（无机化学专业论文）细胞色素b5his39和表面酸性残基对蛋白质结构、性质和功能的影响.pdf

摘要 细胞色素b ；是血红素类蛋白质的代表性分子之一，它是生命体中一种重 要的电子传递蛋白。而含有相同辅基原血红素的其他一些血红素类蛋白 质，如肌红蛋白、细胞色素p 4 5 0 等的功能却是运载氧气和催化各种各样的生化 反应。显而易见，血红素类蛋白质分子活性中心结构和性质的差异导致了它们 不同的反应功能，非常重要的原因在于不同的蛋白质分子中多肽链和血红素辅 基的相互作用形式不同。这其中最为关键的结构要素是不同的血红素轴向配位 环境，包括轴向配体类型、血红素铁离子的配位数以及血红素辅基结合疏水腔 的结构等。其它的影响因素还包括蛋白质外周并不与血红素直接接触的亲水性 氨基酸残基及其在蛋白质多肽链中的分布。本论文即是以牛肝微粒体细胞色素 b ，的亲水结构域为目标，应用蛋白质工程方法和一系列化学、生物学表征手段， 研究血红素轴向配体h i s 3 9 及表面酸性氨基酸残基g l u 4 4 、g l u 4 8 、g l u 5 6 和a s p 6 0 等对蛋白质结构、性质和功能的影响。 f 细胞色素b ；中血红素铁离子具有双组氨酸( h i s 3 9 ，h i s 6 3 ) 六配位结构， 一、j 这种多肽链和血红素辅基的相互作用形式是其作为电子传递载体的必要结构。 也正是这一结构特征使其缺乏底物结合位点，是该分子在功能上区别于其他具 有催化反应活性的血红素蛋白的最关键因素。为了实现细胞色素b ；的人工设计 和分子改造，通过蛋白质工程方法打破这种均衡的六配位结构，创造出可能的 底物结合空穴，将可望构建出具有催化活性的新金属蛋白分子。同时，通过这 种分子改造也将揭示相应的关键氨基酸残基对蛋白质结构和性质的重要影响。 研究表明，细胞色素b 。血红素结合区域中h i s 3 9 一侧的蛋白肽链相对于 h i s 6 3 一侧而言，与血红素结合较为松散，更加适合被改造成为底物结合位点。 因此，我们选择h i s 3 9 作为轴向残基基因突变的靶位点。为了克服在细胞色素 b 。轴向配体突变工作中出现的突变体蛋白稳定性大幅度降低而给后继研究造成 的困难，筛选具有尽可能高稳定性的目标突变体，同时也为了构建可选择性尽 量大的轴向突变体基因库，提高实验效率，我们采用了“基因随机突变”的方 法。通过在细胞色素b ，第3 9 位氨基酸残基密码子的随机突变，我们成功地构 筑了十六条突变体基因，每一种突变体基因均在h i s 3 9 位引入种天然氨基酸 置换。为了克服突变体蛋白稳定性降低引起的蛋白表达的困难，我们建立了新 的蛋白表达体系( p u c l 9 j m 8 3 一p e t l l c b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ) ，小试结果表明尽管 几乎所有的突变体基因都得到高效表达，但是没有发现能够在发酵过程中在宿 主菌体内结合血红素的突变体全蛋白。这说明细胞色素6 ，轴向配位突变使得蛋 白稳定性大幅度降低的困难在我们的体系中也未能避免。 我们从构建的细胞色素b ，h i s 3 9 位轴向突变体基因库中选择了编码 h i s 3 9 c y s ，h i s 3 9 s e r 和h i s 3 9 g l n 三种含有亲水性氨基酸残基置换的突变体蛋白 质的基因进行蛋白质表达，通过纯化得到的脱辅基蛋白可以与血红索在体外重 组为突变体全蛋白。这些置换残基的体积大都小于野生型蛋白中的组氨酸，将 可能形成底物结合空穴，残基的亲水性也将提高蛋白质疏水内核对极性底物的 亲和性，这些都将有利于突变体蛋白质实现催化反应功能。选择它们的原因还 在于这三种突变体的3 9 位残基分别具有以s ( c y s ) 、o ( s e r ) 或n ( g i n ) 原 子与血红素铁离子配位的潜在可能性，这种可能的配位将起到稳定全蛋白质的 作用，当然外源配体或反应底物也可以使其被竞争而脱离。我们在细胞色素b ， 分子疏水内核的关键轴向配体位置引入了非保守的亲水性氨基酸残基置换，这 在该蛋白质分子轴向突变研究工作中尚属首次。 突变体蛋白质的电喷雾质谱结果表明实验测得的突变体蛋白质的分子量 与理论计算分子量相当吻合，从而证实了我们成功地实现了基因突变并获得了 高纯度的目标突变体蛋白质。热变性实验的结果证明了所有突变体蛋白的血红 素辅基结合稳定性相对于野生型均大为降低。外源配体一眯唑可以起到稳定 h i s 3 9 s e r 和h i s 3 9 g l n 的作用，而在没有外源配体的情况下，这两种突变体的 全蛋白均不能在室温下稳定存在。从光谱电化学实验得到的突变体蛋白氧化还 原电位较之野生型蛋白质都有大幅度的负移，这也预示了突变体的功能变化。 三种突变体蛋白质的电子吸收光谱与野生型蛋白的光谱结果相比都有很明显的 改变，这些性质的变化反映了蛋白质轴向配位环境的变动：氧化态的h i s 3 9 s e r 和h i s 3 9 g l n 突变体蛋白质拥有h i s 6 3 - - h e m e f e ( i i i 卜_ h 2 0 形式的六配位环境， 血红素铁离子处于高自旋状态，而还原态蛋白质血红素亚铁离子主要处于 h i s 6 3 - - 1 a e m e f e ( n ) - - - s e r 3 9 ( o rg l n 3 9 ) 六配位环境和低自旋状态：氧化态的 h i s 3 9 c y s 突变体蛋白质则拥有h i s 6 3 - - h e m e f e ( i i i 卜_ c y s 3 9 形式的六配位环境， 血红素铁离子处于低自旋状态，而还原态时h i s 3 9 c y s 突变体蛋白质的血红素亚 铁离子主要处于h i s 6 3 - - h e m e f e ( i i ) 的五配位环境和高自旋状态。结合其它的相 关实验结论，我们证实了在氧化态时，h i s 3 9 c y s 的3 9 位半胱氨酸和血红素的 铁离子存在配位作用，这是细胞色素b ，轴向突变研究工作中首次被发现和报道 的氧化态突变体蛋白中出现的轴向替换氨基酸残基和血红素铁离子存在较稳定 的配位作用。作为此项研究的首要目的，我们对突变体蛋白质的类似于过氧化 物酶的催化反应功能进行了研究，结果显示h i s 3 9 s e r 和h i s 3 9 g l n 突变体蛋白 质的确具有非常高的过氧化物酶催化反应活性，这一结果证明了我们突变体蛋 白质的设计策略是正确的。 在细胞色素b ，血红素结合疏水口袋的外周分布有许多酸性氨基酸残基。 研究表明，虽然这些荷负电亲水性残基并不与血红素直接接触，却影响到蛋白 质分子中多肽链和血红素辅基的相互作用进而影响蛋白质的稳定性。同时，这 些酸性残基对于细胞色素b ；的电子传递功能也十分重要。进一步的研究将加深 对于这些表面酸性氨基酸残基对蛋白质结构、性质和功能影响的认识。为此， 在前人研究工作的基础上，我们选择将g l u 4 8 和a s p 6 0 定点突变为非极性的 a l a ，从而构建了一系列细胞色素b ，的多位点表面酸性氨基酸残基突变体基因， 所有这些突变基因都可以在宿主菌体内表达成为结合血红索的全蛋白。通过与 野生型蛋白质类似的表达和纯化过程，我们得到了六种高纯度的表面酸性残基 突变体蛋白质，它们是：e 4 4 4 8 a 、e 4 8 5 6 a 、e 4 4 4 8 5 6 a 、e 4 4 5 6 a d 6 0 a 、 e 4 8 5 6 a d 6 0 a 和e 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a 。 电喷雾质谱的结果显示这些突变体蛋自的实验测量分子量与理论值相当 吻合，从而证实了基因突变和蛋白纯化的正确性。六种突变体蛋白质的电子吸 收光谱与野生型蛋白的光谱结果相比没有明显的改变，这一结果表明这些表面 酸性氨基酸残基的改变并没有对蛋白质的整体结构和血红素配位环境产生明显 的影响，这个结论得到了蛋白质单晶结构分析和核磁共振研究的证实。从光谱 电化学实验得到的这些突变体蛋白氧化还原电位较之野生型蛋白质也都没有大 的变化，这也证实了这些突变没有引起蛋白质中血红素结合疏水腔结构的变动。 目前该项研究已经取得了一系列重要的成果，进一步揭示和证明了表面酸性残 基对于细胞色素6 ，血红素辅基结合稳定性及其电子传递功能影响的普遍规律。厂 | a b s t r a c t c y t o c l l r o m eb 5 i sat y p i c a le l e c t r o n t r a n s f e rh e m ep r o t e i n s o m eo t h e rh e m e p r o t e i n s ，s u c ha sm y o g l o b i na n dc y t o c l l r o m ep 4 5 0 ，c o n t a i n i n gt h es a m ep r o s t h e t i c g r o u p ( p r o t o h e m ei x ) a r eo x y g e n b i n d i n go rc a t a l y t i cm e t a l l o p r o t e i n so nt h eo t h e r h a n d o b v i o u s l y , d i f f e r e n ts t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e so f t h ea c t i v ec e n t e ro ft h e s eh e m e p r o t e i n sl e a dt od i f f e r e n tr e a c t i v i t i e sa n d n a t u r a lf u n c t i o n s ，a n dt h ep r i m a r yd i f f e r e n c e i st h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ep r o t e i np e p t i d ec h a i na n dt h eh e m e g r o u p a m o n gm a n y s t r u c t u r a lv a r i a b l e s p r o v i d e db y t h e p e p t i d ec h a i n ，o n e o ft h em o s t s i g n i f i c a n t s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s g o v e r n i n g h e m e p r o t e i n f i m c t i o n a l p r o p e r t i e s i st h e c o o r d i n a t i o ne n v i r o n m e n to ft h eh e m ei r o n ，i n c l u d i n g t y p eo fa x i a ll i g a n d s ，t h e c o o r d i n a t i o nn u m b e ro fh e m ei r o na n dt h ec o o r d i n a t i o n s p h e r e o t h e r i n f l u e n t i a l s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c sa l s oi n c l u d et h e h y d r o p h i l i ca m i n oa c i d r e s i d u e so nt h e s u r n c eo f p r o t e i nm o l e c u l ea n dt h e i re s p e c i a ll o c a t i o n i nt h i st h e s i s ，o u rs t u d i e sw e r e f o c u s e do nt h es o l u b l ef r a g m e n t so fb o v i n el i v e rm i c r o s o m a lc y t o c l l r o m e b j b yu s i n g t h ec o m b i n a t i o no fp r o t e i n e n g i n e e r i n gw i t has e r i e s o fc h e m i c a la n db i o l o g i c a l t e c h n i q u e s ，w eh a v es t u d i e da n dd i s c u s s e dt h ei m p o r t a n c eo ft h ea x i a ll i g a n d h i s 3 9 a n ds o m es u r n c ea c i d i ca m i n oa c i dr e s i d u e so fm i c r o s o m a lc y t o c h r o m eb jo nt h e p r o t e i n ss t r u c t u r e ，p r o p e r t i e s ，a n df u n c t i o n s t h ea l m o s ti n c a p a b i l i t yi nc a t a l y t i ca c t i v i t i e so f w i l d t y p e ( w t ) c y t o c h r o m eb ji s c o n s i d e r dd u et oi t ss t r o n gb i s h i s t i d i n e ( h i s 3 9 ，h i s 6 3 ) a x i a l l i g a t i o no f h e m ei r o nt h a t i se s s e n t i a lt ot h ec l a s s i ce l e c t r o nt r a n s f e rh e m e p r o t e i n c u t t i n g o f f o rw e a k e n i n go n e o ft h et w on a t u r a ll i g a n d sa n ds om a k i n ga no p e nh e m e b i n d i n gc a v i t ym i g h tb et h e c r u c i a l s t e pi nt h ef e a s i b l es t r a t e g yo fc a t a l y t i cc y t o c l l r o m eb jc o n s t r u c t i o n a tt h e s a m et i m e ，s u c h p r o t e i n m o l e c u l aa l t e r a t i o n sw o u l db e u s e f u lt od i s c o v e rt h e i m p o r t a n ti n f l u e n c eo f h e m e a x i a ll i g a n d so nt h ep r o t e i n ss t r u c t u r ea n d p r o p e r t i e s w ec h o s eh i s 3 9a st h et a r g e ts i t et ob e r e p l a c e db e c a u s et h ei n t e r a c t i o no fh i s 3 9 l o o pw i t h t h eh e m e g r o u ps e e m s t ob er e l a t i v e l ym o r ef l e x i b l et h a nt h a to f t h eh i s 6 3 l o o p t o s c r e e no u ts o m eh e i n ea x i a lr e s i d u em u t a n t sw i t hh i g h e rh e m e b i n d i n g s t a b i l i t y , a n dt oc o n s t r u c ta l la x i a lr e s i d u em u t a n tl i b r a r ym a k i n g ag o o db a c k g r o u n d f o rt h ef u r t h e rw o r k s ，w ep e r f o r m e das y s t e m a t i cr a n d o mm u t a g e n e s i sa th i s 3 9o f c y t o c h r o m eb ，s i x t e e nd e s i g n e dm u t a t e dg e n e sh a v eb e e nc o n s t r u c t e d a l lo f t h e m c a nb ee x p r e s s e de f f i c i e n t l yi ne s c h e r i c h i ac o l ib u tt h e np r o d u c eo n l ya p o f o r m p r o t e i n s t h r e ev a r i a n t so fc y t o c h r o m eb j ，t h eh i s 3 9 s e r , h i s 3 9 g 1 na n dh i s 3 9 c y sm u t a n t s h a v eb e e ns e l e c t e da n dp u r i f i e di nt h e i ra p of o r m sf o l l o w e db yr e c o n s t i t u t i o nw i t h e x o g e n o u sh e m e t oo b t a i nh o l o p r o t e i n s w es e l e c t e ds m a l l v o l u m eh y d r o p h i l i ca m i n o a c i dr e s i d u es u b s t i t u t i o n si no r d e rt oi m p r o v eh e m e a f f i n i t yt os u b s t r a t e i na d d i t i o n ， t h e s es u b s t i t u t i o n a lr e s i d u e sh o l dt h ep o t e n t i a l i t yo fb e i n gc o o r d i n a t e dt ot h eh e m e i r o nu s i n ge i t h e rt h eo x y g e n ( s e r 3 9 ) ，n i t r o g e n ( g l n 3 9 ) o rs u l f u r ( c y s 3 9 ) a t o m s ，a n d s u c hc o o r d i n a t i o ni n t e r a c t i o n sw o u l d c e r t a i n l ys t a b i l i z et h er e s u l t a n th o l o p r o t e i n s i ti s n o t i c e a b l et h a ti nt h i ss t u d y , w es u b s t i t u t e dt h ek e yh e m ea x i a ll i g a n do f c y t o c h r o m e b jb ys o m eh y d r o p h i l i cr e s i d u e sf o rt h ef i r s tt i m ei nt h er e s e a r c ho f t h i sh e m ep r o t e i n a l lt h e p u r i f i e dp r o t e i n s w e r ef i r s tc o n f i r m e d b y t h e e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o s c o p y ( e s m s ) f o r t h ec o r r e c t n e s so f g e n e c o n s t r u c t i o na n d p r o t e i n m a n i p u l a t i o n s t h ep r o t e i nt h e r m a ld e n a t u r a t i o 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，a n dt h i si n d i c a t e st h ec h a n g eo ft h er e a c t i v i t yo ft h em u t a n t p r o t e i n s t h ee l e c t r o n i ca b s o r p t i o ns p e c t r ao ft h em u t a n t p r o t e i n sa r eq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h a t o fw tc y t o c h r o m e b j ，a n dt h i s i n d i c a t e s t h e yh a v e d i s t i n c th e m ec o o r d i n a t i o n e n v i r o n m e n t s ：t h ef e r r i ch i s 3 9 s e ra n dh i s 3 9 g l nm u t a n t sh a v et h e h i s 6 3 _ h e m e 。 f e ( i i i 卜h 2 0h e x a c o o r d i n a t e dh i g h - s p i nh e m e ，a n dt h ef e r r o u sf o r mo ft h e s et w o m u t a n t sh a v et h eh i s 6 3 - - h e m e f e ( i i ) - - - s e t 3 9 ( o rg l n 3 9 ) a x i a lh e x a - l i g a t i o nf o rt h e l o w s p i nh e i n e ；f o r t h eh i s 3 9 c y sm u t a n t ，o rt h eo t h e rh a n d , i t so x i d i z e df o r mh a st h e h i s 6 3 - - h e m e f e ( i l i ) - 4 e y s 3 9h e x a c o o r d i n a t e dh i g h s p i nf e r r i ch e m e ，a n dt h ef e r r o u s h e i n ei nt h er e d u c e dh i s 3 9 c y sm u t a n ti sc o o r d i n a t e do n l yb yt h ep r o x i m a lh i s 6 3w i t h ah i g h s p i ns t a t e ac o o r d i n a t i o nl i g a t i o no ft h ef e r r i ch e m ei r o nb ya x i a lr e s i d u e h i s t i d i n ea n dt h es u b s t i t u t i o n a la x i a l ( c y s t e i n e ) r e s i d u ew a sf o u n df o rt h ef i r s tt i m ei n c y t o c h r o m eb jh i s 3 9 c y sm u t a n t a s t h em o s ti m p o r t a n t e x p e r i m e n t a lp u r p o s e ， p e r o x i d a s e l i k e a c t i v i t i e so fh i s 3 9m u t a n t so fc y t o c h r o m eb 5w e r ee x a m i n e d a n d d r a m a t i c a l l yh i g hp e r o x i d a s e l i k ec a t a l y t i cr e a c t i v i t yw a si n d e e df o u n di n t h e h i s 3 9 s e ra n dh i s 3 9 g l nm u t a n t s t h i sc o n f i r m st h a to u rc a t a l y t i c p r o t e i nd e s i g n s t r a t e g yo fc y t o c h r o m eb jd o s e w o r k t h e r ea r es o m ea c i d i ca m 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mc o u l db e e x p r e s s e d i nt h eh o l of o r m d t w i n gh o s t c e l l f e r m e n t a t i o n f i n a l l y , w e o b t m n e ds i x m u t a n t s ，t h e ya r e ：e 4 4 4 8 a ，e 4 8 5 6 a ， e 4 4 4 8 5 6 a ，e 4 4 5 6 a d 6 0 a ，e 4 8 5 6 a d 6 0 aa n de 4 4 4 8 5 6 a d 6 0 a a l it h ep u r i f i e dp r o t e i n sw e r ea l s o f i r s tc o n f i r m e db yt h e e l e c t r o s p r a ym a s s s p e c t r o s c o p y ( e s - m s ) f o r t h ec o r r e c t n e s so f g e n em u t a g e n e s i s a n d p r o t e i n m a n i p u l a t i o n s t h ee l e c t r o n i ca b s o r p t i o ns p e c t r ao fa l lt h em u t a n tp r o t e i n sa r es i m i l a r w i t ht h a to fw t c y t o c h r o m eb ，t h i si n d i c a t et h a tt h er e p l a c e m e n t so fa c i d i ca m i n o a c i dr e s i d u e sd on o ta l t e rt h eo v e r a l ls t r u c t u r ea n dt h eh e m e c o o r d i n a t i o ne n v i r o n m e n t o f t h e s em u t a n t si nc o m p a r i s o nw i t hw t c y t o c h r o m eb ，t h i si sa l s oc o n f i r m e db yt h e p r o t e i n3 d 。s t r u c t u r es t u d i e sb yx - r a ya n dn m r e x p e r i m e n t s t h er e d o xp o t e n t i a l so f v i t h e s em u t a n t sa l s os h o wn o s i g n i f i c a n t l ys h i ni nc o m p a r i s o n 谢mw tc y t o c h r o m eb d a n dt h i ss t i l li n d i c a t en oo b v i o u sa l t e r a t i o no c c u r e di nt h eh e m ep o c k e ti n 血e s e m u l t i p l e s i t em u t a n tp r o t e i n s s e v e r a li m p o r t a n tr e s u l t sa l r e a d yh a v eb e e ng e n e r a t e d f r o mt h es t u d i e so ft h e s em u t a n tc y t o c h r o m e b jp r o t e i n s s o m er u l e so ft h ei n f l u e n c e o f t h e s es u r f a c ea c i d i cr e s i d u e so nt h ep r o t e i n ss t a b i l i t ya n d e l e c t r o n t r a n s f e rf i m c t i o n w e r ed i s c o v e r e da n d o r p r o v e d i 综述与引言 一、血红素类蛋白质简介 1 血红素类蛋白质的分类和生理功能 蛋白质是所有生命体及其生命活动的主要物质基础。血红素蛋白质( h e i n e d r o t e i n ，h e m o p r o t e i n ) 是一大类含有血红素( h e m e ) 辅基的金属蛋白质 ( m e t a l l o p r o t e i n ) ，这些蛋白质在生命体中发挥着重要的作用。根据血红素类蛋 白质天然生理功能的不同，又可以大致地分为四类，不同类别的血红素蛋白质 的代表性分子及其生理功能列于表1 中。 t a b l e1 s u b c a t e g o r i e so f h e m ep r o t e i n s a ) c a r b o nm o n o x i d e s e n s i n gt r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o ro f c o o x i d a t i o n ( i n r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m ) 虽然血红素类蛋白质具有迥然相异的生物化学反应活性和功能，它们却拥 有几乎相同的血红素辅基，和类似的由蛋白质多肽链包裹血红素的蛋白质分子 组成方式。多种多样而且至关重要的天然生化功能以及这些蛋白质所蕴涵的精 妙的蛋白质分子结构、性质、反应活性和功能的关系使得血红素类蛋白质成为 化学生物学和蛋白质化学研究领域的热点。 2 血红素辅基的组成和结构 血红素是( 亚) 铁离子和原卟啉( p r o t o p o r p h y r i n ) 形成的配位化合物的总称 ( h u h e ey 1 9 8 3 ) 。根据卟啉环上取代基的不同，天然的血红素可以分为三种主要 类型，即血红素a 、血红素b 和血红素c 。它们的结构如图l 所示。 h e m eah e m ebh e m ec x = c h o h ( c h 2 ) 2 c h c h 3 ( c h 2 ) 3 c h c h 3 ( c h 2 ) 3 c h ( c h 3 ) 2 y = s - c h 2 c h ( n h g c o o h f i g 1 s t r u c t u r eo f h e i n ea ，h e m eb ，a n dh e m ec 血红素a 是细胞色素c 氧化酶( 即细胞色素a + a 3 ) 的辅基。血红素b 是原卟 啉t x ( p r o t o p o r p h y r i ni x ) 和铁离子的配合物，是最为常见的血红素，它是血红 蛋白、肌红蛋白、细胞色素b ，、细胞色素p 4 5 0 和过氧化物酶等血红素类蛋白质 共同的辅基。血红素b 和血红素a 的区别仅在于卟琳环上第2 和第8 位取代基 的不同。血红素c 是细胞色素c 的辅基，其卟啉环乙烯基上加成的半胱氨酸来 自蛋白质的多肽链。 3 血红素类蛋白质的基本结构和结构功能关系研究 绝大多数血红素类蛋白质都是由一条多肽链结合个血红素辅基组成。血 红素分子中卟啉环的四个氮原子分别占据了中心铁离子的四个配位位置，构成 了基本是平面结构的血红素分子。蛋白质多肽链中的一个或两个氨基酸残基和 血红素铁离子形成配位键，这样的配位键被称为血红素辅基的“轴向”( a x i a l ) 配位键，而相应的氨基酸残基就被称为“轴向配体”( a x i a ll i g a n d ) 。如果血红 素主要处于五配位的状态，那么较为牢固而且距离铁离子也更近的氨基酸残基 第五配体被称为“近端配体”( p r o x i m a ll i g a n d ) ，在该配体对面的具有配位潜力 的氨基酸残基则称为“远端配体”( d i s t a ll i g a n d ) 。血红索蛋白质共同的基本结 构可以如图2 简化表示。 f i g 2 d i a g r a m so fh e m eba n dh e m ep r o t e i n 血红素蛋白质多肽链中包裹血红素的疏水氨基酸残基形成蛋白质的辅基结 合疏水腔，而血红素以及轴向配体就深埋于该疏水腔内部。蛋白质多肽链和血 红素辅基的结合是通过配位键作用、疏水相互作用、范德华力以及氢键作用等 多种因素共同作用的结果( s a b u r oe la l ，1 9 9 7 ) 。在细胞色素c 分子中，除了上述 作用外，蛋白质多肽链和血红素辅基还通过半胱氨酸和卟啉环取代基形成的共 价键相互连接。 血红素辅基是血红素蛋白质生物化学反应的活性位点和功能中心，而蛋白 质正是通过不同的多肽链结构来调制相对简单的血红素辅基的反应活性和生理 功能( o r t i zd em o n t e l l a n o ，1 9 8 7 ) ，而其中最为关键的结构要素是辅基结合疏水腔 内血红索辅基的配位环境( c o o r d i n a t i o ne n v i r o n m e n t ) ，包括铁离子的配位数 ( c o o r d i n a t i o nn u m b e r ) 、不同的轴向配体类型以及疏水腔特别是远端配体空穴的 结构( r o d r i g u e za n dr i v e r a ，1 9 9 8 ；o z a k ie la 1 ，2 0 0 0 ) 。可以看出轴向配体是维持 蛋白质高级结构和决定蛋白质功能的至关重要的氨基酸残基( r a p h a e la n dg r a v 1 9 9 1 ；l l c i y de t a l ，1 9 9 5 ) 。 血红素蛋白质的血红素辅基配位环境特别是轴向配体对于蛋白质结构、性 4 质、反应活性和功能的影响一直是该类蛋白质研究领域最重要的内容之一，应 用蛋白质工程技术对关键的氨基酸残基进行突变为研究工作提供了最为直接有 效的方法。大量的研究工作采用了轴向配体置换的方法对血红素类蛋白质轴向 配体的重要影响以及分子的结构功能关系进行了探讨，研究地最多的是细 胞色素c ( r a p h a e la n dg r a y , 1 9 8 9 ；r a p h a e la n dg r a y , 1 9 9 1 ；b r e na n dg r a y ，1 9 9 3 ； h a m p s e y e ta 1 ，1 9 8 6 ；w a l l a c ea n dc l a r k l e w i s ，1 9 9 2 ；s o r r e l la n dm a r t i n ，1 9 8 9 ) 和 肌红蛋白( l l o y de t a l ，1 9 9 5 ；a d a c h ie ta l ，1 9 9 1 ；a d a c h ie ta l ，1 9 9 3 ；d e p i l l i se ta l , ， 1 9 9 4 ；b a r r i c k ，1 9 9 4 ；e g e b e r ge ta 1 ，1 9 9 0 ；q i ne ta 1 ，1