（农业昆虫与害虫防治专业论文）粉纹夜蛾离体细胞诱导抗菌肽基因的cdna克隆与序列分析.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e 8 1 $ 中文摘要 抗菌肽是生物体内由特定基因编码产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽。广 泛存在于昆虫、两栖动物、甲壳动物、软体动物、鱼类、鸟类、植物、哺乳动物等 生物体内，具有广谱抗菌、抗病毒、抑制肿瘤的生物活性和很好的应用前景。 第一种抗菌肽是从昆虫中鉴定出来的，昆虫成为研究抗菌肽的首选生物。在诱 导和非诱导的情况下，昆虫能产生各种类型的抗菌肽，参与机体对入侵病原微生物 的免疫应答反应，是机体免疫系统中对抗外界感染的重要防线。 目前，这些研究主要集中在活体上，随着研究的深入，由于离体细胞在分子水 平研究基因性质的优越性，越来越多的研究者尝试用离体培养的昆虫细胞来研究昆 虫抗菌肽的诱导和表达。实验已证明用脂多糖、昆布多糖、鞭毛蛋白以及热灭活的 大肠杆菌等物质诱导果蝇、棕尾别麻蝇、墨西哥棉铃象、白纹伊蚊、粉纹夜蛾等昆 虫的细胞系表达了抗菌肽。 本实验室已成功的利用大肠杆菌d h 5 a 诱导粉纹夜蛾t r i c h o p l u s i a n i 卵细胞系克 隆株b t i t n - 5 8 1 细胞产生了抗菌活性物质，初步判断其为尚未发现并鉴定的抗菌 肽。 为了进一步验证这一结果并获得其基因序列，本实验对经大肠杆菌d h 5 a 诱导 的t n 一5 8 1 中产生的物质进行抗菌活性检测后，通过t r c i n es d s p a g e 分离出差异 蛋白带，将差异蛋白带经p v d f 转膜后利用e d a n l a n 降解法测定其n 末端l o 个氨 基酸序列，据此设计基因特异性引物，提取5 b i 细胞总r n a ，采用3 r a c e 法分 离克隆待鉴定的抗菌肽e d n a 序列，并对所得基因序列进行生物信息学分析。结果 如下： ( 1 ) 5 8 1 细胞经灭活的e c o l i 诱导后所产生的诱导产物有一定的抑菌活性。 ( 2 ) t r i c i n es d s p a g e 分析了5 8 1 细胞诱导样品比对照样品多出l 条较为明 显的蛋白带，分子量在8 k d 左右。 ( 3 ) 差异带n 端1o 个氨基酸序列为a v 悄v - e t ( a ) i ( d ) ，a a - v 。 ( 4 ) 将3 r a c e 克隆得到的目的基因测序，并推断其氨基酸序列及分子量。该 c d n a 序列全长为4 3 0 b p ，其中包括2 1 6 b p ( 不完整) 开放阅读框，推测编码7 2 个氨 基酸的多肽，分子量约为7 4 9 0 k d ，等电点p i 为4 1 7 ，同时含有2 1 4 b p 的3 非转译 区。其n 末端l o 个氨基酸序列与e d m a n 降解法所得的氨基酸序列完全一致，分子 量也与t i s c i n es d s p a g e 显示的差异条带分子量接近。因此，初步判断其为抗菌肽 硕士学位论文 m a s t e r + st h e s i s 基因。 ( 5 ) 将所得基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，结果显示该基因 与核糖体基因有较高的同源性，而与已报道的抗菌肽基因基本没有同源性。 关键词：抗菌肽；抗菌肽基因；粉纹夜蛾t r i c h o p l u s i ar h 卵细胞系克隆株 b t i - t n - 5 8 1 ；t r i c i n es d s - p a g e 电泳；3 r a c e ；生物信息学 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t a n t i m i c r o b i a lp e p f i d e si sak i n d o fs m a l lm wp o l y p e p t i d ew h i c hh a v et h e a n t i m i e r o b i a la c t i v i t y t h e ya r ec n e o d e e db ys o m es p e c i a lg e n e sa n de x i s ti nt h ei n n a t e i m m u n i t ys y s t e r mo f m a n yo r g a n i s m t h e yw i d e l ye x i s ti ni n s e c t ，a m p h i b i a n , c r u s t a g e a n ，m o l l u s k ，p i s c e s ，b i e d s ，p l a n t s , m a m m a la n ds oo n t h e s ep e p t i d e sh a dt h e 、析d e r a n g eo f a n t i b a c t e r i a l ，a n t i v i r a ls p e c t r u ma n di n h i b i t i n gg r o w t ho f t u m o r c e l l t h ef i r s ta n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sw a si s o l a t e df r o mi n s e c t v a r i o u si n s e c t sa r ek n o w n t op r o d u c eh u m o r a la n t i b a c t e r i a lp r o t e i n si nr e s p o n s et oi n j e c t i o no f d e a do rl i v eb a e t e r i & i n s c e ta n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sw e r eb i o a c t i v ep e p t i d e s , w h i c hp l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei n i n s e c ti m m u n i t y 耽e ya l et h ef i r s td e f e n s ea g a i n s te n v i r o n m e n ti n f e c t i o nf o rt h e o r g a n i s m t h ep r o p a g a t i o no fi m m u n e - r e s p o n s i v ec e l l s nv i t r oh a sp r o v i d e dt h e b a s i sf o r s u b s t a n t i a lc o n t r i b u t i o n st oo u ru n d e r s t a n d i n go fm a n ya s p e c t so ft h ei m m u n er e s p o n s e i nc o n t r a s t ，t h ep o t e n t i a lf o re x p l o r i n gt h ei n n a t ei m m u n er e s p o n s eo fi n s e c t su s i n g c u l t u r e dc e l l si so n l yb e g i n n i n gt ob ed e v e l o p e d m a n ye x p e r i m e n t sh a v ep r o v e dt h a t m a n yi n s e c t c e l ll i n e si n v i t r o ( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r , s a c r o p h a g ep e r g r i m e ， a n t h o n o m u sg r a n d i s , a e d e sa l b o p i c t u s , t r i c h o p l u s i an ow e r ei n d u c e db yt r e a l r n e n tw i t h l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l a m i m a r i n ，f l a g e l l i na n dh e a t - k i l l e de s c h e r i c h a ic o l ic a np r o d u c e a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s s o ，w ei n d u c e da n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o mc u l t u r e dc e l l s i np r e v i o u sw o r k , t h r e ec u l t u r e dc e l l sf r o ml e p i d o p t e r aw e r es t i m u l a t e dw i t h h e a t - k i l l e de s c h e r i c h i ac o l i , a n t i b a c t e r i a la s s a y ss h o w e dt h a tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f i n d u c e db t i t n - 5 8 1c e l ll i n e ( 5 8 1 ) w a sh i g h e s t t h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d ew i 也a m o l e c u l a rw e i g h to f7 4 9 0 k d ，p i4 1 7 ，i n d u c e df r o mb 1 1 - t n - 5 8 1c e l ll i n ew a sas t u r l ( i n da n t i b a c t e r i a lp e p t i d e i no r d e rt os t u d yt h ee d n as t r u c t u r eo f t h i sn e w p e p t i d e ，w ed e t e c t e dt h ea n t i b a c t r i a l a c t i v i t yo ft h e5 8 1c e l ls e c r e t i o na n dt h e nu s e dt r i c i n es d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i st o s e p a r a t et h en e wp e p t i d e a f t e rt r a n s m e m b r a n ei np v d f , s e q u e n c i n gi t sa m i n oa c i d s s e q u e n e e eo f n - t e r m i n a t i ob ye d m a nd e g r a d a t i o n t h e nw ed e s i g na3 r a c eg s p a n d e x t r a c tt h et o t a lr n af r o mt h e5 b ic e l l w eo b t a i n e dt h ec d n as e q u e n c eb y 3 r a c e a n dt h e na n a l y s e di ti nb i o i n f o r m a t i c s o u rr e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t h er e s u l to f a c t i v i t ya s s a yo f i n d u c e ds u p e m a mf r o m5 b ic e l ls h o w e dt h a tt h e i n d u c e dp r o d u c t i o nf r o mi t ss e c r e t i o ns u p e r n a t a n tc a nh a v ea c t i v i t i e sa g a i n s t m i c r o b e ( 2 ) t r i c i n es d s p a g e f o u n d t h a t a n e ws m a l l p e p t i d e w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f a b o u t8 0 0 0 d a , w a sp r e f e r e n t i a l l yi n d u c e di n5 b ic e l l ( 3 ) i t s 舡n i n oa c i d ss e q u e n e c eo f n - t e r m i n a t i oi sa - v 刑- v - e - t ( a ) 1 0 9 ) 一a a v ( 4 ) 1 1 忙c d n ag e n eo ft h en e wp e p t i d ew a ss u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o m5 8 1 i t c o n t a i n s4 3 0 b pb a s e s t h i s g e n ee n c o d e sap e p t i d eo f7 2a m i n oa c i d sw i t h 7 9 2 0 k da n dc o n t a i n sa 2 1 6 b p o p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) a n d2 1 4 b p 的 3 u t r ( 5 ) b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si n d i c a t e dt h a ti th a sah i g hh o m o l o g yw i t hr i b o s o m e g e n e k e yw o r d s ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ；a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sg e n e ；b t i - t n 5 8 1c e l ll i n e ； t r i c i n es d s p a g e ；3 r a c e ；b i o i n f o r m a t i c s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 谴 户| z f 日期：哆年6 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：立缘 日期：9 7 年厶月日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圄童途塞堡銮厦溢卮；旦圭生；旦= 生；旦三生蕉查! 名：五望 日期n 牟6 月日 导师 日期 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，简称a a p ) 又称为抗微生物肽( a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e ) ，是由机体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性 肽类活性物质。它们广泛分布于整个生物界，是脊椎动物、无脊椎动物和植物的重 要免疫因子f 1 1 。 抗菌肽分子量小，活性强，功能广泛：它对g + 、g 。性细菌均存在较强的杀伤作用， 同时还具有一定的抗病毒、杀真菌、原虫、破坏癌细胞膜从而杀伤癌细胞 2 - 3 ，影响 精子的呼吸而具有杀精活性等作用。 抗菌肽作为小分子物质，可以快速合成并易于大量存储，与特异性免疫反应相比 能更加迅速地对病原菌作出反应，使其成为生物机体先天性非特异性防御系统的重 要组分。此外，抗菌肽还具有稳定、水溶性好、抗菌机制独特、对高等动物正常细胞 无害等特点，显示了在医学和农业上潜在的研究价值和应用前途。而且，随着对抗菌 肽的进一步了解，人们认识到它是新一代抗生素的理想候选者m 。这是因为抗菌肽 和常规的抗生素不同，抗生素是通过一系列酶合成的产物，而抗菌肽则是某个特定基 因编码的产物。在杀菌机制上，抗生素一般是通过抑制细菌细胞壁、蛋白质或d n a 等的合成来达到杀菌的目的，所以抗生索的抗菌一般是用特殊的受体，细菌容易通过 变异对抗生素产生抗性，而抗菌肽的作用机理完全不同于传统的抗生素，它能杀死已 产生耐药性的病原菌突变种，而且在使用过程中不易产生具有抗性的突变种。其次， 在病原菌感染中，用抗生素治疗实际上对有机体是有害的，因为它能刺激内毒素的释 放，有时还会造成脓毒休克，但使用抗菌肤时就无此现象发生，并且它能抑制细菌产物 诱导产生对人体有害的细胞因子。因此，近年来有关抗菌肽及其应用逐渐成为动物 学、植物学、药理学及生理学等领域的研究热点。 目前对抗菌肽的研究大多数集中在昆虫上，当昆虫细胞被感染后，其体内能够 快速产生一种免疫诱导分子抗菌肽( a a t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) ，抵抗大多数微生物 的侵染【l o 】。最早发现的抗菌肽是1 9 7 2 年瑞典科学家b o m a a 等首先从天蚕蛹中的 发现i l ”，抗菌肽研究真正兴起则是从2 0 世纪8 0 年代初开始，即1 9 8 0 年h u l t m a r k 等人通过对滞育的美国天蚕h y a l o p h o r ac e c r o p i a 幼虫注入活的e c o l i 以诱导从其 血淋巴中分离出两种低分子量和碱性极强的具有很强抗菌活性的蛋白质分子1 1 2 1 。迄 今己在昆虫中发现了超过2 0 0 种抗菌肽类物质 t 3 l 。 1 1 昆虫抗菌肽的分子结构及种类 昆虫抗菌肽的一级结构差别很大，由1 3 5 0 个氨基酸组成，分子量小于5 k d a ， 由于肽链中富含精氦酸或赖氨酸等带正电荷残基，故多为阳离子型。 昆虫抗菌肽在自然界中来源众多，据初步统计，目前人们已对8 目3 0 多种昆 虫进行了诱导免疫的研究，主要集中于鳞翅( 1 e p i d o p t e r a ) 、鞘翅；( c o l e o p t e r a ) 、 双翅目( d i p t e r a ) 、膜翅l 寻( h y m e n o p t e r a ) ，还有半翅e 1 ( h e m i p t e m ) 、等翅目( i s o p t e r a ) 、 同翅目( h o m o 搿e m ) 及蜻蜒( o d o n a t a ) l 埘。不同昆虫中存在的抗菌物质有所不同。 根据其氨基酸组成和分子结构特点分为5 类：即天蚕素类( c e c r o p i n s ) 、昆虫 防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 、富含脯氨酸的抗菌肽( p r o l i n e - r i c hp e p t i d e s ) 、富含甘氮酸 的抗菌肽( 出y s m e r i c hp e p t i d e s ) h ”、抗真菌肽( a n t i f u n g a lp e p t i d e ) 。 1 1 1 天蚕素类 天蚕素族抗菌肽是大约4 k d a 的阳离子肽由3 l 4 0 个氨基酸残基组成，分子 内很少有半胱氨酸残基，分子主要为螺旋构象，含有两个两性a 一螺旋。其a 螺旋 结构位于n 端和c 端。其n 端区富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，带高度 正电荷，亲水。c 端区则富含丙氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸，c 端往往酰胺化，中 性或弱酸性，不带电或带少量负电荷，疏水。天蚕素类的抗菌谱包括抗革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌，其中对革兰氏阴性菌抗菡活性较强。p i 为8 9 9 5 ，不易被胰 蛋白酶、胃蛋白酶降解。该类抗菌肽以由惜古比天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 中鉴 定的e e c m p i n a f 为典型代表1 1 5 l 。 天蚕素是最早发现的抗菌肽。它主要发现于鳞翅目和双翅目，在其他目昆虫中 也有发现，比如双翅目的果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 、麻蝇( s a r c o p h a g a p e r e g r i n e ) 、膜翅目的意大利蜜蜂( a p i sm e l l i f e r a ) 等。 1 1 2 昆虫防御素 昆虫防御素含有6 个c y s 形成的3 或4 个分子内二硫键，3 个不同的结构域： 一个氨基酸末端环，一个双亲性a 螺旋和一个羧基端反相平行的8 折叠。分子内二 硫键在维持防御素的体内活性方面起重要的作用。目前，从双翅目、鞘翅目和半翅 目几十种昆虫中均已发现防御素，不同种类昆虫的防御素分子结构具有较高的同源 性，该类抗菌肽抗菌谱较窄，主要对金黄色葡萄球菌等g + 菌具有较强的抗菌活性。 这类抗菌肽首先从半翅目昆虫肉蝇( s a r c o p h a g a p e r e g r i n a ) 中分离得到，因与 哺乳动物防御素d e f e m i n s 高度同源而被命名。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 1 1 3 富含脯氨酸的抗菌肽 c a s t e e l s 等( 1 9 8 9 ) 首先从膜翅目的意大利蜂似m e l l i f e r a ) 发现，富含脯氨酸或精氨 酸，其中脯氨酸含量在2 5 以上。目前，已在双翅目、膜翅目、半翅目和鞘翅目中 发现此类抗菌肽，主要对g 一起作用，对g + 无作用。 这类抗菌肽由1 5 3 4 个氨基酸残基组成，是2 4 k d a 富含p r o 或a r g 的多肽， 其中脯氨酸含量在2 5 以上。肽链中脯氨酸往往以并联或三联形式与碱性残基排列 在一起，富含脯氨酸的抗菌肽可以分为两类：一类无取代基，另一类有o 一糖基 化。这两类抗菌肽高度同源，结构上的区别在于第二类有的苏氨酸在羟基上发生糖 基化。推测富含脯氨酸的抗菌肽原来都可能带有取代基，只是在进化的过程中，由 于某些突变而导致其失去取代基。而取代基对抗菌活性有一定影响，有研究表明不 含取代基的抗菌肽或原来带取代基的抗菌肽分子在失去取代基后，它们的活性都明 显下降【l q 。富含脯氨酸的抗菌肽一级结构中有多个特征性的p r o ar g | p r o 基序l j ”。 1 1 4 富含甘氨酸的抗菌肽 这类抗菌肽从天蝇、麻蝇最先中发现，其共同特点是一级结构中富含甘氨酸， 分子量较大，为g - 3 0 k d 。该类抗菌肽c y s 含量少或不含c y s ，不形成分子内二 硫键，氨基酸残基上也不具有修饰基团。富含甘氨酸的抗菌肽有两种相对分子量较 大，一种是从天蚕中分离的a l l a c i n ；另一种就是从肉蝇中分离的s a r c o t o x i n si i 。 a t t a c i n s 的分子量超过2 0 k d ，仅对部分革兰氏阴性菌表现抑制活性。s a r e o t o x i n s i i 是目前昆虫中发现的分子量最大的抗菌肽。为3 0 k d ，来源于麻蝇，s a r c o t o x i n s i i 的c 端大约2 5 0 个氨基酸区域内富含甘氨酸n 端约1 5 个氨基酸区域内富含脯氨酸，与 a t t a c i n 一样，s a r e o t o x i n s i i 也是只对部分革兰氏阴性菌有作用。目前，在鳞翅目、 双翅日、半翅目、鞘翅日和膜翅目昆虫中都发现了此类抗菌肽，此类抗菌肽中含量 很高的g l y 对提高肽链的弹性及广谱抗菌等可能起重要作用 1 7 - 1 9 3 。 1 1 5 抗真菌肽 i i j i m a 等( 1 9 9 3 ) 首次从麻蝇幼虫血淋巴分离出一小肽，该肽抑制白色假丝酵 母c a n d i d aa l b i c a n s 生长，因此命名为a f p ( a n t i f u n g a lp e p t i d e ) 【2 0 】。a f p 中高含量 的组氨酸在抗真菌活性中起关键作用【2 1 五2 1 。随后发现了与其相似的h o l o 仃i c i n ，此分 子中也富含g l y 和h i s ，两者分子量相近，但氨基酸序列无同源性。 3 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s l s 1 2 昆虫抗茵肽的作用及机理 1 2 1 抗菌肽的抗菌作用及其机理 抗菌肽对g + 和g 钧有较高效广谱的杀伤作用，研究发现，抗菌肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、变形杆菌、乙型溶血链球菌等4 0 多个属均 有抑制效果，部分抗菌肽对真菌有杀伤或杀灭作用皤1 。此外，抗菌肽对一些重要 的植物病原菌也有较强的杀伤作用 2 4 1 。 抗菌肽对细菌的作用机理主要有五种学说：( 1 ) 孔洞学说：认为正离子肽通过 静电作用作用于负电性的细菌膜磷脂头部，然后疏水部分插入平面双脂层或脂质 体，形成瞬间通道或孔洞，从而导致细胞内容物泄漏和细菌死亡。( 2 ) 离子通道学 说：抗菌肽分子靠静电吸引作用吸附到膜表面，抗菌肽分子的疏水端插入胞膜中， 同时该分子的两性螺旋结构区插入胞膜内，多个肽分子共同作用形成了离子通道 1 2 5 l 。( 3 ) 抑制细胞呼吸学说：f e h l b a u m 等用一定浓度来自刺肩蝽的一种抗菌肽处理 细胞l h 后，细胞呼吸减弱，6 h 后，呼吸完全停止。因面认为，该抗菌肽可能是通过 控制细胞的呼吸作用来杀菌的。( 4 ) 抑制细胞壁形成学说：一种分子量为3 k d 的麻 蝇毒素，主要抑制细菌正在形成的细胞壁，对已经形成的细胞壁没有作用。( 5 ) 可 变“毯”模型：肽相通过与膜脂作用来破坏膜屏障而不是形成通道 2 6 - 2 7 。 1 2 2 抗菌肽的抗病毒作用及其机理 a n d r e u s 和r e n i s 报道烟芽夜蛾( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 幼虫的血淋巴对6 种d n a 、 r n a 病毒有明显的抑制作用瑚1 ，使病毒感染力迅速降低，而且这种抗病毒活性具 有广谱性。w a c h i n g e r 报道蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒 h i v - i 的基因表达，从而抑制减少h i v 1 的增殖唧3 。戴祝英等发现家蚕抗菌肽对苜 蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体的形成有抑制作用日o 】。 1 2 3 抗菌肽对某些原生动物的作用及其机理 抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物寄生虫病的寄生虫，如杀菌肽的类似物 s h i v a - i 可杀死疟原虫；合成的天蚕素蜂毒索杂合体对莱什曼原鞭毛虫订有损伤作 用，起作用的靶目标是细胞质膜，它可以快速降低细胞膜的通透性，破坏膜电势， 质膜形态也受到损坏。s h a h a b u d d i n 研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的 不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。此外， 抗菌肽对变形虫，四膜虫，阴道滴虫等原虫均有一定的杀伤作用。 4 1 2 4 抗菌肽对肿癌细胞作用及其机理 抗菌肽对癌细胞的作用主要是可使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体 出现空泡化，嵴脱落，核膜界限榛糊不清，有的核膜破损，核染色体d n a 断裂，并 抑制染色体d n a 的合成。 大量研究表明肿瘤细胞比正常细胞对抗菌肽具有更高的敏感性m 3 。抗菌肽对 正常的细胞几乎没有作用，但对发生病变的细胞，如肿瘤细胞有强烈的杀伤作用。 这种对肿瘤细胞进行选择性杀伤的机理，推测可能与细胞骨架的结构差异有关。正 常细胞存在高度发达的细胞骨架系统，它的存在抵抗了抗菌肽作用。癌细胞的细胞 骨架系统由于生长旺盛丽不发达，从而不能抵抗抗菌肽的作用。 此外有报道说抗菌肽还可以调动机体的免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌瘤 的入侵【3 3 】。 1 2 5 抗菌肽其他作用及其机理 研究发现，某些抗菌肽能够促进伤口的愈合。分别用抗菌肽c y t o p o r i n 和磺胺嘧 啶银制成的软膏治疗小鼠烧伤，c 卿面组愈合快，疤痕小，磺胺嘧啶银组虽然创 面感染得到了控制，但创面愈合较慢，疤痕也大【3 3 1 。其作用机制为：抗菌肽能刺激 纤维母细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖，促进创面肉芽组织的增生，加快创 面的愈合。此外，有些抗菌肽还具有内毒素结合能力【蚓。 1 3 昆虫抗菌肽的应用前景 抗菌肽作为一类抗菌能力强、抗菌谱广、种类多、靶菌株不易产生抗性突变的 功能性多肽，在医药卫生、农业、食品工业等领域逐渐显示出广阔的应用前景。 1 3 1 医药领域 由于它具有广谱的抗菌、抗病毒、抗癌能力，以及活性浓度低，无致畸变作用， 无蓄积毒性，不易产生抗药性等优点，有望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物， 其潜在药用价值倍受人们关注。 抗菌肽在医疗中的作用最初研究是在在局部感染治疗方面，m a g a n i n s 利用 m s i 7 8 进行临床实验，主要用于治疗糖尿病患者由于微生物感染引起的脚部溃烂。 目前己进入临床实验阶段的抗菌肽还有有乳链杆菌肽【3 ”、源于马盖宁的m s i 7 8 及源 于猪p r o t e 酣n 的i b 3 6 7 蚓。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 1 3 2 农业领域 在农业领域，通过基因工程的方法将抗菌肽基因导入动、植物体内，为改造物 种获得抗病动、植物品系提供了有效途径。 抗菌肽基因工程在模式植物烟草和马铃薯中首先获得成功。j a y n e s 等将s h i v a - 1 和8 b - 3 7 基因转入烟草和马铃薯中获得的转基因植株青枯病发病延迟，病情指数低 下，植株死亡率降低。此后国内外学者在转抗菌肽基因方面都有相继报道，获得了具 有不同抗性的植株【3 7 4 ”。 1 3 3 食品工业和化妆品领域 抗菌肽具有广谱的杀菌活性，同时对人无毒副作用，因此可被研制开发成有应 用价值的新型食品添加剂，是食品工业中优良的防腐剂、保鲜剂和保藏剂。从乳酸 菌中分离的抗菌肽细菌素，可抑制食品中的各种病原微生物的生长而作保藏剂。 抗菌肽在化妆品上用作防腐剂，它的抗菌和美容作用，比化学防腐剂用于化妆品 具有独特的优势和广泛的市场潜力【4 2 】。 1 4 昆虫抗菌肽的分子生物学研究 随着分子生物学技术的发展，昆虫抗菌肽和抗菌蛋白的基因和e d n a 陆续被克 隆和分离出来，人们在昆虫抗菌肽的分子结构、功能以及基因表达调控，诱导抗菌 机理方面已取得相当大的进展，并利用各种基因工程技术手段生产、改造、设计和 合成抗菌肽，把抗菌肽基因转移到动植物体内，以提高抗病能力。 1 4 1 昆虫抗菌肽基因的分子组成 在鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 以及包括果蝇在内的双翅目 ( d i p t e r a ) 昆虫中，编码抗菌肽( 如天蚕素、防御素等) 的基因已经被成功克隆，它们一 般由1 5 4 5 个氨基酸残基组成f 圳。研究发现，这些基因属于典型的真核基因，具 有一个c a a t 框和一个t a t a 框，转录产物具有一个特异的帽子位点和多聚腺苷 酸加尾信号序列( a a t a a ，并且具有内含子和假基因。 研究表明抗菌蛋白是通过基因启动，从头合成的。对抗菌肽c d n a 克隆序列的 分析表明，昆虫抗菌肽是由前体加工面来，前体含有一段信号肽，c 端有甘氨酸， 信号肽与成熟肽之间还有一段序列。前体在酶的作用下切去信号肽及信号肽与成熟 肽之间的序列，然后c 端酰胺化形成成熟的抗菌肽。抗菌肽的这种合成，就像其他 生物分泌的酶、激素一样，信号肽的存在有利于它的分泌，而其他结构的存在对保 6 护自身避免酶解，调节生物活性是有意义的【4 3 删。 1 4 2 昆虫抗菌肽基因的克隆和表达系统的研究 隧着抗菌默基因克隆技术不断的更新，人们可以构建c d n a 文库并进行 r t - p c r 扩增，或利用差异基因筛选技术【4 5 】选出感染与未感染的昆虫的差异表达基 因，还可以依靠生物信息学的手段鉴别抗菌肽基因序列 4 6 4 7 1 。随着模式生物( 女口果蝇 等) 测序工作的日臻完善以及生物信息学的不断发展，研究人员将能利用基因组搜索 发现具有保守结构域的基因片段，进一步克隆出更多的昆虫抗菌肽新基因。 利用基因重组工程菌是大量表达有活性抗菌肽的一条有效途径。现在抗菌肽的 表达体系主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒介导的昆虫表达系统。 大肠杆菌是目前应用最广泛的基因表达工具，但在利用大肠杆菌表达抗菌肽时，需 要考虑表达产物对工程菌的毒性以及表达产物稳定性等问题。对此，可以通过筛选 抗性株系以及采用融合蛋白表达途径的策略加以解决。如b a g h i a na 等于2 0 0 3 年 将修饰过的天蚕素b 基因以融合蛋白的方式在大肠杆菌中表达，不但避开了对宿主 的损伤作用，而且实现了高水平的表达f 4 s j 。 酵母表达系统是以酵母菌为宿主构建的表达系统，可有效地转录和翻译外源基 因，较好地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等加工修饰过程，较客观地表达天然 蛋白质的结构并维持其生物学活性2 0 0 5 年。苏志坚阳噜用天蚕素杂合肽基因和人 酸性成纤维细胞生长因子基因构建成融合基因重组质粒，然后转化到酵母中进行 表达，表达产物既有抗菌肽的抑菌活性，又有细胞生长因子的促进伤口愈合的能 力。 在杆状病毒介导的昆虫表达系统应用中，h e l l e r s 5 0 】等将编码天蚕素肽原的前体 片段克隆至菖蓿斜纹蛾核型多角病毒启动子的下游，旦的基因成功地在重组感染的 粉纹夜蛾末龄幼虫和天蚕滞育蛹中表达，且产量很高。 1 4 3 抗菌肽的转基因研究 1 4 3 1 转抗菌肽基因动物 通过转基因技术，抗菌肽抗感染抗肿瘤作用可在抗菌肽转基因动物中得到证实， 抗菌肽也可通过转基因动物获得。目前已报道的转抗菌肽基因动物主要有以下几 类： ( 1 ) 转抗菌肽基因蚊子p o s s a n i l 5 噜在c e c r 叩i i lb 基础上构建成杂合s l l i v a _ 3 ， 其前放一个谷胱甘肽转移酶( g s d 基因后介导进入质粒p g e x 2 t 。以蚊肠道特异性 7 硕士擘住论文 m a s t e r s t h e s i s 胰蛋白酶基因5 端区域作启动子、融合基因g s t s h i v a 3 作报告基因构建质粒导 入蚊子产生一种转基因蚊，此蚊子肠道内可合成并分泌的融合蛋i 刍g s t s h i v a - 3 对细菌和疟原虫有高效的杀伤力。k o k o z a 5 2 1 等将埃及伊蚊卵黄生成素 ( v i t e l l o g c n i n v g ) 基因与防御素a ( d e f e n s i na ，d e f a ) 基因连接组成的v g d e f a 融合基因转入伊蚊基因组中，获得了稳定插入v g d e f a 的转基因蚊子。此种转基因 蚊子只通过血液喂养而不需要病原菌感染激发，即可稳定表达转基因抗菌肽，因此 能有效控制病原菌在蚊体内的繁殖，从而阻断蚊虫介导的病原菌的传播。2 0 0 2 年i t o 等i ”j 表达了一种抗疟肽( s a l i v a r y g l a n d - a n g m i d g u t - b i n d i n g p e p t i d ei , s m l ) 。s m l 是 对蚊唾腺和中肠上皮有很强亲合力的一种抗疟肽，用它喂蚊可以阻止疟原虫的入 侵。 ( 2 ) 转抗菌肽基因小鼠r e e d w a 【川等将小鼠i l 一2 基因与抗菌肽s h i v a l a 基 因和s v 4 0 多腺苷酸化p 剪接信号肽连接构建的融合基因，注入小鼠原核期受精卵， 获得2 6 个转基因鼠系。经检测，证实转基因小鼠获得了较强的抗菌能力。2 0 0 1 年， 张永莲等报道在大鼠附睾组织中发现了一种新的抗菌肽基因b i n l b ，费照亮等睁5 j 在真 核细胞中表达了该基因，并建立了表达外源m b i n l b - h a 基因的转基因小鼠。 ( 3 ) 转抗菌肽基因昆虫d u r v a s u l a 5 6 1 ( 1 9 9 7 ) 等成功地获得一个转天蚕素a 基 因共生菌，此天蚕素a 转入昆虫长红猎蝽( r h o d n i u s p r o l i x u s ) 中，昆虫携带了此转基 因的共生菌后，感染昆虫的锥虫数量明显减少或消失。2 0 0 3 年黄贬东等p 将c a d 基 因整合到重组病毒a c n p v a d 中，以重组病毒感染s f 9 细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫，抑 菌活性试验证实了叫d 基因在昆虫培养细胞s f 9 和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得 到表达。表达产物具有抑菌作用。 1 4 3 2 转抗菌肽基因植物 近年来，随着植物转基因技术的发展，有关转抗菌肽基因植物的报道越来越多， 主要集中在抗病菌研究。通过转基因操作培育出抗病品种，丰富了遗传育种学理论， 提高了植物对环境的适应能力，促进了无公害农业领域的发展。近年来，转抗葳肽基 因植物已有较多成功报道。但也有些转抗菌肽植物的性能表现出不稳定性，其原因之 一被认为是转录水平上m r n a 或表达产物在细胞质中被降解 s s - 跏。另外由于生物 间有许多共性，某些用来攻击微生物的抗菌肽也会对动物和植物正常细胞造成伤害。 1 5 r a c e 技术简介 r a c e ( r a p i d - a m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ，c d n a 末端快速扩增) 是通过p c r 进 行c d n a 末端快速克隆的技术。c d n a 完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、 基因功能的研究至关重要。完整的c d n a 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术 获得。末端克隆技术是2 0 世纪8 0 年代发展起来的。 r a c e 的原理：首先用简并引物或别的方法获取基因的一部分序列，以此合成 基因特异性引物。在r t - p c r 时，在基因的两端加一段碱基序列( 同加酶切位点相 似) ，3 r a c e 利用这段碱基序列设计下游引物，利用已设计好的基因特异性引物作 为上游引物，p c r 扩增出3 端序列；5 r a c e 的原理与之类似，利用所加序列设计上 游引物，利用已设计好的基因特异性引物作为下游引物，扩增出5 端序列。 3 r a c e 原理及过程示意图如下： (1)target m 口n s c = = = = = z ：= = = = z = = = = = = = = = = = = = 了a a a j l k j 6 反尊专毒u 匠点z 5 c = = = = z = 互= = = = = = = = = 】a a a a a a a 闩馥制鬻浦他i 职链。d “嗡 ( 3 )+ 4 、莞惩千遁当盼载体l 4 ) t 1 6 本研究的目的和意义 本实验是在实验室前人工作的基础上所作的进一步研究。前期研究发现：经热 灭活的大肠杆菌d h 5 a 诱导后，粉纹夜蛾5 b i 细胞分泌了一种分子量为7 6 9 1 d a 的 抗菌肽，对其进行肽指纹图谱分析并将所得数据登陆到s w i s s p r o t 和n c b i 蛋白质及 多肽数据库进行检索，没有找到类似结构的抗菌肽或抗菌蛋白，说明这是一种尚未 发现并鉴定的抗菌肽。本实验的目的是对这种尚未鉴定的抗菌肽进行分子鉴定，应 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 用3 r a c e 技术获取其e d n a 序列，并对该序列进行生物信息学分析。实验结果可 为今后进一步研究该抗菌活性物质的分子结构和抗菌机理及建立表达系统奠定基 础，同时也是对从离体细胞中筛选和表达抗菌肽基因所作的一个初步探索。 1 0 2 实验材料 2 1 供试细胞系、菌株及质粒 粉纹夜蛾( t r i c h o p l u s i an i ) 卵细胞系克隆株b t i - t n - 5 b i ( 简称5 b i ) ，5 8 1 细胞由美国康奈尔大学g r a n a d o s 教授提供，本所保存。 实验菌株：大肠杆菌e c o l id h 5 a ，k 。：