（植物学专业论文）植物甜蛋白基因thaumatin表达载体的构建及对雪莲果的遗传转化.pdf

摘要 甜蛋白( t h a u m a t i n ) 存在于西非热带雨林中种竹芋科多年生草本( t h a u m a t o c o c c u s d a n i e l l i ib e n t h ) 的果实胶质假种皮中。t h a u m a t i n 蛋白有甜味，而且它还具有低热量、安全 无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点，是类高甜度而又不含糖的新型甜味 剂，所以它被认为有希望发展成为食品工业中营养性碳水化合物的替代品而成为未来新型的 甜味剂。但是zd a n 招l l i i 在原产地之外不能正常结实，并且引种不成功难以大量生产，致使 甜味蛋白成为十分昂贵的商品。生物技术的迅速发展启发人们用基冈重组的手段开发甜蛋 白，对这些甜味蛋白和矫味蛋白进行了克隆和测序，并将其表达于其他宿主。已经实现了甜 蛋白在微生物中的表达，个别的还在一些植物中得到表达。因此，本试验在吸取前人经验的 基础上，构建了植物表达载体p b l l 2 1 t h a u m a t i n ，并将其转入根癌农杆菌e h a l 0 5 中，然 后通过农杆菌的介导将t h a u m a t i n 基因导入雪莲果中，并对转基因植株进行了检测，借以初 步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况，为进一步转化园艺植物打下了基础。实验结果如 下： ( 1 ) 甜蛋白t h a u m a t i n 基因的人工合成和克隆 本实验根据已报道的t h a u m a t i n 基因序列，采用重叠延伸p c r 法人工合成t h a u m a t i n 全长基因，与t 载体p m d l 9 t 连接后转化d h 5 c t ，通过菌落p c r 、双酶切、测序鉴定，得 到克隆载体p m d - t h a u m a t i n 。 ( 2 ) 甜蛋白t h a u m a t i n 基因植物表达质粒p b l l 2 1 t h a u m a t i n 的构建与鉴定。 利用d n a 重组技术，将植物甜蛋白t h a u m a t i n 基因克隆至植物表达载体p b l l 2 1 中，通过 p c r 、酶切、电泳鉴定t h a u m a t i n 基冈已成功构建到植物表达质粒p b l l 2 1 中。 ( 3 ) p b l l 2 1 t h a u m a t i n 质粒转化根癌农杆菌 重组质粒p b l l 2 1 t h a u m a t i n 通过直接转化法导入农杆菌e h a l 0 5 中，利福平( r i d 和 卡那霉素( k a r l ) 平板筛选阳性克隆，有单菌落生长，经过菌液p c r 鉴定，证明重组质粒已转 进农杆菌e h a l 0 5 中。 ( 4 ) 植株再生体系的建立 采用无菌苗雪莲果( s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s ) 叶片为外植体，以m s 为基本培养基， 筛选出m s + 6 - b a l 0 m g l + n a a 0 1 m g l 形成愈伤组织，m s + 6 b a l 0 m g l + i a a 0 1 m g l 以 诱导不定芽的分化，并于1 2 m s + n a a 0 2 m g l 生根培养，获得完整再生植株。 ( 5 ) 转化体筛选及植株再生 将预培养3 4 天的外植体与农杆菌菌液浸染5 1 5 分钟后，共培养2 3 天，然后转化到含 m l p n 和k a r l 的选择培养基上进行分化筛选，转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选 过程中发芽、生根，获得转基因植株。 ( 6 ) 转基冈植株p c r 检测 提取转基因植株基因组d n a 后，p c r 扩增t h a u m a t i n 基因，证明t h a u m a t i n 基因已导 第1 页共5 0 页 入雪莲果中，转化率为3 6 4 。 关键词：t h a u m a t i n 基因、表达载体的构建、雪莲果、再生体系的建立、遗传转化 第2 页共5 0 页 英文摘要： c o n s t r u c t i o n0 ft h a im a t i ng e n ep l a n te x p r e s s i o n v e c t o ra n dg e n e t i ct ra n s f o r m a t i o no ft h e s m r a l l a n t h u ss o n c h i f o l l u s p l a n tm o l e c u l a rb i o l o g y & b i o t e c h n o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f c u ib o & y ey o n g z h o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：j i a n gs u h u a a b s t r a c ts w e e tp r o t e i nt h a u m a t i ne x i s t si n t h e g e l a t i n o u s a r i lo ff r u i to f t h a u m a t o c o c c u sd a n i e l l ib e n t hi n t h et r o p i c a lr a i n f o r e s to fw e s ta f r i c a t h a u m a t i n h a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs w e e t n e s si n t e n s i t y , l o wc a l o r i e s ，n o n - t o x i c i t y , a n d n i c et a s t e i ta l s oc a l lb ed e g r a d e di n t oa m i n oa c i d sw h i c hr e q u i r e db yh u m a nb o d y t h e r e f o r e ，i ti se x p e c t e dt ob et h es u b s t i t u t ef o rn u t r i t i o u sc a r b o h y d r a t ei n t h e f o o d s t u f fi n d u s t r ya n db e c o m ean e ws w e e t e n e ri nt h ef u t u r e h o w e v e r , zd e n & l l i i c a i l tf r u i tn o r m a l l yo u t s i d ei t sp l a c eo fo r i g i n , a n di ti sd i f f i c u l tt oc o n d u c ti t sm a s s p r o d u c t i o nd u et ou n s u c c e s s f u li n t r o d u c t i o no fv a r i e t y t h u st h et h a u m a t i nb e c o m e s v e r ye x p e n s i v ec o m m o d i t y t h er a p i dd e v e l o p m e n to fb i o t e c h n o l o g yi n s p i r e sp e o p l e t ou s et h em e t h o do fg e n er e c o m b i n a t i o nt od e v e l o ps w e e tp r o t e i n b yc l o n i n ga n d s e q u e n c i n gt h eg e n e so fs w e e tp r o t e i na n dt a s t e - m o d i f y i n gp r o t e i n ，t h o s ep r o t e i n s w e r es u c e s s f u l l ye x p r e s s e di no t h e rh o s t ss u c ha sb a c t e r i a ，f u n g i ，a n ds o m ep l a n t s i n t h i st e s t ，b a s e do nt h ep r e d e c e s s o r s e x p e r i e n c e s ，t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp b i121 - t h a u m a t i nw a sc o n s t r u c t e da n dt h e g e n e o ft h a u m a t i nw a st r a n s f e r e di n t o s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se h a l 0 5 i n a d d i t i o n , t h ep r e s e n c eo ft h et r a n s g e n e sw a sa s s e s s e db yp c r t h et r a n s g e n i cp l a n t s w e r et e s t e dt op r e l i m i n a r i l ys t u d yt h et r a n s f o r m a t i o na n de x p r e s s i o no ft h a u m a t i ni n t h ep l a n ta n dl a yaf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rt r a n s f o r m i n gt h eh o r t i c u l t u r ep l a n t t h e e x p e r i m e n tr e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： ( 1 ) a r t i f i c i a ls y n t h e s i sa n dc l o n eo f t h a u m a t i ng e n e i nt h ee x p e r i m e n t ，a c c o r d i n gt ot h er e p o r t e dt h a u m a t i ng e n es e q u e n c e ，t h ee n t i r e t h a u m a t i ng e n ew a sa r t i f i c i a l l ys y n t h e s i z e db yo v e r l a pe x t e n s i o np c r t h e nt h eg e n e w a st r a n s f o r m e dt oec o l id h 5 ab yc o n n e c t i n gt h eg e n et otv e c t o rp m d19 - t ，a n d t h ec l o n ev e c t o rp m d - t h a u m a t i nw a so b t a i n e da f t e ri d e n t i f i c a t i o no fc o l o n yp c r , d o u b l ed i g e s t s ，a n ds e q u e n c i n g 一 一一 。 第4 3 页共5 0 页 、， ( 2 ) c o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h a u m a t i ng e n ep l a n te x p r e s s i o np l a s m i d p b l l 2 1 t h a u m a t i n b yu s i n gd n a r e c o m b i n a t i o nt e c h n o l o g y , t h et h a u m a t i ng e n ew a si n s e r t e di n t o t h ep l a n te x p r e s s i o np l a s m i dp b i121a n dv e r i f i e db yp c r , e n z y m ec u t t i n ga n d e l e c t r o p h o r e s i si d e n t i f i c a t i o n ( 3 ) t r a n s f e r r i n gp b i 121 - t h a u m a t i np l a s m i dt oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s t h er e c o m b i n a t i o np l a s m i dp b i121 一t h a u m a t i nw a sl e dt oa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n se h a l 0 5w i t hd i r e c tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d 1 1 l ep o s i t i v ec l o n ew a s s e l e c t e dw i t hr i fa n dk a nf l a tp l a t ea n ds i n g l ec o l o n y t h r o u g hb a c t e r i as o l u t i o np c r i d e n t i f i c a t i o n ，i ti sp r o v e dt h a tt h ep l a s m i dw a st r a n s f e r r e dt oa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n se h a l 0 5 ( 4 ) c o n s t r u c t i o no fp l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e m r 1 1 l el e a v e so fs t e r i l es e e d l i n gs m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sw e r eu s e da se x p l a n t s ，a n d m sa sb a s i cc u l t u r em e d i u m ，玎1 em e d i u mm s + 6 - b a l 0 m g l + n a a 0 1m g lw a s s e l e c t e dt of o r mc a l l u s ，m s + 6 一b a l o m g l + i a a o 1m g lt oi n d u c et h ed i f f e r e n t i a t i o n o fa d v e n t i t i o u ss h o o t s ，a n d1 2 m s 神、j a a o 3 m g lf o rr o o t i n gc u l t i v a t i o n t h e nt h e c o m p l e t er e g e n e r a t i o np l a n ti so b t a i n e d ( 5 ) t r a n s f o r m a n ts e l e c t i o na n dp l a n tr e g e n e r a t i o n a f t e rb e i n gp r e c u l t u r e df o r3 - 4d a y s ，t h ee x p l a n t sw e r ed i p p e di nt h eb a c t e r i a s o l u t i o no fa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sf o r5 - 15m i n u t e sa n dc u l t u r e df o r2 - 3d a y s t h e nt r a n s f e rt h e mt ot h em e d i ac o n t a i n i n gm l p na n dk a nf o rd i f f e r e n t i a t i o na n d s e l e c t i o n a n dt h et r a n s f o r m a n t st r a n s f e r r e dt oe x o g e n o u sg e n e sg e r m i n a t e da n dt o o k r o o t t h u st h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e d ( 6 ) p c rt e s to ft r a n s g e n i cp l a n t a f t e re x t r a c t i n gt h eg e n o m ed n ao ft r a n s g c n i cp l a n t ，p c rt h a u m a t i ng e n e ， p r o v i n gt h a tt h eg e n ei sl e dt os m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s 、析t ht r a n s f o r m a t i o nr a t eo f 3 6 4 k e y w o r d s ：t h a u m a t i ng e n e ，c o n s t r u c t i o no fp l a n te x p r e s s i o n v e c t o rp b il21 - t h a u m a t i n ， e s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e m ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 第4 4 页共5 0 页 致谢 三年的研究生生活即将结束，我满怀一颗感恩的心面对身边所有的老师、同 学、朋友和家人。不知道“感谢”二字是否可以表达心底那份最深的情意。感谢我 的导师崔波教授，叶永忠教授，恩师不仅在科学研究上精心指导，而且在生活上 也给予了无微不至的关怀。导师真诚善良，严谨的治学态度，对科学不断追求的 精神，将令我终身受益，永志不忘。在此论文完成之际，谨向恩师致以崇高的敬 意和最衷心的祝福以及最诚挚的谢意。 感谢马杰教授，马老师不仅在学业上和生活上给予我无微不至的关心，而且 她严谨求实的态度，踏踏实实的精神使我没有虚度这三年的光阴，获得了人生重 要的财富。 感谢所有教导过我、关心过我的老师，你们为我的学业倾注了大量心血，你 们为人师表的风范令我敬仰，严谨治学的态度令我钦佩。 感谢我的师弟师妹们，这里向他们对我的支持与帮助致以由衷的感谢。感谢 携手共走的同窗好友，使得我的求学之路变得充实而又充满欢愉。感谢2 0 0 7 级 的所有同学，是他们的敬业精神和勤奋好学的高尚品质，感化和鞭策我用心完成 学业。虽然相聚匆匆，但友谊天长地久。 感谢我的家人，是他们给予了我莫大的鼓励和支持，给了我积极向上，不断 进取的动力! 最后，对三年来所有曾经在生活、学习和工作中，给予我支持和帮助的良师 益友们，再次表示诚挚的谢意! 蒋素华 2 0 1 0 6 1 文献综述 1 1 甜味蛋白研究综述 甜味剂广泛地应用在食品、饲料、饮料、医药等工业中，特别是在食品、饮料工业上的 用量最大。甜味剂，按其化学成分可分为以下五类：( 1 ) 糖类：如蔗糖、麦芽糖等甜味剂； ( 2 ) 糖醇类：如山梨醇、甘油等；( 3 ) 配糖体类：如甜叶菊苷、甘草酸苷等；( 4 ) 人工甜 味剂：如糖精、a s p a r t a m e 等；( 5 ) 蛋白质类。 目前使用的甜味剂以糖类，尤其是以蔗糖为主。近年来，与食糖过量相关的疾病如糖尿 病、龋齿、肥胖等患者呈几何指数增加，已成为人类健康的一种威胁。所以人工合成的甜味 剂如甜蜜素、糖精、阿斯巴甜( a s p a r t a m e ) 等作为低热卡甜味剂被限糖疾病患者广泛食用。 但这些人工甜味剂已经引起了一系列的副作用，如膀胱癌、心理问题、精神错乱、心血管疾 病和脑瘤等i 。自然存在的甜味和矫味蛋白是现有的人工低热卡甜味剂的潜在替代者。甜 蛋白有许多优点，与碳水化合物的糖类相比：热量低；甜度高；不会引起口腔蛀牙；不使体 内血糖升高；可增进或改善食品的风味；甜蛋白被消化后降解为人体所需的各种氨基酸。与 化学合成的甜味剂相比：甜味纯，口感好；无毒，不致癌。因此，甜蛋白是人们所期待的一 类理想的甜味剂。 植物甜味蛋白或矫味蛋白均来自热带雨林植物。熟带国家的居民常用其作为食物的增甜 剂。由于甜蛋白来源于热带植物的果实或种子，这些植物正常结实所要求的生态环境比较苛 刻，难以在其他地区引种成功，因此从天然植物中提取甜蛋白难以形成规模，从而限制了甜 蛋白的广泛生产和应用。 生物技术的迅速发展启发人们用基因重组的手段开发甜蛋白，近些年来，对这些甜昧蛋 白进行了克隆和测序，并将其表达于其他宿主。已经实现了甜蛋白在微生物中的表达，个别 的还在些植物中得到表达。 如果将甜蛋白的基因进行改造，将其转入水果、蔬菜中，生产出具有甜味而无糖的蔬菜、 瓜果，不仅能满足限糖疾病患者的需求，还可以为大规模生产甜蛋白产品提供一条良好的途 径。 1 2 甜蛋白的研究进展 1 2 1 甜蛋白的种类和性质 迄今为止已被发现的植物甜味蛋白和矫味蛋白有7 种，分别是m o n e l l i n 、t h a u m a t i n 、 m a b i n l i n 、m i r a c u l i n 、c u r c u l i n 、b r a z z i n 和p e n t a d i n 2 1 。甜蛋白可分为两类，一类是有甜味， 但没有味调功能的甜蛋白，如t h a u m a t i n 、m o n e l l i n 、m a b i n l i n 、p e n t a d i n ；另一类是具有味 调节功能的甜蛋白，如m i r a c u l i n 和c u r c u l i n ，这类甜蛋白可使有酸味的物质吃起来带甜味， 所以也称之为味调节蛋白。现在，这7 种甜蛋白已相继被分离纯化，并且己研究清楚基本性 质和化学组成【2 ，引。它们的来源及特征见表1 1 。 第3 页共5 0 页 1 2 2 甜蛋白的味觉特征 甜蛋白的味觉感受有减弱的现象，特别是t h a u m a t i n ，其刺激程度迅速上升最大，然后 逐渐减弱，甜味消失后，用水漱口，能感受到一些甜昧，这说明甜蛋白是强烈吸附，或结合 在味觉受体上的。 人的舌头的同一部位对不同甜味剂的敏感性存在差异，蔗糖的敏感部位则在舌尖，甜蛋 白的敏感部位是舌头的侧缘和根部。 甜蛋白的剂量响应函数与蔗糖及人工合成的甜味剂有所不周。蔗糖的剂量响应函数符合 s t e v e n 定律，其甜度增加速度较浓度增加速度要快得多；人工合成的甜味剂，甜度的增加速 度比浓度的增加速度慢，而甜蛋白的浓度与甜度呈线性关系1 4 】。 甜蛋白的甜味感会受到溶液中无机盐的显著影响，这一点也与蔗糖形成鲜明的对比。食 盐的存在可以抑制甜蛋白的甜度。另外科学家们还发现在相当甜度的t h a u m a t i n 溶液里，存 在有o 1 mn a c i 时，其甜度下降5 0 。 无机盐离子，尤其是c a 2 + ，对甜蛋白的甜味感影响显著。研究发现，c a 2 + 浓度过高或过 低都会抑制甜蛋白的甜味活性。这可能与味觉细胞中的c a 2 + 通道及c a 2 + 中介的阳离子通道 有关。c a 2 + 调节的环核苷酸级联可在细胞内表面起作用，改变离子通道活性，引起膜电位的 变化。如果在味细胞的外表面存在一个类似的过程，那么细胞外c a 2 + 浓度太低或太高都将 抑制甜蛋创”。 1 2 3 甜蛋白的甜味机理研究 已有研究证明，一些甜昧物质的甜味感觉是通过羧基与受体离子因离子键结合而引发 的。t h a u m a t i n 甜味阈值强度( 1 0 8 m l l ) 和激素与受体结合的阈值强度相似，其肽链序列与其 他甜蛋白之间没有明显的同源性。因此认为t h a u m a t i n 的甜味可能是其高级结构中，与其它 甜蛋白相似的部分特定基团与甜味受体结合而产生的味觉效应。一些现象确实与该推测相吻 合，当p h 、温度等因素破坏了t h a u m a t i n 分子内的二硫键而影响到蛋白质高级结构时，会 对该蛋白的甜味活性产生明显影响。m o n e u i n 与t h a u m a t i n 可以发生免疫交叉反应，推测二 者可能有相同的甜味机理【7 j 。 1 9 6 9 年，u r i b a r a 等对m i r a c u l i n 的味调节机理提出了如下假设：m i r a c u l i n 有两个结合 位点，一个可以与受体膜结合，另一个可以与甜味受体结合。在碱性或中性条件下， 第4 页共5 0 页 表1 - l 甜蛋白的来源及性质【6 1 t a b 1 1o r i g i na n dn a t u r eo f t h es w e e tp r o t e i n 6 1 甜度( 等 产地分子量 来源变体质量的氨基酸数构型 分布( k d a ) 蔗糖 t h a u m a t i nt h a u m a t o c o c c u s 西非i ，1 1 ，i i i , 3 0 0 02 2 2 2 0 7单体 d a n i e l l i ia b ，c m o n e l l i n d i o s c o r e o p h y l l u m 西非 i ，i i ，i i i , 3 0 0 0 1 0 7 4 5 ( a 链) 二聚物 馆肌卅沁f fi 5 0 ( b 链) ( a + b ) m a b i n l i n c a p p a r i sm a s a i k a i 中国li i a 1 0 01 2 4 3 3 ( a 链)二聚物 p e n t a d i n b r a z z e i n c u r c u l i n i i i ，i v 西非 西非 马来 - 西亚 5 0 01 2 o 7 2 ( b 链) ( a 十b ) 2 0 0 06 55 4 单体 5 5 02 4 91 1 4 9 8 41 9 1 二聚物 ( a 十b ) 四聚物 ( a + a + a 十a ) m i r a c u l i n 不与甜味受体结合，当条件改变至酸性，受体膜的构象发生改变，使m i r a e u l i n 与味觉体结合，感觉到强烈的甜味。c u r c u l i n 与m i r a e u l i n 都有味调节功能，且可以发生免 疫交叉反应，二者可能有相似的作用机理1 8 】。 关于甜蛋白的甜味机理目前还不十分清楚。上述这些结论都是研究者根据相关实验作出 的些科学性推测。究竟7 种甜蛋白的甜昧机理是否相似，它们的甜味机理是怎样的? 还需 要更多的研究探索来攻克这一难题。 1 2 4 甜蛋白t h a t m a a t i n 介绍 1 2 4 1t h a u m a t i n 的来源 第5 页共5 0 页 咖 讹 刎 = = 一 t h a u m a t i n 是一类存在于热带植物两非竹芋( t h a u m a t o c o c c u sd a n i e l l i ib e n t h ) 的果实的 假种皮中的甜蛋白。 西非竹竽是竹竽科( m a r a n t a c e a e ) 多年生草本植物。1 8 5 5 年，d a n i e l l 最早对这种植物 进行了描述。其株高可达3 m ，叶宽，椭圆形，薄如纸。短穗状花序，着生于近地面的叶柄 上隆起的基部，每个花序有成对生长着约1 2 对花，花紫红色。通常只2 3 对或偶而有4 5 对开花结果。簇生于地面上，往往部分被枯叶、泥沙所覆盖。果实为三角形的肉质果，初熟 时由墨绿色转为褐色，全熟时鲜红色。每个果实有1 3 枚深黑色种子，种子顶端覆有柔软的 膜质囊( 即假种皮) ，其内含极甜的粘性物质。西非竹竽每年大部分时间都开花，以2 月至6 月和8 月1 0 月花最盛，开花后约3 4 个月果实即成熟，果实上和重量变化颇大，单粒种子 果实平均重9 9 ，双粒种子和三粒种子的果实平均重1 2 1 6 9 ，最重的果实可达4 0 多克【2 1 。主 要分布在塞拉利昂到扎伊尔的热带雨林中，安哥拉等地也有分布；还可在其它某些地方种植， 如马来西亚半岛。 v a nd e rw e l 和l o e v e 等 9 1 人最早分离出了zd a n 把l l i ib e n t h 中的甜味活性成分 t h a u m a t i n ，它的甜度是等质量蔗糖的3 0 0 0 倍。研究发现只有人和欧洲猴( o l d - w o r l dm o n k e y ) 才能感觉到这些蛋白质的甜味1 1 0 】。 1 2 4 2t h a u m a t i n 的氨基酸序列及分子结构 从植物提取的t h a u m a t i n 至少有五种蛋白质分子，t h a u m a t i ni ( 图1 1 ) 、i i ，t h a u m a t i n a ，b ，c 。各组分的t h a u m a t i n 氨基酸组成、甜度和分子量等都相似。植物t h a u m a t i n 的多肽 链中含8 个二硫键。每种t h a u m a t i n 都由2 0 7 个氨基酸组成，t h a u m a t i ni 的2 0 7 个氨基酸及 其序列己全部直接测定，测定结果与由t h a u m a t i nm r n a 合成的c d n a 推得的肽链不完全 一致，只有5 个氨基酸不同。由e d n a 推得的肽链被认为对应于t h a u m a t i ni i ，并认为二者 氨基酸不同部分是因为t h a u m a t i ni ，i i 的电荷不同。由c d n a 得到的t h a u m a t i ni i 也是如下 结构：n 端是一个由2 2 个氨基酸组成的分泌信号( 前体序列) ，c 端有一个含6 个氨基酸的 副体。除去前体和副体序列，就可以得到成熟蛋白质。t h a u m a t i ni 和i i 的氨基酸序列见表 1 - 2 1 1 1 】。用克隆的t h a u m a t i ni i c d n a 作为探针对zd a n 抬l l i 染色体d n a 进行d n a 印迹法 分析，结果表明存在一组t h a u m a t i n 基因。t h a u m a t i ni i 的基因编码中含有二个较短的内含 _ 7 - - 1 2 1 j o i n g e n e 公司最早进行重组t h a u m a t i n 生产的研究，他们在s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中 进行了t h a u m a t i n 表达。首先从植物提取得到了二种主要t h a u m a t i na 和b 。比较发现，这 二种t h a u m a t i n 中只有在4 6 位上的氨基酸不同( 分别为天冬酰胺和赖氨酸) ，但二个序列均与 报道的t h a u m a t i ni 和i i 不同。t h a u m a t i n a 有l 或4 个、t h a u m a t i nb 有2 或3 个氨基酸与 t h a u m a t i ni 或i i 不同( 见表1 3 ) 。并经变性t h a u m a t i n 的折叠复性试验及重组t h a u m a t i n 分 泌结果看，植物提取的二种主要t h a u m a t i n 分子应对应于t h a u m a t i n a 和b 【1 蛇3 1 。 第6 页共5 0 页 图1 1 t h a u m a t i ni 的三级结构 f i g 1 1t e r t i a r ys t r u c t u r eo f t h a u m a t i ni 、 表1 2 t h a u m a t i ni 和t h a u m a t i ni i 的氨基酸组成和序列 t a bl - 2t h ec o m p o s i t i o na n ds e q u e n c eo f t h a u m a t i nia n dt h a u m a t i ni ia m i n oa c i d a l a l t h r p h e g l u i i c v a i a s n a r g c y s s c r 加t y r t h r v a l t r p p h e p h e p h e s e t l y s g l y 2 0 a s n a l a a l a l e u a s p a l a g l y g l y a r g g i n l c u a m s c r g l y g l u s e r t r p t h r i l e a s h 柏v a l g l u p r o g l y t h r a s n ( l y s ) g l y g l y l y s 1 i e 5 0 t r p a l a a r g t h r a s p c y s t y r p h e a s p a s p 6 0 s e t g l y s e r ( l y s ) g l y 1 i e c y s l y s ( a r g ) t h r g l y a s p 7 0 c y s g l y g l y l e u l e a a r g ( g l n ) c y s l y s a r g p h e s o g l y a r g p r o p r o t h r t h r l e u a l a g l y p h e s e r l e u a m g i n w y r g l y l y s a s p t y r i i c l 0 0 a s p 1 l e s e r a s h 1 i e l y s g l y p h e a s n v a l 旧 p r o m e t a s n ( a s p ) p h e s c r p r o t h r t h r 旭g l y l 2 0 c y s a r g g l y v a l a r g c y s a l a a l a a s p 1 i e l 3 0 v a l o y g i n c y s p r o a l a l y s l e u l y s a l a 竺p r o g l y g l y g l y c y s a s n a s p a l a c y s t h r 瑚v a l p h e g i n t h r s e r g l u r y r c y s c y s t h r l 6 0 t h r g l y l y s c y s g l y p r o t h r g l u r y r s e r l 7 0 a r g p h c p h e l y s a r g l e u c y s p r o 却a l a 瑚p h e s e t r y r v a l l e u a s p l y s p r o t h r t h r l 9 0 v a l t h r c y s p r o g l y s c r s e r a s n t y r a r 9 2 0 0 v a l t h r p h e c y s p r o t h r a i a 2 0 7 ( c 端) 注：t h a u m a t i n1 1 的不同之处标在括号内，残基自n 一端开始编号。 第7 页共5 0 页 表i 3四种t h a u m a t i n 氨基酸序列差别分析 t a b 1 3d i f f e r e n c e si na m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i so f f o u rk i n d so f t h a u m a t i n 1 2 4 3t h a u m a t i n 的基因工程 产t h a u m a t i n 的植物t h a u m a t o c o c c u sd a n i e l l i i 生长在西非某些地区的热带雨林边缘，在 马来两亚半岛也能种植。但是这些植物的果实小，t h a u m a t i n 产量低。然而在其它很多地区 种植( 包括温室培养) 的z = d a n e 腑都不接果实。目前都是在西非建立提取加工设备，直接在 原产地提取植物t h a u m a t i n 。从果实原料中提取一般采用单一的水抽提法，仅利用物理方法 进行过滤和超滤，以保持产品的天然特性。据报道l k g 果实可提取9 0 0 r a gt h a u m a t i n ，另一 研究表明提取时添加低浓度铝盐可使提取率提高至6 9 k g 。 天然植物t h a u m a t i n 产量低，并且由于植物发生基因变异或季节和气候条件不同，从植 物提取的t h a u m a t i n 质量不稳定，不同批产品中两种主要t h a u m a t i n 的含量差别会很大，这 限制了它的应用。 目前用基因工程生产t h a u m a t i n 的研究很活跃，己有许多研究者采用t h a u m a t i ni i 的天 然克隆基因或用宿主优选表达密码子合成的基因，在微生物或植物中得到了表达。e d e n 等【l 3 l 和l e d e b o e r i 悼1 6 1 等较早克隆了t h a u m a t i ne d n a ，并对其进行了测序。他们的工作为 t h a u m a t i n 基因工程奠定了基础，此后t h a u m a t i n 基因相继在酵母1 1 7 】、大肠杆菌1 1 8 1 9 1 以及 高等植物中得到表达。然而在酵母中表达产物均没有甜味，所得包含体在体外变性复性后才 具有甜味，而且表达量低。高音【2 0 l 等采用大肠杆菌偏爱的密码子，合成3 0 个寡聚脱氧核 苷酸，在体外进行退火和连接合成t h a u m a t i ne d n a 。他们将连接得到的d n a 产物克隆到 质粒p b l u e s c r i p t - s k 上，转化大肠杆菌d h 5 c t 细胞，进行i p t g 诱导表达筛选，从8 0 个克隆 中最终获得了2 个有诱导表达产物的克隆，并对其进行了e d n a 全序列测定验证。此后， 杨成丽等和赵琦等7 , 2 1 利用d n a 重组技术，将t h a u m a t i n 基因克隆至植物表达载体p b i l 2 1 中，为转化高等植物打下了基础。孔建强1 2 2 】将t h a u m a t i n 基因转入烟草中，得到转基因植 株，但在转基因烟草中没有表达出甜味蛋白。w i t t 等利用毛根转化技术成功地将t h a u m a t i n l l 第8 页共5 0 页 基因在马铃薯( s o l a n u mf 幻p ，琊训中进行了表达1 2 习。t h a u m a t i n l i 因先被克隆在植物穿梭载 体p w i t 2 中的花椰菜花叶病毒启动子c a m v 3 5 s 下游，将p w i t 2 与农杆菌n 质粒一起接种 在马铃薯愈伤组织中后，成功得到了含有t h a u m a t i ni i 基因的再生植株。而且o 1 9 的叶片、 茎、毛根或愈伤组织样品足够进行甜味检测。1 9 9 2 年，杨美珠等i 2 4 1 将带有t h a u m a t i n l l 基 因和胭脂碱合成酶标记基因的啊质粒导入马铃薯，获得大量转化植株。叶片抗性检测和胭 脂碱( n o p a l i n e ) 检测表明外源甜蛋白基因己进入马铃薯基因组中。d o l g o v 【2 5 1 将t h a u m a t i n l i 基因导入温室苹果和梨树，结果表明愈伤组织中t h a u m a t i n l i 较多多而叶片较少。l e b e d e v l 2 6 1 等利用u n i l e v e r 克隆的t h a u m a t i n l ic d n a 与p b l l 2 1 构建双元载体，经农杆菌