc o n c e n t r a t i o n s ( m i c ) o fc m ，e ma n dp p ti n1 i q u i d f e r m e n ta m o u m e dt o12 0 ，2 8a t l d5 m g l ，r e s p e c t i v e i y ，w h i l et h em i c so fc n l ，e n ，p p t a n d a c ti ns o l i dm e d i u mw e r eo n l y6 0 ，16 ，3a 1 1 d0 2 m g l ，r e s p e c t i v e l y t h em l c so fs m ， k m ，a m p n mw e r eo v e r1 0 0 0 m g + l “ i ns o l i dm e d i u m t h em i c so fi s o n i a z i d ， l c a l l a v a n i n e ，l a z e t i d i n e 一2 一c a r b o x y l i ca c i da n dm e r c 印t o p u r i n ef o rn “l “州，i nl i q u i d m e d i u mw e r eo v e f2 0 0 m g l ，w h i l et h em i co fp f l u 甜o p h e n y l 甜a n j n ew a so n l y 1 8 0 m g 一 d5 口? 铆盘h a sn oc o m p l e t e 磊b f o u sc e l lw a l ! ，b u tg l y c o p r o t e ；nc o a to nt h ee x t e r n a i i a m e l l ao ft h ep l a s m a l e m m a t h ep r o t o p l a s t sc a nb eo b t a i n e db yp r o n a s ebj nb u f 弛ro f 5 m m o l l “h e p e sp h 7 ，5w i t h0 ，5 m o l l “s o r b i t o la so s m o t i c s ，a n dt h ee & c to fp r o n a s eb w a s1 i t t i eb e t t e rt h a nt h o s eo fp r o t e i n a s ek ，p a p a i n ，a n dp e p s i n t h eb e s te n z y m o l y s i s p a r a m e t e r sw e r ea sf o i i o w i n g ：4 0 0 m g l _ p r o n a s eb ，l ho f i s o i a t i o nt i m e ，3 0 t h er e s i s t a n ta b i l j t yo fd 阳，仂口t ot h eu l t r a v i o l e tr a yw a ss t r o n g e rt h a no t h e r m i c r o a l g a e s t h ei r r a d i a t i o na t ad o s eo v e r6 0 j m c o u k lc a u s ed e a t ho fd s n f i ”以 c o m p j e t e i y t h e9 0 l e t h a ld o s ew a s13 9 2 j m ，a n dt h ed o s ew a ss u i t a bj ef o rt h e i s o i a t i o no f m u t a n co f dj 日f j h 口 t h ep r e s e r v a t i o no fa x e n i cs t m i no fdj 口，加日w a si n v e s t i g a t e dw i t hd i f 托r e n tw a y s t h er e s u l t ss h o w e dt h ea l g a ec o u l db ep r e s e r v e di nl i q u i dm e d i u m ，p l a t e ，a n ds i a n t k e yw o r d s ： d 。f 玎d ，f 已，肠j d ，f 肝d a n t i b i o t i c s a x e n i cp ur i f i c a t i o nn u t r i t i o nf a c t o r s p r o t o p l a s t v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或正书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：筵奎：l 时问：2 0 0 4 年0 6 月l o 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保尉、使用学位论文的规定，即：学校仃权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，司以采用影印、缩印或扫捕等复 制手段保存、汇编学位沦文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体l 发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 连奎：l 时间：2 0 0 4 年0 6 月1 0h 导师签名： 盛丛塑 时f 日j ：2 0 0 4 年0 6 月1 0f 缩写 g e n a m p e m c m p p t n m s m a c t k m h e p e s m i c 6 b a g a k t n a a v b l v b 6 v b l 2 v c v h d m s o c h l c k d g 缩略词 英文全名 g e n 踟y c i n a m p c i l l i n ， e r y m m m y c i n c h l o m m p h e n i c o l p h o s p h i n o t l r i c i n i c n e o m y c i n s 打印t o m y c i n a c t i d i o n e k a r l 锄y c i n ， n 2 一h y d r o x y e 伽】p i p e r a z i n e - n 一【2 e 恤m e s l l l f o n i ca c i d 】 m i n i m 哪i n h j b i t e dc o n c e n n j a t i o n 6 一b e n z y ia m i n o p 面n e 百b b e r d l m k i n e t i n n a p h t l l a l e n e a c e t i ca c i d v i t 锄i n eb i v i t a m i n eb 6 v i t a m i n eb 1 2 v i 协m i i l e c v i t a m j n e h d i l l l e t h y l - s u l f o x i d e c h l o r o p h y n c o n n d l d a y g e n e m 廿o n 中文名 庆大霉素 氨节菏霉素 红霉素 氯霉素 草酊磷 新霉素 链霉素 放线菌酮 卡那霉素 n 双( 2 羟乙基) 哌 嗪n 2 ( 乙磺酸) 最低抑制浓度 6 苄氨摹嘌呤 赤霉素 激动素 ( 6 糠基嘌呤) 萘乙酸 维生素b l 维生素战 维生素b 1 2 维生素c 维q 三索h ( 生物素) 二甲基姬砜 绿索 对照 灭 代 泰经作：肴、导肺阀魁 垒文公希 第一章引言 海洋是生物资源的宝库，海藻尤其是杜氏盐藻的研究与开发正受到越来越多的关 注。札氏盐藻属绿藻门、绿藻纲、团藻目、杜氏藻科、杜氏藻属，广泛分布于海洋、 盐湖等盐度较高区域，无细胞壁，原生质膜外有一层糖蛋白外被2 1 。藻个体通常旱卵 圆形，具2 条等长的鞭毛。藻体内有一杯状叶绿体，内含一淀粉核，前端有重【色眼 点。营养繁殖为纵裂，有性生殖为同配生殖，形成红色或绿色接合予。 1 1 研究价值和意义 在一定的生长条件下，盐藻细胞内可大量积累b 一胡萝卜素和甘油，在食品、 医药保健、化工和养殖业中有独特经济价值。 盐藻应用于理论研究有如下优点： ( 1 )盐藻有广泛的盐适应度，有利于进行相关耐舳基因和渗透调节机制的研究； ( 2 )营养细胞是单倍体，便于对其进行遗传改造和遗传分析： ( 3 )缺乏细胞壁，易于制备原生质体，为遗传转化和细胞融合奠定了良好的基础； ( 4 ) 易培养，町以构建新的生物反应器，高效地表达些重要基因。 本文拟从影响杜氏盐藻生长的营养因子出发，研究生长因子( 维生素j 激素等) 、 有机碳、氮源和复合营养等对杜氏盐藻生长的影响，探讨杜氏盐藻生理生化特性，为 进一一步开展盐藻分子遗传研究奠定基础；为混养培养时增加生物量提供参考。基r 提 高植板率考虑，添加一些营养因子考察藻落生长情况，确立盐藻平板生长的最佳条件。 从盐藻对抗生素、除草剂和代谢产物类似物的敏感性着手结合紫外诱变，试图获得 些筛选标记和抗代谢物抗性突变体，为深入丌展盐藻转基因工作奠定基础。 1 2 国内外研究现状 藻类纯培养是生理生化和遗传研究的基础。获得纯培养主要有离心洗涤法f 3 。4 i 、 稀释过滤法【5 j ；抗生素法【6 1 、消毒法【7 】、毛细管显微分离法m l o 1 引、利用特性法( 趋 向运动性、耐高盐性等) 和物理法等。 目前国内外相当多的研究组在盐藻生理学【1 4 6 8 ，眦。扎2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 1 、 耐盐机制m 3 2 n 3 4 ，3 5 3 6 3 7 3 8 ，3 9 。o ，4 2 4 3 1 和遗传转化等方面丌展了卓有成效的研究工作。生 理学研究大多集中于无机营养特别是n 、p 等方面的研究，而涉及有机营养对盐藻，l i 长影响的研究却相当少，特别是混养条件下盐藻的生理生化特性研究更是鲜见报道。 盐藻遗传方面的研究主要是筛选一些突变体4 4 ，4 5 ，4 6 删和丌展原生质体融合 【4 8 1 ，4 9 ，5 0 j u 、基因克隆旧5 3 ，5 4 ，5 5 ，5 4 5 5 ，56 5 8 5 9 6 0 ，6 1 ，6 2 1 与遗传转化1 5o 6 3 ，删，然而这些研究榭、 粗糙。获得的突变体不多，能应用于遗传研究的更少。原生质体的再生和融合予的稳 定遗传始终未能得到很好的解决。遗传转化方面虽实现外源基因的瞬时表达，但要将 其作为基因工程表达宿主，仍然有诸如提高植板率、进行有效的筛选等限制盐藻转基 因研究的问题值得去探讨。 1 3 本研究拟解决的问题 针对目前国内外研究存在的主要问题，本研究拟利用杜氏盐藻无菌藻株a 1 丌展 生理学和遗传学相关研究，探讨杜氏盐藻基本生理生化特性获得杜氏盐藻平板生长、 混养培养、转基因有效筛选、原生质体制备、突变株筛选和藻种保藏的最佳条件。 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 试验藻种 杜氏盐藻( d 姗f j e 砌曲z m 口q 0 2 0 7 )由中国科学院青岛海洋研究所提供，经本 室无菌纯化。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 杜氏盐藻培养液 改良的j o l l i l s o i l s 培养基，配方如下： 大量元素( g l 。1 )m g c l 2 7 h 2 0 k n 0 3 n a h c 0 3 c a c l 2 铁盐母液 l o m l 1 mt r i s - h c l ( p h 8 o )1 0m l 铁盐母液：n a 2 e d l 冷2 h 2 0 蒸馏水 微量元素母液： h 3 8 0 3 z n c l 2 c o c l 2 6 h 2 0 蒸馏水 固体培养基加1 0 琼脂粉。1 2 1 ， 2 1 2 ，2 杜氏盐藻无菌检测培养液 a蛋白胨3g b 酵母提取物 5g 蒸馏水l 0 0 0 m l cj o h n s o n s 培养液9 0 0 m l dj o | l l l s o n s 培养液9 0 0 m l e葡萄糖5g 蒸馏水1 0 0 0 m 1 1 5g o 5g 0 1 5 1g o 0 3 5g 微量元素溶液 蒸馏水 o 2 0 9 9 1 0 0 0 m l m g s 0 4 7 h 2 0 k c l k h 2 p 0 4 n a c l 1 0 m 1 9 7 0 m l f e c l 3 6 h 2 0 0 5g 0 - 2g 0 + 0 4 3g 3 0 0g o 2 4 _ 4 9 6 1 0m g ( n h 4 ) 6 m 0 7 仍4 4 h 2 03 8 om g 4 1m g c u s 0 4 5 h 2 0 6 0m g 5 1m gm n c l 2 4 h 2 0 4 1m g l o o o m l 灭菌2 0 分钟。 j o l l l l s o i i s 培养液 蛋白胨 1 0g 1 0 0 0 m l n a c l3 0g ；6 0g 土豆汁 1 0 0 m l 豆芽汁 l o om l 蛋白胨 5g k 2 h p 0 42g 3 21 3 仪器与试剂 2 1 3 1 常用仪器 p y x 一2 5 0 g a 型光照培养箱 回转振荡培养箱 7 2 2 0 型光栅分光光度计 o l y m p u sc o l l 相差显微镜 l e i c a d m l b 荧光显微镜 s c 3 2 6 型冷减柜 t g l 一18 r 台式高速冷冻离心机 l s 5 0 1 立式圆形高压蒸汽灭菌锅 电热恒温培养箱 酸度计 p b 2 0 3 n 电子天平 双筒解剖镜 血球计数板 微量移液器 三角烧瓶 2 1 3 2 主要试剂 s b j c i a 型超净工作台 t u 一18 0 0 s p c 紫外可见分光光度计 7 2 l 型光栅分光光度计 m d f u 5 4 1 0 型医用低温保存箱 j y 9 2 i i 型超声波细胞破碎仪 e m 一5 0 l s 型微波炉 普通离心机 1 0 1 型电子鼓风干燥箱 紫外辐照箱 分析天平 托盘天平 冷冻干燥机 w h 3 微型旋涡混合仪 吸管 平皿 n a c l 、k n 0 3 、m g s 0 4 、m g c l 2 、k c l 、e d t a 2 n a 、f e c l 3 6 h 2 0 、1 l i s h c i h 3 8 0 3 、( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0 4 、c u s 0 4 5 h 2 0 、c o c l 2 6 h 2 0 、z n c l 2 、m n c l ! 4 h ! o 维牛素b 簇( v b l 、v b 6 、v b l 2 ) 、维生素c ( v c ) 、生物素( v h ) 萘乙酸( n a a ) 、肌醇、激动素( k t ) 、6 苄基嘌呤( 6 b a ) 葡萄糖、醋酸_ f l f l 、尿素、甘氨酸 异烟胼、刀豆氨酸、铃蓝氨酸、p ，氟苯丙氨酸6 巯基嘌呤 g e n 、a m p 、s m 、k m 、e m 、c m 、n m 、t c 、a c t 胰蛋白胨、酵母提取物 土豆汁、豆芽汁、鱼汤 链霉蛋白酶 甘油、丙酮、 22 实验方法 山梨醇h e p e s 甲醇、乙醚 2 2 1 抗生素配制方法 表2 1 不同抗生素的配制 t a b 2 1p 化d a m t i o n so f m ed i f f h 呲明t i b o t i c s 2 2 2p p t ( p p t ) 的配制方法 称取p p t ( p p t ) o 1 9 于无菌螺旋管中，加入l o m l 无菌水，充分溶解后，用o 2 2 “m 滤膜过滤。2 0 保存 2 2 3 链霉蛋白酶缓冲液和原生质体稳渗剂的配制方法 缓冲液的配制：5 m m o l l - 1h e p e sp h 7 5 稳渗剂的配制：o 5 m 0 1 l - l 山梨醇 2 2 4 链霉蛋白酶的配制方法 称取链霉蛋白酶o 2 9 于无菌螺旋管中，加入l o m l 酶反应缓冲液，充分溶解后， 用0 2 2 u m 滤膜过滤后，分装成小份，放入2 0 保存。每次使用拿一小份即可。 2 2 5 代谢产物类似物的配制方法 表2 2 不同代谢产物类似物的配制 一一! 竺：! 型! 坚! ! ! 型盥竺竺型! 坐! 唑墅 ! i ! 堕耋! 竺丝墅型塑婆 鳖鱼丝堕壁! ! ：_ ! 鳖坚笙一 异烟肼 ( j 5 0 n i a z l d ) 川豆氨艘 ( j c a n a v a n i n e ) 铃蓝氨簸 【l a z e t i d i n e 一2 一c a r b o x y l i ca c i d ) p 氟苯山氨艘 ( p n u o r o p h e n y l a l a n i n e ) 6 一巯早嘌呤 【m e r c a p t o p u r i d e ) 先用少量无水 i ! ! f 精溶解， 再用j e 茸蒸馏水定容。1 0 02 2 m 滤膜过滤 溶于无菌燕馏水 0 2 2 l l m 滤膜过滤 溶卡无菌蒸馏水 o2 2 “m 滤膜过滤 先用少量光水淄精 l = f 斛， 卅用尤菌蒸馏水定容。2 o 2 2 “m 滤膜过滤 丸用少量1 m hc l 溶解， i q 用无菌蕉馏水定容。 2 0 仪存 2 0 保存 2 0 慌仔 2 0 保存 2 0 雠存 ! ：! ! ! ：要鎏堕基堕 226 土豆汁、豆芽汁等天然营养成分贮备液的配制方法 土豆汁的配制：新鲜成熟土豆去皮，蒸馏水洗净，切成块后，称3 5 0 9 放入不锈 钢容器内，加入4 0 0 m l 蒸馏水，加热煮沸半小时，煮沸过程中不断补充蒸馏水，使汁 液的体积始终维持4 0 0 m 1 左右，然后用8 层纱布过滤，定容至5 0 0 m 1 ，1 2 1 灭菌2 0 分钟。 豆芽汁的配制：称新鲜豆芽l o o g ，放入不锈钢容器内，加水4 0 0 m 1 ，煮沸半小时， 煮沸过程中1 i 断补充蒸馏水，使汁液的体积始终维持4 0 0 m l 左右，然后用8 层纱仉过 滤，定容至5 0 0 m l ，1 2 1 灭菌2 0 分钟。 鱼汤的配制：挑选约5 0 0 9 新鲜整鱼，蒸馏水洗净，放入不锈钢容器内，加入8 0 0 m l 蒸馏水，加热煮沸半小时，煮沸过程中不断补充蒸馏水，使汁液的体积始终维持8 0 0 m l 左右，然后然后用8 层纱布过滤，定容至1 0 0 0 m l ；1 0 0 ，3 0 分钟，间歇火菌。 2 27 盐藻的培养方法 液体培养：三角瓶装9 0 m i 的培养液，按1 0 的接种量，接种1 0 m 1 凛液，振荡 培养( 1 5 0 r p m ) ：1 8 18 0 m m 试管装4 5 m l 的培养液，按1 0 的接种量，接种05 m l 藻液，振荡培养( 1 5 0 r p m ) 。每天交换位置2 次。光暗比为1 4 ：l 卟，温度2 7 ，光照 2 5 0 0 3 0 0 0 l u x 。各实验均设置3 组平行。 固体平板培养：采用血球计数板计数，确定藻细胞密度，稀释涂平板。平板用 6 p a r a n l m 膜封口，置于光照培养箱中培养。前期光照适当减弱，后期光照增强。每凡 早晚各交换一次平板位置。光暗比为1 4 ：1 0 h ，温度2 7 ，光照2 5 0 0 3 0 0 0 l u x 。备 实验均设置3 组平行。 2 2 8 盐藻藻细胞植板率 为证明熊藻藻细胞能否在平板上形成单藻落，以迸一步丌展生理学和遗传学相关 研究，将培养至对数期的藻液按1 0 倍系列稀释，分别取0 1 m l 均匀地涂布平板后， 在超净工作台上吹干平板表面水分，用口a r a f i l m 封口，放入光照培养箱( 2 7 ， 3 0 0 0 l u x ) 培养。1 5 2 0 d 后，统计藻落数量，计算植板率。 2 2 9 盐藻吸收光谱扫描 培养杜氏赫藻至对数生长期，吸取一定量藻液，一部分直接在紫外分光光度计上 作波长( 3 9 0 n m 1 1 0 0 砌) 扫描，另一部分用9 0 丙酮：甲醇( 5 ：1 ) 提取液提取后，置 于已有石油醚( 沸点6 0 9 0 ) 的分液漏斗中用力振荡后静置分层。萃取上层石油醚 色素提取液进行波长扫描。 2 2 1 0 盐藻细胞密度与光密度值( 0 d ) 的对应关系 离心收集对数期藻液，作系列稀释，于4 3 0 眦波长处测定o d 啪( 控制o d 值不 超过1 ) ：用血球计数板对o d 值对应的藻液进行细胞计数硝& 据测定结果以藻液o d 4 3 0 为横坐标、藻细胞密度为纵坐标绘制细胞密度一光密度标准曲线。 2 2 1 1 盐藻的生物量测定 浊度比色法( 测定藻细胞光密度值) ：用7 2 l 型或7 2 2 0 型分光光度计于夫4 3 0 n m 处测定藻培养液的0 d 值。 藻细胞计数：取藻液2 m l 予螺旋管中，5 0 热水中热休克2 37 。在相差显微镜 下，用血球计数板立即进行细胞数目的测定，并计算细胞密度。 干重法：离心收集藻体，生理盐水离心洗涤3 q 次，蒸馏水离心洗涤2 3 次，冷 冻干燥，8 5 恒重6 7 h ，称重，计算生物量。 藻落大小比较与藻落计数：在固体培养基均匀地涂靠不同密度的藻细胞，培养 段时间后，观察藻落形态特征，统计藻落数。 2 2 1 2 盐藻生长速率的测算 采用血球计数板细胞计数法。按同等条件接种3 瓶作平行实验，接种后当即用珈 球计数板和计数器在相差显微镜下测算细胞密度，以后每隔2 4 h 测算次，连续观测 3 周。细胞数目的测算，每个样品测6 次后取平均值，生长曲线按3 个平行样品的乎 均值绘制出细胞密度与培养时问的散点图，并根据生长曲线模型求出叫归方程，进 j 二 显著性检验。 足值按公式( 2 1 ) 【6 5 j 计算： 足= 3 ，3 2 2 ( 1 9 m l 烈o ) ，( t - t 0 ) ( 2 1 ) 7 式中，k 为细胞分裂率：t o 为t o 时问藻细胞生物量( 实验以光密度或藻细胞密 度汁) ；m 为t 时间藻细胞生物量；t t o t 时间间隔的天数( d ) 。 g 按公式( 2 2 ) 【6 5 1 计算： g = 1 k( 2 2 ) 式中，g 为平均世代时间：k 为细胞分裂率。 u 按公式( 2 3 ) 计算： u = ( 1 n t l n i o ) ( t t o ) ( 2 - 3 ) 式中u 藻细胞比生长速率( 一) ； 厂一t o 时间藻细胞生物量( 实验以光密度 或藻细胞密度计) ：m t 时问藻细胞生物量；t t o t 时问问隔的天数( d ) 。 2 213 盐藻光台色素的测定 取一定量藻液4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃去上清，用9 0 丙酮：甲醇( 5 ：1 ) 提取液 多次萃取至藻体呈白色，合并萃取液，适当稀释后测定4 5 0 n m 、6 4 5 n m 、6 5 2 n m 、6 6 3 n 1 1 处的i 吸光值。 总胡萝h 素含量按下列公式( 2 4 ) 6 7 】计算： c = ( d v f l o ) 2 5 0 0( 2 4 ) 式中： c - 类胡萝h 素含量( m g ) d 藻色素提取液在4 5 0 n m 处的吸光度 v - 藻色素提取液体积 f 一稀释因子 2 5 0 0 色素平均消光系数 山( 1 ) 式中计算所得的数值除以离心时所取藻液体积( l ) ，即可得单位体积藻液 的胡萝h 素含量( m g t l 。1 ) c h l a 和c h l b 以及总c h i 的含量分别按下列公式( 2 5 ) 、( 2 6 ) 、( 2 7 ) 侧计算： c h l a = 1 2 7 d 6 6 3 2 5 9 d 6 4 5 ( 2 5 ) c h l b = 2 2 9d 6 4 5 4 ，6 7 d 6 6 3( 2 6 ) c h i a + b = d 6 5 2 1o o o 3 4 一 ( 2 7 ) 式中： d 6 4 5 藻色素提取液在6 4 5 n m 处的吸光度 d 6 5 2 - 藻色素提取液在6 5 2 n m 处的吸光度 d 6 6 3 藻色素提取液在6 6 3 n m 处的吸光度 式中：叶绿素含量的单位为m g l 。 22 1 4 杜氏盐藻的无菌纯化 22 1 41 杜氏盐藻的无菌纯化方法 方法1 ：配制2 9 2 5 2 9 2 5 9 l 1n a c l 浓度的j o h n s o n s 培养液。2 5 0 m i ! j ! f _ i 瓶装入 9 0 m i 培养液，1 2 1 灭菌2 0 分钟。在2 9 2 5 9 l - l n a c i 的j o l l i l s o n s 培养液中接入含有 杂菌的藻种1 0 m l ，并放于光照培养箱中培养。当生长至对数期时，转接1 j 弱瓶较 高n a c l 浓度的新鲜藻液中培养。依次重复，直至最终将其转接于2 9 2 5 9 l 1 n a c l 的 j o h n s o n s 培养液。待藻细胞在此培养液中生长至对数期，用无菌枪头吸取1 0 l 藻液 点种于2 9 2 5 9 l “n a c l 的j o h n s o n s 培养基平板上。用p a 均面l m 膜封口， 二2 7 ，2 5 0 0 3 0 0 0 l u x 的培养箱中培养。在培养过程中需经常观察藻落生长状态和杂菌菌落生长情 况。1 4 1 6 d 后，可见平板上生长出藻落。于解剖镜下观察藻落周围是否存在杂菌菌 落，如无杂菌菌落，则于无菌条件下挑取此藻落于1 0 0 m l 新鲜培养液中振荡培养。 方法二：配制2 9 2 5 9 l 。n a c l 的j o t l l l s o n s 培养液，用2 5 0 m li 角瓶装入9 0 m l 培 养液，1 2 l 灭菌2 0 分钟。接入含有杂菌的藻种1 0 m l 后放入光照培养箱中培养。待 藻液生长至对数期，加入g e n 、a m p 和s m ，终浓度分别为：1 6 0 、2 0 0 和2 0 0 m g l _ 1 。 培养6 h 后追加上述抗生素一次，并计数，2 4 h 后继续追加抗生素，并计数，4 8 h 后低 速离心( 5 0 0 1 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) 洗涤藻细胞4 5 次，加入适量新鲜培养液，刚无 菌枪头吸取l o “1 藻液点种于2 9 2 5 9 l o n a c i 的j o l l i l s o n s 培养基平板上。用p a r a l = i l | n 膜封口，于2 7 ，2 5 0 0 3 0 0 0 l u x 的培养箱中培养。在培养过程中需经常观察藻落的 生长状态和杂菌菌落的生长情况。1 4 1 6 d 后，可见平板上生长出藻落。手解剖镜_ 卜 观察藻落的周围是否存在杂菌菌落，如无杂菌菌落则于无菌条件下挑取此藻落r 1 0 0 m i 新鲜培养液中振荡培养。 方法三：配制2 9 2 5 9 tl - i n a c l 的j o h n s o n s 培养液，用2 5 0 m l 三角瓶装入9 0 m l 培 养液，1 2 1 灭菌2 0 分钟。接入含有杂菌的藻种1 0 m i 后放入光照培养箱l _ _ l 培养：待 生长至对数期，于4 0 0 0 r p m ，l o m i n 离心收集藻细胞，倾去上清，加入新鲜培养液， 充分悬浮藻细胞，离心洗涤，重复8 1 0 次。将沈涤后藻细胞用适量新鲜培养液转入 无菌试管，按1 0 倍系列稀释，藻细胞终密度为1 0 4 个l l l l 。再次浓缩藻细胞后，加入 适量新鲜培养液，充分悬浮藻细胞。用无菌枪头吸取1 0 肛l 藻液点种于2 9 2 5 9 一n a c l 的j o h n s o n s 培养基平板上。用p 锄f j l m 膜封口，于2 7 ，光照2 5 0 0 3 0 0 0 h l x 的培 养箱中培养。在培养过程中需经常观察藻落生长状态和杂菌菌落牛长情况。1 4 1 6 d 后，可见平板上生长出藻落。于解剖镜下观察藻落周围是否存在杂菌菌落，如尢杂茼 菌落，则于无菌条件下挑取此此藻落于1 0 0 m l 新鲜培养液中振荡培养。 2 2 1 4 2 不同培养基纯化藻株的无菌检测 对m2 1 4 1 叶i 每。纯化方法所获得的7 个藻株进 r 编号和尤菌检测。 j j 山法 所获得的藻株编号为1 7 ：出方法二所获得的藻株编号为8 1 4 ：山力+ 法i 所扶得的藻 株编号为1 5 2 1 。配制培养液a 、b 、c 、d 、e ，其中培养液b 一n a c l 敬置3 0 馨一 和6 0 9 l o2 个浓度梯度。分别用2 5 0 m l | _ 三角瓶装培养液a 、b 、c 、d 、e 各9 0 m i ， 编号1 2 l ，1 2 i ，灭菌2 0 分钟。按l o 接种量，分别按对应编号接入纯化后培养 至对数期的藻液1 0 m l 。各组均设置3 个平行。3 7 ，1 5 0 r p m ，振荡培养l 周。观察 并记录培养1 周后的各培养液澄清状态。重复上述操作三次。 2 2 1 5 不同n a c i 浓度对盐藻生长的影响 液体培养中n a c l 浓度梯度设置为o 、2 9 2 5 、5 8 5 、8 7 7 5 、1 1 7 、1 4 6 2 5 、1 7 5 5 、