（植物学专业论文）兴安落叶松转录因子cbf1和actin基因的克隆及特性分析.pdf

d d 厄rm o n g o l i au n r 、厂e r s i t y h u h h o t , 0 10 0 21 ，e r c h i n a 6 几烈e ，2 0 11 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经 注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大学及其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：l 艇 指导教师签名： 日期：塑! ：厶! ! 竺 日 期：，塑l ! ! 芝：也 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：二龃 指导教师签名：学位论文作者签名： 冷垒立 指导教师签名： e t期：鎏! ：鱼生日 期： 兴安落叶松转录因子c b f l 和a c t i n 基因 的克隆及特性分析 摘要 低温是诸多非生物因素中对植物危害最为严重的胁迫因子之一，它极大地 限制了植物正常代谢和分布地域。植物自身拥有一套抵低温的机制，例如改变 生物膜的性质，渗透调节等，而这些代谢活动的改变都离不开抗寒基因的表达 调控。c b f ( c r t - b i n d i n gf a c t o r ) 转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用 因子，它们可以调控多个抗寒基因启动子上的顺式作用元件，诱导启动子中含 有这一调控元件的多个冷诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种抗寒机制。 因此，c b f 基因的表达及调控机理的研究对于阐明植物的抗寒机理具有重要意 义。 在本研究中，我们克隆了兴安落叶松的c b f l 同源基因序列，命名为l g c b f l ， 并调查了该基因的表达特性。兴安落叶松是我国东北、内蒙古林区以及华北、 西南的高山针叶林的主要森林组成树种，在针叶树种中是最耐寒的，所以对 l g c b f l 基因的研究可为解明兴安落叶松的抗寒机理、开发其抗寒基因资源提供 依据。另外，由于在检测l g c b f l 表达特性的实验中需要一个稳定表达的内参 基因，我们分离了兴安落叶松的肌动蛋白基因( l g a c t ) ，并对其基因结构和系统 发育关系进行了分析。l g a c t 基因的分离对于以此基因为内参，研究兴安落叶松 其他基因的表达和调控奠定了基础。 该研究的主要结果如下： 1 采用简并p c r 的方法克隆了兴安落叶松低温诱导转录因子l g c b f l 基因 序列，利用b l a s t 比对分析发现，该l g c b f l 基因序列与其它物种c b f l 基因 间具有很高的同源性。 2 采用半定量p c r 的方法对l g c b f i 基因在冷胁迫下( 4 ) 的m r n a 表 达量调查结果显示：在持续的冷胁迫下，l g c b f l 被快速诱导。在低温处理6h 后期表达量达到峰值，但在低温胁迫解除后( 转移到2 2 ) 3 0m i l l ，其m r n a 水平明显下降，这显示出c b f l 基因在植物对抗冷胁迫的途径中的快速的调控机 制。 3 采用简并一p c r 和r a c e 技术克隆了兴安落叶松的肌动蛋白基 g a c o 。 该基因c d n a 全长1 6 6 2b p ，编码3 7 7 个氨基酸；基因组d n a 长度约为2 5 6 4b p ， 包含4 个内含子，5 个外显子。所克隆的l g a c tc d n a 序列与g e n b a n k 中注册的 其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在7 7 以上，氨基酸序列的相似性高 达9 3 以上。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统树显示，兴安落叶松肌 动蛋白与挪威云杉肌动蛋白之间的亲缘关系较为密切，在进化中分化时间最为 接近。 关键词：兴安落叶松( l a r i x g m e l i n i i ) ，a c t i n ，c b f l ，基因克隆，表达特性 c l o n 可ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft r a n s c r ，t i o n f a c t o rc 差 f ja n d 彳c 删g e n e a b s t r a c t l o wt e m p e r a t u r ei so n eo ft h ek e yf a c t o r st h a tg r e a t l yr e s t r i c t sg r o w t ha n d d i s t r i b u t i o no f p l a n t s p l a n th a ss p e c i f i cm e c h a n i s m t or e s i s tl o w - t e m p e r a t u r es t r e s s ， s u c ha sr e g u l a t i n gt h ec h a r a c t e r i s t i co fb i o m e m b r a n e ，o s m o r e g u l a t i o n , a n ds oo n c o l d r e g u l a t e d ( c o r ) g e n e sp l a ya l li m p o r t a n tr o l ef o rr e g u l a t i n gm e t a b o l i ca c t i v i t y u n d e rc o l d - s t r e s sc o n d i t i o n s t r a n s c r i p t i o nf a c t o rc b fi sac l a s so ft r a n s a c t i n gf a c t o r , w h oi ss p e c i f i c a l l yi n d u c e db yl o wt e m p e r a t u r e ，a n d c a nc o n t r o le x p r e s s i o no f c o rg e n e sw h o s ep r o m o t e rc o n t a i nc i s - a c t i n ge l e m e n t s ，t oa c t i v a t eav a r i e t yo f c o l d r e s i s t a n tm e c h a n i s m si np l a n t s t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ho ne x p r e s s i o na n d r e g u l a t i o no fc b fg e n e si ss i g n i f i c a n tf o ru n d e r s t a n d i n gc o l d - r e s i s t a n tm e c h a n i s mi n p l a n t s i nt h i ss t u d y , ac b f l o r t h o l o gw a sc l o n e df r o ml a r i xg m e l i n i i ，r e f e r r e dt oa s l g c b f l ，a n di t se x p r e s s i o np a t t e r n w a si n v e s t i g a t e d l g m e l i n i ii st h em a j o r c o n i f e r o u st r e es p e c i e si nt h ep l a n t a t i o nf o r e s t so fn o r t h e a s tc h i n a ，w h i c hh a ss t r o n g r e s i s t a n c et oc o l d s t r e s s t h e r e f o r et h er e s e a r c ho nl g c b f li sv e r yi m p o r t a n tf o r u n d e r s t a n d i n g t h ec o l d r e s i s t a n tm e c h a n i s mi n 三g m e l i n i i t oi n v e s t i g a t et h e e x p r e s s i o np a t t e r no fl g c b f l ，aa c t i ng e n ew a sa l s oi s o l a t e df r o m 三g m e l i n i i ， r e f e r r e dt oa sl g a c t ，a n dt h eg e n es t r u c t u r ea n dp h y l o g e n e t i ce v o l u t i o nw a sa n a l y z e d a c t i ng e n eh a sas t a b l et r a n s c r i p t i o ne v e nu n d e rs t r e s sc o n d i t i o n ，t h e r e f o r e ，i tc a nb e u s e da sac o n t r o lt oi n v e s t i g a t ee x p r e s s i o nl e v e l so ff u n c t i o n a lg e n e si nl g m e l i n i i t h em a i nr e s u l ma rea sf o l l o w s ： 1 a no r t h o l o go fc b f lt r a n s c r i p t i o nf a c t o rw a si s o l a t e df r o ml g m e l i n i i b y d e g e n e r a t e - p c r t h er e s u l to fb l a s ts e a r c hs h o w e dt h a tt h el g c b f lg e n eh a s h i g hs e q u e n c es i m i l a r i t yt oc b f lg e n e so fo t h e rp l a n ts p e c i e s 2 s e m i q u a n t i t a t i v ep c r w a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f l g c b f l g e n eu n d e rl o w t e m p e r a t u r es t r e s s t h et r a n s c r i p t i o no fl g c b f lw a sa c t i v a t e d a f t e r t r e a t m e n t ( 4 ) f o r 10 m i n ，a n d t h em a x i m u ml e v e lo ft h e l g - c b f l e x p r e s s i o nw a si n d u c e da f t e r6h o u r s w h e nt h ec o l d - t r e a t e ds e e d l i n g s w e r et r a n s f e r r e dt o2 2 c ，t h ee x p r e s s i o no fl g c b f ls i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d , i n d i c a t i n g t h a tt h e t r a n s c r i p t i o n o fl g c b f l g e n e i s r a p i d l yr e g u l a t e db y c o l d s t r e s s 3 f u l l l e n g t hs e q u e n c e so fl g m e l i n i ia c t i ng e n e ，r e f e r r e dt oa sl g a c t , w e r ei s o l a t e d b yu s i n gd e g e n e r a t e p c ra n dr a c et e c h n i q u e t h ec l o n e dl g a c te d n aw a s 16 6 2b pi nl e n g t h , e n c o d i n gap r o t e i no f3 7 7a m i n oa c i d s ，w h i c hs h o w sm o r et h a n o f7 7 n u c l e o t i d es e q u e n c es i m i l a r i t ya n dm o r et h a no f9 3 a m i n oa c i ds e q u e n c e s i m i l a r i t yt oo t h e rp l a n ta c f i ng e n e s g e n o m i cd n a o ft h el g a c tc o n t a i n s2 5 6 4b p ， i n c l u d i n g4 i n t r o n sa n d5e x o n s t h ep h y l o g e n e t i ct r e e g e n e r a t e df i o mt h e d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so fp l a n ta c t i n sr e v e a l e dt h a tt h el g m e l i n i ia n d p i c e aa b i e sa c t i n si si nas i s t e rg r o u pt ot h ec l a d eo f a n g i o s p e r m s ，c o r r e s p o n d i n g t op l a n te v o l u t i o n a r yh i s t o r y k e y w o r d s ：l a r i xg m e l i n i i ，a c t i n ，c b f l ，g e n ec l o n i n g ，e x p r e s s i o np a t t e r n 缩略词 2 5 4 2l g a c t 基因末端的克隆1 2 2 5 5l g a c t 全长的扩增1 5 2 5 6a x y g e n 凝胶回收试剂盒回收目的片段1 6 2 5 7 目的d n a 片段与载体连接1 7 2 5 8t b 法制备感受态细胞1 7 2 5 9 转化l8 2 5 1 0 重组子的筛选与鉴定1 8 3 1 2l g a c t 序列及基因结构分析2 7 3 2 兴安落叶松l g c b f l 基因的克隆及表达分析。2 8 3 2 1 兴安落叶松l g c b f l 基因的克隆2 9 3 2 2 l g c b f l 的半定量一p c r 表达分析3 3 4 讨论3 5 4 1 简并p c r 技术要点3 5 4 2r a c e 技术要点3 5 4 3c b f l 基因的表达3 6 4 4l g c b f l 两端序列的克隆3 6 5 结论3 8 参考文献3 9 致谢4 6 攻读学位期间发表的学术论文目录4 7 内蒙古大学硕士论文 1 引言 植物生存于自然环境，其生长发育受到自然环境中诸多因素的影响。温度是植物正 常生长、生存的首要条件，温度同时也是限制植物形态和分布的重要因素之一【l 】。高温 和低温都会对植物产生伤害，其中低温对植物的伤害可分为冷害( o 以上低温) 和冻 害( o 以下低温) 两类。即使温度降到o 以下，植物体内发生结冰，因而受伤甚至死 亡，不同纬度分布的植物在冰冻温度生存的能力差异也很大，热带地区的植物根本没有 能力抵抗冰冻，温带地区的草本植物依据不同物种则能在3 0 c 5 c 的冰冻温度生存下 来。 植物逆境研究是植物生理学研究的热点领域，长期以来对植物抗寒性的研究一直是 来研究者极大关注问题，如今分子生物学技术已经广泛应用于植物的抗逆性之中。c b f ( c r t - b i n d i n gf a c t o r ) 转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用因子，它可以调控 多个抗寒基因启动子区的顺式作用元件( 核心序列c c g a c ) ，即c r t d r e ，促进启动子 中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种耐 逆机制【2 1 ，提高植物的抗寒性。而肌动蛋i 刍( a c t i n , a c t ) 是作为一种广泛参与真核细胞生 理过程的管家基因，在基因表达调控研究时被广泛用作为分子内标【3 羽。 兴安落叶松是我国东北针叶森林区的主要树种，它是处在寒温带及温带的兴安落 叶松，在针叶树种中是最耐寒的，冬季可忍受7 0 c 的低温【6 】。该植物不仅具有珍贵的抗 寒基因资源，而且用途十分广泛，但是对兴安落叶松抗寒基因相关研究的报道尚很少， 挖掘极耐低温木本植物的抗寒基因资源，对于植物低温驯化提高抗寒能力，以及植物育 种和品种改良具有具有非常重要的意义。 研究发现，c b f 基因在拟南芥和油菜等植物中超量表达，转基因植株对低温的抗性 均显著增强【7 1 1 1 。g e n b a n k 数据库搜索结果显示，许多植物中均有潜在的c b f 同源基因 【1 2 】。这表明，c b f 在提高各种大田作物和园艺植物耐寒性中具有很大的利用价值。本研 究克隆了c b f l 转录因子，并分析了在4 c 不同时间胁迫下，兴安落叶松中c b f l 表达 量的变化，为下一步转化南方不抗冻作物，达到南种北移奠定基础，为国家创造更高的 经济效益。 肌动蛋白普遍存在于维管植物细胞中，参与细胞质流动、细胞器运动、顶端生长、 植物细胞形状控制、植物细胞的有丝分裂、植物对重力的感应性和叶绿体运动等许多重 内蒙古大学硕士论文 要的生命活动【1 3 】。肌动蛋白作为一种广泛参与真核细胞生理过程的管家基因，在基因 表达调控研究时被广泛用作分了内标 1 4 - 1 6 】。作为管家基因，p - a c t i n 在脊椎动物的不同物 种之间的序列同源性超过9 8 ，作为一种细胞质肌动蛋白，1 3 - a c t i n 是细胞骨架的重要 组成部分。它与一些管家基因一样在物种内的生理或病理状态下都持续恒量表达，因而 在很多需量化的试验技术，如简并p c r 、半定量p c r 、n o r t h e r n 杂交中被当作内参基 因。 1 1c 刚与植物冷胁迫 植物对低温和干旱抗性的分子机理是从研究这些植物在冷驯化过程中基因表达发 生变化开始的，拟南芥、油菜、小麦等抗冻植物( c o l dt o l e x a n tp l a n ts p e c i e s ) 的抗冻基因 ( c o l d r e g u l a t e dg e n e ，c o r ) 和抗旱基因( r e s p o 璐et od e h y d r a t i o n ，r d ) 的克隆、这些基因启 动子中r e 元件( d eh y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t ) 的发现，以及能识别d r e 元件并与之结 合的转录激活因子c b f l 在调节这些基因表达中的作用使我们对植物低温和干旱抗性的 分子机理有了更为深刻的认识【1 7 1 。植物的抗寒性是由复杂的多基因控制的数量性状，因 此，导入单一的功能基因虽然在一定程度上提高了植物的抗寒性，但是总的来说效果不 是很明显【1 s , 1 9 。于是，人们将重心转向研究能够调控一系列抗性基因表达的转录因子。 其中，c b f d r e b l ( c r t d r eb i n d i n gf a c t o r ) 是调控植物冷习驯化相关基因表达的最重要 转录因子之一。 1 1 1c r t d r e 的发现 1 9 8 5 年，g u y 等第一次给出了有力的证据：在植物冷驯化中存在基因表达的变化【2 0 】。 这个针对菠菜的研究很快引发了更多的针对冷驯化的其他植物包括拟南芥的相似研究 2 1 1 。发现在响应冷驯化的时候许多拟南芥的基因出现上调，这些被命名的基因中有c o r ( c o l d - r e g u l a t e d ) 、l t i ( 1 0 w t e m p e r a t u r ei n d u c e d ) 、x w ( c o l d 血d u c e d ) 、r d ( r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n ) 和e r d ( e a r l yr e s p o n s i v et od eh y d r a t i o n ) 。这些基因的转录水平被发现在植物暴 露于低温下几小时后有很大的提高，暴露时间的增加会让这些基因仍然持续表达提高， 返还到植物生长的温暖条件后会很快回到预处理的水平。 在拟南芥r d 2 9 a 基因启动子中鉴定出一个d n a 调控元件d r e ，含有9b p 的核心 序列( t a c c g a c a t ) ，它是干旱响应所必须的，且能够独立响应高盐和低温处理，但不 响应a b a 2 2 - 2 5 。同年，从c o r l 5 a 基因的启动子中又鉴定出一与d r e 极为相似的调控 元件c r t ( t g g c c g a c ) 。这两个元件均含有c c g a c 核心序列，即l t r e 2 内蒙古大学硕士论文 ( 1 0 w - t e m p e r a t u r e - r e s p o n s i v ee l e m e n t ) 元件【2 6 】。随后证明，c r t d r e 或其核心序列普遍 存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的冷诱导和脱水诱导表达所必需 2 7 1 。进而推测，在含有c r t d r e 元件的冷诱导和脱水诱导基因表达过程中，可能有相 应调控蛋白的参与。发现在响应冷驯化的时候许多拟南芥的基因出现上调，这些基因的 转录水平被发现在植物暴露于低温下几小时后有很大的提高，暴露时间的增加会让这些 基因仍然持续表达提高，返还到植物生长的温暖条件后会很快回到预处理的水平。 许多冷响应基因的启动子含有多个顺式元件如脱水响应元件胞嘧啶重复元件 ( d r e c r t ) 、脱落酸响应元件( a b r e ，p y a c g t g g c ) 、m y b 识别位点( c t a a c n a g ) 、 m y c 识别位点( c 砧叮n t c ) 【2 8 ，2 9 1 。基于遗传扫描的冷冻抗性发现了很多提高和降低了抗寒 性的拟南芥突变株【3 们。 研究发现，1 植物在低温和脱水反应中有两种主要途径，第一为依赖a b a 途径，包 括a b a 应答元件和带有b z i p 基序( m o t i f ) 的a b a 应答结合蛋白。植物体内的a b a 已经 被证明在提高植物耐逆性中是作为逆境胁迫信号使用的，在这条途径下，应答基因会受 到外源a b a 的诱导开始大量表达，大多数受低温和干旱调控的基因都会同时受到a b a 的调控；第二为非依赖a b a 途径，该途径是由y a m a g u c h i 和s h i n o z a k i 等采用示差筛选 法证明得到的，其中的转录因子不受a b a 调控，也在抗寒胁迫响应中起重要作用【3 l 】。 c r t d r e ( c - r e p e a t d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t ) 和c b f i ( c r t d r e - b i n d i n gf a c t o r1 ) 是这一途径的主要元件，因此，该途径也被称为c b f 途径。c r t d r e 的核心序列普遍 存在于冷诱导基因的启动子中，为这类基因的冷诱导表达所必需。d r e b l c b f 基因所 编码的蛋白时转录激活子，含有a p 2 e r fd n a 结合区域，能识别位于包括c o r i s a ， c o r 丘6 ，c o r 4 7 和c o r 7 8 等近4 0 个低温响应基因启动子的c r t d r e 元件，并与之结 合转录激活的协同表达，产生一系列的生理生化反应：脯氨酸合成增加，可溶性糖积累 等，并提高植物的抗冻能力。 1 1 2c b f 转录因子的家族成员 在模式植物拟南芥中，s t o e k i n g e r 等采用酵母单杂交方法从拟南芥e d n a 文库中首 次克隆出一段编码转录因子的e d n a 序列，这种转录因子含有a p 2 e r e b p 的d n a 结 合域，能识别c o r 基因中的c r t d r e 元件并与之结合，故命名为c b f l ( c r t d r e b i n d i n 9 1 ) ，即c r t d r e 结合因子，它能与其调控的基因上游c r t d r e 元件结合，从而 调控该基因的表达。后来又利用探针分离了c b f 2 ，c b f 3 【3 2 1 。2 0 0 2 年h a a k e 在研究 拟南芥抗旱时克隆了c b f 4 3 3 1 。l i u 等( 1 9 9 8 ) 鉴定出5 种d r e 结合蛋自，其中d r e b l a ， 内蒙古大学硕士论文 d r e b l b 和d r e b l c 分别对应于c b f 3 ，c b f j 和c b f 2 。 s a k u m a 等于2 0 0 2 年通过分析拟南芥基因组文库又发现了与d r e b l c b f 基因同源 的咄j d i 伤，d r e b l e 和d r e b l f ，虽然它们和c b f l 3 基因的同源性很高，但 是它们的表达机制模式和前三个c b f 基因明显不一样0 4 。c b f 4 不仅不受低温的诱导表 达，反而受干旱和外源a b a 的诱导。c b f 5 ，c b f 6 基因也不受低温调控【3 5 】。而且这3 个基因在逆境诱导条件下的表达水平很低，推测它们在逆境胁迫响应信号传导的过程中 起到的作用不大。 前三个基因以c b f l c b f 3 一c b f 2 的同向方式随机串连位列在拟南芥染色体4 上， 其中c b f 3 位于c b f i 下游3k b 处，c b f 2 位于c b f i 下游7 k b 处【3 6 - 3 9 ；而c b f 4 定位在 5 号染色体上【4 0 4 1 1 。 1 1 3c b f 的表达特性 正常生长温度下，植物体内c b f 基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存 在。将拟南芥植株转移到低温环境中，c b f i - 3 基因的转录在1 5m i n 内明显提高，1 2h 内继续升高，2h 后开始下降，但在2 4h 内仍保持较高的水平。a b a 处理和脱水胁迫条 件下，没有c b f 转录物积累 4 2 1 。与拟南芥中的情况一样，油菜、小麦、黑麦和番茄中 类似c b f 基因的转录也在经受低温胁迫后1 5 3 0r a i n 内快速提高，几小时内达到最高， 随后开始下降。而且，c b f 基因的这种冷诱导表达是非器官特异的，它们的转录物在叶、 茎、根等器官中积累到相似的水平【4 3 1 。 l e e 等( 2 0 0 1 ) 研究发现，在h o s l 突变体中，经过冷诱导后，c b f 2 和c b f 3 基因的 表达增强，冷处理后3h ，c b f 2 基因的表达大约要比野生型植株高5 0 。而且，冷处理 时间越长，c b f 2 和c b f 3 基因表达的增强就越明显【删。由此推断h o s1 编码的蛋白 可能是在c b f 上游起调控的负调控因子。 1 1 4c b f l 基因及其产物蛋白的特性 拟南芥c b f l 基因的o r f 包含6 4 2 个核苷酸，c b f 2 和c b f 3 基因的o r f 各含有 6 5 1 个核苷酸，它们之间的相似性非常高。通过基因组分析得到这3 个c b f 基因的o r f 中都没有内含子，这三个c b f 基因所表达的蛋白的结构和功能都很相似。它们蛋白的 分子量在2 4 - - 3 8 k d 之间，一级结构分析知道d r e b c b f l 转录因子分为4 个区域【4 5 】： ( 1 ) 1 3 2 位的氨基酸残基是一个n 末端区域；( 2 ) 3 3 4 4 位的氨基酸序列是一个潜在的核 定位信号，此区域富含精氨酸和赖氨酸残基；( 3 ) 4 8 - 1 0 6 位的氨基酸残基是一个a p 2 基 元1 4 6 ：( 4 ) 1 0 7 2 1 3 位的氨基酸残基是酸性的活性因子区域，它富含酸性氨基酸，其p h 4 内蒙古大学硕士论文 值在3 乱3 8 之间，这一区域被认定是在转录激活中起主导作用。每种c b f 蛋白都含有 一个a p 2 基元。c b f l 的n 末端区域和c 末端酸性片段中含有一个潜在的核定位序列， 该序列后面是一个a p 2 基元。 c b f l 蛋白的一大特性是局部冷变性。这种冷变性在53 0 c 范围内是可逆的，主 要存在于氨基末端区和酸性区。在体外，c b f l 蛋白在常温和近零点温度都能与c r t d r e 结合。然而，常温条件下，拟南芥的c b f l 蛋白不能激活c o r 基因的转录。因此， 温度下降才能使c b f l 蛋白c r t d r e 复合体由一个阻遏子( r e p r e s s o r ) 转化成一个活化子 ( a c t i v a t o r ) 。 1 1 5c b f 在植物冷驯化中的作用 l e a 蛋白和亲水多肽、脯氨酸以及可溶性糖等己被证明对植物的耐寒性起重要作用 w r 。c b f 转录激活因子与c r t d r e 调控元件特异结合，诱导目标基因表达，促进这几 类物质的合成与积累，从理论上来讲能提高植物耐受低温的能力。事实正是如此，c b f 转录激活因子在拟南芥和油菜中超表达，在没有低温刺激的情况下提高转基因植株的低 温耐性，或进一步增强冷驯化转基因植株的抗冻能力。而且，c b f 转录激活因子超表达 植株的低温耐性与目标基因在非胁迫条件下的表达水平正相关。一些实验结果表明， c b f 3 基因在拟南芥中超量表达，使其生长发育受到抑制。 1 2 肌动蛋白简介 肌动蛋白( a c t i n , a c t ) 普遍存在于维管植物细胞中，是在真核细胞进化过程中高度 保守的一种重要的蛋白家族，相对分子质量为4 2 k d a ，各种生物肌动蛋白的氨基酸序列 同源性高达7 0 - , 1 0 0 。在高等植物体内，肌动蛋白主要参与许多重要的生命活动，它 在某些细胞中占总蛋白的1 0 。1 9 6 3 年，我国科学家阎隆飞先生首先证明植物中存在 肌动蛋白【5 。高等植物a c t i n 与动物及真菌a c t i n 基因一样，属于多基因家族基因，在 进化过程中保持着高度的保守性和同源性。高等植物的a c t i n 都是由多基因编码【5 2 1 。这 些基因高度相似，通过多轮复制由一个基因祖先进化而来【5 3 1 ，这暗示着a c t i n 基因在进 化过程中承受着较大的选择压力，在生物体内执行着重要的生物学功能。植物肌动蛋白 是植物细胞生物学领域发展起来的研究热点，涉及植物细胞的分裂机制、细胞运动、细 胞器运动、细胞的极性、细胞空间形状的维持和物质运输等【5 4 1 。自1 9 7 3 年e l z i n g a 等首 次测定兔肌肉肌动蛋白的氨基酸序列至今，高等植物水稻、玉米、马铃薯、胡萝卜、拟 南芥、烟草、花生【5 5 】、水花生【5 6 】以及八棱海棠【5 7 】等肌动蛋白基因序列陆续被测定。迄 内蒙古大学硕士论文 今为止，国际数据库中已经存有百余种生物的2 0 0 多个肌动蛋白核苷酸序列和氨基酸序 列 5 8 - 6 3 】。 肌动蛋白家族极其保守，各成员的表达具有与物种无关的组织特异性【删。常规的植 物肌动蛋白通常由3 7 6 - - 3 7 7 个氨基酸残基组成，具有6 种不同的异构体，这些异构体非 常相似，仅存在3 7 的变异。肌动蛋白存在5 个外显子和3 个内含子，其5 端的先 导区外显子只能被转录而不能被翻译。内含子的数目与位置在所有测序过的肌动蛋白中 高度保守，3 个编码区内含子分别位于第2 0 ，1 5 2 和3 5 6 个密码子处。此内含子将57 先 导区外显子与蛋白质编码区分开，它能对基因的表达起调控作用6 5 1 。作为管家基因，b - a c t i n 基因在脊椎动物的不同物种之间的序列同源性超过9 8 。作为一种细胞质肌动蛋 白，b - a c t i n 是细胞骨架的重要组成部分。与一些管家基因一样在物种内的生理或病理 状态下都持续恒量表达，因而在很多需量化的试验技术，如简并- p c r 、半定量p c r 、 n o r t h n 杂交中被当作内参基因。 1 3 研究目的与意义 目前，一些植物的冷诱导基因已被克隆，研究的植物材料绝大多数集中于草本植物， 挖掘极耐低温木本植物的抗寒基因资源，对于植物低温驯化提高抗寒能力，以及植物育 种和品种改良具有潜在的经济价值。c b f ( c r t - b i n d i n gf a c t o r ) 转录激活因子是一类受低 温特异诱导的反式作用因子，它们可以调控多个抗寒基因启动子区上的顺式作用元件 ( 核心序列c c g a c ) ，即c r t d r e ，促进启动子中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱 水诱导基因的表达。肌动蛋( a c t i n ，a c t ) 普遍存在于维管植物细胞中，参与细胞质 流动、细胞器运动、顶端生长、植物细胞形状控制、植物细胞的有丝分裂、植物对重力 的感应性和叶绿体运动等许多重要的生命活动【7 。兴安落叶松是我国东北、内蒙古以 及华北、西南的高山针叶森区的主要树种，在针叶树种中是最耐寒的植物，该植物具有 珍贵的抗寒基因资源，但是目前，对兴安落叶松抗寒基因相关研究的报道尚很少。研究 发现c b f 基因在拟南芥和油菜等植物中超量表达，转基因植株对低温的抗性均显著增 强【7 2 7 6 1 。g e n b a n k 数据库搜索结果显示，许多植物中均有潜在的c b f 同源基因，表明 c b f 在提高农作物和园艺植物耐寒性中具有很大的利用价值。本研究克隆了c b f l 转录 因子和a c t i n 基因，并在4 c 胁迫兴安落叶松幼苗不同时间( 0r a i n ，1 0m i n ，3 0r a i n 、lh 、 2h 、6h 、1 2h 、2 4h 和4 c 处理6h ，再恢复2 2 3 0m i n ) ，比较分析了胁迫条件下植 物中c b f l 表达量的变化，为进一步将该基因转化不抗冻作物奠定了基础。 6 内蒙古大学硕士论文 2 1 植物材料 2 材料和方法 本研究的初始材料兴安落叶松( l a , i xg m e l i n i i ) 的种子由内蒙古大兴安岭管理局甘河 林业局提供。种子采集后低温保存于4 。c 冰箱中。 2 2 菌种 用于转化的宿主菌d h 5 a 菌株购于宝生物( t a k a r a ) t 程有限公司。 2 3 试药和试剂 苯酚、氯仿、异戊醇、l i c l 、p 巯基乙醇、醋酸钠、无水乙醇等均为分析纯。 d e p c 、c t a b 、m o p s 、d m s o 、甲酰胺、氨苄青霉素、i p t g 、x - g a l 为a m r e s c o 公司生产。 t a k a r ar n ap c rk i t ( a m y ) v e r3 0 ( t a k a r a ) 、克隆载体p m d l8 - t ( t a k a r a ) 、 a x y p r e pd n a g e le x t r a c t i o nk i t ( a x y g e n ) 、s m a r t e rr a c ee d n aa m p l i c a t i o nk i t ( c l o n t e c h ) 、t a qd n a 聚合酶( t a 勋i 哪、e s a y s c , p t t mr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( t r a n s g e n b i o t e c h ) 。 2 4 实验仪器 ( 1 ) 低温高速离心机( 日本t o m y 公司) ( 2 ) 台式离心机( 中国其林贝尔公司) ( 3 ) 超净台( 杭州恒宇净化设备厂) ( 4 ) 干式恒温器( 杭州奥盛仪器有限公司) ( 5 ) 恒温培养箱( 南京实验仪器厂) ( 6 ) h h z c 1 台式冷冻恒温振荡器( 太仓市实验设备厂) ( 7 ) 精密天平( 赛多利斯科学仪器有限公司) ( 8 ) p h 计( 北京赛多利斯科学仪器有限公司) ( 9 ) 超低温冰箱( 美国t h e r m o 公司) 7 内蒙古大学硕士论文 ( 1 0 ) p c r 仪( 美国b i op a d 公司) ( 11 ) 电泳仪( 美国b i or a d 公司) ( 1 2 ) 凝胶成像分析仪( 美国b i o r a d 公司) 2 5 方法 2 5 1 幼苗的培养及低温胁迫处理 ( 1 ) 幼苗培育：兴安落叶松种子用自来水浸泡2 天，转移到4 。c 冰箱中在低温浸泡1 天，然后播种于蛭石中，定期浇水，出苗后2 周的幼苗用于提取基因组d n a 。 ( 2 ) 低温胁迫处理：出苗后2 周的幼苗放在4 c 培养箱中，进行低温胁迫处理6 小时后 用于提取总r n a 。 2 5 2 兴安落叶松核酸的提取 2 5 2 1 兴安落叶松总r n a 的提取( 改良的c t a b 法) 【7 7 】 ( 1 ) 取兴安落叶松幼苗0 5g ，置于用液氮预冷的研钵中，用液氮反复研磨，重复3 次， 直至磨成粉末状，然后转移到5m l2 c t a b 缓冲液中。 ( 2 ) 将上述混合物在6 5 c 孵育1 5r a i n ，加入等体积的c i ( 氯仿：异戊醇2 4 ：1 ) 。 ( 3 ) 激烈涡旋震荡混合后，4 1 0 0r p m 离心1 0r a i n 。 ( 4 ) 将上清液收集到一洁净的离心管中，加入等体积c i 。 ( 5 ) 4 1 0 0 r p m 离心1 0m i l l ，收集上清液。 ( 6 ) 加入1 4 体积的1 0 ml i c l ，2 0 冷冻2h 。 ( 7 ) 在4 c 下，4 1 0 0r p m 离心1 0r a i n 沉淀r n a ，将r n a 转移至t e 中。 ( 8 ) 分别用等体积的t e 饱和酚、p c i ( 苯酚：氯仿：异戊醇2 5 - 2 4 ：1 ) 和c i 处理，4 1 0 0 r p m 离心1 0m i n ，收集上清。 ( 9 ) 加入l 4 体积的l oml i c l ，2 0 冷冻2h 。 ( 1 0 ) 在4 c 下，4 1 0 0r p m 离心1 0r a i n ，弃上清，用7 0 的乙醇清洗r n a 沉淀。 ( 1 1 ) 弃去上层液体