（植物学专业论文）薯蓣皂苷元提取工艺优化与薯蓣皂苷的生物降解方法研究.pdf

1 摘 要 盾叶薯蓣(dioscorea zingiberensis c.h.wright )隶属于薯蓣科薯蓣属为 我国特有植物因其根茎中含有丰富的薯蓣皂苷元工业中称皂素而成为 我国生产甾体激素类药物和避孕药的重要的原料植物 工业中在利用盾叶薯 蓣提取薯蓣皂苷元的工艺中存在一些问题 本文对薯蓣皂苷元生产过程中影 响薯蓣皂苷元产率的因素进行研究 并通过对降解薯蓣皂苷为薯蓣皂苷元的 微生物进行筛选 以及对薯蓣皂苷水解酶提取及其性质进行研究 以期解决 薯蓣皂苷元生产过程中存在的一系列问题主要研究结果如下 1. 采用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵与水解条件优化 采用 rp-hplc 法检测薯蓣皂苷元含量 对利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷 元过程中影响薯蓣皂苷元产率的多种因素 分预发酵 水解两部分分别进行 单因素和正交设计的方法进行优化 结果表明40预发酵 16 小时加 6% 硫酸料液比为 16121-126水解 5 小时饱和碳酸钠溶液中和至中 性后抽滤于 80烘干后打包置索氏提取器中于 80水浴条件下回流 抽提 5 小时薯蓣皂苷元产率最高为 3.62%该法重现性好 2. 能有效降解薯蓣皂苷的微生物筛选及鉴定 分别对与盾叶薯蓣关系密切的微生物即对来源于大气根缘土壤 模拟发酵发酵液以及内生寄生的微生物 用薯蓣皂苷代替查氏培养基中碳源 的方法使用平板法进行筛选并进行分离 得到五种微生物的纯培养 分别编 号为菌株 no.1-5经初步鉴别分别为束丝菌属ozonium lk. ex fr.一株 曲霉属(aspergillus micheli) 两株镰孢属fusarium link ex fr.一株青 霉属penicillium link一株使用 tlc 法检查培养基中薯蓣皂苷元的产 生情况结果表明培养基中均有薯蓣皂苷元产生表明该五种微生物都能 利用薯蓣皂苷中的碳源进行生命活动 说明这几种微生物能产生降解薯蓣皂 苷的水解酶并利用降解产生的糖维持生命活动并维持世代的延续因此 我们可以在这几种菌株及其近属菌种中进行筛选高效的降解薯蓣皂苷的菌 株 2 3. 高效降解薯蓣皂苷的菌株筛选 通过对初筛出的五种微生物进行液体培养 使用 rp-hplc 法检测液体 培养基中薯蓣皂苷元的产量 观察各菌株在液体培养时的生长情况并计算该 五种微生物在相同培养条件下的生物生长量根据各种菌株的生物生长量 生长情况与薯蓣皂苷元的产率进行综合评价研究结果表明no.3 菌株产 酶力强液体培养不结球生物生长量较高符合工业生产需要是比较理 想的降解薯蓣皂苷的产酶菌株 4. 薯蓣皂苷水解酶性质研究 为了给薯蓣皂苷元的工业生产以及酶工业提供指导参数特对筛出的 高效菌株no.3 菌株所产生的水解酶的酶学特性进行初步研究研究结 果表明该菌株所产水解酶在 (nh4)2so4等物质存在的情况下稳定性好 其最佳盐析浓度为 45该水解酶的酶促反应最适 ph 值为 7.2 左右酶促 反应最适温度为 45在 ph 值为 5.2-9.9 之间较为稳定当 ph 值低于 5.2 或高于 9.9 时该水解酶的酶活力下降很快温度高于 55时酶活力急剧下 降 关键词盾叶薯蓣薯蓣皂苷元预发酵水解优化rp-hplc 微生物筛选鉴定酶解酶学特性 3 abrstract diosecorea zingiberensis c. h. wright, which is endemic to china, ranks in the section of stenophora, the genus of dioscorea l., the monocotyledonus dioscoreacea. it characteristically bears rich diosgenin in rhizome and thus has great economic value as a precursor for the synthesis of steroidal hormone drugs and contraceptive drugs. there are many problems in the technics of using the rhizome of diosecorea zingiberensis producing diosgenin in the industry. in order to resolve a series of problems in the industry of the diosgenin producing, optimization all terms departed to spontaneously zymolysis and acid hydrolysis of extracting technology of diosgenin from the rhizome of diosecorea zingiderensis; screening and identification the microorganism which bio-zymolysis dioscin to diosgenin, and study the extracting technology of enzyme from the culture medium and the character of the enzyme in the thesis.the results showed that as fallow 1. optimization of spontaneously zymolysis and acid hydrolyze of diosgenin from the rhizome of diosecorea zingiberensis c. h. wright single factor and orthogonal test were applied by optimization of extracting technology, the determination of diosgenin was applied rp-hplc. to optimize all periods separation for spontaneously zymolysis and acid hydrolyze of extracting technology of diosgenin from the rhizome of diosecorea zingiderensis , the results showed that, the optimization terms of spontaneously zymolysis is at 40 , 16 hours; acid hydrolyze term is 6% vitriol ,proportion of solid to liquid is 1:6, hydrolyze method is high pressure(121-126 ), hydrolyze time is 5 hours. using the condition extracting diosgenin from the rhizome of dioscorea zingiberensis, the contents of diosgenin is increased, and the reproductive is good. 4 2. screening and identification of the microorganism which bio-zymolysis dioscin to diosgenin using dioscin as the carbon-origin of the culture medium, separating and filtrating and identify the microorganism which gathered from the air, the soil near the root of dioscorea zingiberensis, the water of the simulative zymolysis dioscorea zingiberensis dregs and the dioscorea zingiberensis rhizome separately. the five kinds of microorganism bio-zymolysis dioscin to diosgenin gathered from the test, and number the five kind microorganism to no.1, no.2, no.3, no.4 and no.5. the five kinds of microorganism identified as one of ozonium lk. ex fr., two of aspergillus micheli, one of fusarium link ex fr., and one of penicillium link respectively. through tlc test the diosgenin of the culture medium, the results showed that: the five kind microorganism can utilize the carbon-origin of the dioscin and live on it. that show out these microorganism can produce enzyme to bio-zymolysis dioscin to diosgenin. so we can filtrate some microorganisms which can bio-zymolysis dioscin to diosgenin efficiency from the five and their farmily. 3. screening of efficient microorganism bio-zymolysis dioscin to diosgenin through utilizing liquid culture medium the no.1-5 microorganism, and the rp-hplc was applied by determination diosgenin of the culture medium by the five microorganism bio-zymolysis dioscin to diosgenin, the growth instance ing in the liquid culture medium of the no.1-5 was noted. and the growth magnitude of the five microorganism under the same condition was accounted. the yield of diosgenin, the growth instance and the growth magnitude were targets general appraising the characteristic of yield enzyme of the five microorganism. the result showed that : the yield enzyme ability of the no.3 is good, the growth magnitude is high, and the no.3 in the liquid culture medium is not dumpling, these characteristics are according to the require of the industry. so the no.3 is the more ideal microorganism to yield enzyme to bio-zymolysis to dioscin to diosgenin. 5 4. study of the characteristic of the enzyme which bio-zymolysis diocin to diosgenin morphology study of the characteristic to the enzyme yielded by the no.3 has been done specially in order to offer the parameter to the yield-diosgenin industry and the enzyme industry. the results showed that: stability of the enzyme which bio-zymolysis diocin to diosgenin is good under the liquid phase condition has some substance like (nh4)2so4, the best salt out consistency of the enzyme is 45%, and the best ph is about 7.2, the best temperature is 45 of the enzyme effecting. and the active of the enzyme is stability between ph 5.2-9.9, if the ph under 5.2or up 9.9, the active of the enzyme descend promptly, if the temperature up to 55, the active of the enzyme descend promptly also. key wordsdiosecorea zingiberensis c. h. wright; diosgenin; spontaneously zymolysis; acid hydrolyze; optimization; rp-phlc; microorganism; screening ; identification; bio-zymolysis; characteristic of the enzyme 6 引 言 薯蓣皂苷元(diosgenin)是 20 世纪三十年代中期日本学者藤井胜也等人从山萆薢 (dioscorea tokoro makino)中分离得到的由于其结构和甾体激素类药物相似因此成为合 成甾体激素类药物的重要起始原料自甾体激素的重要生理活性和植物来源发现以来世 界上许多国家都投入了大量的人力物力对其进行研究已筛选了 2-3 万种植物从中发现 了许多有开发价值的植物主要有薯蓣属dioscorea l.龙舌兰属agave l.丝兰属 yucca l.和茄属(solanum l.)等类群其中薯蓣属植物是最主要的因而就形成了薯蓣 属植物的分布中心东亚中国印度等国和中南美州墨西哥危地马拉等国为世界 甾体激素原料药的主产地的格局 我国对甾体激素原料的调查研究始于 1957 年 江苏省中 国科学院植物研究所领导了全国甾体激素资源植物的普查 摸清了我国薯蓣属植物的种类 分布并总结了甾体皂甙在薯蓣属中的分布规律进行了人工栽培和提取工艺的研究结 合中国科学院上海有机化学研究所的甾体激素人工合成结构修饰工业化生产等方面的 工作使我国由五十年代甾体激素原料的进口国到八十年代变为仅次于墨西哥的世界第二 大出口国盾叶薯蓣dioscorea zingiberensis c. h. wright就是江苏省中国科学院植物研 究所通过调查发现的薯蓣皂苷元高含量植物它是我国特有种 现有的薯蓣皂苷元生产工艺在对盾叶薯蓣或其它生产薯蓣皂苷元的原料植物材料进 行酸水解之后通过板框分离出渣和废液其中渣用于提取薯蓣皂苷元而废液被直接 排放掉用于生产薯蓣皂苷元的原料盾叶薯蓣等是一类淀粉含量较高的野生植物当淀粉 被完全水解后其中的淀粉就转变为葡萄糖因此废液中含糖量较高废液 cod化学需 氧量和 bod生化需氧量远远超过排放标准每生产一吨薯蓣皂苷元将产生这种有机 物含量高酸性强的废液高达 300-400 立方米如果将废液直接排放掉既对环境造成很 大的污染又造成自然资源的极大浪费在提取薯蓣皂苷元时大都使用溶剂汽油作为提 取剂采用保持一定的温度条件下进行连续抽提的静态操作方法进行用这种方法提取 薯蓣皂苷元的效率低时间长(需 10 小时以上)同时溶剂汽油是易燃易爆的有机溶剂 不够安全易发生事故 另外采用盐酸进行酸水解在酸水解时有副反应产生容易生成 3, 5-去氧替告皂苷 元( 3 5-deoxytigogenin) 降低了薯蓣皂苷元的产量和质量 而使用硫酸进行酸水解的条件 要求苛刻否则易产生皂苷元差向异构化并且酸水解后的残渣和废液的处理难度大使 7 生产薯蓣皂苷元的成本提高用汽油提取的薯蓣皂苷元产品中含有水解时的副产物 3, 5- 去氧替告皂苷元以及蜡等杂质影响了产品的质量若进行分离则加大了薯蓣皂苷元的生 产成本 在对盾叶薯蓣进行综合利用方面除了联合生产酒精葡萄糖或柠檬酸外还有以薯 蓣皂苷元废渣为原料制取燃料南怀炼等专利申请号 92100103.7产品附加值低在 实际生产中的应用也很有限因此生产上还迫切需要寻找新工艺新方法来解决薯蓣皂 苷元生产环境污染大原料浪费大和操作危险大的问题酸水解是简便易行的生产方法 但这是在国内外普遍缺乏环保意识的情况下提出来的 为了提高薯蓣皂苷元的收率各国研究人员对薯蓣皂苷元的生产工艺进行一系列的研 究重要的发现之一是在酸水解前将植物材料进行预发酵hardman 等人发现将植物材料 进行酸水解前经一段时间发酵可以大大提高薯蓣皂苷元的产量而且还有人发现在发酵过 程中加入纤维素酶果胶酶苦杏仁酶等外源酶可以进一步提高薯蓣皂苷元的产量也 曾有用预发酵法提高薯蓣皂苷元的收率的报道因此为了减少薯蓣皂苷元生产过程中对 环境带来的污染 我们可以从研究预发酵和加入外源酶是怎样提高薯蓣皂苷元的产量出发 寻找降解薯蓣皂苷新的途径以便达到降解薯蓣皂苷生成薯蓣皂苷元的目的同时减少对 环境带来的污染 因此本文从预发酵和与盾叶薯蓣关系密切的微生物中寻找能降解薯蓣皂苷的微生物菌 株期望从中筛选到能高效降解薯蓣皂苷的微生物并初步研究该微生物所产生的能降解 薯蓣皂苷的酶的特性 8 第一章 文献综述 采用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元工艺 及皂苷元检测方法研究进展 前言 薯蓣皂苷元(diosgenin)工业上称为薯蓣皂素是合成多种甾体激素药物比较理想的 前体而甾体激素药物是世界各国药品工业生产的重要领域它包括肾上腺皮质激素可 的松类氢化可的松类性激素口服避孕药雌激素类雄性激素类和蛋白同化激素 等重要药品 世界各国生产的甾体激素 60以上以薯蓣皂苷元为原料 甾体激素应用广泛 发展迅速世界各国药典收载的皮质激素原料药有 50 余种制剂 150 余种仅美国就有 60 余种目前国内有众多厂家生产甾体激素类药物和口服避孕药是药品生产中仅次于抗 菌素的第二大药品生产领域宋发军2003在国际市场上我国薯蓣皂苷元的出口量仅 次于墨西哥而居世界第二杨明河1981盾叶薯蓣又名盾叶薯蓣火头根为薯蓣科 薯蓣属根状茎组植物盾叶薯蓣(dioscorea zingiberensis c.h.wright)的根茎 其根茎内薯蓣皂 苷元含量较高是我国工厂提取薯蓣皂苷元的重要原料丁志遵1983薯蓣皂苷元的生 产工艺包括薯蓣皂苷元的提取和淀粉和纤维素的综合利用一直备受广大薯蓣皂苷元生 产厂家以及科研人员的关注另外薯蓣皂苷元的检测方法也是人们关心的问题以下就 薯蓣皂苷元的生产工艺和薯蓣皂苷元的检测方法作一概述 1 薯蓣皂苷元生产工艺研究进展 薯蓣皂苷元在植物体内主要是以薯蓣皂苷的形式与纤维素结合存在于细胞壁中由于 薯蓣皂苷元的结构特征和在植物体内存在形式决定了提取薯蓣皂苷元的步骤首先必须使 薯蓣皂苷与植物细胞壁分开再断开薯蓣皂苷元与糖纤维素连接的苷键使薯蓣皂苷 元游离出来薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的结构式见下图 1-1再利用薯蓣皂苷元不溶于水而 溶于有机溶剂的-性质用丙酮石油醚氯仿或酒精等有机溶剂把它提取出来由于薯蓣 皂苷元在植物体内存在形式的复杂性直接酸水解提取的方法薯蓣皂苷元的产率不高研 究表明植物材料在进行酸水解前经自然发酵加入纤维素酶果胶酶苦杏仁酶和植物 生长激素 2,4,5三氯苯氧乙酸吲哚3乙酸均可提高薯蓣皂苷元的产率近年来利 9 用酶发酵和酸水解配合使用的方法提取薯蓣皂苷元取得了很好的效果还有报道宋小妹 1998郭孝武 1999利用超声波破碎细胞壁和使用超临界 co2萃取的方法(陈钧王俊等 2003)也可提高薯蓣皂苷元的产率 图 1-1 dioscin diosgenin 在薯蓣皂苷元的工业生产中提取薯蓣皂苷元的方法可以分为两大类一类是先用甲 醇乙醇或异丙醇等中等极性的有机溶剂将薯蓣总皂苷从植物材料中提取出来然后将其 进行酸水解得到薯蓣皂苷元早年 marker(1947)和 wall(1952)等人主要采用这种方法另 一类是 rothrock(1957) 提出的直接酸水解法该方法是先将植物材料加酸水解水解物用 石油醚有机汽油或苯提取薯蓣皂苷元这种方法比较简便目前工业上多采用此法生产 薯蓣皂苷元但是该方法也存在许多问题薯蓣皂苷水解不彻底薯蓣皂苷元的产率低 反应温度高水解条件要求强烈从而造成盾叶薯蓣中其它成分不同程度遭到破坏且原 料经水解后多次用水洗涤水消耗量大在水洗过程中半成品大量流失影响薯蓣皂苷元 的产率并且在直接酸水解过程中原料的投放量较大酸消耗也较大对环境带来极 大的污染 现在经常使用的利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的提取方法有直接酸水解法和预发酵法 等方法预发酵法是将植物材料先进行堆放经自然发酵后进行酸水解这些方法在提取薯 蓣皂苷元的过程中均采用了酸水解因此盾叶薯蓣中含有的约 40的淀粉经过酸水解后 产生的葡萄糖会导致滤液中的生化需氧量(bod)化学需氧量(cod)增高严重污染环境 另外 盾叶薯蓣中含有的约 50的纤维素成分经过酸水解后的产物为粉纤维和纤维水解产 物这些产物一般不能进行利用而成为工业废渣对环境造成二次污染现在广泛使用的 利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的提取工艺大多是在直接酸水解法或预发酵法的基础上进行 一些工艺改进薯蓣皂苷元提取工艺中的水解方式主要有以下几种直接酸水解预发酵 后再进行酸水解分离后再进行酸水解酶解后再进行酸水解微生物发酵后再进行酸水 10 解 1.1 薯蓣皂苷元提取工艺 国内外报道的关于薯蓣皂苷元的生产工艺大致可分为两类:化学水解法(直接酸水解 法预发酵一酸水解法酸性乙醇/丙酮水解法超临界流体提取法等)和生物水解法(酶解 法或微生物发酵法)尽管方法多样但有一点是共同的那就是不论用化学水解还是生物 水解其目的就是使薯蓣皂苷元与纤维素的葡萄糖单元相连的糖苷键断裂从而用有机溶 剂提取薯蓣皂苷元本文按水解方法将薯蓣皂苷元的生产工艺分为以下几种 1.1.1 直接酸水解法提取薯蓣皂苷元 提取薯蓣皂苷元的最传统的方法是直接酸水解法(rothrock,1957)即先用硫酸或盐酸 将盾叶薯蓣根茎进行酸水解 水解物用饱和碳酸钠水溶液洗涤至中性 于 80左右烘干后 再用溶剂汽油提取薯蓣皂苷元此法费时费工很多薯蓣皂苷元收率较低且使用溶剂汽 油易发生危险另外盾叶薯蓣中的大量淀粉和纤维素等其它成分在酸水解过程中被破 坏而不能利用并且直接酸水解原料投放比较多需酸量较大水解物需用水反复洗涤 水消耗量大并且水溶性成分因多次洗涤而流失使薯蓣皂苷元产率下降因此该工艺存 在很多需要改进的地方但由于该法对设备要求简单工艺易于掌握在一些盾叶薯蓣主 产区还有大量的工厂使用该法进行生产薯蓣皂苷元 1.1.2 预发酵法提取薯蓣皂苷元 据报道刘承来陈延镛 1984将植物材料酸水解前进行预发酵(国内称自然发酵) 可以提高薯蓣皂苷元产率该工艺采用自然发酵处理原料现在我国多数厂家都采用这种 工艺生产薯蓣皂苷元方法是将薯蓣原料浸润任其自然发酵数天至十多天使材料中的 淀粉分解植物体疏松后再进行酸水解然后从植物材料中提取薯蓣皂苷元可使薯蓣皂 苷元收率提高但是杂质含量增加熔点降低其原因是植物材料经过长时间自然发酵后 生成了菝葜皂苷元酮(smilagenin)和表菝葜皂苷元(epismilagenin)由于自然发酵过程中多 种微生物参与发酵发酵条件难以控制杂质增多使薯蓣皂苷元质量下降因此该工艺也 不够理想 现在黄进等人(2001)将该工艺进行了改进综合利用水解后的滤液生成葡萄糖其 方法是将盾叶薯蓣粉碎加入 3 倍体积水搅拌均匀40恒温培养 2 天后加压酸水解 水解物中和后抽滤滤饼在 105下烘干后用石油醚抽提薯蓣皂苷元往滤液加入活性 炭粉末脱色再经离子交换树脂脱盐浓缩结晶干燥得到葡萄糖该工艺可以综合利用滤 液中的葡萄糖具有一定的应用前景 11 1.1.3 分离法提取薯蓣皂苷元 我国最早采用分离法提取薯蓣皂苷元的是陕西省凤翔县卫东化工厂 (周振起封玉贤 1985)报道的工艺研究该研究是将盾叶薯蓣加水磨碎过筛先分离出纤维渣用于制羧甲 基纤维素过滤液经过沉淀排水后上清液浓缩后用乙醇提取乙醚沈淀得到水溶性皂苷 往分离得到的皂苷淀粉浆加入淀粉酶进行酶解酶解后的糖渣再进行酸水解水解干燥物 用汽油提取得到薯蓣皂苷元酶解得到的葡萄糖可以用来制作干酵母粉该方法在提取薯 蓣皂苷元的同时综合利用了纤维素和淀粉但工艺流程长由于目前多数薯蓣皂苷元生产 厂家一般只注重薯蓣皂苷元的生产而忽视了薯蓣中的淀粉和纤维素等其它有用物质的利 用因此该工艺并未得到广泛地推广应用西北植物研究所和陕西省卫东医药化工厂(周振 起封玉贤 1995)多年来在该工艺的基础上进一步改进研制出分离法制取薯蓣皂苷 元新工艺将工艺路线分为三部分第一步先分离出纤维素第二步接种菌种降解淀粉生 成酵母粉并得到糖渣第三步将得到的糖渣进行酸水解提取薯蓣皂苷元该工艺综合利 用了淀粉和纤维素但用于工业生产的微生物需要经过一定的筛选或者将该淀粉作进一 步的处理才能用故该工艺中的利用淀粉这一步还存在一定的需要改进的地方 刘国梁等(2003)采用先从植物材料中分离出纤维素和淀粉 其余部分用来提取薯蓣皂 苷元的工艺该工艺是将盾叶薯蓣片先进行粉碎过筛分离得到纤维素淀粉上清液以及 悬浊液四部分经检测薯蓣皂苷元仅存在于悬浊液部分故该工艺用来提取薯蓣皂苷元的 部位就相应地减少可使薯蓣生产设备容积缩小一半以上在工业生产中生产 1 吨薯蓣 皂苷元可节约煤 30 吨为常法的 75可节省汽油 4 吨为常法的 57减少排放废水 1400 吨比常法减少 72另外该法还可以利用盾叶薯蓣中的淀粉和纤维素该法存在较 强的技术优势但是由于该工艺在进行酸水解之前需要进行一系列的分离工作较直接 酸水解复杂故该工艺推广起来有一定的难度 1.1.4 酶解法提取薯蓣皂苷元 薯蓣皂苷元在植物体内主要以薯蓣皂苷的形式与纤维素结合存在于细胞壁中由于 植物细胞壁比较坚韧因此经典的直接酸水解法提取薯蓣皂苷元很难将薯蓣皂苷元提取完 全为了提高薯蓣皂苷元的产率国内的科研人员韩应许1983对此进行了比较系统 的研究除了预发酵法以外加入纤维素酶果胶酶淀粉酶苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶 等酶液对其先进行酶解 使薯蓣皂苷暴露出来 在酸水解时可以与催化剂更好地发生作用 而提高薯蓣皂苷元的提取产率佟玲等2003研究的工艺的流程为将干燥盾叶薯蓣材 料粉碎后加到一定量的酶溶液中先进行酶解后加入酸进行酸水解再用碱中和经水洗 12 抽滤干燥等一系列过程后再提取浓缩得薯蓣皂苷元该方法采用先酶解后水解比直接酸 水解的薯蓣皂苷元收率大为提高提高幅度达到 28.8该法优化后的酶解工艺对盾叶 薯蓣采取先进行酶解后进行水解的方法提取薯蓣皂苷元可以大幅度的提高产品收率 向纪明等(2003)将利用盾叶薯蓣提取薯蓣皂苷元的工艺改进为 将干燥的盾叶薯蓣材 料带水粉碎除去粗纤维用来制成羧甲基纤维糖浆液用于发酵发酵后进行抽滤 滤液用来制成乙醇将滤渣进行酸水解后用碱中和水洗抽滤干燥提取浓缩的薯蓣皂 苷元该法中发酵可以进行自然发酵或加入 1的淀粉酶或者苦杏仁酶可以提高薯蓣皂 苷元收率 10-20该工艺在提取薯蓣皂苷元的同时充分利用了纤维素和淀粉可以达到 综合利用的目的 1.1.5 微生物发酵提取薯蓣皂苷元 华中工学院赵书申等(cn 85108564)采用纯种黑曲霉菌 用未经自酶发酵的生产原料 经蒸煮破坏了自身存在的各种酶以后直接用黑曲霉菌接种发酵再经硫酸水解提取薯蓣 皂苷元 其产率较普通方法提高一倍 这一方法可同时生产薯蓣皂苷元和柠檬酸两种产品 但黑曲霉菌是柠檬酸的生产菌在利用淀粉的同时使薯蓣皂苷暴露出来再进行酸水 解可以将薯蓣皂苷元提取根完全至于是否能够降解薯蓣皂苷未加以研究 现有的盾叶薯蓣皂苷元的提取工艺改进都是在酸水解提取薯蓣皂苷元工艺的基础上 进行改进的 故这些工艺都存在其本身所具有的缺陷 那就是酸水解带来的对环境的污染 现有的工艺改进所达到的目的就是在充分提取薯蓣皂苷元的同时充分利用盾叶薯蓣中所 含有的淀粉和纤维素以及减少酸液的排放量减少对环境的危害目前最迫切需要工艺 改进的地方是找到一种能取代酸水解的方法将薯蓣皂苷降解成薯蓣皂苷元改善酸水解 对环境带来的污染及危害 1.2 综合利用研究进展 用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的同时由于盾叶薯蓣中含有约 40的淀粉和约 50的 纤维素成分因此盾叶薯蓣的综合利用一直倍受关注目前在综合利用方面除了联合 生产酒精葡萄糖或柠檬酸外还有以生产薯蓣皂苷元的工业废渣为原料制取燃料产品 附加值低在实际生产中的应用也很有限 盾叶薯蓣中除含有各种皂苷外还含有大量的淀粉和纤维素等其它成分 并且薯蓣皂 苷元在薯蓣属植物中主要以薯蓣皂苷的形式与纤维素结合存在于细胞壁中因此要提高 薯蓣皂苷元的产率就必须先将薯蓣皂苷降解成薯蓣皂苷元游离出来考虑到综合利用盾叶 薯蓣中的纤维素和淀粉可以采用微生物降解或者使用微生物产生的酶降解薯蓣皂苷的方 13 法一方面可以提高薯蓣皂苷元的产率另一方面由于不使用酸水解过程植物材料中的 纤维素和淀粉不会被破坏可以加以利用而提高生产薯蓣皂苷元的附加产值 2 薯蓣皂苷元检测方法研究进展 薯蓣皂苷元的检测方法有很多种在具体工作中的选择何种检测方法也是一个需要考 虑的问题国内外报道的薯蓣皂苷元的检测方法早有重量法紫外分光光度法红外光谱 法气液色谱法和薄层扫描法等方法由于分析仪器和分析方法的不断进步后人又研 究出一些检测薯蓣皂苷元的方法如旋光法分光光度法气相色谱法反向高效液相 色谱法(rp-phlc)等现在此处对经常应用的几种检测方法进行简单概述 2.1 重量法 实际应用中重量法用两种方法一丁志遵等1983在甾体激素药源植物一书中 采用多次重结晶法将薯蓣皂苷元结晶集中称取薯蓣皂苷元的总重量的方法来计算植物 材料中薯蓣皂苷元的含量方法二在实际应用中普遍使用的简易操作方法是将植物材 料经过酸水解后用石油醚提取将其浓缩干燥至恒重再称得浓缩物和瓶的总重(g1)然 后用将薯蓣皂苷元溶于乙醇将瓶洗干净后烘干至恒重称得瓶重(g2)计算 g1g2之差 即为属于薯蓣皂苷元的重量计算出薯蓣皂苷元的含量方法一中得到的薯蓣皂苷元的含 量由于经过多次重结晶母液中含有的薯蓣皂苷元可以忽略不计该方法可以达到一定的 精确度但是该法比较繁琐因此在实际应用中一般不采用此种方法方法二中由于计 算的是浓缩物的总重因此该方法得出的薯蓣皂苷元的含量要比实际的含量要高该方法 简便在实际应用中在对薯蓣中薯蓣皂苷元的含量进行粗略测定时大多采用此法但是使 用该法进行薯蓣皂苷元的检测误差较大使用此法得出的资料应加以注明 2.2 紫外分光光度法 在应用比色法时需要用到酸性以及氧化性腐蚀性均很强的试剂并且使用该法进 行测定时先要对薯蓣提取物进行脱色会带来一定的误差因此在实际应用也存在问题 但该法用于工厂中的薯蓣皂苷元产品中的薯蓣皂苷元含量的测定不需要进行脱色时还 是可行的在使用该法进行测定时对测定波长显色时间显色温度以及各种显色试 剂加入的顺序都有一定的要求在进行测定时都要严格控制否则会产生较大的误差 2.3 库仑滴定法 使用库仑滴定法检测薯蓣皂苷元是利用薯蓣皂苷元分子结构与其它皂苷元分子结构 不同的地方就是薯蓣皂苷元分子中具有一个易为卤素加成的双键可以利用含有溴化钾 14 的溶液为电解液在阳极上以恒电流发生溴与其反应用双指示电极确定终点使用库仑 滴定法检测薯蓣皂苷元的方法简便快速但是由于薯蓣皂苷元的提取过程中往往带有 其它甾体皂苷元成分这些成分会影响到薯蓣皂苷元测定的准确性使用该法则无干扰 雅姆皂苷元yamogenin是薯蓣皂苷元 25 位差向异构体虽对本法有干扰但作为合成原 料影响不大不必分离进行测定本法样品分析的平均偏差在 0.5-1.5%范围但使用本法 测定薯蓣皂苷时由于薯蓣皂苷元不溶于水必须在电解质中加入乙醇而在电解质中加 入乙醇后库仑滴定法的精确度就会下降其原因可能是加入乙醇后终点指示灵敏度会 随乙醇的加入量增加明显地下降所以在使用库仑滴定法检测薯蓣皂苷元含量是加乙醇的 量应以不析出薯蓣皂苷元为准否则乙醇的量过大终点难定人为误差会加大因此库仑 滴定法只能用于粗略检测薯蓣皂苷元的含量而不能检测薯蓣皂苷元的质量并且人为误 差也较大 2.4 旋光法 旋光法检测薯蓣皂苷元的含量具有简便快速结果准确的特点在检测过程中不需 要应用到价格昂贵的仪器也不需要用到强酸性强氧化性的化学试剂只需要将样品溶解 即可测定因此该法比较适合于工厂中对产品的质量检测时应用该法的缺点是不适用于 粗提物的薯蓣皂苷元含量的分析 2.5气相色谱法以及毛细管气相色谱法 气相色谱法因仪器价格昂贵一般的小的薯蓣皂苷元生产厂家以及在薯蓣皂苷元源 植物材料的收购过程中不太适用并由于薯蓣皂苷元的沸点较高不易气化因此在气相 色谱法检测前先要进行衍生化尽管使用该法检测薯蓣皂苷元可以达到较高的精确度操 作也较为简便在实际检测中未得到广泛应用 2.6 高效液相色谱法(rp-hplc) 高效液相色谱法因仪器价格昂贵一般的小的薯蓣皂苷元生产厂家以及在薯蓣皂苷 元源植物材料的收购过程中不太适用但是应用该方法检测薯蓣皂苷元的含量不需要进行 分离也不需要进行衍生化减少了检测薯蓣皂苷元含量的操作因此采用该方法可以 更快速准确地检测出薯蓣皂苷元的含量并且可以通过高效液相的出峰情况可以看出薯蓣 皂苷元中杂质峰的多少和峰面积的大小判断薯蓣皂苷元的质量现在不少生产厂家以及科 研单位都已经拥有自己的高效液相色谱分析仪因此高效液相色谱分析法也会越来越广泛 地被应用于薯蓣皂苷元的检测 不同的检测方法有其不同的特点和适用范围因此在实际检测薯蓣皂苷元时应根据 15 不同的要求以及具体情况因时因地进行选择 3本论文研究的目的和意义 盾叶薯蓣是我国重要的甾体激素药源植物 多年来利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的生 产工艺一直都是采用酸水解和在酸水解基础上稍加改进的工艺流程采用该工艺生产薯蓣 皂苷元对环境都会不可避免的带来了污染另外由于使用强酸进行酸水解将盾叶薯蓣中含 有的大量的淀粉和纤维素成分大都破坏掉而不能加以利用使盾叶薯蓣的综合利用达不到 最大化本论文在研究利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的预发酵以及酸水解条件优化工艺的 同时另外寻找代替酸水解的降解薯蓣皂苷的方法达到降低对环境污染的目的并使盾叶 薯蓣中的其它成分不受破坏以达到综合利用的目的 薯蓣属植物在相当长的时间内有较好的市场前景其原因主要有三点1甾体类药 物市场不断扩大薯蓣资源萎缩造成原料不足更加严重2全世界甾体激素原料长期处 于短缺状态至今未发现比薯蓣更好的替代来源导致薯蓣价格不断上涨3生物学研 究技术的最新进展使近年取得较大突破成为可能 此外 盾叶薯蓣综合利用的潜力还很大 因此对薯蓣皂苷元的提取工艺及其综合利用的研究不仅有助于缓解甾体激素原料紧张 的问题还将有力地推动农村经济发展 16 第二章 利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵 与水解条件优化 前言 盾叶薯蓣 dioscorea zingiberensis c. h. wright又名黄姜是我国特有的薯蓣属植 物其根茎中含有丰富的薯蓣皂苷是我国工业生产薯蓣皂苷元的主要原料之一当前 在工业生产薯蓣皂苷元过程中仅采用重量法和熔点法对薯蓣皂苷元进行定量定性薯蓣 皂苷元的分析方法制约了工艺条件的优化在薯蓣皂苷元的工业生产中至今未有具体可靠 类似于实际生产的工艺参数可以借鉴结果导致产品产率低且质量不稳定目前利用盾叶 薯蓣生产薯蓣皂苷元的生产方法主要采用直接酸水解法和预发酵法前人刘承来陈延 镛 1984研究表明在生产薯蓣皂苷元进行酸水解前对薯蓣属植物材料进行预发酵能提高 薯蓣皂苷元的产率但是在采用预发酵法生产薯蓣皂苷元过程中往往由于长时间自然发 酵生成了菝葜皂甙元酮smilagnenone和表菝葜皂甙元酮酮epi-smilagnenone尽管采 用预发酵法使薯蓣皂苷元的收率提高但是杂质增加熔点下降使薯蓣皂苷元的质量下 降 因此如何控制预发酵的条件越来越受到研究人员的重视 有文献报道 王元兰等 2002 利用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元先要进行 48 小时预发酵可以提高薯蓣皂苷元的收率 并认为 最佳发酵时间是 48 小时 但该文作者是采用重量法测定薯蓣皂苷元的含量 该方法所检测 结果与本文所采用的 rp-hplc 所检测结果有较大误差本文与前人研究表明发酵时间 过长薯蓣皂苷元会发生结构变化故本文在设计预发酵时间时选择了较短的预发酵时间 和较小的时间梯度另外在将盾叶薯蓣进行盐酸或硫酸酸水解过程值得注意的是常有 副反应发生一是使用盐酸水解时有可能产生羟基氯代因此要控制好水解条件二 是薯蓣皂苷元易脱水形成去氧替告皂苷元 3 5-deoxytigogenin 其得量会随水解温度 和时间的增加而增加三是加热方式的选择对酸水解有很大的影响在检测薯蓣皂苷元 含量过程中 多采用水浴加热或者直火加热方式进行水解 前者温度达不到酸水解的条件 水解不完全后者温度不易控制容易发生碳化故工业上多采用盐酸或硫酸高压酸水解 的方法进行酸水解盐酸高压酸水解生产薯蓣皂苷元的工艺在国内普遍采用但是该工艺 存在的主要问题是薯蓣皂苷元产率低用酸量大对环境带来很大的污染并且会产生 羟基氯代使薯蓣皂苷元的质量下降因此本文在进行工艺优化研究时使用硫酸代替盐 酸进行酸水解为了减少对环境的污染和提高薯蓣皂苷元的产率本文对在实际生产过程 17 中影响薯蓣皂苷元产率的因素分预发酵和酸水解两部分进行优化尽可能准确地将各因素 之间的影响进行最佳组合以便给实际生产提供有价值的指导 1 材料与方法 1.1 实验材料试剂及仪器 本文所用的盾叶薯蓣根茎材料由陕西省白河县科技局提供经江苏省中科院植物研究 所徐增莱副研究员鉴定为盾叶薯蓣dioscorea zingiberensis c. h. wright实验用试剂 硫酸石油醚(60-90)以及甲醇均为南京化学试剂厂生产 a.r.粉碎机高压灭菌锅高 效液相色谱仪 agilent 1100 series hplc 检测仪薯蓣皂苷元标准品由本实验室制备 bp: 207-208并经高效液相色谱仪检测为薯蓣皂苷元 1.2 薯蓣皂苷元的检测 1.2.1 供试品溶液的配制 将石油醚抽提液浓缩干后用甲醇定容于 100 ml 容量瓶中保存待测 1.2.2 色谱条件的选择 rp-hplc 高效液相色谱仪为agilent 1100 series hplc 检测仪, 色谱柱为 agilent eclips dc- c18 柱 (5m , 4.6250mm)流动相为甲醇经超声浴抽气 30 分钟流速: 1mlmin-1dad 检测器检测波长208nm , 柱温30进样量为 5l 1.2.3 薯蓣皂苷元标准品溶液的配制 准确称取于 80条件下烘干至恒重的薯蓣皂苷元标准品用流动相甲醇配制成 0.55mgml-1的对照品溶液 1.2.4 方法学考察 1.2.4.1 线性范围与标准曲线 取薯蓣皂苷元标准品溶液 12345678 910l进样薯蓣皂苷元标 准品和样品 rp-hplc 色谱图如下见图 2-1结果表明在 0.555.5g 范围内线性关系 良好回归方程为y= 332.96x+ 0.168y峰面积积分值x薯蓣皂苷元标准品微克 数r0.9999图 2-2r0.5=0.632r0.1=0.765 1.2.4.2精密度试验 取薯蓣皂苷元标准品溶液重复进样 4 次每次 2l机械手自动进样测定峰面 积计算相对标准偏差rsd为 2.85平均保留时间为 6.440 minrsd 为 0.86 1.2.4.3 溶液稳定性试验 取同一供试样品在同一天内进样 3 次10 天后再次进样测定峰面积计算日内以 18 及日间相对标准偏差rsd分别为 3.61, 6.5日内保留时间和日间保留时间的变异 系数分别为 0.641.15说明该供试品溶液在所测定期间内基本稳定 1.2.4.4 回收率试验 精密称取同一样品 3 份分别加入精密称取的薯蓣皂苷元标准品 2mg按上述步骤 操作定容至 10ml进样 2l测定计算回收率为 98.2n=3 a b 图 2-1 薯蓣皂苷元 rp-hplc 色谱图(图 a:标准品图 b样品) fig. 2-1 rp-hplc chromatogram of diosgenin a :diosgenin standard; b: samplethe crude extract of diosgenin 图2 - 2 标准曲线图 f i g . 2 - 2 s t a n d a r d c u r v e 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 2 0 0 0 0 . 5 51