（生物化学与分子生物学专业论文）sedlin与depp相互作用的初步研究.pdf

安徽医科大学硕士学位论文高雪敏 英文缩写 3 a t a d a m p b d b p c d n a c i a p c o p d d e p p d m f d m s o d o e b e c o l i e d l ：a e r g g f p h l m b p 1 m l n m 邛2 a 英文缩略词表 英文全称 3 - a m i n o l ，2 ，4 - t r i a z o l e a c t i v ed o m a i n a m p i c i l l i n b i n d i n gd o m a i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c a l f i n t e s t i n ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e c o a tp r o t e i ni i d a y d e c i d u a lp r o t e i ni n d u c e db yp r o g e s t e r o n e n , n - d i m e t h y l f o r m a m i d e d i m e t h y ls u t f o x i d e d r o p - o u tm i x e m i d i u mb r o m i d e e s c h e r i d l i ae o l i e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a e e t i c a e i d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m g r a m g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h o u r l i t r e c - m y cp r o m o t e r - b i n d i n gp r o t e i nl m i n u t e m b p - 1i n t e r a c t i n gp r o t e i n 中文全称 3 氨基三唑 转录活化结构域 氨苄青霉素 d n a 结合结构域 碱基对 互补d n a 小牛肠碱性磷酸酶 外被蛋白i i 天 孕酮诱导的蜕膜蛋白 n ，n - 二甲基酰胺 二甲基亚砜 营养缺陷混合物 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 内质网 克 绿色荧光蛋白 小时 升 e - m y e 启动子结合蛋白1 分钟 m b p 1 结合蛋白 安徽医科失学硕士学位论文高雪教 m l m o p s n s f m i l l i i i t e r 3 - i n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d n - e t h y m a l e i m i d e s e n s i t i v ef a c t o r o d o p t i c a ld e n s i t y p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r p m r o t a t i o np e rm i n u t e s d ss o d i u md o d e e y ls u l f a t e s e e s e c o n d s e d t s p o n d y l o e p i p h y s e a ld y s p l a s i at a r d a s n a ps o l u b l en s fa t t a c h m e n tp r o t e i n s s n a r es o l u b l en s fa t t a c h m e n tr e c e p t o rp r o t e i n s t f t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r t r a p p t r a n s p o r tp r o t e i np a r t i c l e t - s n a r e t a g r g e tm e m b e rs n a r e v - s n a r ev e s i d es n a i t e x - g a l 5 - b r o m o - 4 - e h l o m - 3 - i n d o l y l - 6 - d - g a l a c t o s i d e 毫升 3 ( n 吗啡啉) 乙磺酸 n 乙基顺丁烯二酰亚胺 敏感因子 光密度 聚乙二醇 聚合酶链反应 每分钟转数 十二烷基磺酸钠 秒 迟发性脊椎骨骺发育不良 可溶性的n s f 附着蛋白 可溶性n s f 附着蛋白受体 转录因子 运输蛋白颗粒 靶膜s n a i 遭 囊泡s n a r e 5 一溴4 氯- 3 吲哚- 1 3 - d - 半乳 糖苷 学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。 学位论文作者签名：尚：重敏日期：竺z 鲤 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定 学位论文作者签名：南重j 乏 日期：卅! 牛 撇名：舭 日期： q 、q 一 安教医科犬学硕士学住论文高雪敏 s e d l i n 与d e p p 相互作用的初步研究 摘要 目的利用酵母双杂交技术了解s e d l i n d e p p 之间的相互作用及s e d l i n 与d e p p 相 互作用的区域。构建带g f p 标签的d e p p 的表达载体，将其转染至c o s 7 细胞， 观察其在细胞内的定位，为以后的研究奠定基础。 方法以p o f f s e d l 为模板，用p c r 方法扩增s e d l - n 序列，通过限制性内切 酶酶切、回收目的片段、连接等方法将s e d l - n 片段插入载体p a s 2 1 中，构建 p a s - s e d l 的缺失突变体p a s s e d l - n 。将p a c t 2 p a s s e d l 、p a c t 2 - d e p p p a s - s e d l 、p a c t 2 p a s s e d l - n 、p a c t 2 - d e p p p a s s e d l - n 四组质粒分别共转 化入酵母菌y 1 9 0 ，再通过滤膜印迹实验测定8 半乳糖苷酶活性，呈蓝色的克隆是 两种蛋白可能相互作用的阳性克隆。 以含人d e p p 全长e d n a 序列的质粒p a c t 2 d e p p 为模板，用p c r 方法扩增 d e p p 全长序列，扩增产物与t 载体连接，构建克隆载体p u c m - t - d e p p 。用限制 性内切酶酶切重组质粒，回收目的片段d e p p ，插入带g f p 标签的载体p c ：d g f p 中构建表达载体p c d g f p d e p p 。用限制性内切酶酶切图谱分析及d n a 序列分析 两种方法鉴定构建的质粒。将构建正确的质粒转染至c o s 7 细胞，d a p i 染色，在 荧光显微镜下观察其细胞定位。 结果营养筛选和b 半乳糖苷酶活性测试均表明四组共转化入y 1 9 0 的质粒中，仅 p a c t 2 - d e p p p a s - s e d l 组克隆为阳性，其余三组均为阴性；经限制性内切酶酶切 图谱分析及d n a 序列测定证实p c d g f p - d e p p 的构建是正确的，细胞定位实验显 示d e p p 广泛分布于细胞内，在胞核内的表达略强。 结论应用酵母双杂交系统验证了s e d l i n 与d e p p 之间的相互作用；羧基端2 7 个 氨基酸残基对于s e d l i n 与d e p p 的相互作用是必须的；成功构建表达载体 p c d g f p d e p p ；通过细胞转染明确d e p p 广泛分布于细胞内，在胞核内表达略强。 关键词s e d l i nd e p p 酵母双杂交系统蛋白质相互作用细胞转染定位 3 安徽医科大学硕士学位论文高雪敏 t h ep r e l i m i n a r ys t u d ya b o u tt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e ns e d l i na n d d e p p a b s t r a c t o b i e c t i v et oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns e d l i na n dd e p pa n dd e f i n et h e i n t e r a c t i o nr e g i o no f s e x t l i nf o rd e p pb yy e a s tt w o h y b r i dt e c h n i q u e t oc o n s t r u c tt h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c d g f p d e p p t h e nc o s 7c e l l sw e r et r a n s f e e t e dw i t h g f v - t a g g e dd e p p t oi n v e s t i g a t et h el o c a l i z a t i o no f d e p p m e t h o d sp c rm e t h o dw a su s e dt oa m p l i f ys e d l o nf i - a g m e n tf i o mp o f f s e d l p l a s m i d b o t ht h ep r o d u c ta n dt h ep l a s m i dp o f fw e r ed i g e s t e db yt h es a m er e s t r i c t i o n e n z y m e s a n dt h e n l i g a t e d t oe i e a t ead e l e t i o nm u t a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p o f f s e d l - n b o t ht h ep o f f s e d l - na n dt h ep l a s m i dp a s 2 - 1w e r ed i g e s t e db yt h e s a m er e s t r i c t i o ne n z y m e sa n dt h e nl i g a t e dt oc r e a tad e l e t i o nm u t a n te x p r e s s i o nv e c t o r p a s - s e d l - n y e a s ty 1 9 0c e l l sw e r ec o t r a n s f o r m e dw i t hf o u rg r o u p so fp l a s m i d s ， i n c l u d i n gp a c t 2 p a s s e d l 、p a c t 2 p a s s e d l - n 、p a c t 2 - d e p p p a s - s e d la n d p a c t 2 d e p p p a s s e d l - n ，t h e nd e t e c tt h ea c t j 、r i t yo fi - g a l a e t o s i d a s eb yc l o n y - l i f t f i l t e r a s s a y t h eb l u ec l o n e sw e r ep o s i t i v e ，w h i c hs h o w sp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t a t i o n i na d d i t i o n , p c rm e t h o dw a su s e dt oa m p l i 匆t h ef u l ll e n g t he d n a f r a g m e n to f d e p pf r o mp a c t 2 一d e p pp l a s m i d , a n dt h ep r o d u c tw a sl i g a t e di n t ot h etv e c t o rt og e t t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp u c m - t - d e p et h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sd i g e s t e db yt h e r e s t r i c t i o ne n z y m e s ，a n dt h eg e n ed e p ps e q u e n c ew a si n s e r t e di n t op c d g f pt o c o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c d g f p - d e p p , w h i c hw a sc o n f i r m e d b yd n a s e q u e n c i n g t h e nc o s 7c e l l sw e r et r a n s f c c t e dw i t ho f p - t a g g e dd e p pt oi n v e s t i g a t e t h el o c a t i o no f d e p p r e s u l t sa f t e rf o u rg r o u p so f p l a s m i d sc o t r a n s f o r m e di n t oy e a s tc o m p e t e n tc e l l s ，a s s a y o f l b - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t ys h o w e dt h a to n l yt h ey e a s tc e l l st r a n s f o r m e dw i t l i p a c t 2 - d e p p p a s - s e d l w e r ep o s i t i v e r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sm a p p i n g a n a l y s i s 4 安徽医科大学硕士学位论文高雪敏 a n dd n a s e q u e n c i n gd e m o n s t r a t e d t h a tt h ee x p r e s s i o nv e c t o re n c o d i n g d e p pw a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y i nc o s 7c e l l s ，d e p pw a s e x t e n s i v e l yl o c a t e db o t hi nt h e n u c l e u sa n dc y t o p l a s m ，b u ts t r o n g e rs l i g h t l yi nt h en u c l e u s c o n c l u s i o n s s u c c e s s f u l l yu s e dy e a s t - t w o h y b r i ds y s t e mt oi d e n t i f yt h ei n t e r a c t a t i o n b e t w e e nd e p pa n ds e d l i n t h ec - t e r m i n a l2 7r e s i d u e so f s e d l i nw e r ec r i t i c a lf o ri t s i n t e r a c t i o nw i t hd e p p t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c d g f p d e p pw a sc o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y i nc o s 7c e l l s ，d e p pw a se x t e n s i v e l yl o c a t e db o t hi nt h em m l e u sa n d c y t o p l a s m ，b u ts t r o n g e rs l i g h t l yi nt h en u c l e u s k e y w ，o r d s s e d l i n ；d e p p ；y e a s t - t w o h y b r i ds y s t e m ；p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n ； t r a n s f e e t i o n ；l o c a l i z a t i o n 5 安徽医科大学硕士擘住论文 高雪教 1 前言 s e d l i n 与d e p p 相互作用的初步研究 真核细胞中多数蛋白质均在细胞质基质中的核糖体上开始合成，然后转运至 细胞的特定部位，这一过程即是蛋白质的定向转运或分选。蛋白质只有转运至正 确的部位并装配成结构与功能的复合体，才能参与细胞的生命活动。蛋白质通过 分泌途径进行运输可分为三个不同的阶段：从内质网到高尔基体的运输、高尔基 体内的运输以及后高尔基体运输。分泌途径的每一步都是由囊泡出芽和融合调节 的，这种调节对于蛋白质正确的靶向定位具有重要意义。目前对于这种调节的具 体机制并不十分清楚，其中有一种模型被称为s n a r e ( s o l u b l e n - e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v ef a c t o ra t t a c h m e n tr e c e p t o rp r o t e i n s ) 假说t 旧。在这种模型 中，从供体膜出芽的囊泡中包括特异性的跨膜蛋白v - s n a r e s ( v e s i c l es n a r e ) ，这 些蛋白只和靶膜上的特异性蛋白t - s n a r e s ( t a g r g e t m e m b e r s n a r e ) 结合。囊泡的锚 定和融合能力依赖于囊泡上的v s n a r e s 与对应的靶膜上的t - s n a r e s 特异性结合 的能力。一旦v s n a r e s 和t - s n a r e s 结合形成复合物，汇集在s n a r e s 上的可 溶性蛋白n s ff n e t h y m a l e i m i d e s e n s i t i v ef a c t o r ) 和s n a p ( s o l u b l en - e t h y l m a l e i m i d e s e n s i t i v ef a c t o ra t t a c h m e n tp r o t e i n s ) 就从复合物中解聚，诱发膜融合。 s n a r e 在膜泡转运的特异性形成中具有核心地位，但是随着研究的深入，发 现还有其他的蛋白质或蛋白质复合物参与了将不同性质的运转小泡牵引至正确的 受体细胞器的过程【3 】，已经发现的有e x o c y a 、c o g ( c o n s e r v e do l i g o m e r i cg o l # ) 复合物，g a r p ( g o l g i a s s o c i a t e dr e t r o g r a d ep r o t e i n ) 复合物，t r a p p ( t r a n s p o r tp r o t e i n p a r t i c l e ) 复合物、c 类v p s ( v a c u o l a rp r o t e i ns o r t i n g ) 复合物和d s l l p 复合物等，他们 被统称为囊泡牵引复合物( v e s i c l et e t h e r i n gc o m p l e x ) 。 不同的囊泡牵引复合物以不同的方式参与膜泡转运过程。其中t r a p p 最早发 现于酿酒酵母( s a c c h a r o m y c c se e r e v i s i a e ) 的内质网一高尔基体转运后期。t r a p p 是一个高度保守的蛋白质复合物，包括十个亚基，形成两种复合物形式 4 1 ：七个亚 基的t r a p pi ( b e t 3 p ，b e t 5 p ，t r s 2 0 p ，t r s 2 3 p ，t r s 3 l p ，t r s 3 3 p ，t r s 9 5 p ) 和十个亚基的 6 安徽医科大学硕士学住论文高雪敏 t r a p p i i ( 比t r a p pi 多三个亚基：t r s 6 5 p ，t r s l 2 0 p ，t r s l 3 0 p ) 。t r a p pi 在内质 网到高尔基体的物质运输过程中发挥作用，而t r a p pi i 在高尔基体内部的物质运 输过程中发挥作用。t r a p pi 定位于高尔基体，为c o p i i 囊泡的受体 4 1 ，t r a p p i 和c o p1 i 囊泡的结合可以激活一种o t p 结合蛋白y p t l p 4 , 5 6 1 ，促进y p t l p 上的 g d p g t p 交换，使之活化，发挥其功能，完成物质从内质网到高尔基体的转运。 迟发性脊椎骨骺发育不良( s p o n d y l o e p i p h y s e a ld y s p l a s i a t a r d a , s e d t ) 是一种x 一连锁隐形遗传性疾病 7 1 ，临床特征为身体不匀称的矮小，桶状胸等。研究表明， s e d t 是由位于染色体x p 2 2 上的s e d l 基因突变而造成的嘲。s e d l 基因定位于 x p 2 2 2 x p 2 2 1d x s l 6 和d x s 9 2 之间的区域慨1 0 1 ，近侧与c x o r f 5 基因毗邻，与其 共用一个启动子，远端与r a b 9 基因相接，长度约2 0 k b ，包括六个外显子。人基 因组中还包括7 个s d e l 假基因，分别被称为s e d l p i 7 ，其中只有s e d l p l 具有 表达功能。虽然s e d l p l 和s e d l 的开放读码框架序列不完全一致，但是它们编 码的蛋白质的氨基酸序列相同。 s e d l 基因编码的蛋白质被称为s e d l i n t l 心s h 盱等通过免疫印迹实验显示 s e d l i n 蛋白是人t r a p p 复合物中的一个组分【1 2 1 。t r s 2 0 p 是s e d l i n 在酵母中的同源 物【1 1 1 ，也是酵母t r a p pi 和t r a p p 复合物的一个亚基。目前对于s e d l i n 蛋白的 功能了解不是十分清楚，由于它和t r s 2 0 p 亚基的氨基酸序列有4 1 的相同性和5 7 的相似性，故推测它在膜泡运输过程中发挥作用。 g h o s t 等1 1 3 通过酵母双杂交实验从h e l a 细胞e d n a 库中筛选出e o m y e 启动子 结合蛋白l ( c - m y e p r o m o t e r 岫i n d i n g p r o t e i nl ，m b p 1 ) 的结合蛋白m i p - 2 a ( m b p 一1 i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) 。研究表明，m i p - 2 a 可以翻弱m b p 一1 对转录的抑制作用，并且 可以对抗在成纤维细胞中m b p 1 介导的细胞死亡。m i p - 2 a 的编码基因定位于人 1 9 号染色体，其编码序列与s e d l 基因的编码序列完全相同，这也有助于我们对 s e d l i n 功能的了解。 酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法，具有灵 敏度高和特异性好的优点。自1 9 8 9 年由f i e l d s 等0 4 提出并初步建立以来，得到了 不断的完善和改进，在细胞生物学、肿瘤学、蛋白质组学等诸多领域有着广泛的 安徽医科大擘硕士学位论文 高雪敏 应用b 5 , 1 6 1 。我们先前己经利用酵母双杂交系统3 从胎盘c d n a 文库中初步筛选出 了几种与s e d l i n 相互作用的蛋白质，其中包括孕酮诱导的蜕膜蛋t ( d e c i d u a l p r o t e i n i n d u c e db yp r o g e s t e r o n e ，d e p p ) 。本实验中，我们通过酵母双杂交系统2 进一步证 实两者的相互作用，并构建了一种羧基端缺失2 7 个氨基酸残基的s e d l i n 突变体 s e d l - n ，以进一步了解s e d l i n 与其他蛋白质相互作用的区域，为以后更深入的研究 这种蛋白质的功能奠定基础。 绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ，g f p ) 是由c h a l f i e 等研究维多利亚 水母( a e q u o r e av i c t o r i a ) 发光现象中分离纯化出来的f 切，已成为监测在完整细胞 和组织内基因表达和蛋白质定位的一个理想标记，其荧光性质比较特殊，在蓝光 或紫外光的照射下就能激发荧光，不需要添加底物或共作用因子。另外，g f p 的 荧光也比较稳定，只有在过热、过酸和过碱的情况下蛋白才会变性。此外，检测 方便，对细胞无毒，作为一种标记基因己广泛应用到生物学的各个领域。d a p i 也 是一种荧光检测信号，产生蓝色荧光，与g f p 激发的绿色荧光成鲜明对比。d e p p 是新发现的一种蛋白质，在人子宫内膜基质细胞中可以被孕酮所诱导【嘲。目前其 功能尚无研究。本实验中，我们首先用p c r 的方法扩增d e p p 全长序列，连接到 p u c m - t 载体中，用适当的酶切后回收目的片段，插入到带g f p 标签的表达载体 p c d g f p 中，并经酶切鉴定和测序，证实成功构建了重组表达载体p c d g f p d e p p ， 然后将构建正确的质粒转染至c o s 7 细胞中，用d a p i 染色，在荧光显微镜下观察 其细胞定位情况，为进一步的研究奠定基础。 2 材料与方法 2 1 常用仪器及材料 2 1 1 常用仪器 ( 1 ) p c r 仪，珠海黑马医学科学仪器公司，4 8 0 0 型； ( 2 ) 电热恒温培养箱，d n p 9 1 6 2 型，上海精宏实验设备有限公司； ( 3 ) 电热恒温鼓风干燥箱，d h f 9 2 0 3 a 型，上海三申医疗器械有限公司； 安徽医科大学硕士学位论文 高雪敏 ( 4 ) 电子天平，j y 2 0 0 2 型，上海精密科学仪器有限公司； ( 5 ) 精密酸度计，p h s 3 型，上海天达仪器有限公司； ( 6 ) 磁力加热搅拌器，7 8 1 型，国华电器有限公司； ( 7 ) 超净台，h s 一8 4 0 - u 型，苏净集团安泰公司； ( 8 ) 电热恒温水槽，d k - s d 型，上海精宏实验设备有限公司； ( 9 ) 气浴恒温振荡器，s h z 8 z 型，常州国华电器有限公司： ( 1 0 ) 水浴恒温振荡器，s h a c 型，常州国华电器有限公司； ( 1 1 ) 手提式不锈钢蒸气消毒器，y x 2 8 0 a ，上海三申医疗器械有限公司： ( 1 2 ) 高速离心机，t g l 1 6 h ，珠海黑马医学科学仪器公司： ( 1 3 ) 冷冻高速离心机，t g l - 1 8 r ，珠海黑马医学科学仪器公司； ( 1 4 ) 大容量冷冻低速离心机，l x j i i 型，上海医用分析仪器厂： ( 1 5 ) 快速混匀器，s k 1 型，常州国华电器有限公司； ( 1 6 ) 纯水机，d z g - 3 0 3 a 型，上海生仪分析技术有限公司； ( 1 7 ) 紫外可见分光光度计，u v - 7 5 4 ，山东高密彩虹分析仪器有限公司； ( 1 8 ) 紫外手提式分析仪，z f p 型，上海长明光学电子仪器厂； ( 1 9 ) 石英比色皿，q - 4 4 型，江苏宜兴市晶科光学仪器有限公司； ( 2 0 ) 超低温冰箱，u l t1 3 8 6 3 - v 3 6 ，r e v c o ： ( 2 1 ) 核酸蛋白质凝胶图象分析系统，g s g - 2 0 0 0 ，黑马仪器公司； ( 2 2 ) 微量移液器，2 0p l 、2 0 0 一、1 0 0 0m ，上海大龙； ( 2 3 ) 电泳仪，d y y - 1 0 型，北京六一仪器厂： ( 2 4 ) 电泳槽，d y y 一型，北京六一仪器厂； ( 2 5 ) 荧光显微镜，尼康e c l i p s e8 0i 型： ( 2 6 ) c o2 恒温培养箱，美国s h e l d o nm a n u f a c t t t r i n g , i n c 。 2 1 2 质粒和菌株 ( 1 ) 质粒p c d g f p ：为g f p 标记质粒p c d n a 3 而成，由中国科学院上海生物化学 与细胞生物学研究所朱学良博士提供。 9 安徽医科大学硕士学位论文 高雪敏 ( 2 ) 质粒p u c m - t 载体( 5 0n g i _ t 1 ) 为s a n g o 产品。 ( 3 ) 大肠杆菌t g l 菌株：本实验室保存。 ( 4 ) 质粒p a c t 2 、p a c v 2 一d e p p 、p a s 2 1 、p a s s e d l 、p o f f 、p o f f s e d l 由 本实验室保存。 2 1 3 常用材料 ( 1 ) t a q 酶( 5 u i x l ) 为t a k a r a 产品。 ( 2 ) t 4 d n a 连接酶( 1u i x l ) 、小牛肠碱性磷酸酶( c l a p ，lu 仙1 ) 均为f e r m e n t a s 公司产品。 ( 3 ) 限制性内切酶b a m hi ( 1 0 u i t l ) 、e e o ri ( 1 0 u i t l ) 、h i n d i i i ( 1 0 u 4 , 1 ) 、 n c oi ( 1 0u d 均为f e r m 锄s 公司产品，各种酶的酶切位点如下： b 锄hi ：g 。g a t c c e c o ri ：g a a t t c c c t a g gc t t a a g h i n d m ：a a g c t tn e oi ： c c a t g g t t c g a 。ag g t a c c x h o i ：c t c g a g g a g c r c ( 4 ) r n a s e a 酶( 1 0 0 m g n f l ) 购自s i g m a 公司。 ( 5 ) d n t p s ( 2 5 r a m ) 、l d n a e e o ri + h i n d mm a r k e r ( o 1m gd n m m l ) 为 f e r m e n t a s 公司产品。 ( 6 ) 胰化蛋白胨、酵母提取物为o x i o d 产品。 ( 7 ) 氨苄青霉素( a m p ) 、卡那霉素( k a n ) 、t r i s 碱、e d t a - n a 2 购自沃德赛斯 生物公司。 ( 8 ) 各种氨基酸均为上海源聚生物科技有限公司分装，蛋白胨( 酵母用) 、酵母 提取物( 酵母用) 均购自c l o n t e c h 公司，酵母氮碱为u k a s 产品。 ( 9 ) 琼脂、x - g a l 为b b i 产品。 ( 1 0 ) 二甲苯青f f 、m o p s 、d m f ( n ，n - d i m e t h y l f o r m a m i d e ) 、争巯基乙醇均为 1 0 安教医科大学硕士擘位论文高雪敏 a m l e s c , o 产品，p e g 4 0 0 0 、p e g 8 0 0 0 、3 一a t 为f l u k a 产品。 ( 11 ) d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) 购自s i g m a 公司。 ( 1 2 ) 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 ( 1 3 ) 胶回收( 小量) 试剂盒购自北京道普生物科技有限公司。 ( 1 4 ) 定性滤纸购自杭州富阳特种纸业有限公司。 ( 1 5 ) 微孔滤膜( 孔径为o 2 2r u n ) 和硝酸纤维素滤膜( 孔径0 2 2 岫) 分别购自 新亚净化器件厂和上海医药工业研究院上海亚东核级树脂有限公司。 ( 1 6 ) 其它试剂均为国产分析纯。 2 1 4 溶液配制 ( 1 ) 营养缺陷混合物( d r o p o u tm i x ) ( 1 0 x d o ) 1 0 x d o ( 一t r p 一l e i l 一h i s ) l 一异亮氨酸 3 0 0m g r l l 缬氨酸 1 5 0 0m g l l 腺苷硫酸盐2 0 0m 班 l 精氨酸 2 0 0m e t , l 组氨酸 一 l 亮氨酸 一 l - 赖氨酸 3 0 0m e , r l l 一蛋氨酸 2 0 0m g 几 l 苯丙氨酸5 0 0m g l l 苏氨酸 1 0 0 0m g 几 l 色氨酸 一 l - 酪氨酸 3 0 0m g l l - 尿嘧啶 2 0 0m g l 高压蒸气灭菌1 5m i n ，待冷却后，4 c 储存。 ( 2 ) y p d 液体培养基( 1l ) 安徽医科大孝硕士学住论文 高雪敏 蛋白胨( 酵母用) 2 0 9 酵母提取物( 酵母用) 1 0 9 葡萄糖2 0 9 去离子水 9 5 0 m l 用5 m o l l h c i 溶液调p h 至5 8 ，加去离子水定容至ll ，高压蒸气灭菌1 5 m i n 后，待冷却后4 储存备用。 ( 3 ) y p d 固体培养基 按照上述配方配制y p d 液体培养基，在其灭菌前加入琼脂( 终浓度为2 0 9 j l ) ， 高压蒸气灭菌1 5m i n 。等培养基冷却到5 0 ，在超净台中铺板。为避免产生气泡 应旋动混匀培养基，然后直接从烧瓶中倒至平板。倒置平板并于4 c 储存备用，使 用前放入3 0 3 0 m i n 。 ( 4 ) s d 培养基( 一1 砸一l e t l ，一h i s + 3 a t ) ( 1l ) 酵母氮碱 6 7 9 琼脂 2 0 0 9 葡萄糖 2 0 0 9 1 0 x d o 溶液( 一t r p 一l e l l ，一h i s ) 1 0 0 0 m l 调p h 值至5 8 ，高压蒸气灭菌1 5 r a i n 后，等培养基冷却到5 0 0 ，加入2 5 1 l l ll m o i l3 a t 溶液，在无菌操作台中铺板，4 储存备用，使用前放入3 0 3 0r a i n 。 1m o l l 3 一a t 溶液：称取3 a t 0 8 4 毫溶于1 0 m l 去离子水中，过滤除菌， 4 c 储存。 ( 5 ) e d t a 溶液( o 5m o l l ，p h8 o ) ： 将1 8 6 1g e d t a - n a 2 加3 8 0 0 m l 去离子水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用 n a o h 调节溶液的p h 值至8 0 ，定容至1l ，高压蒸气灭菌1 5m i n 。e d t a 二钠盐需 加kn a o h 将溶液的p h 值调至接近8 0 时，才会完全溶解。 ( 6 ) t r i s c i 溶液( 1m o l l ) ： 8 0 0m l 去离子水溶解1 2 1 1gt r i s 碱，加浓盐酸调p h 至所需值7 5 和8 0 。使溶 液冷却至室温，方可最后调定p h 值，加去离子水定容至1l ，分装后高压蒸气灭 安徽医科大学硕士学位论文高雪教 茵1 5r a i n ，4 c 储存备用。 ( 7 ) 1 0 x t e 溶液( p h 8 0 ) 1m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) 1 0 0m l 0 5m o l le d t a ( p h8 0 )2 0m l 加去离子水至ll 。高压蒸气灭菌1 5r a i n ，室温保存。使用时稀释为1 。 ( 8 ) 1 0 m g m l 鱼精d n a 储液 鱼精d n a 溶于1x t e 溶液中，超声处理，然后用无水乙醇沉淀，7 5 乙醇 洗涤，干燥。最后用双蒸水溶解，终浓度为1 0m g m l 。- - 2 0 c 储存备用。酵母转 化时用沸水浴5m i n ，并立即置冰上。 ( 9 ) 5 0 p e g 4 0 0 0 溶液 5 0gp e g4 0 0 0 用适量去离子水溶解，然后加至1 0 0r n l 。高压蒸气灭菌1 5m i n 后，室温储存。 ( 1 0 ) 1 0 l i a c 溶液 lm o l ll i a c ，用稀释的醋酸调p h 至7 5 ，高压蒸气灭菌1 5r a i n 后，室温储 存。 ( i i ) p e g l i a c 溶液( 用前现配) 终浓度制备1 0m l 溶液 p e g 4 0 0 0408ml5 0 p e g t e 缓冲液 l i m l1 0 x t e l i a cl 1 m l1 0 x l i a c ( 1 2 ) 1 儿认c 溶液 用1 0 l i a c 溶液和1 0 x t e 缓冲液在使用前配制。 ( 1 3 ) x - g a l 溶液： 用d i v i f 溶解g a l 配制成2 0 m g n a 的储存液，保存于e p 管中。无须灭菌。 e p 管用铝箔封裹，储存于一2 0 。 ( 1 4 ) z 缓冲液( 1l ) n a 2 h p 0 4 7 1 4 2 0 1 6 1g 安徽医科大学硕士学位论文 高雷敏 n a h 2 p 0 4 h 2 0 5 5g k c i 0 7 5g m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 4 6g 调p h 值为7 ，0 ，用去离子水定容至1l 。高压蒸气灭菌1 5r a i n ，4 c 储存。 ( 1 5 ) x - - g a l 溶液z 缓冲液d 一巯基乙醇( 用前制备) z 缓冲液1 0 0 0 0 m l b - 巯基乙醇o 2 7n l l x g a l 1 6 7 m l ( 1 6 ) 5 0 甘油溶液( v ) 在5 体积灭菌的去离子水中加入5 体积甘油，过滤除菌，4 c 储存。 ( 1 7 ) l b 固体培养基 配制每升培养基，在9 5 0l i l l 去离子水中加入： 胰化蛋白胨 l o g 酵母提取物 5g n a c i 1 0 9 琼脂 1 5g 用n a o h 调p h 值至7 0 。用去离子水定容至ll ，高压蒸气灭菌1 5r a i n 。取 出培养基，稍冷却后从烧瓶中倒至平板。待培养基完全凝固后，倒置平板并储存 于4 0 c 备用。 ( 1 8 ) s o b 培养基( 1l ) 胰化蛋白胨 2 0 9 酵母提取物 5g n a c l 0 5 9 加入2 5 0 m m o l l k c l 溶液l o i n l ，用n a o h 调节溶液的p h 值至7 0 ，加去离 子水定容至1l ，高压蒸气灭菌1 5r a i n 。 ( 1 9 ) 转化缓冲液( 用于大肠杆菌感受态制备) 转化缓冲液1 ( 1 l ) 4 安徽医科大学硕士学位论文 高雪敏 k c i 7 4 9 m n c i ：4 h 2 0 9 9g c a c l 2 。2 t 2 0 1 5g 甘油 1 5 0 0 9 乙酸钾( 1m o l l ，p h7 5 ) 3 0 0 r a l 用0 2 m o l l h a c 调p h 值至5 8 ，加去离子水至1l 。过滤除菌，4 储存。 转化缓冲液2 ( 1l ) m o p s ( o 5m o l l ，p