（微生物学专业论文）表面活性剂高产菌株的遗传改良.pdf

ab s t r a c t r e s e r v e d b a c i l l u s l i c h e n 晌r m i s x , i n t h e l a b c a n u t i l i z e g l u c o s e a t 3 7 0c a n d t h e n p r o d u c e a g r e a t a m o u n t o f h i g h - a c t i v i t y b i o s u r f a c t a n t w h i c h i s l i p o p e p t i d e . t h e s u r f a c e t e n s i o n o f t h e wa t e r c a n b e d e c r e a s e d f r o m 7 6 . 6 mn/ m t o 3 5 . 5 mn/ m. b u t x3 c a n t g r o w a t t h e t e m p e r a t u r e o v e r 4 5 c a n d c a n t u s e h y d r o c a r b o n a s c a r b o n r e s o u r c e . b a c il l u s s t e a r o l h e r m o p h i l u s n , i s s e l e c t e d f r o m s o lu t i o n o f h i g h t e m p e r a t u r e o i l w e l l . i t c a n u s e h y d r o c a r b o n a n d g r o w w e l l a t 5 0 c - 7 5 0c b u t p r o d u c i n g a l i t t l e g l u c o l i p i d b i o s u r f a c t a n t . b y p o r t o p l a s t s f u s i o n b e t w e e n x , a n d n z , i g o t a n e w f u s e d s t r a i n n z , w h i c h c a n g r o w a t b o t h 3 7 0c a n d a b o v e 5 0 0c .a n d it c a n p r o d u c e t w o k i n d s o f b i o s u r f a c t a n t : l i p o p e p t i d e a n d g l u c o l i p i d .b y g l u c o l i p i d h y d r o l y s i s w i t h a l k a l i , p a p e r c h r o n o g r a p h s s h o w t h a t t h e s u g a r p a r t i n c l u d e r h a m n o s e a s s a m e a s n i . t h e r e s u l t o f i r i n d i c a t e s t h a t n z , a n d x , h a v e t h e s i m i l a r i n fr a r e d c h r o n o g r a p h .p c a n a l y s i s s h o w s t h a t h y d r o p h i l i c m o i e t y c o n t a i n s t h e s o m e f i v e k i n d s o f a m i n o a c i d s : a s p , g l u , i te , v a t , a n d幼s as t h a t o f x , ; a ft e r h c t - c h 3 0 h h y d r o l y s i s - m e t h a n o l y s i s , g c i n d i c a t e s t h a t t h e f a tt y a c i d p a r t h a v e c ,2 1 c ,6 a n d c 18 f a t t y a c i d ; t h e c iv i c o f t h e p r o d u c t i s a b o u t 3 0 .o m g / l . a t 6 5 0c , n z , u s e s h y d r o c a r b o n a n d p r o d u c e s g l u c o l i p i d a b o u t 0 . 8 4 g / l a n d l i p o p e p t i d e a b o u t o .o l l g / l ; a t 3 7 0c i n g l u c o s e m e d i u m , n 2 , c a n p r o d u c e g l u c o l i p i d 0 . 1 4 g / l a n d l i p o p e p t i d e 2 .2 g 几. c o m p a r e d w i t h t h e p a r e n t n 2 , f u s e d s t r a i n i m p r o v e t h e r a t e o f d e g r a d a t i o n o f p e t r o l e u m a n d c a n d e c r e a s e t h e v i s c o s it y a n d s o l i d i f i c a t io n p o i n t m o r e e f fi c i e n t l y , n 2 , i s mo r e u s e f u l f o r me or. k e y w o r d s :p r o t o p l a s t f u s i o n , g l u c o l i p i d , l ip o p e p t i d e , b i o l o g i c a l i n t e r f a c i a l a g e n t , me o r 生物表而活性a ll 高产ii i 株的遗传改i 前言 c 一)生物表面活性剂概述 表面活性剂是一种具有表面活性的物质，它可以改变气一液、液一液以及 固 一液界面的特征， 使界面张力降低。生物表面活性剂( b i o l o g i c a l i n t e r f a c i a l a g e n t b i a ) 是微生物在一定条件下培养时， 在其代谢过程中 分泌出 的具有表面 活性的代谢产物，它是集亲水基和憎水基于一身的两亲化合物。非极性憎水基 是一长链脂肪酸或是一个。 一烷基， 0 -轻基脂肪酸;亲水基可以 是糖、磷酸、 氨基酸、环肚或醇等构成。许多微生物具有产生表面活性剂的能力，可通过培 养基表面张力的下降观察并判定。表面活性剂的效能是通过其浓度对表面张力 的影响显示出来的。 c m c ( 临界胶束浓度) 是测定表面活性剂效率最常用的数值。 一般说来，当表面活性剂浓度超过 c mc值时，表面张力就不会再明显下降。据 推测， 此时增加的多余表面活性剂分子会聚集成 “ 泡相” ( b u l k p h a s e ) ，而不再 进一步改变界面张力。目 前己知分离并鉴定的几种不同类型的b i a包括:糖脂、 脂肤、磷脂和中性脂等。 1 . 1 b i a的特点及应用 b i a具有如下性能:它能明 显降 低表面张力( 特别是油水界面相间张力) ，形 成胶束溶液，使烃类乳化、改变岩石表面的憎水性。水驱后的油藏，因为油同 岩石间的毛细管作用，使原油残留于岩石孔隙中，表面活性剂通过降低表面张 力界面张力而减弱毛细管作用力，使被束缚的原油通过进一步的水驱被开采出 来， 这是微生物提高石油采收率( m e o r ) 的重要机理之一。 b i a用于三次采油的 优点是:易溶于水，在油水界面上具有良好的表面活性;易于润湿含油岩石的 表面，洗掉岩石表面及孔隙中的残油;对原油具有较强的乳化分散能力，被储 层固体表面吸附数量少。b i a之所以具有很强的驱油能力正是因这些特点造成 的。 据专家预测， b i a成本只 是 化学合成表面活 性剂 ( c h e m i c a l i n t e r f a c i a l a g e n t . c i a ) 成本的 3 0 % ， 从环保角 度看，前 者较后者易为生 物所降 解m ，降 低污染负 荷， 并且微生物表面活性剂对极端的 温度、 p h .盐 浓度2 ,3 等不 太敏感。 此外， 从经济上考虑，用廉 价可再生底物为原料生产表面活性剂较之用日 渐减少的烃资源生产有着更广阔 的前景。因此，近年来对b i a的兴趣日见增长。特别是在me o r方面，b i a可 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 以有效地降低油一水表面张力和界面张力，有助于油一水乳化，防止油滴凝聚， 提高 高 粘、 高 蜡油的 采收率。 例如， 用多 聚体b i a e m u l s a n 4 )处理v e n e z u e l a n 的 重质原油，粘度由2 0 0 0降至 1 0 0 m p a - s 。 处理后， 使经化学处理无效的油可以 输送2 6 k mo 有些油田从传统采收法的角度看己经被认为是枯竭了，但当用 b i a与其它 技术配合使用时，便可使这类油田获得增采，这是非常有意义的。但是，b i a 在大规模应用上，也存在着某些问题:有些 b i a的提取和纯化存在某些难点， 有可能使价格升高，限制了其应用范围。比如放线菌纲细菌的 b i a产物，其活 性受细胞壁束缚，而其它细菌的 b i a 主要分泌于胞外，这些因素直接影响到产 物的回收及回收成本。基于上述问题，可采用以下方式解决: 1 ) .在工厂利用发酵罐在需氧条件下大量生产 b i a ，由注水井或油井注入油藏。 既可以利用经过分离提纯的胞外和胞内 b i a，也可直接利用含有胞外 b i a 的发 酵液。 2 ) . 将产生 b i a的高产菌株( 兼性厌氧菌) 和营养直接注入油藏， 通过其生长代谢 生成大量b i a 。为此必须保证该种微生物在油藏中的发育条件。 1 .2 b i a的类型及产生菌 一般说来，c i a是按照其极性基团分类的。而 b i a则不同，它按照化学构 成及其来源分类。 b i a主要类型有:糖脂， 、脂肤和脂蛋白 6 ,7 磷脂和脂肪酸(8 ,9 1 、多聚体(1 0 等。 常见的糖脂及其产生菌 1 ) 鼠 李糖脂: j a r v i s j o h n s o n ( 1 9 4 9 ) 最先发现 p . a e r u g i n o s a可产生鼠李糖脂。 它可将正十六烷同水的界面张力由4 0降低到i m n / m，水的表面张力降低到2 5 - 3 0 m n / m . i t o h 和s u z u k i ( 1 9 7 2 ) 分离到p . a e r u g i n o s a 的两个突变株p u - 1 和p u - 2 , 它们无法在含烷烃的培养基上很好生长，在补加鼠李糖脂的培养基上恢复正常。 2 )海藻糖脂: 来自r . e r y t h r o p o l is 加和a r t h r o b a c t e r s p . ， 可将培养基表面张力、 界面张力降低至2 5 - - 4 0 , 1 -5 m n / mo 3 )槐糖脂: 主要由 酵母菌t o r u l o p s is b o m b i c o l a , t . p e t r o p h i l u m和t . a p i 。 产 生它可将正十六烷同水的界面张力由4 0降至 5 m n / m，并对 口 h及温度的变化有 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 显著的稳定性。 有趣的是t . p e t r o p h i l u m在含烷烃或植物油等非水溶性介质培养 基上可产生槐糖脂，同t . b o m b i c o l a 产生的槐糖脂在化学结构上相同，可是没有 乳化效果。当 t . p e t r o p h i l u m在含葡萄糖一 酵母提取物的培养基上生长时却可以 产生一种有效的含蛋白的烷烃乳化剂，这似乎同微生物产乳化剂和表面活性剂 是为了摄取非水溶性物质的传统观点相矛盾。 脂肤和脂蛋白:由b . s u b t i l i s 产生的环脂脚i q 是最有效的b i a之一， 在5 0 p p m 这样的 极低浓 度下， 可将表面张力由7 2 降 至2 7 . 9 m n / m e b . l i c j e n if o r m is l j产生 几 种对温度、 p h ,盐浓度有较强稳定性的表面活性剂。 在以 下内 容中， 将作详细 介绍。 脂肪酸、磷脂、中性脂:几种细菌和酵母菌可在正烷烃培养基上生长并产生 脂肪酸和磷脂型表面活性剂。 多 聚体: 研究最透彻的多 聚体b i a是。 m u l s a n l 1 , l ip o s a n 、 甘露糖蛋白 14 1 以 及其 它多聚糖蛋白。 e m u l s a n 在1 0 - 1 0 0 p p m的低浓度下，仍具有很强的乳化能力， 它是迄今为止最佳 的乳化稳定剂。 n a v o n v e n e z i a等人( 1 9 9 5 ) 分离到一产阴离子型含亮氨酸的杂多糖 蛋白b i a ( a l a s a n ) 的菌株a c i n e t o b a c t e r r e d i o r e s is t e n s k a - 5 3 。 并发现a l a s a n 115 j在中 性或碱性条件下加热到1 0 0 0c ，活性提高2 . 5 - 3 倍。 1 .3 b i a的研究历史及现状 早在 4 0年代 z o b e l l f , i 就提出，微生物产生表面活性剂是 me o r的重要机 制之一。随后， 捷克d o s t a l e k 和 s p u r n y 1 8 根据实验室结果， 把d e s u 如v i b r i o 和 p s e u d o m o n a s 同糖蜜一起注到油层中，观察到原油产量提高，他们认为，这可 能是因细菌产生的表面活性物质，改变了岩石一 油一 水系统的界面张力所致。但上 述作者均未提取出微生物产生的表面活性物质。 6 0 年代以 后， 石油发酵工业开始发展， 微生物对烃类乳化机制的 研究引 起关注， 并提取到几种 b i a ，就其结构、化学性质、生物合成及调控方面进行了 广泛研 究。近年采，大量的 b i a方面的研究集中在发展快速、有效地筛选高产菌嘶评 估其潜力等方面，v a n d e r v e g t ( 1 9 9 1 ) 进行的 轴对称: 液滴分析 a d s a ) 非常有效。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 其它比 较简单的方法: ( 1 ) 快速液滴破裂实 验; ( 2 ) 对 b i a产生菌落直接进行薄层 层析1 9 1 ; ( 3 ) 用比色法优选解烃菌及产鼠 李糖脂菌。 用微生物生产 b i a是 7 0年代后期生物工程领域中发展起来的一个新课题。加 拿大、英国、德国、前苏联等先后进行了 研究与开发，多数处于室内研究阶段， 主要研究各种新型 b i a，并搜索最适发酵条件、b i a 的结构剖析和改性、物化 性能测试、室内驱油物理模拟等。 j .e .z a j i c 实验室开展的工作较多，儿个产品已 商品化。 m .e . s i n e r 实验室用h - 1 3 细菌，以 正烷烃为唯一碳源时， 产生一种胞内 和胞外糖脂化合物 b i a，它能将重油粘度降低 9 5 %以上，并形成稳定的水包油 乳状液。中科院上海有机化学所是国内首先研究b i a的单位。从1 9 8 6 年开始， 经微生物菌种筛选和条件优化，已推出的糖脂型化合物有:槐糖脂，海藻糖脂 和多糖脂。中科院感光所测定了由有机所提供的六种糖脂样品的界面性质，优 选了三种耐盐 3 %- 5 y.、耐温 4 0 -8 0 的糖脂，用多糖与槐糖脂或鼠李糖脂复配 时呈现 “ 超加合”现象，可将界面张力降得更低。 1 9 6 8 年a r i m a 等d 1 重首次发现枯草芽 胞杆菌 ( b a c i l l u s s u b t i l t is ) 1 f 0 3 0 3 9 产生 的脂肪多肤类 b i a ，呈晶体状，商品名为表面活性素( s u r f a c t in ) ，最初被分离并 鉴定为纤维蛋白凝集抑制剂，后来发现它能够溶解红细胞及某些细菌的原生质 体， 可显著降低水的表面张力( 从 7 2 m n / m降到了2 7 m n / m ) , c m c值达到 1 .2 8 x l 0 - m o l / l ，是迄今已 报道的最强的b i a之一，具有广泛的应用前景，如油类 回收及感光乳剂的稳定等。 s u r f a c t i n是由一个含 7个a 氨基酸的多肚及一个同 源系列 ( 带有 1 3 . 1 4或 1 5 个碳原子) 的 轻基脂肪酸构成的大内 脂环。 此后，又 相 继发 现几 种氨基酸醋 有明 显的 表面 活性。 b . b r e v is iz 0 i和 b .p o ly m y x a j产生的 十 肤及脂肤抗生素、p . r u b e s c e n s 和 t h io b a c i l l u 、 产生的鸟氨基酸酷，g l u c o n o b a c t e r c e r i n u s生成的含鸟氨酸和牛磺酸的酷( c e r i l i p i n ) 12 1 以及 a g r o b a c t e r i u m tu m ef a c i e n s i f 0 3 0 8 5 1z z i 生 成 的 赖氨 酸 m e 等 均 是 很 有 效 的b i a . 同 以 上 氨 基 酸 脂 相 比较，枯草和地衣芽抱杆菌产生的环脂肤有着更强的效力，这类物质对极端的 温度， p h ，盐浓度显示出良 好的稳定性。可以 溶解哺乳动物的血红细胞， 利用 该特性，可借助血平板检测出表面活性剂。 近年来，随着测试技术的不断提高， 新的b i a相继被发现。 m i c h a l m. x2 3 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 等，在 1 9 9 5 年发现一株名为地衣芽抱杆菌b a s 5 0的菌，该菌存活于地下一千五 百米，耐盐、耐热，可产生一种名为地衣菌素的 b i a ， 这是一种分子量在 1 0 0 6 至 1 0 3 4 d a的环脂肤，脂基部分含有十四种线形或分枝的0 轻基脂肪酸，含碳数 目 为c ,2 - - c , 7 ,月 太 基部分为5 种共7个氨基酸构成的肤环。该脂肤可以 将表面张 力由7 2 m n l m降至2 8 m n l m , c m c值 低达1 2 m 酬。由 于 脂 肚类b i a具有高 效的 表面活性，国外学者给予了极大的关注。 目前，国内有关的研究多集中于糖脂类2 4 ,2 5 。在数株铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s a e r u g in o s a ) 中 分离 到的鼠 李 糖脂中1 个或2 个鼠 李 糖分子 与p - 羚基葵酸的 1个或 2个分子相连。同样，球形酵母书属菌株生产的糖脂中的二 糖槐二 糖是通过糖昔与吸附 在 c , 。 到 c ,: 脂肪酸次末端碳上的 轻基相连。 这种槐 二糖在 c - 6和 c - 6 处可能被酞化。另外，山玉蜀黍黑粉菌细胞可产生非常相似 的胞外纤维二糖脂。另有文献报道，王修垣、田新玉等5 4 发现一种新的 b i a, 因未发现脂肪酸成分，故认为属多肤类。 1 . 4 生物表面活性剂的遗传学研究 在研究生物表面活性剂生物合成过程及酶结构的同时，人们也同时进行控 制其生物合成的遗传机制研究。 n a k a n 。和z u b e r 等对 s u r f a c t i n生物合成基因及 其调节机理作了一系列深入研究。 他们发现共有三个基因座位即s r f a , s r f b和s r p 与b .s u b t i l i s 产生s u r f a c t i n有关2 6 ,2 7 。s r f a是一个2 5 k b以 上的大操纵子，负责 编码催化s u r f a c t i n 合成的几个酶2 8 , s r f a的突变株不仅中止合成s u r f a c t i n ，而且 还影响细胞利用异种 d n a和形成抱子的能力，因此这个操纵子表达的蛋白质在 细胞特化和分化中有重要作用。s r f b包括c o m p和c o m a基因，它形成一个信号 转导系统，并调节s r f a的转录2 9 。 m u l l i g a n 等分离到了一 株在s r f b位置发生突 变从而增加s u r f a c t i n产量的菌株3 0 。 s r p基因编码了一个有2 2 4个氨基酸的蛋 白 质，该蛋白 质是 s u r f a c t i n 合成系统的关键成分。 它直接或间接的调节s u r f a c t i n 合成基因的表达i l l . s r p蛋白 质的过量合成会降低 s r f a的转录能力并阻遏 s r f a 操纵子中l a c z的转录融合。c o s m i n a 3 2 1进一步发现了枯草芽抱杆菌中含有完整操 纵子、s f p以及两者之间的 4 0 0 0个碱基对的染色体区段，并进行了全序列分析 和功能描绘。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 在另外一些研究中，r u s a n s k y等3 3 1 发现乙酸钙不动杆菌 ( a c i n e t o b a c t e r c a l u o a c e t i c u x - k a 5 7 )在原油污泥上生长时，出现四种质粒。进一步的研究表明 其中一种质粒 p s r 4 控制着这种微生物利用原油基质。 这个 2 0 k b的质粒编码了 一个与细胞紧密相联的因子，从而使细胞能与烃类基质产生生理作用。在食油 假单胞菌 ( p o l e o v o r a n s )中，位于 o c t质粒的a l k b a c基因编码了一个烷烃利 用系统，它是烷烃末端羚化和脱氢所必须的3 4 1 。现在还不了解在烷烃吸收过程 中是否还有寄主编码的因子参与。 a l k b a c操纵子中调节基因和结构基因在恶臭 假单 胞菌 ( p p u t id a ) 和 e .c o l i 中的异 源表达使这些微生 物能以正 辛烷为唯一 碳 源和能源生长。 1 . 5 生物表面活性剂合成的研究 脂肚类化合物 s u r f a c t i n中的脂肪酞部分和短肤部分都是直接从糖类合成的。 基质中另加的氨基酸和脂肪酸可以影响产量不影响结构13 5 1 。红色球菌 ( r . e r y t h r o p o l is ) 产生的海藻糖糖脂的脂肪酸则会随饲食烷烃的不同而改变13 6 1 。 另一种微生物石蜡节杆菌(a a r t h r o b a c t e r p a r a fn e u s ) 产生的糖脂会依照基质碳源 而变化，当以 果糖为碳源时， a . p a r a fn e u s 就产生果糖脂;当以 蔗糖为碳源时， 就产生葡萄糖脂和蔗糖脂13 7 ,3 8 1 生物表面活性剂的脂肪酸部分可由一般的脂代谢途径产生，但它们的极性 亲水基，由于种类繁杂，结构多样，因而由多种合成机制产生13 9 1 。近年来的一 些研究揭示了 脂肤表面活性剂中氨基酸部分的合成机理4 0 ,2 6 1 。脂肚是由多功能酶 复合体如短杆菌肤 ( g r a m i c id i n ) s合成酶合成的， 不需要核糖体的 参与。 十 肤 的短杆菌肤 s合成的第一步是 a t i 对氨基酸的活化，这个活化的中间体依靠硫 醚键附着在短杆菌肤 s合成酶复合体上的特定位点。后来的氨基酸中间体也按 照在短肤中的序列依次排列到合成酶上。短肤的装配还涉及到一个有一 s h基的泛 酞琉基乙胺辅助因子，它的功能是充当内摆臂来调节合成中的肤在氨基酸结合 位点的运输。这种合成模式被称为硫模板机制。s u r f a c t i n 也是通过硫模板机制合 成的 12 7 1 。 它 在无细胞溶液中的 正常合成需要 a t p , m g t 、 前体和蔗糖， 后者的 作用可能是稳定酶复合体。 研究还发现，尽管这个脂肤含有d - l e u ， 但只有d - l e u 才能充当前体4 1,4 2 1 。有关这方面的研究还有待进一步的深入。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 ( 二 ) 原生质体融合的 研究 早在 1 9 3 7 年， mi c h e l 就作过植物细胞原生质体凝集、融合的报道，1 9 5 8 年 冈山善雄又报道了艾氏 腹水瘤细胞的融合。1 9 6 0年 c o c k i n g用酶法制备大量有 活力的原生质体获得成功。1 9 7 4年高国楠发现聚乙二醇在钙存在时能促进原生 质体融合，显著提高融合率。这些皆促进了原生质体融合技术的重大发展。 1 9 7 6 年 s c h a e ff e r 报道了b .s u b t i l i s间原生质体融合的现象4 1 , f o l d e r 则研究 了b . m e r g a t e r i u m的 融合 “ ;1 9 7 9 年f r e h e l 用 透射电 镜 研究了b .s u b t i l i s 的 融 合 现象14 5 1 ，发现使用产抱期的细胞制成的原生质体进行 p e g诱导的融合时，用电 镜可以看到融合子有两个前芽抱在内，从二在电镜水平上证实了 p e g介导的融 合是细胞间的融合，而在此之前还有人提出意见分为两个步骤，首先是一个依 赖于p e g的短过程，由p e g激发膜活力，然后是一个慢的、要求细胞代谢机制 的融合过程，用高渗培养基在此时处理融合体系后，f r e h e l 等人得到了较高的融 合 频率; s h i n g c h i n g 则 报道了 一种质粒d n a在p e g助融下高 频转 入b .s u b t i l i s 的方法4 6 1 ，他们报道原生质体有吸收具有转化活性的 d n a的能力，所以在原生 质体制备中加入 d n a s e ，防止了由于无关 d a n对转化的影响;g a b o r 系统研究 了影响 b . s u b t i l i s原生质体融合后细菌再生与遗传重组的各项参数4 7 1 ，他认为培 养菌、溶菌酶处理和 p e g处理的温度对形成率和再生率是很重要的，根据实验 结果，他提出使用3 7 培养菌，酶处理用4 2 c , p e g处理用2 8 0c 。 他还发现在 高渗稀释液中加入 1 %的小牛血清白蛋白可以显著增加再生率 ( 可高达上百倍) 。 对于 p e g的处理时间，他指出延长该时间会对再生起到不利的影响，最佳时间 约为两分钟。他还比较了 p e g 6 0 0 0 , p e g 1 5 0 0和 p e g 6 0 0对形成和再生的不同 影响等;1 9 8 1 年m a r t i n 使用b t 进行了 质粒d n a转化入原生质体的研究发现影 响原生质体形成的因素包括菌龄、培养基、菌株以及菌浓等因素4 8 1 ; 1 9 8 4年， 日 本的t a k a s h i a k a m a t s u 等人一种原生质体再生方法的改进， 并把这种方法应用 于细胞融合中来，他们首先在再生前使用预备培养基将菌体悬浮一定时间，然 后使用 o v e r l a y i n g这种方法将原生质体 直接稀释于再生 培养基中， 不使 用传统 的涂布方法，避免了由于机械挤压造成的原生质体破裂，得到了较好的再生率 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 4 9 ) 0 7 0 年代末8 0 年代初是原生质体技术发展最快的时期，此后， 原生质体融合 技术作为一种将质粒d n a或其它染色体体d n a转入受体细胞的一种快速手段， 得到了广泛的应用，这种方法不需要知道目的基因的位置，而能把整个供体的 全基因组转入受体，甚至异种、异属、异科的原生质体间也可融合，并且有方 便的检出标记，因此成了基因工程普遍使用前广泛应用的育种手段。 在国内，1 9 8 1 年江行娟等人研究了b . s u b t i l is 间 通过细胞融合的 质粒转移5 0 1 他们使用 p u b 1 1 0质粒与枯草杆菌 g i菌株原生质体的转化，得到的转化子具有 了两种抗药性，高温消除转化子的质粒后，亲本的性状得以恢复; 1 9 9 7年，冯 清平等人对地衣芽抱杆菌原生质体的最佳形成和再生条件进行了研究j5 2 1 ，他们 在菌体的对数生长期加入青霉素来抑制细胞壁的合成，利于原生质体的形成， 对于他们的菌株所确定的青霉素最佳浓度为 1 6 u / m l ，最佳作用时间为4 h r 。另外 他们还研究了甘氨酸对原生质体形成的影响，发现在细胞生长的延滞期加入甘 氨酸比不加时的原生体形成率平均提高 3 6 %，这种促进作用的主要原因是因为 在细胞破壁过程中，加入的适量甘氨酸可促使肤聚糖中的丙氨酸残基所置换， 由此干扰细胞壁的网状结构，引起细胞壁的缺失。同时他们对融菌酶的最佳作 用条件也作了详细的研究。 ( 三) 此项研究的目的 本实 验室保藏的 两株菌 株， 一株为 地衣芽 饱杆菌x 3 ， 生 长温度 3 0 0c - -4 2 0c ， 高 产 脂肤表面活性剂， 利用烃生长极其缓慢; 另一株为嗜热脂肪芽抱杆菌 n 2 ， 生长温度 5 0 0c - 7 8 0c ， 能在较高的温度下利用烃为碳源生长. 但糖脂表面活性剂的产量很低， 通过将其进行原生质体融合， 以期获得一株较理想的融合子: 能在高温下利用烃生 长， 同时表达大量的表面活性剂， 以 提高微生物采油的采收率， 这也是天津市自 然基 金项目: “ 构建微生物采油工程菌株”的内容之一。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 第二部分 材料和方法 2 . 1 材料 2 . 1 . 1 菌种 表 1本实验使用的菌种 ta b l e i s t r a i n s o f u s e d 菌名类别来源标记 b a c i l l u s l i c h e n if o r m i s x 3 地衣芽饱杆菌本室 9 8 年分离链霉素抗性、氯霉素敏感 b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s n z 嗜热脂肪芽抱杆菌本室保藏氯霉素抗性、链霉素敏感 2 . 1 .2 培养基 本实验使用的全部培养基如下: 表2培养基列表 t a b l e 2 l i s t o f me d i u ms 名称 n b液体培养基( % ) l b液体培养基( % ) 成分 n b固 体培养基( % ) l b固 体培养基( % ) h n b再生培养基( % ) 糖发酵培养基( % ) 12 3 1 烃发酵培养基( % ) 牛肉 膏0 . 5 克; 蛋白 陈1 .0 克 ; n a c 1 0 . 5 克;p h 7 .2 - 7 .4 胰蛋白 陈 1 .0 克; 酵母浸出汁 0 . 5 克; n a c 1 0 .5 克; p h 7 .2 - 7 .4 n b液体培养基中加入1 .8 %的琼脂粉 l b液体培养基中加入 1 . 8 %的琼脂粉 n b 固体培养基中加入 0 . 5 m o l / l的蔗糖 蔗糖1 .0 克;n h 4 c 1 0 .6 克; m g s 0 4 0 .0 2 克; c a c l 2 7 .0 x 1 0 m ; k h , p 0 4 0 .4 1 克; n a 2 h p 0 4 1 .4 克;n a 2 e d t a 4 .0 x 1 0 -6 m , 酵母粉 0 .0 5 克;p h 7 . 5 n a 2 h p 0 4 0 .0 6 克 ; k h 2 p 0 , 0 .0 2 克;n a n 0 3 0 .2 克; c a c l 2 0 .0 0 1 克;f e s 0 4 0 .0 0 1 克;m g s 0 4 0 .0 3 克， 酵母粉 0 .0 5 克; 蔗糖 0 . 1 克; 液体石蜡 2 - 4 m 1 ,p h 7 .2 以上所有培养基需 1 1 5 0c 3 0 分钟灭菌 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 2 . 1 . 3试剂和缓冲液 下表列出本实验用到的主要溶液和试剂 表3 溶液成份和试剂列表 ta b l e 3 名称 h m溶液5 4 1 。 l i s t o f s o l u t i o n s a n d r e a g e n t s 成份和来源 s h m溶液* 4 0 %聚乙二醇 4 0 0 0 1 %小牛血清蛋白溶液 脂肤脂肪酸部分的甲脂化1 2 3 ,3 4 1 , 肤的水解5 4 1 . 二苯胺显色剂: 0 . 5 % 荀三酮丙酮溶液: 糖的纸层析 展开系统: 显色剂:苯胺磷酸盐一 丙酮 1 l中含有: k c 1 0 .0 3 7 克;n a c 1 0 .0 5 8 克;n a 2 s o 4 0 . 1 4 2 克; t r i s 1 2 . 1 克 ;n h 4 c 1 1 克 ; 葡萄 糖 2 克; 蔗糖 6 8 . 5 克;p h 7 . 5 除蔗糖浓度为 1 5 4 .4 克/ 升外，其他同h m 4 0 %聚乙二醇4 0 0 0 溶于h m溶液 小牛血清蛋白溶于s h m溶液中 5 % h c l - c h , o h溶液;乙 醚 6 nhcl 1 0 %二苯胺乙醇溶液 2 0 m1 加入 1 0 0 m 1 浓盐 酸和 8 0 m 1 冰醋酸稀释 加0 .5 g 荀三酮到1 0 0 m 1 无水丙酮溶液中 正丁醇:乙 酸: 水= 4 : 1 :2 ( v / v / v ) 溶液a : 按顺序混和2 0 m l 苯胺，2 0 0 m l 水， 1 8 0 m 1 醋酸和 l o m l 磷酸 ( 4 保存) 溶液b : 丙酮将a 和b 按 2 :3 ( v / v )混和 氨基酸的纸层析 ( p c ) 展 开 系 统 及 显色 剂 f 55 1 p c展开系统: 显色剂:0 . 5 %荀三酮乙醇溶液 薄层层析用展开剂: 第一展开剂: 第二展开剂: 溶菌酶: 正丁醇:乙酸:水= 4 : 1 : 1 ( v / v / v ) 加0 . 5 g 荀三酮到1 0 0 m 1 无水乙 醇溶液中 石油醚 氯仿: :乙醚:醋酸 ( 8 0 : 2 0 : 1 , 甲醇:水 ( 6 5 / 1 5 / 2 , v / v / v ) v / v / v ) 华美公司 生物表面活性剂高产菌 株的遗传改良 小中血清蛋白 ( b s a) : 聚乙二醇4 0 0 0 : 氯霉素、链霉素: 氨基酸标准品: 月 旨 肪酸标准品: 华美公司 广州化学试剂玻璃仪器批发部进口分装 华美公司 天津氨基酸公司 中心实验室吕宪禹老师提供。 带* 符号的溶液和培养基需1 1 5 0c 3 0 分钟灭菌 2 . 1 .4仪器 实验过程中所使用的主要仪器见下表: 表4 仪器列表 t a b l e 4 l i s t o f e q u i p m e n t s 名称产地 界面张力仪承德市材料实验机厂 n d j - 7 9 型旋转式粘度计同济大学机电厂 旋转薄膜蒸发器 ( z f q - i o l )天津玻璃仪器厂 7 2 1 分光光度计上海第三分析仪器厂 水浴振荡器常州国华电器有限公司 n i c o l e t 傅立叶变换红外分光光度计1 7 0 s x f t l r 微量注射器 ( 1 u l )上海医用激光仪器厂 高 速离心 机美国b e c k m a n j 2 - m c 真空冷冻干燥器美国 l a b c o n c o 光学显微镜日 本 o l y m p u s 笔式酸度计葡萄牙h a n n a公司 g c - 7 a型气相色谱仪日 本岛 津 7 2 1 型分光光度计上海第三分析仪器厂 0 .4 5 u m , 1 .2 u m微孔滤膜及滤器德宇公司 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 2 . 2方法 2 .2 . 1 原生质体制备和再生 亲本株 x , 3 7 0c ( n i 6 3 0c ) l b液体培养基培养到对数生长期 = 3 ,0 0 0 r p m , l o m i n 离 心=-h m洗一 次弃上 清一 加 入s h m溶 液l m l ， 从中 取出9 0 u l 于 l m l 离心管中= 加入 l o u t 一定浓度的溶菌酶二 3 7 水浴作用一定时间，计算 形成率， 从原生质体悬浮液中取出一定体积分别用s h m和水稀释，涂布h n b再 生培养基， 放入温箱培养， 计算再生率. 形成率和再生率的计算:公式为: 形成率=( a - c ) / a ; 再生率= ( b - c ) / ( a - c ) o a :制备原生质体前的菌悬液用水稀释后涂步普通n b平板计数的总菌数; b :原生质体制备体系用高渗溶液稀释后涂再生平板长出的菌落数; c :原生质体制备体系用水稀释后图普通n b平板长出的菌落数; 2 .2 .2 原生质体融合 两亲株原生 质体( 1 0 1 ) 等体积混和 =加入4 0 % p e g 1 . 8 m l , 0 .2 m l c a c l : 溶液， 轻 轻振荡混匀= 3 4 0c 水浴， 4 分钟= 加s h m溶液稀释， 离心 ( 2 0 0 0 r p m / m i n l 0 m i n ) , = 用含 1 % b s a的h m 稀释= 涂布双抗再生培养基二 3 7 培养至菌落长出，计 数。 2 .2 .3融合子的检出及评价 2 .2 . 3 . 1 融合子的筛选 从双抗平板上筛出的单菌落进行初筛，再进一步就其耐温性 、表活剂产 量、进行复筛。 2 .2 .3 .2 融合子的评价 ( a ) 菌体高温下最适生长温度 比较不同温度下的生长曲线:在发酵过程中，定时取样测定，用稀释平板菌 落计数法，绘出菌体生长曲线; ( b ) 菌体生长、 表面活性剂产量、 表面张力变化曲 线 挑出单菌落。分别接种到糖发酵培养基和烃发酵培养基中=得到种子液再 按2 %的接种量进行发酵。表面张力变化曲线测定方法如下:常温3 7 振荡培养 产 物 和高 温6 3 振荡 培养产 物=培养不同 时间 = 8 , 0 0 0 r p m ,2 0 m i n离心两次 =取 上清液过滤后测表面张力，用界面张力仪测定发酵过程中y s 的变化。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 表面活 性剂产量测定:发 酵终 产物 二 8 , 0 0 0 r p m , 2 0 m i n 离 心两次 = 取上 清液 以 浓盐 酸调p h 2 .0 ， 出 现絮 状沉淀 一 4 静置 过 夜 二 1 0 0 0 0 r p m ,3 0 m in收 集沉淀 二 烘干称干重 ( g l l ) e 2 .2 .4表面活性剂的提取 2 . 2 . 4 . 1脂肤类表面活性剂的提取 发酵终产物 尽 取上清液，加入h c l 8 , 0 0 0 r p m , 2 0 m i n 离心两次 至p h 2 .0 尽 4 冰箱静置过夜 尽nhz尽 沉淀溶于 1 0 ,0 0 0 r p m ,3 0 m i n 离 心 ，p h 2 .0 的h c l 溶 液 洗 涤两 次 0 的盐酸混匀 1 2 , 0 0 0 r p m , 3 0 m i n 离心 褐色颗粒状沉淀物 尽 溶 于 稀 n ao h 溶 液 使 p h 接 近 7 .0 冷 冻 干 燥 浅褐色疏松片层状固体 尽 c h zc l z 抽 提 ， 抽 提 液 减 压 蒸 干 灰白色粉末状固体 滤液加入 h c t z 加入稀n a o h溶液使其p h至7 .0 ， 将其溶解 wh a t m a n n o 4 号滤纸过滤 调p h 2 .0 1 5 , 0 0 0 r p m , 3 0 m i n 离心得 米黄色油状沉淀 ( 即为纯品) 。 2 .2 .4 .2糖脂的 提取 方 法一: 发 酵终 产物 二 8 ,0 0 0 r p m ,2 0 m i n离 心 两次 =去 菌 体并 过滤除 去 液 蜡 =过 滤 液中加入 1 0 % h 2 s o 。 调p h至6 .0 = 加 入二 倍体积的 氯仿 / 甲 醇 ( 2 : l ,v ( v ) 混和 液， 磁力搅拌 3 0 m i n = 萃取两次，合并有机相， 水洗二 4 5 0c 减压蒸馏去溶剂= 得到粗产 物。 生物表面活性剂高产菌株的遗传改良 方法二: 低温糖发酵终 产物 二 8 ,0 0 0 r p m ,2 0 m i n 离 心两次去菌 体 二 发酵上清 液用h c i 调p h至2 . 0 = 4 冰 箱静置过夜 = 1 2 ,0 0 0 r p m , 3 0 m i n 离 心 =上 清液按 照方法一处理。 2 .2 . 5 表面活性剂的性质分析 2 .2 . 5 . 1薄层层析法: 采用两步展开法， 先用石油醚: 乙醚: 醋酸( 8 0 : 2 0 : 1 , v nn) 展开， 前沿离薄层顶端l e m左右处停止， 再用氯仿: 甲醇: 水( 6 5 : 1 5 : 2 , v nn) 展开，前沿过薄板长度的一半距离时取出。再分别用二苯胺、0 . 5 %荀三酮丙酮 溶液显色，记录并照相。 a ) 糖脂的检测 使用两步展开法 展开剂:1 .石油醚:乙醚:乙酸 ( 8 0 :2 0 : 1)