（微生物学专业论文）类细菌素产生菌的选育及其发酵产物性质的初步研究.pdf

四川大学硕士学位论文 图形目录 研究论文 图1 标准曲线中牛津杯的排列位置相片1 2 图2 目的菌株的初筛流程1 3 图3 c a - a l g 胶珠制备流程示意图1 9 图4 a c a 小球制备流程示意图1 9 图5 硫酸庆大霉素标准曲线2 4 图6 c f l 0 发酵液对铜绿假单胞菌的抑制效果图一2 6 图7 c f l 0 菌株的s e m 相片2 8 图8 u v 诱变c f l o 的致死曲线2 9 图9 诱变前后c f l 0 菌株效价对比3 1 图10 突变株连续1 0 代所产类细菌素抑菌活性对比3 1 图1 1 培养基起始p h 值对类细菌素产量的影响3 4 图12 培养温度对类细菌素产量的影响3 4 图1 3 培养时间对类细菌素产量的影响3 5 图1 4 接种量对类细菌素产量的影响3 5 图15 培养基装量对类细菌素产量的影响3 6 图16 金属离子对类细菌素产量的影响3 6 图1 7 蛋白酶处理后的抑菌试验结果3 7 图1 8 液化酶及糖化酶处理后的抑菌试验结果3 8 图1 9 发酵液中乙醇含量对抑菌活性的胁迫影响4 1 图2 0 游离菌与固定化菌的抑菌活性对比4 2 图2 1 c f l o 及大肠杆菌的质粒d n a 电泳相片4 3 图1 图2 图3 图4 n i s i n 结构示意图 文献综述 n i s i n 前体加工及成熟n i s i n 分子结构 n i s i n 对细胞膜作用的模型 n i s i n 生物合成基因簇的组成 i v 6 4 6 5 6 8 7 1 四i i i 大学硕士学位论文 图5 n i s i n 的成熟过程 表格目录 表1 培养基主要成分的正交试验表 表2 表3 表4 表5 表6 表7 表8 表9 表1 0 表1 1 表1 2 表1 3 表1 4 表1 5 硫酸庆大霉素标准曲线的测定结果 有抑菌作用的菌株数统计 对不同供试菌有抑制作用的菌株数统计 c f l 0 发酵液与有机酸的抑菌效果对照 过氧化氢酶处理前后的发酵液抑菌效果对照 c f l 0 菌株的生理生化特征 u v 照射后突变株的变异分布 碳源及氮源对类细菌素产量的影响 正交试验结果 c f l 0 所产类细菌素的热稳定性 不同p h 值对发酵液抑菌活性的影响 c f i o 发酵液抑菌活性的持久性 c f i o 所产类细菌素的抗菌谱一 质粒消除前后的抑菌活性对比 v 7 1 斟巧盯卯捣驼嚣 四川大学硕士学位论文 类细菌素产生菌的选育及其发酵产物性质的 初步研究 微生物学专业 研究生常峰指导教师王忠彦 摘要 从l 四) z l 某浓香型大曲酒酿造企业窖池里的黄水中，通过厌氧分离 技术、纸片法初筛、三角瓶扩大培养、杯碟法复筛，得到一株代谢产 物对革兰氏阳性致病菌、革兰氏阴性致病菌及部分真菌和酵母菌具有 抑制作用的乳酸菌，菌株编号c f i o 。经形态观察、生理生化及分子 生物学实验，鉴定该菌为布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i ) 。在排 除酸性末端产物和过氧化氢的干扰作用后，c f i o 发酵上清液仍具有 明显的广谱抑菌作用，故将这一抑菌活性成分纳入类细菌素的范畴。 在类细菌素高产菌株的选育过程中，采用紫外线( u v ) 与硫酸 二乙酯( d e s ) 多轮复合诱变，类细菌素高产菌发酵液相对效价较未 诱变前提高了2 5 8 且具有良好的传代稳定性。 通过单因素分析和正交试验法，对目的菌c f l 0 的培养基组成和 发酵条件进行了探讨，确定了c f l 0 的最佳培养基配方为：以2 麦 芽糖为碳源，1 大豆蛋白胨加0 5 酵母粉为氮源，有微量、m 矿、 n l - h + 、1 等金属离子存在。最适发酵条件为：培养温度3 7 c ，起始 四川大学硕士学位论文 p h 6 o 6 5 ，培养时间4 8 h ，接种量l ，厌氧条件下静置培养，发 酵产物的抑菌活性可达3 1 6 u m l ( 以硫酸庆大霉素为标准品) 。 对该类细菌素生物学特性进行初步研究发现，用蛋白酶k 、胰蛋 白酶、液化酶及糖化酶处理发酵上清液后，抑菌活性有不同程度的减 弱；经高温处理一定时间后抑菌活性保持较完整，证明其熟稳定性较 高；在酸性条件下稳定且具有较高活性；室温下长时间放置其抑菌活 性表现稳定。 c f l 0 菌株表现出一定的酒精耐受性，乙醇百分含量为1 0 时， 其抑菌活性保留了2 8 ，乙醇含量为1 2 时，活性丧失。 经过对c f l o 菌株进行固定化研究发现，相同的培养周期内，游 离菌发酵液表现出最大的抑菌活性，微囊化菌发酵液的抑菌活性最稳 定，固定化菌发酵液的抑菌活性和稳定性介于二者之问。 经质粒d n a 提取和琼脂糖凝胶电泳，没有检测到质粒带，经过 质粒消除试验，该菌保持了产生抑菌活性成分的能力，可以推测编码 该菌株产类细菌素的基因可能存在于染色体上。 对c f l o 发酵液进行盐析、透析后发现，该抑菌活性成分分子量 介于3 0 0 0 3 5 0 0 d a 之间，估计是一小肽类物质。 关键词：类细菌素，布氏乳杆菌，抑菌活性，发酵条件，诱变，固定 化，质粒，小肽 四川大学硕士学位论文 s t u d i e so ns c r e e n i n ga n d b r e e d i n g b a c t e r i o c i n l i k es u b s t a n c ep r o d u c i n gs t r a i n a n di t sf e r m e n t a t i o ns u b s t a n c e p o s t g r a d u a t e ：c h a n gf e n gt u t o r ：w a n gz h o n g y a n an o v e lb a c t e f i o c i n - l i k es u b s t a n c ep r o d u c i n gs t r a i nw a ss c r e e n e d f r o my e u o w - f i q u o rs a m p l e sb ya n a e r o b i ci s o l a t i o na n ds c r i pm e t h o da n d c y l i n d e r - d i s hm e t h o da n dw a sn a m e dc f i o t h es u p e m a t a n to fc f i o c u l t u r eh a v e s t r o n gb a c t e r i 0 6 t a s i sa c t i v i t ya g a i n s t t h e g r a m - p o s i t i v e p a t h o g e n i cb a c t e r i aa n dt h eg r a m - n e g a t i v ep a t h o g e n i cb a c t e r i aa n ds o m e f u n g ia n dm i c r o z y m e t h es t r a i nw a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i b ym o r p h o l n g i cc h a r a c t e r i s t i c sa n dp h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lt e s t i n ga n d m o l e c u l a r - b i o l o g i c a lt e s t i n g , e x c l u d e dt h ei n t e r f e r e n c eo fo r g a n i ca c i d s a n dh y d r o g e np e r o x i d e , s t r o n gb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yw a sa s oo b s e r v e d , w eb e l o n gi tt ob a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c e i n t h e p r o c e s s o fm u t a t i o n b r e e d i n gb a a e d o c i n l i k es u b s t a n c e l l i g h p r o d u c i n gs t r a i l l s $ c f l 0w a st r e a t e dw i t hm u l t i p l et i m e sc o m p o u n d m u t a t i o nb yu l t r a v i o l e t ( i n ) r a d i a t i o na n dd i e t h y ls u l p h a t ed e s ) ，t h e r e l a t i v ep o t e n c yo fs u p e m a t a n th a di n c r e a s e d2 5 8 a n di th a v es t a b l e i n h e r i t a n c e - 3 四川大学硕士学位论文 f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rb a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c ep r o d u c t i o n h a v eb e e ne s t a b l i s h e d ：t h em e d i u mw i t h2 m a l t o s ea sc a r b o l ls o u l c e 1 s o y ap e p t o n ea n d0 5 y e a s te x u a c i ea sn i u o g e ns o b i c ei so p t i m a l t h e m a x i m u mb a c t c d o s t a s i sa c t i v i t yi sr e a c h e da tc u l t u r et e m p e r a t u r e3 7 a n di n i t i a l p h 6 0 6 5f o r4 8 h , 1 i n o c u l a t i o nq u a n t u m , a n a e r o b i c c o n d i t i o n , e 、m 矿、m l + a n dm n 2 + e x i s lt h eb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yc a n r e a c ha t3 1 6 u m l ( s o d i u ms u l f a c e t a m i d eb eu s e da ss t a n d a r d ) t h eb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yh a v eb e e nl o w e r e di nd i f f e r e n t d e g r e e w h e nt h es u p e r n a t a n tw a st r e a t e dw i t hp r o t e i n a s ek 、t r y p s i n 、a - a m y l a s e a n dc a r b o h y d r a s e t h i sk i n do fb a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c eh a sh i g hh e a t s t a b i l i t y t h eb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yi sh i g h e ru n d e ra c i d i cc o n d i t i o na n di s l o n g t i m ee f f e c t i v ei ni o o mt e m p e r a t u r e c f l 0h a v es o m ee n d u r a n c et oa l c o h o l , i t sb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t y r e t a i n2 8 w h e ne t h a n o lc o n t e n ti s1 0 ，a n dt h eb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t y d i s a p p e a ro n c ee t h a n o lc o n t e n th a sr e a c h e d1 2 t h eb a c t e f i o s t a s i s a c t i d t yo ff l e ec e l li st h eh i g h e s t , a n dt h e b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yo fc e l li n m i c r o e n c a p s u l a t i o nh a st h eh i g h e s t s t a b i l i t y , a n dt h eb a c t c r i o s t a s i sa c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fi m m o b o l i z e dc e l l a l eb e t w e e na b o v et w o t h ep l a s m i do fc f i oc o u l dn o tb ef o u n d e d h 1 0 嶝血e x t r a c t i o no f p l a s m i dd n a a n da g a r o s cg e le l e c t r o p h r e s i s ，a f t e rp l a s m i db ee l i m j l l a t e d , c f i or e t a i nt h ea b i l i t yt op r o d u c et h eb a e t c r i o s t a s i sa c t i v i t ys u b s t a n c e t h ee n c o d e dg e n et op r o d u c i n gt h eb a c t e f i o c i n - l i k es u b s t a n c es h o u l db e l o c a t e do nc h r o m o s o m e t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h eb a c t e r i o s t a s i s a c t i v i t ys u b s t a n c ei s b e t w e e n3 0 0 0 d aa n d3 5 0 0 d ab ys a l to u ta n dd i a l y s i s ，a n di tw o u l db ea k i n do fs m a l lp e p t i d e k e y w o r d s ：b a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c e ，l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i b a c t e f i o s t a s i sa c t i v i t y ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，m u t a t i o n ， i m m o b o l i z a t i o n ，p l a s m i d ，s m a l lp e p t i d e 一4 - 硼川大学硕士学位论文 类细菌素产生菌的选育及其发酵产物性质的 初步研究 前言 随着社会的进步，人们生活水平不断提高，食品工业也在不断的 发展。据统计，我国食品工业总产值在1 9 9 9 年达到6 0 2 0 3 亿元人民 币，占全国工业总产值的9 3 “】，但是由于腐败变质导致生产的食 品约有1 0 2 0 损失。，这是一个巨大的浪费。因此，研发安全有 效的食品防腐剂是食品工业发展的关键之一。食品防腐剂一般分为人 工合成防腐剂( 无机防腐剂、酸性防腐剂和脂性防腐剂) 和天然防腐 剂( 植物性来源、动物性来源和微生物性来源) 两大类锕，以前人工 合成防腐剂由于成本低廉，因此长期以来在食品工业中占主导地位。 但随着生活水平的提高和科学技术的发展，人们逐渐认识到人工合成 防腐剂在适用条件、对食品风味的影响以及对人体的毒副作用等方面 或多或少存在缺陷，因此，近年来研究者纷纷把目光投向天然防腐剂 的开发湖。天然防腐剂的缺点是在自然界中的生产周期长、人工提取 和制造工艺复杂，技术投资规模大、产品得率低、价格昂贵嘲，这使 得天然防腐剂不能完全取代人工合成防腐剂。但在以乳酸链球菌素 ( n j s i n ) 为代表的细菌素类天然防腐剂的研制生产中克服了这些不 足，从而使对细菌素的研究成为人们研究天然防腐剂的重点嘲。 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i al a b ) 是一类可发酵糖并产生大量乳 酸的细菌统称。长期以来，乳酸菌广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品 的发酵和防腐中棚。许多乳酸菌代谢除了产生乳酸、乙酸等有机酸和 过氧化氢外，还能产生多种具有抑菌或杀菌生物活性的细菌素 ( b a c t e d o c i n ) ，在抑制多种病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要 四川大学硕士学位论文 意义。细菌素是某些细菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抑菌活性 的蛋白质或多肽类物质，其抑菌范围不局限于同源菌，产生菌对其细 菌素有自身免疫性伽它与人工合成防腐荆相比具有杀菌力强、适用 条件广、在人体内能被蛋白酶分解、无毒副作用，水溶性好、热稳定 性好、不影响食品风味等优点嘲，它的生产过程同其他天然防腐剂相 比具有生产周期短，生产效率高、成本低廉等优点，因此，细菌素非 常适合作为天然防腐剂用于食品工业嘲。目前食品工业中研究得最透 彻的细菌素是乳酸链球菌素( n i s i n ) ，它于1 9 6 9 年被联合国粮食与农 业组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 联合专家组推荐为商效安全天然 防腐剂，现在广泛的运用于肉类工业、奶制品工业、酿酒工业和罐装 食品工业。 细菌素也有其局限性，细菌素大多是由革兰氏阳性菌产生并抑制 革兰氏阳性菌，对大多数革兰氏阴性菌和真菌无效“，这限制了它的 使用范围。人们在对细菌素的研究过程中陆续发现了另外一些拮抗物 质，它们也是某些细菌在代谢过程中由核糖体合成产生的一类具有抑 菌杀菌作用的蛋白类物质，但是能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性 菌和真菌“2 埘，这特性决定了其具有比细菌素更广泛的应用前景， 国外的学者于1 9 5 8 年正式将这类物质定义为类细菌素并对其展开了 研究“”。目前已经有链霉菌“ 、苏云金芽孢杆菌咖、地衣芽孢杆菌 、链球菌恤1 、铜绿假单胞菌位1 1 、日本根瘤菌嘲等产生类细菌素的报 道；有报道称将类细菌素作为防腐剂加入食品中能抑制大肠杆菌的生 长嘲，类细菌素能抑制口腔厌氧微生物在口腔医学中发挥作用魄瑚， 类细菌素能够作为药品使用在临床上嘲等等。在国外，对类细菌素的 研究已经相当深入，但是在国内相关报道却很少。 黄水是浓香型白酒酿造过程中的副产物，含有丰富的醇、醛、酸、 酯等呈香呈味物质和经长期驯化的有益微生物等”，长期以来，对黄 水的综合利用程度一直都处于较低水平，甚至不加处理直接排放，造 成环境污染。本文着眼于开发新型的类细菌素以及对资源的再生利 用，从酿酒副产物黄水中筛选出一株产生类细菌素的乳酸菌，采用复 合诱变对其进行改良，对该菌的最适发酵条件、抑菌活性成分的性质、 四川大学硕士学位论史 酒精耐受性、固定化细胞前后活性对比、抑菌基因可能存在的位置、 抑菌活性成分分子量大小等进行了研究，为今后工业化的开发和医药 利用奠定基础。 四川大学硕士学位论文 材料与方法 1 材料 1 1 样品来源 采集自四川某浓香型大曲酒酿造企业窖池中的黄水。 1 2 培养基渊 1 2 1 筛选培养基( g l ) ：m r s 培养基 牛肉膏i 0 。0 ，大豆蛋白胨1 0 0 ，葡萄糖2 0 0 ，酵母粉5 0 ， 乙酸钠5 0 ，柠橡酸三铵2 0 ，k 2 1 - 1 p 0 42 0 ，m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 5 8 ， m n s 0 4 - 4 h 2 00 2 5 ，吐温8 0i m l ，琼脂2 0 0 p h 6 2 6 4 ，1 1 5 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 2 种子培养基( g l ) ： 葡萄糖1 0 0 ，大豆蛋白胨1 0 0 ，牛肉膏5 0 ，酵母粉5 0 ，乙 酸钠5 0 ，柠檬酸三铵2 0 ，k 2 蝴0 4 2 0 ，吐温8 0i m l p h 6 2 6 4 ，1 1 5 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 1 2 3 供试菌生长培养基( g l ) ： 蛋白胨i 0 0 ，酵母粉6 0 ，牛肉膏3 0 ，葡萄糖1 0 ，琼脂2 0 0 p h 7 2 7 5 ，1 1 5 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 4 真菌培养基( g l ) ：p d a 培养基蚓 马铃薯2 0 0 0 ，蔗糖2 0 0 ，琼脂2 0 0 马铃薯去皮，切成块煮沸3 0 m i n ，纱布过滤，加糖、琼脂，溶化 后加水定容至1 0 0 0 m l ，自然p h 值，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 5 发酵培养基( g l ) 四川大学硕士学位论文 m r s 液体培养基。 1 2 6 抑菌活性检测用培养基( g l ) ：采用双层平板 下层培养基：1 5 水琼脂培养基。 上层培养基：1 0m l 供试菌生长培养基中加入0 1m l 供试菌悬 液( 供试菌斜面于3 7 c 过夜培养，用i 0m l 无菌水洗脱，制成菌悬 液) ， 1 2 7 菌种鉴定用培养基： 生理生化培养基：葡萄糖蛋白胨培养基、明胶水解培养基、肉汁 胨培养基、石蕊牛奶等呻堋。 1 3 主要试剂与设备 1 3 1 主要试剂 硫酸庆大霉素标准品：s i g m a 公司 蛋白胨：北京奥博星公司 酵母粉：进口分装 琼脂粉：进口分装 其他试剂：均采用国产分析纯或化学纯 1 3 2 主要设备 p h s 一2 c 酸度计：上海康仪仪器有限公司 光学显微镜：日本o l y m p u s h i t a c h l - - 4 5 0 型扫描电镜：日本日立公司 7 2 1 型分光光度计：上海第三分析仪器厂 d d y 一8 型电泳仪：北京六一仪器厂 d y c z - - 2 8 a 型电泳槽：北京六一仪器厂 8 1 2 型磁力恒温搅拌器：上海县曹行无线电元件厂 t g l 一1 6 b 高速微量离心机：上海安亭科学仪器厂 四川大学硕士学位论文 1 4 抑菌活性供试菌 金黄色葡萄球菌a 3 0 1 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s a 3 0 1 ) 金黄色葡萄球菌a 3 0 9 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 青霉素敏感型) 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b a t 话) 鸟链球菌( s t r e p t o c o c c u sa v i u m ) 表皮葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s p y o c y a n e a ) 伤寒杆菌( s h f g e l l ad y s e n t e r i a e ) 痢疾杆菌( s a l m o n e l l at y p h i ) 瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) k 酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i m a ek ) 玉米纹桔菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 新月弯孢霉( c u r v u l a r i al u n a t a ) 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 藤仓赤霉菌( g i b b e r e l l a f u j i k u r o i ) 玉米小斑菌( h e l m i n t h o s p o r i u mm a y d i s ) 柑桔绿霉菌( p e n i i c i l b u md i i g i t a t u m ) 油菜菌核菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u r n ) 白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u s ) 蓝色犁头霉( a b s i d i ac o e r u l e a ) 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 黄曲霉( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) 黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 常见青霉( p e n i c i l l i u m f r e q u e n t a n s ) 白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n e ) 2 方法 2 1 类细菌素效价的测定陋矧 四川大学硕士学位论文 由于该类细菌素的研究尚在初级阶段，没有标准品或结构类似物 作参照，故选取硫酸庆大霉素作为对照。制作硫酸庆大霉素抑制大肠 杆菌的标准曲线，该类细菌素的效价参照对大肠杆菌具有相同抑菌效 果的硫酸庆大霉素标准品的效价来定义。 2 1 1 供试菌的制备 将大肠杆菌( e c o l d 接种于供试菌生长培养基斜面3 7 1 2 下过夜 培养，用1 0 m l 生理盐水将斜面细胞洗脱，振荡均匀，制成菌悬液( 菌 悬液细胞浓度大致在l 矿个m l ) 。 2 1 2 抑菌活性检测平板的制备 采用双层平板法。 下层培养基：1 5 水琼脂培养基1 0 m l ；上层培养基：将e c o l i 菌悬液在5 0 c 下以l ：1 0 0 的比例加入到1 0 m l 供试菌生长培养基中， 摇匀，倒平板。 2 1 3 效价测定方法( 一剂量法) a 制备1 0 u m l 、2 0 u m l 、3 0 u m l 、4 0 u m l 、5 0 u m l 、 6 0 u m l 、7 0 u m l 、8 0 u m l , 9 0 u m l 1 0 0 u m l 的硫酸庆大霉素 标准溶液： b 取制备好的抑菌活性检测平板9 个，每个平板中均匀放置6 个牛津杯( 1 0 8 x 6 c m ) ，每间隔的3 个牛津杯注入0 3 m l 5 0 u m l 中 间浓度的硫酸庆大霉素标准品，其余3 个牛津杯注入0 3 m l 同浓 度的硫酸庆大霉素标准品( 5 0 u m l 除外) ，每一浓度做3 个重复， 全部平板用陶瓦盖密封，3 7 c 下培养1 5 h ，测定抑菌圈直径( 十字 交叉法) ，如图l ； c 将上述9 个平扳中2 7 个5 0 u n l l 中间浓度的硫酸庆大霉索标 准品的抑菌圈直径的平均值作为标准曲线的校正点，将每个浓度对应 的抑菌圈直径所得的平均值校正成适当的数值； d 以上述l o 个浓度的硫酸庆大霉素标准溶液校正后的抑菌圈直 阴川大学硕士学位论文 径为纵坐标，相应的浓度对数为横坐标，在双周半对数坐标纸上绘制 标准曲线，或将上述数据以d = a l g c + 8 进行回归处理，其中：d 为抑 菌圈直径( n u n ) ，c 为抑制剂浓度( u m l ) ，a 、b 为常数。 图1 标准曲线中牛津杯的排列位置相片 2 1 4 类细菌素效价的测定 将c f l 0 发酵上清液按2 1 3 所述方法在抑菌活性检测平板上加 样，做3 个平行试验，3 7 c 下培养1 5 h ，测定抑菌圈直径，依照硫酸 庆大霉素标准曲线计算发酵液效价。 2 2 类细菌素产生菌的筛选 2 2 i 目的菌株的初筛”“1 初筛采用纸片法。将样品用无菌水梯度稀释，取微量( 5 0 1 0 0 u l ) 不同浓度的样品涂布于筛选培养基平板上，3 0 倒置培养4 8 7 2 h 。 待长出菌落后用无菌牙签挑取单菌落接种于装有i m l 发酵培养基的 1 5 m l e p 管中，密封，3 0 c 静置培养7 2 h 。将发酵液以1 0 0 0 0 r p m 离 心3 0 s ，用直径约5 m m 无菌滤纸片蘸取上清液点于抑菌活性检测平 板上，3 7 c 倒置培养1 5 h ，挑取纸片周围抑菌圈较大且抑菌谱较广的 菌株进行复筛( 如图2 ) 。 2 2 2 目的菌株的复筛。“1 四川大学硕士学位论文 c ：。o 。_ 神 童径h 的 l 嗳取上 三层纸片 蒗 可豢 在唧譬内 发酵培莽7 强 i 号芦 3 t c 倒x 培养l $ h 一 选取纸片局圈有明显 押蕾的菌株。记录 囊定平爱 图2 目的菌株的初筛流程 复筛采用杯碟法。将初筛菌种以划线法进行纯化，将纯化后的初 筛菌种接入装有1 0 0 m l 发酵培养基的1 0 0 m l 三角瓶中，3 0 c 活化 7 2 h ，按l 的接种量接入装有2 5 0 m l 发酵培养基的2 5 0 m l 三角瓶中， 3 0 c 静置培养4 8 7 2 h 。将发酵液以1 0 0 0 0 r p m 离心i m i n ，用杯碟法 测定上清液的抑菌活性。 2 2 3 酸性末端产物千扰的排除”柳 发酵液对供试菌的抑制作用，可能是代谢合成的乳酸菌素，也可 能是酸性末端产物如乳酸、乙酸或其他有机酸作用的结果。为了排除 酸性末端产物的干扰，将培养4 8 h 的发酵液离心，取上清液( p h 3 9 ) 进行抑茵试验( 以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为供试菌) ，分别 以乳酸、乙酸调等量的发酵培养基至p h 3 5 作为对照。 2 2 4 过氧化氢干扰的排除池捌 乳酸菌代谢过程中产生的过氧化氢也可能抑制细菌的生长，尤其 是抑制g 一菌的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。用过氧化氢酶处 理培养4 8 h 后的发酵上清液，以大肠杆菌为供试菌进行抑菌试验，以 未经处理的发酵上清液为对照( 两者p h 值一致) 。 四川大学硕士学位论文 2 3 类细菌素产生菌的鉴定 2 3 1 菌种的初步鉴定慨“。枷 采用形态观察、生理生化和分子生物学实验相结合的方法进行特 性鉴定，并以伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 和乳酸细菌分类鉴 定及实验方法作为分类参考。 2 3 2 扫描电镜( s e m ) 的制片方法懈蜘 a 将菌悬液用p h 7 2 的0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) 冲洗三次； b 最后一次悬浮于适量p b s 中，浓度以滴在3 4 m 矗小玻片上 密度均匀、菌落不相互重叠为宜； c 在3 4 珊吡2 小玻片上铺放f o r m v r a 膜( 方法同超薄切片) ，3 7 干燥； d 菌悬液稀释到适当浓度后滴在小玻片上，室温静置1 0 m i n ，将 多余细胞悬液吸去； e 将小玻片面朝上放入称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓慢加入1 冷却的戊二醛溶液，没过样本即可，4 c 固定2 h 以上或过夜； f p b s 洗三次： g 随即加1 四氧化锇，固定3 0m i a 或更长； h p b s 洗三次； i 逐级脱水：5 0 ，7 0 、9 0 丙酮各一次，1 0 0 两次，每次5 1 0 r a i n j 用醋酸异戊酯逐级脱丙酮，5 0 、7 0 、9 0 各一次，1 0 0 两 次，每次5 1 0 m i n ； k 放入临界点干燥仪进行干燥； i 以碳、金分别喷镀： m 取出样本，扫描电镜观察( 如不能立即观察，则应继续保存在 真空条件下或干燥器内) 。 2 3 3g + c 摩尔百分含量测定 采用热变性温度法( t h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r et m ) 法。 四川大学硕士学位论文 a 将待测的d n a 样品用1 s s c 适当稀释，装入石英比色杯，塞 好带有半导体点温计热敏电阻探头的塞子，另一支比色杯装入1 s s c 作对照，把比色杯放入分光光度计的带有加热装置的比色架内，固定 波长在2 6 0 r i m ； b 记录2 5 c 的吸光度，然后将温度迅速上升到5 0 ，取出比色 杯检查有无气泡，如有气泡用手指轻弹可除去； c 比色杯继续加热，估计到开始变性前3 5 c ，停止升温，稳定 5 1 0 m i n ，然后一度一度地升温，每升一度持续5 m i n ，保证杯内温 度充分平衡和在给定温度下变性彻底完成，直到升温后吸光度不再增 加为止，完成热变性扫描曲线，每次升温前准确记录比色杯内温度和 相应的吸光度； d 各吸光度乘以相应温度的相对膨胀体积，使校正成相当于2 5 水溶液体积的吸光度，用校正后的各吸光度分别除以2 5 c 的吸光 度，得出各温度的相对吸光度； e 根据各检测温度和对应的相对吸光度绘制d n a 热变性曲线， 曲线中点对应的温度即为t m 值； f 选取大肠杆菌k 1 2 菌株( 5 1 2 g + c ) 作为参比d n a ，依据既 有公式计算出待测菌株d n a 的g + c m 0 1 。 2 4 类细菌素高产菌株的诱变选育 2 4 1 紫外线( t l v ) 诱变处理 用1 0 m l 无菌水洗脱新鲜的c f l 0 出发菌斜面，梯度稀释制成每 毫升约1 0 2 个细胞的菌悬液，在紫外灯下进行诱变。紫外灯功率为 3 0 w ，照射距离3 0 c i n ，照射时间分为3 0 s 、6 0 s 、9 0 s 、1 2 0 s 、1 8 0 s 、 2 4 0 s 和3 0 0 s 。移取照射后的菌悬液0 1 m l 涂布于烘干的筛选培养基 平板，3 0 c 避光培养4 8 h 。 2 4 2 硫酸二乙酯( d e s ) 诱变处理蚓 以u v 诱变后抑菌圈直径增加最显著且稳定的突变株为出发菌， 用1 0 m l 无菌水洗脱其新鲜斜面，离心菌液，弃去上清液，以无菌水 四川大学硕士学位论文 洗涤两次，加入1 0 m l 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p h 7 o ) 制成菌悬液。取 4 r n l 加入到1 6 m l 生理盐水中，加入d e s 0 2 m l ，振荡处理6 0 m i n 。 加入0 5 m l 2 5 硫代硫酸钠溶液中止反应后稀释涂布于筛选培养基 平板，3 0 c 避光培养4 8 h 2 4 3 多轮复合诱变嘶刚 以d e s 诱变后抑菌圈直径增加最显著且稳定的突变株为出发菌， 连续多轮进行u v 与d e s 相结合的诱变处理，具体方法见2 4 1 和 2 4 2 。 2 5 发酵条件优化试验 2 5 1 培养基组分的优化 2 5 i i 单因素试验油。“卸 检测不同的碳源、氮源、生长因子对抑菌活性的影响。 2 5 1 2 正交试验瞄蜘 通过上述单因素试验，选取培养基中3 个主要成分( 1 种碳源与 2 种氮源物质) 进行3 因子3 水平的正交试验，选用1 1 9 ( r ) 正交表 ( 见表1 ) 。 2 5 2 发酵条件对抑菌活性的影响池“删 检测不同的培养温度、起始p h 值、培养时间、培养方式、接种 量、培养基装量和金属离子对抑菌活性的影响。 2 60 1 ：10 所产类细菌素生物学特眭的研究眇町 2 6 1 对蛋白酶的敏感- 性 取等量c f l 0 发酵上清液数份，用l n 的h a 和i n 的n a o h 调节 其p h 值至蛋白酶k 和胰蛋白酶的最适作用p h 7 6 ，按o 5 r a g m l 入蛋白酶k 、胰蛋白酶和适量无菌水，在3 7 下温育1 h 后，1 0 0 c 水 四川大学硕士学位论文 浴l m i n 灭活再将p h 值i 周i e nc f l 0 发酵液的初始p h 值，并以未 经处理的原液为对照，进行抑菌试验( 以铜绿假单胞菌为供试菌) 。 表1 培养基主要成分的正交试验表 n o 1 n o 2 n o 3 n o 4 n o 5 n o 6 n o 7 n o 8 n o 9 1 5 0 1 5 0 1 5 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 2 5 0 2 5 0 2 5 0 0 7 5 1 0 0 1 2 5 o 7 5 1 0 0 l2 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 o 5 0 0 7 5 1 0 0 0 7 5 1 0 0 0 5 0 1 0 0 0 5 0 o 7 5 2 6 2 对液化酶、糖化酶的敏感性 取等量c f l 0 发酵上清液数份，用l n 的h c i 和1 n 的n a o h 调节 其p h 值至p h 7 3 ，按0 5 m g m l 加入液化酶，9 0 c 温育l h ，再加入 糖化酶( 0 5 m g m l ) ，6 0 c 温育l h ，最后将p h 值调回到p h 3 9 ， 以未经处理的原液为对照，进行抑菌试验( 以金黄色葡萄球菌为供试 菌) 。 2 6 3 热稳定性 取等量的c f l 0 发酵上清液分别于6 0 c 、8 0 c 、1 0 0 c 和1 2 0 c 恒 温处理2 0 r a i n ，以未经处理的原液为对照，进行抑菌试验( 以金黄色 葡萄球菌和铜绿假单胞菌为供试菌) 。 2 6 4 不同p h 值对类细菌素抑菌活性的影响 取等量的c f l 0 发酵上清液用1 n 的h c i 和l n 的n a o h 调至不 同p h 值，以未经处理的原液为对照，进行抑菌试验( 以铜绿假单胞 菌为供试菌) 四川大学硕士学位论文 2 6 5 类细菌素抑菌活性的持久性 将于室温下放置长达6 个月的c e l 0 发酵上清液每隔1 个月取1 次做抑菌试验( 以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为供试菌) ，并以 新鲜活化后的发酵液为对照。 2 6 6 抗菌谱分析 选取i 4 所列的g + 菌、g 一菌、酵母菌和真菌作为供试菌，检测 c f l 0 发酵上清液对各供试菌的抑制作用，以确定其抗菌谱。 2 7c f l0 菌株酒精耐受性的研究 取等量( 1 0 0 m k ) 发酵培养基数份，加入不同百分比含量的无水乙 醇，混匀，以相同的接种量接入c t l 0 菌液，厌氧密闭条件下，3 7 c 静置培养4 8 h ，用离心后的发酵上清波进行抑菌试验( 以铜绿假单胞 菌为供试菌) ，并以未经处理的原液为对照。 2 8c f l 0 菌株的固定化试验咖 2 8 1 固定化小球( c a - a l g 胶珠) 的制备鼬侧 a 离心培养了4 8 h 的c t l 0 菌悬液，4 0 0 0 r p m ，1 0 m i n b 收集细胞，用8 无菌生理盐水洗涤2 次，制成8 m l 生理盐水 菌悬液； c 取上述菌悬液i m l 与5 0 r o l l 海藻酸钠溶液混匀，3 0 c 水浴； d 将2 0 0 m l 0 1 5 m o l l 的c a c l 2 溶液移入烧杯中，3 0 c 水浴1 0 m i n 后将灭过菌的磁力搅拌子置于其内，将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌； e 。将海藻酸钠菌悬液移入注射器中，垂直匀速滴入c a c l 2 溶液 中，形成直径2 3 m m 的固定化小球，滴加完毕后。室温固定化7 h ； f 倾去溶液，以无菌生理盐水洗涤c a - a l g 胶珠2 次，置于1 5 0 m l 无菌生理盐水中，4 备用( 如图3 ) 2 8 2 微囊化( a c a ) 小球的制备隗“唧 a 将c a - a i g 胶珠j t 于1 0 0 m l 0 6 壳聚糖溶液( 溶于i l 酸、 四j i i 大学硕士学位论文 p h 5 5 ) 中进行膜反应； b 1 5 r a i n 后取出用无菌生理盐水洗净，再用1 0 0 m l 外层修饰剂 ( o 1 5 海藻酸钠溶液) 浸泡5 r a i n c 修饰完毕后用无菌生理盐水洗涤，浸于1 0 0