（微生物学专业论文）高等培菌白蚁高效利用木质纤维素的机理研究.pdf

安徽农业大学博士学位论文 摘要 培菌白蚁属于高等白蚁白蚁科( t e r m i t i d a e ) 、大白蚁亚科( m a c r o t e r m i t i n a e ) ，因 与t e r m i t o m y c e s 属真菌共生而得名。由于在热带干旱地区可消耗9 0 以上的干木、在 多雨的热带草原地区能矿化2 0 的初级产物而引起研究学者们的广泛研究兴趣。在初 步了解高等白蚁与其培养真菌的共生关系后，本研究利用分子生物学技术调查了共生 系统中自蚁肠道及菌圃共生生物的多样性，通过c d n a 文库的构建从共生真菌中筛选 与木质纤维素降解相关的基因。主要研究内容如下： 在安徽省、湖南省、江苏省、云南省等地广泛采集白蚁标本，建立了白蚁的形态 鉴定和分子鉴定平台，利用i s s r 分子标记调查了在上述地区广泛分布的高等、低等 白蚁种群的遗传多样性及其与系统发育的关系。得到如下结果：候选的2 4 个i s s r 引物中筛选出l o 个能得到清晰条带、重复性好、多态性高的引物，在1 4 个白蚁群体 中共扩增出1 4 5 条带，平均每个引物扩增出1 4 5 条带，多态性条带有1 4 4 条，占总 条带的9 9 3 1 ，可见平均等位基因数( ) 为1 9 9 3 l4 - 0 0 8 3 0 ，平均有效等位基因数 ( ) 为1 5 6 6 14 - 0 3 0 4 3 ，n e i 0 基因多样性指数( 办) 和s h a n n o n 0 信息指数( ，) 在 分别为0 3 3 5 54 - 0 1 3 6 3 和o 5 0 6 54 - 0 1 6 4 5 ，表明所有供试种群具有较高的遗传多样性； 而三个不同种类种群多样性受地理条件影响较大，地理上的分隔很可能阻碍了种群内 的基因交流；一个种群内不同品级间的i s s r p c r 扩增格局是相同的，并且在一 个品级内不同个体间的扩增也是稳定的，从而确定在缺失兵蚁的情况下也可以利用工 蚁进行分子鉴定和种群多样性的调查；利用p a u p 软件分别对所有种群的c oi i 序列及i s s r - p c r 电泳条带生成的0 1 矩阵构建系统发育树，结果表明，两个系统发 育树的拓扑结构相似，且都较好地与形态分类结果相吻合，显示了物种遗传多样性与 其进化是保持一致的，同时也显示了i s s r 分子标记是一个进行系统发育分析的有力 工具。 对广泛采集得到的白蚁种群进行高通量酶活测定，通过比较不同地区采集的1 7 个种群、5 种高等白蚁的4 种纤维素酶酶活后，选择在西双版纳地区广泛分布的云南 土白蚁( o d o n t o t e r m e sy u n n a n e n s m ) 及其共生t e r m i 幻m y c e s 属真菌作为研究对象。为 探讨共生系统原核生物所发挥的作用，分别构建白蚁肠道细菌1 6 sr d n a 全长序列克 隆文库和菌圃细菌1 6 sr d n a 全长序列克隆文库进行微生物区系的调查。其中，白蚁 肠道细菌1 6 sr d n a 文库分析显示，6 2 3 条可用序列被分成1 8 7 个系统发育型，其中 丰度最高的是厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) ( 占3 8 ) ，9 4 4 的系统发育型比对上梭菌纲 ( c l o s t r i d i a ) 、梭菌目( c l o s t r i d i a l e s ) 的纯培养或未培微生物；其次分别是拟杆菌门 ( b a c t e r o i d e t e s ) ( 占2 6 7 ) 、变形菌门( p r o t e o b a c t e r i a ) ( 占1 1 8 ) 、螺旋体门 ( s p i r o c h a e t e s ) ( 占8 ) ，拟杆菌目( b a c t e r o i d a l e s ) 、6 一变形菌纲( d e l t a p r o t e o b a c t e r i a ) 、 安徽农业大学博士学位论文中文摘要 密螺旋体属( t r e p o n e m a ) 分别是它们相应的优势群体；而浮霉菌门( p l a n c t o m y c e t e s ) 、 放线菌门( a c t i n o b a c t e r i a ) 、t m 7 门、脱铁杆菌门( d e f e r r i b a c t e r e s ) 、绿菌f - 1 ( c h l o r o b i ) 及t g1 门的丰度则较低。而菌圃细菌文库分析表明，菌圃上细菌菌群的多样性明显 低于肠道菌群，但厚壁菌门、变形菌门及拟杆菌门仍为主要组成。 在成功分离得到菌圃上的共生真菌t e r m i t o m y c e ss p 菌株后，对其展开了一系列基 础研究。得到以下结论：生长于菌圃上的野生菌大部分情况下成小白球状，经显 微镜观察可见由无数产孢结构和长椭圆形分生孢子构成，并判断分生孢子是由庞大的 球状胞原生质体浓缩而分隔开形成的；纯化菌株的i t s 区序列( g e n b a n k 号： f j 7 6 9 4 1 0 ) 与野生菌株的i t s 区序列( g e n b a n k 号f j 7 6 9 4 0 9 ) 基本一致，表明两者 为同一菌株，同时在分类地位上都与t e r m i t o m y c e ss p g r o u p8 ( a b 0 7 3 5 2 9 ) 较近，但 由于缺乏野外形成的子实体形状等分类信息，只能将该菌株鉴定为t e r m i t o m y c e ss p ； 菌圃及白蚁肠道真菌多样性的分析表明，在野外良好的共生状态下，菌圃上只生 长一种t e r m i t o m y c e s 属真菌，未见其他真菌生存，且白蚁肠道真菌与其为同一种，表 明该共生真菌为白蚁食物组成的一部分。 考虑到在共生状态下，共生真菌极可能在木质纤维素降解过程中发挥着重要作 用，本研究首次利用直接在野外菌圃上采集的野生菌为材料，通过s m a r t t mc d n a 文库构建试剂盒构建了一个全长c d n a 文库。所构建的文库经检测，文库滴度为7 x 1 0 6 p f u m ，库容量为3 5 1 0 6p f u ，文库重组率达9 7 ，平均插入片段长度约为1 3 3k b ， 文库质量合格。在此基础上，建立了引物p c r 筛选目的基因的技术平台，经过两轮 p c r 筛选成功获得一个含木聚糖酶基因的阳性克隆，记为x y lc 5 。该目的基因序列 在3 端存在明显的p o l y a 结构，可编码2 2 6 个氨基酸，预测分子量大小约为2 4k d a ， 在4 3 位氨基酸至2 2 3 位氨基酸处为g h f il 的功能域，并且1 2 9 氨基酸和2 2 0 氨基酸 两个位点为活性位点，均为谷氨酸，n c b i 比对后多数与曲霉属a s p e r g i l l u s 真菌木聚 糖酶基因的序列一致性在5 8 6 0 ，可判定这是首个来自t e r m i t o m y c e s 属真菌的木 聚糖酶基因。最后，构建了一个p e t 2 2 bx 重组质粒、转化感受态大肠杆菌ylc5 b l 2 1 进行诱导表达，经s d s p a g e 分析表明，目的蛋白表达出两条大小分别约为1 7k d a 、 1 5k d a 的条带，且为不可溶性蛋白。该结果与预测的蛋白大小存在差距，可能是由 于原核表达体系不适合表达真核来源基因或表达过程的各种折叠、修饰等步骤的原因 导致的。 关键词： 培菌白蚁，t e r m i t o m y c e s 属真菌，木质纤维素，细菌多样性，e d n a 文库 i i 安徽农业大学博士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t s oc a l l e d “f u n g u s g r o w i n g t e r m i t e sb e l o n gt ot e r m i t i d a e ，m a c r o t e r m i t i n a e t h e s p e c i a ln a m ei sg o tf r o mt h es y m b i o s i sb e t w e e n t e r m i t ea n df u n g io fg e n u st e r r n i t o m y c e s f o ri t sa b i l i t yo fc o n s u m i n gm o r et h a n9 0 o fd r yw o o di ns o m ea r i dt r o p i c a la r e a sa n d m i n e r a l i z i n gu pt o2 0 o ft h en e tp r i m a r yp r o d u c t si nw e t t e rs a v a n n a s ，t h e ya r o u s e d e x t e n s i v ei n t e r e s t so fm a n yr e s e a r c h e r s u n d e rt h ep r e l i m i n a r ys t u d yo ft h i ss y m b i o s i s ，w e s u r v e y e dt h ed i v e r s i t yo fs y m b i o t i co r g a n i s m su s i n gm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sa n d c o n s t r u c t e do n ee d n al i b r a r yi no r d e rt os c r e e n i n gf o rg e n e sr e l a t e dt ot h ed e g r a d a t i o no f l i g n o c e l l u l o s e s t h em a i nr e s u l t sw e r el i s t e da sb e l o w f i r s t l y , t e r m i t e ss a m p l e sw e r ew i d e l yc o l l e c t e di ns o u t hc h i n a ( e g a n h u ip r o v i n c e , h u n a np r o v i n c e ，j i a n g s up r o v i n c ea n dy u n n a np r o v i n c e ) ，w h i c hw e r ew e l li d e n t i f i e d t h r o u g ht r a d i t i o n a lm o r p h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o na n dm o l e c u l a rm e t h o d t h eg e n e t i c d i v e r s i t yo ff i v em a j o rp e r e g r i n u s e sw a sa n a l y z e db yi n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ( i s s r ) m a r k e r s 10p r i m e r s ，w h i c hg e n e r a t e db r i g h t ，p o l y m o r p h i ca n dr e p r o d u c i b l ea m p l i f i c a t i o n p r o d u c t sw e r es e l e c t e d 1 4 5d i s c e r n i b l ed n af r a g m e n t sw e r ep r o d u c e d ，o fw h i c h14 4 ( 9 9 31 ) w e r ep o l y m o r p h i cl o c i t h eo b s e r v e dn u m b e ro fa l l e l e s 伽口) w a s1 9 9 31 + 0 0 8 3 0 ， t h ee f f e c t i v en u m b e ro fa l l e l e s ( ，z 0w a s1 5 6 6 1 士0 3 0 4 3 ，t h en e i sg e n ed i v e r s i t y ( 矗) w a s 0 3 3 5 5 j ：0 1 3 6 3a n dt h es h a n n o n si n f o r m a t i o ni n d e x w a s0 5 0 6 5 士0 1 6 4 5 t h e s ed a t a s u g g e s t e dh i g hg e n e t i cd i v e r s i t yi nt h eo v e r a l lp o p u l a t i o n s s o m ep o p u l a t i o ng e n e t i cd i v e r s i t i e s w e r es e v e r a l l ya f f e c t e d b y g e o g r a p h i cs e p a r a t i o n ，w h i c hb l o c k e d i n t e r c o u m e s o fg e n e s t h e i s s r - p c rp a t t e r nw a su n i f o n nb e t w e e nd i f f e r e n tc a s t e so fo n ec o l o n ya n dt h e a m p l i f i c a t i o nb a n d so f d i f f e r e n ti n d i v i d u a l si no n ec a s t ew e r ea l s os t a b l e s o ，w h e ns o l d i e r s w e r ea b s e n t ，i ti sf e a s i b l et ou s ew o r k e r sa so b j e c t si nm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o na n ds u r v e y o fd i v e r s i t y p h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ec o n s t r u c t e do i ls e q u e n c eo fc y t o c h r o m eo x i d a s e s u b u n i ti i ( c o u ) a n d0 1m a t r i xg e n e r a t e db yb a n d so fi s s r p c re l e c t r o p h o r e s i s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt o p o l o g yo ft w ot r e e sp a r t i a l l yc o i n c i d e dw i t he a c ho t h e ra n dt h e yw e r e a l s oc o n g r u o u sw i t ht h er e s u l to fm o r p h o l o g i ci d e n t i f i c a t i o n n e x t ，e n z y m ea c t i v i t i e so f4k i n d so fc e l l u l a s e sw e r ec o m p a r e di n17c o l o n i e s ，5 s p e c i e so fh i g h e rt e r m i t e a sar e s u l t ，o d o n t o t e r m e sy u n n a n e n s i s ，w h i c hw a sw i d e l y d i s t r i b u t e di nx i s h u a n g b a n n a , w a sc h o s e na so u rs p e c i m e nf o r t h eh i g h e s te n z y m e sa c t i v i t y o ft h es y m b i o t i cs y s t e m i no r d e rt oe x p l o r et h ep o s s i b l er o l eo fp r o k a r y o t ei nt h e s y m b i o s i s ，t w ob a c t e r i a l16 sr d n ag e n ec l o n el i b r a r i e so fm i c r o b i a lc o m m u n i t yf r o m t e r m i t e sg u ta n df u n g u sc o m b sw e r ec o n s t r u c t e dr e s p e c t i v e l y a n a l y s i so fl i b r a r yf r o mt h e i i i 安徽农业大学博士学位论文 英文摘要 g u ts h o w e d6 2 3u s a b l es e q u e n c e sw e r ed i v i d e di n t o 18 7p h y l o t y p e s a m o n gt h e s e r e p r e s e n t a t i v ep h y l o t y p e s ，m o s tw e r ea f f i l i a t e dt of i r m i c u t e s ( 38 ) a n d9 4 4 o ft h i s p h y l u mw e r er e g a r d e d a l st h e p u r ec u l t u r e d o ru n c u l t u r e d m i c r o o r g a n i s m s f r o m c l o s t r i d i a l e s m o s to ft h er e s tp h y l o t y p e sw e r em a i n l yc o n s i s t e do f b a c t e r o i d e t e s ( 2 6 7 ) ， p r o t e o b a c t e r i a ( 11 8 ) ，s p i r o c h a e t e s ( 8 ) a n db a c t e r o i d a l e s ，d e l t a p r o t e o b a c t e r i a ， t r e p o n e m aw e r ec o r r e s p o n d i n gd o m i n a n tc o l o n i e s o n l yaf e wp h y l o t y p e sb e l o n g e dt o p l a n c t o m y c e t e s ，a c t i n o b a c t e r i a ，t m 7p h y l u m ，d e f e r r i b a c t e r e s ，c h l o r o b ia n dt g1p h y l u m r e s u l t ss h o w e dl o w e rb a c t e r i a ld i v e r s i t ya p p e a r e di nf u n g u sc o m bt h a nt h a ti nt e r m i t ef l o r a ，a n dt h e c o m b sw e r ea l s oc o n s i s t e dm o s t l yo fp h y l o t y p e sb e l o n g i n gt of i r m i c u t e s as e r i e so ff u n d a m e n t a lr e s e a r c hw e r ec a r r i e do u ta f t e r p u r ec u l t u r e ds t r a i nw a s i s o l a t e df r o mf u n g u sc o m b m i c r o e x a m i n a t i o no fo n en o d u l ec o l l e c t e di nt h ew i l ds h o w e d m a n yt y p i c a li n f l l a t e dc o n i d i o g e n o u ss t r u c t u r e sa n da b u n d a n tc o n i d i aw i t ht h es h a p eo f l o n go v a l i ts u g g e s t e dt h a tc o n i d i aw e r ec o m p a r t e df r o ms p h e r ec e l l sa sp r o t o p l a s m c o n c e n t r a t i n g t h ei t ss e q u e n c e so ff u n g u sn o d u l e ( g e n b a n kn o ：f j 7 6 9 4 0 9 ) a n d c u l t u r e ds t r a i n ( f j 7 6 9 410 ) w e r et h es a m ea n do nt h es t a t u so fc l a s s i f i c a t i o n , t h e yw e r ea l s o n e a rt ot e r m i t o m y c e ss p g r o u p8 ( a b 0 7 3 5 2 9 ) b u ti tw a ss t i l lh a r dt og i v et h ea c c u r a t e s p e c i e sn a m ed u e t ot h ea b s e n c eo ff r u i t i n gb o d i e sf o r m e di nt h ef i e l d a n a l y s i so ff u n g a l d i v e r s i t yr e v e a l e dt h a to n l yt e r m i t o m y c e ss p f u n g iw e r ec u l t i v a t e do nf u n g u sc o m bb y t e r m i t e sa n da n yo t h e rn o n t e r m i t o m y c e sf u n g ic a n n o tb ed e t e c t e d u n i f o r mf u n g u s a p p e a r e di ni n t e s t i n a lt r a c ta n dt h a tc o m b sa l s oi n d i c a t e dt h a tt e r m i t o m y c e ss p w a sp a r t i a l c o n s t i t u e n to ft e r m i t e s f o o d c o n s i d e r i n gt h es i g n i f i c a n t r o l eo fs y m b i o t i c f u n g i i nt h e d e g r a d a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s e s ，ae d n al i b r a r yo ft e r m i t o m y c e ss p c o l l e c t e dd i r e c t l yf r o mf u n g u sc o m b s w a sc o n s t r u c t e dv i as m a r t t me d n a l i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t ，w h i c hp r o v i d e dav a l u a b l e l i b r a r yf o rs c r e e n i n go fc e l l u l a s eg e n e sa n dl a i daf o u n d a t i o nf o rb a s i cb i o l o g yr e s e a r c ho f t h i sf u n g i t h el i b r a r yh a sah i 曲t i t e ro f7 x10 0p f u p la n dt h ec a p a c i t yw a s3 5x10 6p f u t h er e c o m b i n a t i o nr a t ew a s9 7 t h es i z eo fa v e r a g ei n s e r tc d n a sw a s1 3 3k b t h e s e e x p e r i m e n td a t as h o w e dt h eg o o dq u a l i t yo ft h i sl i b r a r y ap o s i t i v ec l o n ec o n t a i n i n g x y l a n a s eg e n e ，n a m e da sx y l _ c 5 ，w a so b t a i n e du s i n gp c rs c r e e n i n gm e t h o df r o ml i b r a r y s u c c e s s f u l l y t h i sg e n ec o d e d2 2 6a m i n oa c i d sa n dh a da no b v i o u sp o l y as t r u c t u r ee x i s t i n g a tt h e3 e n d t h em o l e c u l a rw e i g h to f p r o t e i nc o d e db yt h i sg e n ew a sa b o u t2 4k d aa n d f r o m4 3t o2 2 3a m i n oa c i d sw a sf u n c t i o n a ld o m a i no fg l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y11 t h e 12 9a n d2 2 0a m i n oa c i d sw e r et w oa c t i v es i t e s ，m a d eu po fg l u t a m a t e t h ea m i n oa c i d s s e q u e n c ew a s5 8 一6 0 i d e n t i c a lt os o m eo t h e rx y l a n a s ep r o t e i n sf r o ma s p e r g i l l u s ，i n d i c a t i n g i v t h ef i r s tr e p o r to fx y l a n a s ef r o mt e r m i t o n y c e s l a s t ，ar e c o m b i n a n tp l a s m i d ，p e t 2 2 b x y l c 5w a sc o n s t r u c t e da n di n d u c e d s d s - p a g es h o w e dt w oi n s o l u b l et a r g e tp r o t e i n se x p r e s s e d w i t hs i z e so f17k d aa n d15k d a , r e s p e c t i v e l y t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h i sr e s u l ta n dt h e p r e d i c t i o np e r h a p sw a sd u et ot h eu n s u i t a b l ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mo rt h ef o l d i n g a n dm o d i f i c a t i o no ft h ep r o t e i n s k e yw o r d s ： f u n g u s g r o w i n gt e r m i t e ，t e r m i t o m y c e s ，l i g n o c e l l u l o s e ，b a c t e r i a ld i v e r s i t y , c d n al i b r a r y v 安徽农业大学博士学位论文插图和附表清单 图1 1 图1 2 图1 3 图1 4 图1 5 图3 1 图3 2 图3 3 图3 - 4 图3 5 图4 一l 图4 2 图4 3 图4 - 4 图4 5 图4 6 图4 7 图4 8 图4 9 图5 - 1 图5 2 图5 3 图6 一l 图6 2 图6 3 图6 - 4 图6 5 图6 - 6 图6 7 图6 8 图6 - 9 图6 1 0 图6 一l l 图6 1 2 图6 1 3 图6 1 4 图6 1 5 图6 1 6 图6 1 7 图6 1 8 图6 一1 9 图6 - 2 0 图6 - 2 1 图6 - 2 2 图6 - 2 3 插图和附表清单 白蚁消化道结构i l w 3 白蚁品级及其生活史3 纤维素、半纤维素及木质素的结构示意图7 纤维素酶在纤维素水解过程中的协同作用8 木聚糖酶各组分在木聚糖水解中的作用l2 采集的白蚁种群的地理分布一二2 8 引物i s l 6p c r 扩增产物3 l 引物i s l 5 在l 1 7 a 中的扩增图谱3 3 基于c oi i 基因序列构建的p a u p 系统发育树一3 6 基于i s s r p c r 产生的条带二维矩阵构建的p a u p 系统发育树3 6 y 3 蚁巢白蚁及菌圃四种酶活的比较一4 5 d n a 电泳检测图4 6 1 6 sr d n a 的p c r 产物4 6 细菌克隆文库的稀薄曲线及物种多样性的累积曲线4 6 云南土白蚁肠道细菌菌群中主要成员分布4 8 b a c t e r o i d e t e s 及c h l o r o b i 系统发育型的系统发育关系4 9 云南士白蚁肠道细菌系统进化树5 0 云南土白蚁肠道细菌菌群中主要成员分布( 基于文库总o t u 数) ：5 1 肠道细菌菌群o t u 比例在d y u n n a n e n s 妇与0 f o r m o s a n u s 之间的比较6 2 蚁巢共生真菌及其纯培养物的形态观察6 8 y 3 蚁巢共生真菌及其纯培养物的i t s 序列比对6 9 t e r m i t o m y c e s 属菌株基于i t s i 5 8 s i t s 2 全长序列的系统发育树6 9 s m a r t 法构建e d n a 文库的第一个阶段7 3 纯化前、后t o t a lr n a 电泳图8 3 18 轮p c r 循环双链c d n a 电泳图8 3 e d n a 大小分级分离电泳图8 4 纯化后e d n a 的浓度检测8 4 从文库中随机挑选4 8 个克隆检测e d n a 插入片段的p c r 产物电泳结果8 5 筛选引物的选择8 5 p c r 反应体系退火温度的确定8 6 第一轮阳性孔筛选结果8 6 阳性孔的验证8 7 阳性孔液稀释倍数的确定8 7 第二轮阳性孔筛选结果8 8 阳性孔的验证8 8 阳性孔液稀释倍数的确定8 8 阳性克隆a f ai 酶切结果8 9 x y t克隆的核酸序列及蛋白序列信息89c5 功能域分析9 0 x y l a n a s e 基因片段同源性比较一9 0 目的基因片段的p c r 扩增产物9 l 目的基因和载体双酶切的电泳结果一9 l 阳性克隆的p c r 验证9 2 重组质粒的s d s p a g e 分析。9 2 重组蛋白的可溶性分析9 2 v i 安徽农业大学博士学位论文插图和附表清单 表1 1与纤维素降解相关的真菌和细菌1 0 表3 1采集信息及白蚁物种c oi i 基因序列号2 7 表3 - 2i s s r 引物序列、p c r 条件及扩增位点的多态性分析3 2 表3 3 种间及种内遗传多样性分析3 5 表3 _ 4 所有群体的遗传相似度( 上三角) 和遗传距离( 下三角) 3 5 表3 5 三个小群体各自遗传相似度( 上三角) 和遗传距离( 下三角) 3 5 表4 一l白蚁采集信息4 0 表4 2 纤维素酶活性检测方法：。4 2 表4 3云南土白蚁肠道细菌1 6 sr d n a 克隆的分类关系4 8 表4 4 云南土白蚁菌圃细菌1 6 sr d n a 克隆的分类关系5 l 表4 5白蚁肠道细菌1 6 sr d n a 序列与r d p 数据库的比对结果5 2 表4 6 菌圃细菌1 6 sr d n a 序列与r d p 数据库的比对结果5 8 表6 1p c r 筛选所设计的引物序列7 8 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：洲年占月，弓日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一虢粒帆砷年6 月多日 第一导师签名：时间： 6 ( ；| 每彭旯f 安徽农业大学博士学位论文第1 章文献综述 第1 章文献综述 当今世界范围内，石油资源逐渐紧缺、原油价格不断攀升、环境压力日益加重， 生物燃料作为一种可再生绿色资源正日益获得人们的重视和青睐。其中，燃料乙醇主 要是通过粮食作物和甘蔗、甜菜等糖类农作物发酵获得的。但二者己凸显出难以克服 的矛盾促使人们将获得燃料乙醇的来源指向了木质纤维素。因而，纤维素乙醇的生产 立即成为了研究热点。 纤维素乙醇是通过众多复杂的代谢反应将木质纤维素转化为乙醇，其中尤以木质 纤维素的水解最为关键，这也是利用纤维素生产乙醇的最大障碍。木质纤维素是光合 作用的基本产物，是地球上最丰富的可再生生物资源，多为高分子聚合物【l 】。据估计， 木质纤维素占全球生物量的9 0 以上，而很大一部分的资源都未被充分利用。如果将 这部分来源丰富的木质纤维素用以乙醇生产，不仅可以降低生产成本，而且还可以变 废为宝，净化环境。 许多植食动物和腐生生物是木质纤维素的主要消费者，它们通过摄取这些富含纤 维素的物质作为营养来源和能量。在这个过程中，腐生生物主要是通过真菌、细菌的 一套完整的纤维素酶系统来降解纤维素分子链【2 3 ，4 】，高等植食动物主要依赖肠道共生 微生物产生的纤维素酶进行木质纤维素的消化【5 】，而某些无脊椎动物，如一些节肢动 物、软体动物和线虫等，则可通过自身分泌的纤维素酶来达到消化木质纤维素的目的。 近年来，在众多的木质纤维素消费者中，在热带地区木质纤维素的生物循环中发挥重 要作用的等翅目白蚁，引起人们的高度关注。它们具有利用微生物共生体进行消化木 质纤维食物的能力【6 】。科学家们希望通过研究白蚁利用木质纤维素的过程，找到高效 降解木质纤维素的相关功能基因，为进一步提高纤维素乙醇生产工艺提供有效途径。 白蚁降解木质纤维素的能力比大型草食动物要高出3 0 4 0 t 。它们通过与肠道 微生物( 低等白蚁) 及菌圃真菌( 高等白蚁中的大白蚁亚科) 的共生来有效地降解木 质纤维素。由研磨器( 咀嚼组织的下颚和前胃) 、反应池( 消化道) 、酶和微生物区 系构成的特殊消化系统被形象的称作小型的生物反应器【8 】。其中，微生物区系分泌的 纤维素酶同白蚁自身分泌的纤维素酶协同作用【9 】，共同降解白蚁取食的各种纤维素类 物质并进行吸收和利用。近年来，科学家们已经从白蚁共生系统中分离到了一些来自 白蚁及其共生系统的纤维素酶基因，也获得了一些具有纤维素降解功能的肠道细菌及 具有木质素降解能力的共生真菌【i 0 , 1 1 】，但研究仍处于非常初步的阶段。现阶段，随着 肠道细菌元基因组和相关的分子生物学手段的逐渐展开，加快发掘大量具有降解纤维 素、木质素的相关基因及相关生物显得尤为重要。 安徽农业大学博士学位论文第l 章文献综述 1 1白蚁的概况 1 1 1白蚁的生物学特性 白蚁属于昆虫纲( i n s e c t a ) 、等翅目( i s o p t e r a ) ，包括7 个科l l2 1 。世界上目前己 发现2 6 0 0 多种【1 3 1 ，在中国有记录的种类达至u 4 6 0 余种【1 4 1 。从解剖学和社会组织性特征 方面考虑可以把白蚁分为两大类群，即低等白蚁和高等白蚁。低等白蚁包括澳白蚁科 ( m a s t o t e r m i t i d a e ) 、原自蚁科( t e r m o p s i d a e ) 、木白蚁科( k a l o t e r m i t i d a e ) 、草白 蚁科( h o d o t e r m i f i d a e ) 、鼻白蚁科( r h i n o t e r m i t i d a e ) 和齿白蚁科( s e r r i t e r m i t i d a e ) 6 个科；高等白蚁虽仅有白蚁科( t e r m i t i d a e ) 1 个科，但这个科却占据了所有白蚁种 类的四分之三。这些不同科的白蚁在生物学和行为学上各不相同。从进化关系上看， 草白蚁科和原白蚁科可能是等翅目最古老的类群，保留了许多原始祖先的特征；鼻白 蚁科则是低等白蚁中最为进化的一个科，一般为土木栖性白蚁，某些种类是世界性大 害虫，分布广，危害极大；白蚁科是等翅目中最大的科，该科属土栖性白蚁，筑巢于