（微生物学专业论文）两株假单胞菌不同烃摄取机制的初步探索.pdf

摘要 从乳化分散大港6 9 区块高胶高蜡原油效果非常好的混合菌种8 0 中分出两 株菌8 0 - a ，8 0 b ，经鉴定均为假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 。在以十六烷为 基质培养时，8 0 - a 的生长速度远比8 0 b 要慢，但是8 0 a 在生长过程中表面 张力呈降低趋势，而8 0 - 1 3 则变化极小到可以忽略的程度， 这说明8 0 - a 有胞 外的生物表面活性剂产生。3 r n v l 的e d t a 可以明显抑制8 0 b 在十六烷培养基 中的生长，对8 0 a 则没有作用。补加c 矿后只有8 0 b 的生长被恢复，但e d t a 并不抑制这两株菌在肉汤培养基中的生长。由于c a 2 + 是拟增溶活性所必需的。 所以这暗示出拟增溶作用是8 0 b 摄取烃的主要机制。 t 收获在十六烷和营养肉汤中生长的8 0 a ，8 0 b 的菌体细胞， 十六烷的粘 、 附性卖验证实，8 0 a 表现出比8 0 b 更为强烈的粘附性。这说明8 0 a 对烃的摄 取在初期主要依赖细胞与烃的直接接触，后期依赖自身合成的表面活性物质。i ，、 对8 0 a 所产生的胞外生物表面活性剂进行了定性和定量分析证明其为 鼠李糖脂， 含量为o 9 5 9 ，l 。 分离出8 0 b 所产生的胞外的拟增溶因子( p s e u d o s o l u b i l i z i n gf a c t o r ) 和乳 化因子( e m u l s i f y i n gf a c t o r ) ，证明它们的化学本质为蛋白质， 建立了测定其活 性的方法， 探讨了温度和c a 2 + 对拟增溶因子活性的影响，温度对乳化因子活 性的影响。 也- a ，8 0 一b 对6 9 8 原油的分解率及对原油的粘度和凝固点的影 出8 0 b 比8 0 a 作用更好，说明拟增溶因子在烃摄取和降解中更有效。 关键词：假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) ，拟增溶活性，拟增溶因子，乳化因子 a b s t r a c t f r o mt h er e s e r v e dm i x e ds t r a i n sw h i c hc a nd e c r e a s et h ev i s c o s i t yo fh i g h a s p h a l t - c o n t a i n e do i ls t r i k i n g l y , t w op u r es t r a i n sw e r ei s o l a t e dn a m e d 8 0 aa n d8 0 - b w h i c hw a si d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss p 8 0 bg r e wm u c hf a s t e rt h a n8 0 aw h e n c u l t i v a t e do nn - h e x a d c a n e t h es u r f a c ea c t i v i t yo f8 0 ad e c r e a s e dw i t hg r o w t h ，w h i c h i n d i c a t e st h ep r o d u c i n go f b i o s u r f a c t a n t ，b u t8 0 - bh a sn or e d u c t i o ni ns u r f a c ea c t i v i t y t h eg r o w t ho f8 0 - bo nn - h e x a d c a n ew a si n h i b i t e db y3 r a me d t aw h i c hh a s n oe f f e c to n8 0 - a ，h o w e v e rt h eg r o w t ho f8 0 - bw a sr e c o v e r e dw h e ns u p p l y i n gw i t h c a 2 + b e c a u s ec a 2 + i sv i t a lf o rp s e u d o s o l u b i l i z i n g ，s ow ea g r e et h a tp s e u d o s o l u b i l i z i n g i st h em a i nm o d ef o r8 0 - bt ou p t a k eh y d r o c a r b o n a f t e rt h ee x p e r i m e n to fc e l la d h e r a n c e ，w ef o u n dt h a t8 0 - a sc e l lh a sm u c h g r e a t e ra f f i n i t yt oh y d r o c a r b o nt h a n8 0 - b s t h eb i o s u r f a c t a n tp r o d u c e db y8 0 - aw a s i n d e n f i f i e da s g l y c o l i p i dw h i c hc o n t e n ti s0 9 5 9 1 p s e u d o s o l u b i l i z i n gf a c t o ra n d e m u l s i f y i n gf a c t o rw h o s en a t u r ei sp r o t e i nw e r es e p a r a t e df r o m8 0 - bc e l l - f r e eb r o t h as e to fm e t h o d sa b o u th o wt oc h e c kt h e i ra c t i v i t yw a s c o n s t r u c t e d t e m p e r a t u r eh a s s t r o n g e f f e c to nb o t hf a c t o r s ，a n dc a 2 + c a na l s oe f f e c tt h e a c t i v i t y o f p s e u d o s o l u b i l i z i n gf a c t o rg r e a t l y a f t e rs e v e r a le x p e r i m e n t sa b o u to i l ，i td e m o n s t r a t e de x i s t a n c eo ft h ed i f f e r e n t m o d e so f h y d r o c a r b o nu p t a k eb y8 0 - aa n d8 0 - b k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a ss p p s e u d o s o l u b i l i z i n g ，p s e u d o s o l u b i l i z i n gf a c t o r , e m u l s i f y i n gf a c t o r 前言 1 。袋油徽生匏壤述： 微擞物提高石油采收率( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r ym e o r ) 是采 油微生物学中发展最快、最活跃的一个分支m i 。微生物采油技术以其显著 酶经济效箍为石漓界所关注，是传统的热驱、纯学疆、气体辍之后静又一 新的提高原油采收率技术。 自1 9 2 6 年b e c k m a n n 提出细菌可用来浆油以来，美国科学家 z o b e l l ( 1 9 4 7 ) ，苏联辩学家k u z e n e t s o v ( 1 9 6 1 ) , i v a n o v ( 1 9 8 2 ) 等在徽生耱挺离采 收率领域中作出了重骚赏献。采油微生物研究的初期，主要侧重予菌种的 筛选，室内模拟和矿场应用试验。谯此基础上，逐步开展了微生物采油技 术与矿场盖程擎及擞垒纺捷裹石漓牧率掇毽静磷究。 近年来，由于矿场应用的良好效果，更加快了其基础理论的研究 i 。1 石油微黛物生理学麟究： ， 戳烃为碳源的微生臻其代谢物种类相当笈杂，这取决予臻境条辞( 滠 度、矿化度、压力、p h 值和有咒氧) ，维持细胞代谢的营养物( 氮、磷 等) ，其代瀣产物一般可以是气体( c h 4 、h 2 、c 0 2 等) ，羧骏( 甲酸、 乙酸、戊酸等) ，溶翔( 簿、醛、凝等) ，聚会貔( 蛋鑫质炎、多耱类) ， 表面浦性化合物( 阴离子类腮擞) 以及其他许多单体到十分复杂的大分 子的各种诧合物f 3 q 。由于微生物产生的高分乎聚合物的分子量是不辐 等斡褥整复杂，其中诲多聚合糍盼纯学结孝奄税来明确。因鼗，重新强调 这姥产物。可能对石油开采和加工是更重要的因素，以引起对这些微 生物代谢产物酶化学结构及性质礤究靛重视： 1 2 石油微生物酶学的磷究： 翻1 9 4 6 年z o b e l l 获得第一项微生物采油的专利以后，人们针对烷 烃异化的翡学进行了一些卓有成效的研究。肖关烷烃异化的途径，最 为常觅静是烷烃的荦端氧纯途径，包括烷烃的脱氢、疑化、氢过氧 化作用使烷烃转变为相应的伯醇，这个过程中起作用的分别为脱氢酶、 如攀裁蹲、翔双氧黪。然爱再经过艇甄酶豹终期生成援应豹戆釉酸f 3 2 。除 此之外，还存在有烷烃的双端氧化及次末端戴化途径。异化过程如下； 双断氧化：正烷烃一脂肪伯醇一脂肪醛一单羧基脂肪酸一二羧基脂肪 酸 次末端氧化：正烷烃一醇一酮一酸 1 3 利用烃的微生物遗传学研究： 在最近几十年中，实际上邑经出现一门被称为利用烃的微生物遗传 学的学科，目前关于利用简单芳香烃的微生物遗传学知识大大超过利用 烷烃的微生物遗传学知识。在石油微生物遗传学中，烃降解微生物遗传 学是研究的重点。由于石油微生物对烃降解存在“共代谢”现象，所以 对烃降解的遗传系统比较复杂。对于短链烷烃分解代谢遗传学的了解， 首先来自腐臭假单胞菌的系统研究工作，出色地证明了一整套遗传学座 位的存在，这些座位位于o c t 质粒与染色体上。不动杆菌长链烷烃分 解代谢的遗传信息只位于染色体上。由于烃降解基因常常携带在质粒 上，且成簇聚集，所以烃降质粒自吩予生物学研究仍是目前研究的重点。 烃降解基因工程菌株构建仍是研究者们的努力方向。 2 微生物细胞对于烷烃的摄取机制； 众所周知，细胞只有与底物实现接触才能进而吸收某种物质。这对于 水溶性的底物是不难做到的。然而由表l 列出的一些长链烷烃基本上都是 不溶与水的，则它们必须通过某种方式运送到细胞才能实现细胞- 底物的接 触。因此微生物要想利用这些不同寻常的底物作为唯一的碳源和能源，则 必须存在摄取烷烃的机制，使疏水的水不溶性烷烃穿过细胞壁进入细胞内 的烷烃氧化部位【3 l 。 表1 烷烃在水中的溶解度 烷烃的碳数2 5 ( 2 时的溶解度 l2 4 4 26 0 4 3 6 2 4 46 1 珥 53 8 4 69 5 2 72 9 3 8o 6 6 9o 2 2 1 00 0 5 2 l l0 0 0 4 4 1 20 0 0 8 4 1 40 0 0 7 0 1 60 0 0 6 3 1 8 0 0 0 6 0 机制l ：细胞与溶解在水相中的烷烃直接作用。 有证据表明，某些酵母能依靠某些溶于水相培养基的烷烃生长，但 是大多数研究者认为，在水相介质中用物理增溶法溶解烷烃的速度不足 以支持酵母以观察到的速度生长。e t d s i e c k 和r i e t e m a ( 1 9 7 1 ) 的试验 表明，解脂酵母能够在用十一烷和十二烷蒸汽饱和的培养集中生长。但 它们观察到，同一酵母在溶解有十三烷或更长链的烷烃培养基生长却十 分有限，推测是由于长链烷烃溶解度较低，而不是因为底物专一性的限 制。据y o s h i d a ( 1 9 7 4 ) 等测定，在溶解了液态烷烃或气态烷烃的培养 基中热带假丝酵母的生长速率近似，这表明微生物主要摄取溶解状态的 烷烃f 1 0 】。进一步的研究表明，“溶解的”烷烃以直径0 1 “m 0 8 9 m 的小 液滴存在，并且十六烷在培养基中的溶解度比在水中高出2 0 倍m 】。 g o m a ( 1 9 7 3 ) 等指出，在含有十一烷至十八烷为烷烃混合物中， 解脂假丝酵母首先选择性的利用低分子量的烷烃，然后才利用较高分子 量的烷烃。这可能是由于低分子量的烷烃溶解度较高，而不是因为底物 专一性或亲和性【“l 。 机制2 ：细胞与烃液滴直接作用。 在这种情况下，微生物的细胞可吸附到比自己大很多的烃液滴表 面，而且物质的运输主要是靠扩散和主动运输。这些细胞对烷烃具有很 高的亲和力。k e n n e d y ( 1 9 7 8 ) 等通过相差和扫描电镜观察到，不动杆 菌h 0 1 - n 附着于烷烃小液滴的表面，而大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和产 气杆菌等则没有与烷烃附着。有些用烷烃培养的酵母形成絮凝物( 由细 胞、烷烃、气泡组成的凝块) 。絮凝物的形成使得细胞可于烷烃保持紧 密接触，造成一种微环境【2 】。 k a p p e l i 和f i e e h t e r ( 1 9 7 6 ) 证明，与葡萄糖培养的热带假丝酵母或 葡萄糖培养的酿酒酵母( 一种利用非烃的微生物) 相比，热带假丝酵母 与烷烃有很高的亲和力。据鉴定，细胞表面与烷烃结合的组份是一种多 糖，脂肪酸复合物，它主要由甘露糖和4 的脂肪酸组成【7 j 。 m i u r a 等比较了几种酵母对烷烃的附着能力。中型假丝酵母对烷烃 的附着能力很强，而热带假丝酵母却很弱。酿酒酵母没有结合烷烃的能 力。通过对摄氧速率的测定，这些研究者还指出，热带假丝酵母同化高 度乳化的十四烷的速率比同化未乳化的底物快。与此相反，较好的附着 于十四烷的中型假丝酵母无论对乳化的还是未乳化的十四烷，其代谢速 率都不变。 但是，并非说依靠烷烃生长的微生物种群都会附着于烃类。n a k a h a r a ( 1 9 8 1 ) 等证明，多达4 0 的十六烷培养的解脂假丝酵母是非附着性的。 与此类似，g u t i e r r e z 和e r i e k s o n ( 1 9 7 7 ) 发现，大约三分之一的依靠十 六烷生长的解脂假丝酵母不全附着在烃上。r o s e n b e r g ( 1 9 8 0 ) 等的试 验表明，用营养羊肉汤培养的醋酸钙不动杆菌r a g - 1 和b d 4 1 3 对十六 烷、辛烷和二甲苯具有较高的亲和力。这种细菌不能代谢辛烷和二甲苯， 这表明他们附着与烃可能是一种非特异性疏水作用引起的i ”1 。 机制3 ：细胞与“拟增溶的”小烃液滴相互作用。 有很多的文献描述了利用烃的微生物所产生的胞外的生物表面活性 剂和生物乳化剂有增加烃水界面之间接触面积的作用。有两个概念是必 须加以澄清的，那就是生物表面活性剂和生物乳化剂的区别。就乳化作 用而言，生物表面活性剂是一些低分子量的小分子，他们能显著降低空 气水或油水界面的张力，从而有助于油水乳化；生物乳化剂是一些生 物大分子，他们不能显著降的表面张力，但它们对油水界面表现出很 强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，从而使这种 乳状液滴得以稳定。w h i t w o r t h 认为，表面活性剂促进微生物的生长是 由于其乳化效应，这种效应使得烷烃星胶状分散，这增加了烷烃与细胞 的接触，并加快了烷烃的利用【”】。 r o s e n b e r g 在1 9 8 1 年分离到一种不能附着于烃的不动杆菌r a g - 1 自发突变株不能依赖十六烷生长，而在上述条件下，野生型不动杆菌 r a g 1 却能正常生长。给m r - 4 8 1 菌株补充一种由r a g 。l 菌株产生的 胞# i - - 孚l 化剂，结果该菌株立即消耗十六烷生长。试验表明，m r 4 8 1 能 够利用乙醇产生正常的胞外乳化剂，并能够依靠十六烷蒸汽生长。这些 结果暗示，非附着性的m r - 4 8 1 突变株并非由于缺乏某些酶而不能靠十 六烷生长，而且，在没有乳化底物或强烈机械搅动的情况下，细胞附着 于烃对不动杆菌r a g 1 以十六烷的生长可能是必不可少的。不动杆菌 r a g - 1 韵稀疏菌毛对其附着于十六烷可能是重要的。非附着性的m r - 4 8 1 突变株明显缺乏细胞表面的稀疏菌毛在这种机制中，烃的液可以小到 o 5 1 a m 一下，这时与以上所涉及的第二种情况不同的是，不再是细胞吸 附烃液滴的表面而是烃的小颗粒吸附到细胞的表面。随着物质颗粒体积 的降低，油水之间的界面面积大大地提高了。 对于微生物体而言，烃类的摄取过程可能是一种或者以上介绍的几种 机制结合进行。据报道，在c a n d i a l t p o l y t i c a 以十六烷为碳源生长时， 第二种和第三种机制扮演了同等重要的角色t 2 3 1 。 ；与烃类摄取有关的因子： 早在1 9 6 9 年，s u z u k i 就提出了有关细胞产生的乳化因子在其烃摄取过 程中的作用，在其后的十年中又有很多学者就此问题发表过很多文章。1 9 8 2 年，r e d d y 认为烃类的乳化因子不论是在强烈的搅拌还是在温和搅拌的条 件下都能够引起适当数量的烃类的非特异性增溶。在随后的1 9 8 3 年，他成功 的分出了一种具有乳化活性的因子，他给它命名为“乳化增溶”因子，并 建立了测定乳化因子活性和增溶活性的方法；在1 9 9 1 年，g o s w a m i 提出了 更为科学和完备的有关于烃类摄取相关因子提取方法，并提出了“拟增溶 因子”“乳化因子”的概念。这样一来，对于此类因子无论定性还是定量都 有了更为可信的方法和尺度田列1 。 4 立题意义； 在徽嫩物提高石油袋收率( m e o r ) 研究中有关烃类摄取机制的研究 鏊内还寒凳青擐遴，我稻楚在参考黼辨觞裙关文献鼹其遗行探讨静。壶予 绝大多数的烃在水中的溶解度都是极小的，所以说在水相中细胞若要以烃 为碳源生长，在与烃糊接触很困难的愤况下，研究其烃的摄取机制就变的 + 分重要。褥国内还没有关予这方瑟的任鹰疆逶，在这释清溅下我们磅究 烃摄取的桃制是十分必要的。在我们实际的工作中经常遇到这样的困难： 当报据其乳化原油的效果为依据评价袋一株菌对原油降解效果辩寸，即使生 物表露活性懿的产量鞍瞧质基本一致，对孤漓 乍髑效采也有时差聚缀大， 这时我们想到是否在烃的摄取机制上存在什麽不同呢? 如果确肖其事，这 将对予选出优良豹逶予矿场应用的麓株又多了一条非常重要的依据，其现 实意义释壤论意义都怒藤犬静。 6 材料与方法 一。材料 1 菌种： 各菌种均由本实验室提供，其中8 0 a ，8 0 b 是由混合菌种8 0 中分 离得到。 2 原油； 大港油田官6 9 区，6 9 8 原油，含胶质沥青2 4 6 ，含蜡2 5 9 的双高油。 3 培养基z 3 1 基础离子培养基( w ，v ) ( n h 4 ) z s 0 4 n a h p 0 k h 2 p 0 4 m g s o i 7 h 2 0 c a c k 2 h 2 0 f e s 0 4 7 h 2 0 酵母粉 p h 3 2 十六烷培养基 基础离子培养基+ 2 十六烷 3 3 液蜡培养基 基础离子培养基+ 2 液蜡 3 4 原油分解培养基 基础离子培养基+ 2 原油 3 5 原油降粘降凝培养基 基础离子培养基+ 4 0 原油 揣一一揣一一一他咪一一一|量蝴删他 3 6 营养肉汤培养基 牛肉膏 0 5 蛋白胨 l n a c l 0 5 p h7 0 - 7 2 3 7 琼脂固体培养基 营养肉汤培养基+ 1 5 琼脂粉 4 主要试剂； 1 ) 芷已烷，正庚烷。芷辛烷，正壬烷，正十二烷，正十六烷，液蜡，丙酮， 硫酸铵，浓硫酸，薄层层析硅胶g - 6 0 。氯仿，蒽酮。甲醇等，均为国产a r 试剂。 2 ) 双缩尿试剂：详见文献蚓 3 ) s d s p a g e 蛋白电泳相关试剂：详见文献i 虾】 5 主要实验仪器，设备 界面张力仪承德市材料实验机厂 g c 7 a 型气相层析仪日本岛浓 旋转薄膜蒸发器( z f q 1 0 l ) 天津第三分析仪器厂 n d j 7 9 型旋转式粘度计同济大学机电厂 t h z 8 2 型恒温振荡器上海跃进医疗器械四厂 n i c o l e t 傅立叶变换红外分光光度计 17 0 sf t l r 7 2 1 型分光光度计上海第三分析仪器厂 7 5 2 型分光光度计上海第三分析仪器厂 d y y - i i i2 8 a 型垂直板电泳槽 北京六一仪器厂 高速离心机美国b e c k m a nj 2 一m c 笔式酸度计葡萄牙h a n n a 公司 微量注射器( 5 0 u l ，l u l )上海医用激光仪器厂 0 4 5 u m 1 2u m 微孔滤膜及滤器德宇公司 二方法： 1 菌种筛选； 以大港油田官6 9 区块6 9 - 8 号油为唯一碳源，筛选分散乳化原油最佳 的菌种。 2 菌种鉴定及初步评价； 2 1 根据伯杰氏手册( 第八版) 就8 0 a ， 8 0 一b 进行分类鉴定。 2 2 用稀释平板法测菌浓，绘出两株菌在十六烷和肉汤培养基中的生长曲 线。 2 3 分别在不同的时间段取样测定十六烷发酵过程中两株菌的表面张力变 化 2 4 细胞粘附性测定： 收获8 0 - a ，8 0 一b 经十六烷和营养肉汤分别培养的菌体 l 真空干燥后，精确称重l o o m g 1 分别接入含2 十六烷的蒸馏水中，1 7 0 r p m ，3 7 c 作用1 小时 i 在不同的离心力条件下各离心五分钟 l 菌体沉淀经真空干燥后称重计算细胞粘附率 3 e d t a 对8 0 一a ，8 0 - b 生长的影响 用菌落平板记数法观察e d t a 对8 0 一a ，8 0 一b 在十六烷和肉汤培养基中 9 生长的抑制作用，得出e d t a 抑制生长的最适浓度。 4 。+ 8 0 - a ，8 0 - b 的无细胞液的拟增溶及乳化活性的测定： 4 1 拟增溶活性的测定 其活性是以经拟增溶化后而“溶解”在无细胞液中的的烃的含量 ( m g m 1 ) 来表示的。 8 0 一a ，8 0 一b 的以十六烷为基质摇瓶培养的发酵液 i 过滤，离心去除菌体 l 通过0 4 s u m 微孔滤膜 i 按2 的量加十六烷到5 0 m l 滤过液中，t 2 0 r p m 摇床5 分钟 l 转入分液漏斗，用定量正己烷抽提 、 l 取上相( 己烷层) ，以气相色谱内标法( 十二烷为内标) ，求出十六烷含量 l 得出拟增溶活性( m g m 1 ) 内标法见文献【3 6 l 4 2 乳化活性的测定： 乳化活性是以o d 。的值来表示的，其测定过程如下： 8 0 一a ，8 0 一b 十六烷培养的的无细胞液l o m l + 0 1 m l 己、庚、辛、壬、十二、十六烷 l 混合后用涡旋仪混匀一分钟 l 静置三十分钟 l 0 o d 6 l o 比色 5 拟增溶因子和乳化因子的提取及活性测定 5 1 产物提取： 1 5 0 0 m l s o b 发酵液 l8 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n 上清液( 沉淀弃去) l 通过1 2 u m 的滤膜 滤过液( 2 5 0 m i ) l 磁力搅拌器缓慢搅动下用两体积的冷丙酮沉淀，4 c 冰箱静置2 h r 以上 i 1 0 ，0 0 0 9 离心3 0 m i n ll 白色沉淀上清 l 溶入5 0 m l 蒸溜水中并在4 5 0 水浴条件下用薄膜式旋。 对蒸馏水透析3 6 h r转蒸发仪除去丙酮 ll 用冷丙酮再次沉淀得到的上清液在冰浴条件下加入 i 硫铵至7 5 饱和度 i 0 ，0 0 0 9 离心3 0 m i n l4 冰箱放置4 - 6 h r 最后沉淀i i 、 1 5 ，0 0 0 r p m 离心3 0 m i n 真空冷冻干燥 l l 得到浅黄色沉淀 干样品( 拟增溶因子) l 沉淀溶入蒸溜水中4 对蒸溜 水透析过夜 l 1 5 ，0 0 0 r p m 离心3 0 m i n 又得到浅 黄色沉淀 l 真空冷冻干燥 l 干样品( 乳化因子) 5 2 拟增溶因子和乳化因子的活性测定： 分别称取0 1 克拟增溶因子和乳化因子的千样品溶于5 0 m l 蒸馏水中 ( 拟增溶因子液中c a 2 + 浓度1 5 m m ) ，加入2 十六烷按4 1 和4 2 中的方 法分别在：2 5 1 2 ，7 0 ，1 0 0 c ，测定拟增溶活性和乳化活性，透析除去 c a 2 + 后测拟增溶活性。 6 拟增溶因子和乳化因子的定性分析 6 i 红外光谱分析 6 2 拟增溶因子和乳化因子的蛋白显色反应： 双缩尿法详见文献【3 b 】。 6 3 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳：用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法。 a 凝胶配制：采用1 0 分离胶，2 5 浓缩皮。 b 其他如缓冲液、凝胶溶液配制详见文献。6 。 7 8 0 一a 的表面活性剂分析 7 i 产物提取 8 0 a 的无细胞液中加入i o h ：s o 。调p h 6 0 ，加入两倍体积的氯仿甲醇 ( 2 ：1v v ) ，混合液磁力搅拌3 0 分钟，分液漏斗中静置l 小时，重复抽 提一次合并有机相，6 0 ( 2 用旋转薄膜蒸发仪减压蒸馏，得产物。 7 2 定性分析 以硅胶一羧甲基纤维素钠铺平板，用类脂展开荆展层后，分别用类脂显 色剂( 钼酸铵一高氯酸) 及糖脂显色剂( 1 葸酮一硫酸液) 显色。后进行糖 的定性分析其方法见文献 4 0 。类脂显色剂在1 0 5 1 2 2 1 热2 0 分钟。糖脂显 色荆在1 1 0 加热5 分钟。 7 3 定量分析 7 3 1 标准曲线的制作 取0 5 9 l 的糖脂溶液0 2 ，o 4 ，0 6 ，0 8 ，1 o ，1 2 m l 用蒸馏水 补至2 o o m l ，分别加入1 o o m l 酚液( 5 ) 、5 m l 浓硫酸( 9 8 9 6 ) ，各 管加完后，静置1 0 分钟，3 0 水浴2 0 分钟，混匀后4 8 0 n m 测吸 光度。以蒸馏水为空白，得标准曲线。 7 3 2 样品测定 取样品溶液0 5 m l ，稀释1 0 倍，按以上方法操作。 8 8 0 一a ，8 0 - b 对6 9 - 8 原油的作用 8 1 对6 9 8 原油的分解实验。 准确称取2 0 0 克油，予3 7 1 2 摇床培养7 2 小时，具体方法见文献p ”。 8 2 对6 9 8 原油作用后的气相色谱分析。 作用后的残油做气相色谱分析。 8 3 对6 9 8 原油粘度和凝固点的影响。 分别将8 0 - a ，8 0 - b ，8 0 - a + 8 0 b ，接入降粘降凝培养基3 7 1 2 摇床培养 五天后测其粘度和凝固点的变化。 9 8 0 菌种在大港油田单井注入中的应用效果 结果与讨论 1 ；菌种筛选 3 7 c 筛选分散乳化原油的菌株其结果如表l ； 表1 ：菌对原油分散乳化效果 菌种6 9 - 8 原油 2 - 1 3 - 1 1 + + 9 5 - 6 + 8 0 + + + s 2 + + n 2 + + n 2 3 + 2 5 - 2 7 + + 2 1 - 2 3 + + 4 - 9 4 7 + + z 1 7 + + 7 9 5 8 + + + + 1 1 8 + + z 1 6 + + 经多次重复，发现其中8 0 重复率最高，分散效果最好。 2 菌种鉴定及初步评价： 2 1 菌种初步鉴定： 表3 菌种鉴定结果： 、菌株号 鉴定项i 、 8 0 a8 0 b 菌株特征暗黄色、大、有核心、圆、亮乳白色、小、中凸、圆、粘 菌大小( g m ) 0 4 一旬5 x1 5 之00 5 o 6 1 0 1 5 体 革兰氏染色 g g 一 特 鞭毛端生三根鞭毛极生一根鞭毛 征 葡萄糖氧化 + + 葡萄糖发酵 一 - 氧化酶 + 接触酶 + 硝酸盐还原 + + 类脂粒染色 + + 水解淀粉 +- - 水解明胶 - 卜 鉴定结果 假单胞菌属p s e u d o m o n a s s p 假单胞菌属p s c u d o m o n a s s p 根据伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 初步鉴定二者均为假单胞菌属。其 菌落及菌体特征见图卜3 。 图18 0 蒴平板菌落特征 圈2 $ o - a 圈38 0 - 3 2 28 0 a ，8 0 b 在十六烷和营养肉汤培养基中的生长曲线 以上初步鉴定的菌株经反复纯化后，将其分别接到十六烷液蜡培 养基中，3 7 c 震荡培养3 6 小时后作为出发菌株。为观察两株纯种分 别对烃的利用情况及在烃中的生长速度，分别做了它们在不同碳源中一 的生长曲线。 表4 8 0 a ，8 0 - b 菌浓大小( 营养肉汤) 时间( 小时) 菌名 o2 44 87 2 8 0 a1 , 0 1 0 8 1 2 1 0 9i 9 x 1 0 93 5 1 0 8 8 0 。b1 2 1 0 61 3 1 0 92 1 1 0 94 0 1 0 8 2 5 0 e + 0 9 2 0 0 e - h ) 9 k 。- 1 5 0 e + 0 9 k 巅- 1 0 0 e + 0 9 蓑5 0 0 e + 0 8 0 0 0 e + 0 0 l o2 03 04 05 06 07 0 8 0 小时 图4 = 8 0 哦8 0 - b 生长曲线( 肉汤培养基) 由此可见，在营养肉汤培养基中，8 0 a 和8 0 b 生长速度区别不 大，只是8 0 b 稍微快一点。 表5 8 0 a ，8 0 - b 菌浓大小( 十六烷) 、时间( 小时) 菌名 o2 4 4 87 2 8 0 a 1 5 x 1 0 7 4 5 1 0 83 6 1 0 88 0 1 0 7 8 0 - b 3 0 x 1 0 78 7 x 1 0 72 5 1 0 85 0 x 1 0 7 5 0 0 e + 0 8 o4 0 0 e + 0 b ； 3 0 0 e + 0 8 ： 2 0 0 e + 0 8 箴 粗i 0 0 e + 0 8 0 0 0 e + 0 0 2 04 06 08 0小时 图5 8 ，8 0 一b 生长曲线( 十六烷) 7 盔 由上圈可看出8 0 b 在十六烷培养基中的生长速度明晟比8 0 a 快， 2 4 小融8 0 - 1 3 即达到对数生长期峰值。这说明在其生长的最初阶段， 8 0 - b 袭烃类物质翁莉激下缀侠便合成了育辎予其生长翡榻关因子， l 孬 这类因子对于烃类物质的“溶解”作用是明照的。8 0 a 则可能很少成 是没鸯产生这类送学，只是在搅动静条件下砖烃搁接触。 2 。3 缡飚糖聚性灏定； 精确称取8 0 - a ，8 0 b 分别在十六烷和肉汤培养基中得到的干菌 体1 0 0 m g ， 放入禽2 十六烧鹣蒸馏承中，予3 7 c ，1 7 0 r p m 吸驸 l 小时，立即离心。结果如淡5 和图6 。 粘附率以不同离心力下得到吸附到烃上的菌体干重来衡量的。 袭68 0 - a ，8 0 - 1 3 经十六烧培养的菌体对十六烷粘附憔测定结果 离心力菌名 沉淀予鬃( m g ) 粘附率( ) 2 0 0 08 0 - a2 5 8 07 4 2 8 0 b4 0 ，8 05 9 。2 4 q8 0 - a3 9 0 06 1 o 8 0 - b5 0 6 04 9 4 6 0 8 0 - a4 0 2 05 9 8 8 0 - b5 1 7 04 8 3 8 0 0 08 0 a4 0 4 05 9 6 8 0 b5 1 7 24 8 。2 8 1 0 0 0 08 0 - a4 0 5 05 9 。5 8 0 - b5 1 7 34 8 2 7 表7 8 0 - - a ，8 卜b 经肉汤培养的菌体对十六烷的粘附性 离心力( g ) 菌名离淀干重粘附率( ) 8 0 _ 一a 7 8 4 42 1 5 6 2 0 0 0 7 7 8 02 2 2 08 0 b 8 d a 9 1 7 08 3 0 4 0 0 0 9 2 4 07 6 0 8 伊b 8 0 _ 一a 9 4 5 85 4 2 6 0 0 0 9 5 6 14 3 9 8 0 一b 8 0 一a 9 5 6 04 4 0 8 0 0 0 8 0 _ b 9 5 6 24 3 8 8 0 一a 9 5 6 04 4 0 1 0 0 0 0 8 0 b 9 5 7 04 3 0 离心力( x g ) 图6 8 0 一a ，8 0 一b 经十六烷和肉汤培养的菌体对十六烷的粘附性 在十六烷上生长的细胞对于十六烷的粘附性是很强的，即使在1 0 x g 这样高的转速下也只有不到一半的菌体被沉淀下来，而8 0 a 显示出 比8 0 b 更强的与烃的亲和力，这暗示出对8 0 - a 而言，细胞直接吸附 到烃液滴上是其摄取烃类的主要手段，至于水不溶性的十六烷则是由 8 0 a 所产生的胞外生物表面活性剂乳化的。在肉汤中生长的8 0 - a ， 8 0 b 细胞对十六烷基本没有粘附性，这说明在烃中培养的8 0 一a ，8 0 - b 在烃分子的激活作用下其细胞表面会合成特殊的结构使得它们与烃之 间的亲和力增加从而导致粘附性的产生。 2 48 0 a 8 0 b 十六烷培养过程中表面张力变化 将8 0 a 和8 0 b 分别接种到十六烷培养基中，定时取样，分别测 定它们全培养液及离心去细胞后培养液的表面张力，其结果如下表： 表88 0 a ，8 0 b 表面张力变化 吐闷( 小时) 02 44 8 7 2 8 0 a 全培养液 6 2 45 5 04 9 84 9 0 无细胞液 6 2 55 5 45 0 0 4 9 0 8 0 b 全培养液 6 8 06 6 76 6 0 6 5 0 无细胞液 7 1 47 1 37 1 07 0 4 对照 7 2 o7 1 87 1 57 1 5 童 毛 、一 震 畿 旧 粥 0 1 0 2 0 3 04 0 f i 0 6 07 0 8 0 时间( 小时) 图7 8 0 一1 3 表面张力变化 他n鹋盯 献图中哥看鑫，8 0 - a 瓣培养滚和芜缅魔液的表嚣张力醚培养时闽蕊 延长明驻的降低，并鼠二者之间并没有多大的区别，这说明8 0 - a 在利用 十六烷生长过程中产生了生物表孺溪性剂：嚣8 0 。b 的培养液的表面张力 随对溺必有很小的降低，8 0 - b 的光细耱菌滚静表面张力凡警没有变纯， 这说明对于8 0 - b 而肖并没有产生生物表面活性剂，但从上j 趣的生长曲线 可以器渤，8 0 - b 在十六烷中生长拢8 0 a 生长快的多，说明8 0 b 一定有 更寄效的代谢物键避其在烃中生长，函茈傲如下实验，躜察是否有摈增 溶因子存在。 3 。e d t a 对8 0 - a 。8 0 - b 鸯长的影响 由予e d t a 可以结合对于烃擞的拟增溶活憔所必需的c 矿。故而观察 e d t a 在卡六烷彝凌汤培养基中对藩赣生长的耱剡牲嚣可剡定其是否以 拟增溶化的方式来摄取烃。 表9e d t a 对8 0 - a ，8 0 - b 生长的影响( 个m 1 ) 靶i m m2 m m3 m m4 m m5 m m 、 8 0 a 十六烷2 0 x 1 0 82 1 x 1 0 82 5 1 0 8 23 1 0 82 1 1 0 8 凌汤1 1 x 1 0 71 。5 x 1 0 91 。8 l 妒l 。6 l 铲1 。4 l 矿 8 0 b 十六烷8 0 1 0 76 7 1 0 5 0 x 1 0 77 8 x 1 0 77 4 x 1 0 7 岗汤 2 。e l 铲2 。5 l 铲2 1 1 0 92 。0 1 0 91 9 x 1 妒 图8 e d t a 对8 0 - a ，8 0 一b 生长的影响 上图为培养4 8 小时以后测定的菌浓，与其生长曲线相比较后，可 以看出，在十六烷和肉汤中生长的8 0 a 不受e d t a 的影响，而在十六 烷中生长的8 0 b 被e d t a 强烈抑制；3 m m e d t a 是其抑制生长的最适 浓度。向十六烷培养基中补加一些c a 2 + 可以消除e d t a 的抑制作用( 达 到1 8 1 0 8 个m 1 ) 。8 0 b 在肉汤中生长则不受e d t a 影响。由此说 明，e d t a 抑制8 0 - b 在十六烷中的生长并不是由于影响到了细胞的代 谢途径，而是由于e d t a 结合了c a 2 + ，从而抑制了8 0 b 通过拟增溶作 用来摄取烃。所以肯定地说拟增溶是8 0 - 3 烃摄取过程中重要的一步。 而对8 0 - a 而言，拟增溶作用在其烃摄取的过程中微乎其微。 4 8 0 - 4 ，8 0 - b 无细胞液拟增溶活性和乳化活性的测定 4 1 拟增溶活性： 拟增溶活性的测定是以“溶解”在无细胞液中的十六烷的含量 ( m g m 1 ) 来表示的。图9 中十六烷的峰面积为8 2 8 2 4 ，十二烷的峰面 积为4 6 1 9 4 8 ，由内标法可知8 0 一b 无细胞液的拟增溶活性为1 1 1 6 m g m l ， 图1 0 中十六烷的峰面积为4 2 4 1 9 ，十二烷的峰面积为2 5 3 2 9 0 ，则8 0 a 无细胞液的拟增溶活性为o 1 5 2 2 m g m l 。由此可以看出8 0 b 发酵液的 拟增溶活性远大于8 0 a ，这进一步说明对于8 0 b 而言拟增溶因子的存 ：在。 4 2 乳化活性： 取8 0 a ，8 0 b 的无细胞液1 0 m l 加入各种烷烃o 1 m l ，混匀后静 置，6 1 0 r i m 测其光吸收。结果如表9 所示： 表1 0 8 0 - a ，8 0 一b 乳化活性( o d 6 l o ) 己烷庚烷辛烷壬烷十二烷十六烷 8 0 ao 1 3 0o 1 5 0o 1 8 60 2 0 0 o 3 1 5 0 4 1 0 8 0 b0 1 3 70 1 2 “0 4 0 50 4 1 00 8 4 00 9 1 0 8 0 - b 对于烷烃的乳化活性远远大于8 0 a ，表示出8 0 b 的乳化因 子的存在，而且其乳化活性是随着碳链的增长而增大，而8 0 a 的乳化 活性是由于其产生的胞外生物表面活性剂所造成的。 5 8 0 a 产生的生物表面活性剂 5 1 产物的定性分析结果 产物经蒽酮硫酸显色后呈暗黄色，为糖脂，糖为鼠李糖。其结 果如图1 l 、图1 2 所示： 图1 1 糖脂显色 圈1 2 糖的定性 5 2 产物的定量分析 表11 标准糖脂溶液的光密度值 l 糖脂浓度 1 0 0 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 0 d 4 o 0 2 0 0 3 50 0 4 90 0 7 00 0 8 5o 1 0 5 0 1 2 0 1 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 01 0 0 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 图1 3 糖脂定量标准曲线 i ! o d 。值j 7 0 0 糖脂浓度( m g l ) 8 0 a 的发酵液稀释1 0 倍以后测得其o d 值为o 0 1 7 ， 由标准曲线可 知糖脂浓度为0 9 5 9 l 。 6 8 0 b 的拟增溶因子和乳化因子的定性及活性分析 1 5 0 0 m l 的8 0 b 发酵液经提取后得到0 5 9 拟增溶因予和0 3 9 的乳化 因子( 干重) 。其得率分别为o 3 3 9 1 和0 2 9 l 。 6 1 定性： 6 1 1 红外光谱分析： 由k b r 晶片涂膜得到的拟增溶因子和乳化因予红外光谱谱 图，如图1 4 和1 5 所示： 由标准铺图及相关文献报道，它们存在如下基团： 嗣 r r c n r ，r - - c - - o r t ，r - - n h 2 由此推测可能是蛋白质。 6 1 2 蛋白显色反应及蛋白电泳 经双缩脲显色反应二者均为紫红色，因此判定为蛋白 质，随后进行s d s p a g e 垂直板电泳其结果如下： 墅1 6 羧壤溪强予帮巍纯嚣予瓣鬣鑫邀沫缮聚 壶忿躲，羧增溶爨予秘孚l 佬羧予麓分子壁大约分裂戈 莲，4 0 0 秘2 0 , i 0 0 2 温度和c a 2 + 对拟增溶羽子活性的影响 图1 8 、1 9 、2 0 、分别为1 0 0 c 、7 0 c 、2 5 、加热5 分钟 测定羧增溶霹子活蠼的气稳色谱潮。卡六巯懿潦露积分裂为4 4 4 7 7 ； 3 7 11l ：1 5 3 9 9 6 ；十二烷的峰面积分剐为：2 5 0 6 1 4 ；2 3 2 8 0 4 ；4 6 7 6 1 0 。 表1 2 温度对拟增溶因子活性的影响 l温度 1 0 0 7 0 2 5 | 8 0 - b 拟增溶因子活性大小( m g m 1 ) 0 6 72 1 6 5 81 0 2 5 囊藏霹冕在7 0 c 瓣毅增溶爨予戆活经最大，魄室瀑辩罐熬一薅 多，说明这是一种较耐热的因子，同时也说明了为什么8 0 菌株在 高温条