（人体解剖与组织胚胎学专业论文）不同碘摄入量对子二代小鼠生长、脑发育的影响.pdf

天津医科大学硕七学位论文 中文摘要 目的： 研究不同碘摄入量对2 0 同龄、4 0 同龄子二代b a l b c 小鼠生长发育的影响及 大脑、小脑皮质和海马的形态学改变，进一步探讨碘缺乏和碘过量对子二代小 鼠生长发育、大脑、小脑发育及功能的影响。 方法： 选用断乳后一个月，体重在1 6 2 0g 的s p f v a f 级的b a l b c 小鼠，雌雄各 半，随机分为5 组：低碘组( l i ) 、适碘组( n i ) 、5 倍碘组( 5 h i ) 、1 0 倍碘组 ( 1 0 h i ) 、5 0 倍碘组( 5 0 h i ) ，l i 组动物饲以低碘饲料( 平均碘含量 5 0 9 9 k g ) ， 其余各组饲以正常饲料( 平均碘含量3 0 0 9 9 k g ) ，上述两种饲料中各种粮食的配 比相同，只是碘含量不同。l i 组饮用去离子水，其余各组饮用含不同浓度碘化 钾的去离子水，其饮水中碘化钾含量分别为1 0 1 t g l ( n i ) ，1 2 0 0 9 9 l ( 5 h i ) ， 2 7 0 0 1 a g l ( 1 0 h i ) ，1 4 7 0 0 ，t g l ( 5 0 r e ) 。小鼠每同的碘摄入量估计如下：小鼠每同 进食5 9 ，进水5 m l ，各组动物每日碘摄入量分别为： 1 9 9 d ( l i ) ，1 5 9 9 d ( n i ) ， 7 5 t e d d ( 5 h i ) ，1 5 i ，t g d ( 1 0 h i ) ，7 5 9 9 d ( 5 0 h i ) 。喂养三个月后，雌雄随机1 ：l 合 笼，连续传两代，分别取2 0 同龄、4 0 同龄子二代小鼠脑组织，电子天平称重， 中性福尔马林溶液固定后常规石蜡包埋，进行焦油紫染色、免疫组化( n s e 、 g f a p 、m b p ) 染色，观察大脑皮质，海马区神经元、星形胶质细胞及少突胶质 细胞形念学的改变。应用m o t i ci m a g e sa d v a n c e d3 1 图像分析系统测量以下指 标：焦油紫染色切片中大脑皮质分子层厚度；免疫组化切片中海马c a 3 区n s e 阳性神经元面数密度、平均光密度；c a l 区g f a p 阳性星形胶质细胞面数密度、 平均光密度及m b p 阳性少突胶质细胞平均光密度。小脑n s e 阳性神经元和 g f a p 阳性星形胶质细胞的面数密度( n a ) 、体积密度( v v ) 、细胞质的平均光 密度，m b p 阳性神经纤维平均光密度，小脑皮质分子层及颗粒层厚度。 结果： ， l 子二代小鼠生长发育：2 0 同龄时，l i 组和5 0 h i 组子二代小鼠的体重、脑 重和身长、尾长、后肢长与n i 组相比呈现出了不同程度的发育落后，其中l i 组表现更为明显。4 0 日龄时小鼠体格有所增长，但与n i 组比较，l i 组和5 0 h i 组仍呈现不同程度的发育落后。 天津医科大学硕士学位论文 2 子二代小鼠大脑皮质、海马发育：与n i 组相比，2 0 同龄、4 0 日龄子二 代小鼠其余各组均表现出不同程度的脑发育差别，其中l i 组、5 0 h i 组落后更为 明显，且差异有统计学意义。 3 子二代小鼠小脑皮质、颗粒层，髓质发育：与n i 组相比，2 0 日龄、4 0 日龄子二代小鼠其余各组小脑g f a p 、n s e 、m b p 及皮质层、颗粒层厚度均降低， 其中l i 组、5 0 h i 组落后更为明显，且差异有统计学意义。 结论： 1 子二代小鼠生长发育：碘缺乏和严重碘过量都会影响子二代小鼠的生长 发育，其中碘缺乏的影响更为明显，其机理可能与碘缺乏和碘过量所致甲状腺 功能低下有关。 2 子二代小鼠大、小脑皮质、海马发育：脑发育临界期碘缺乏和严重碘过 量都会影响子二代小鼠大脑皮质发育，海马区及小脑神经元、神经胶质细胞的 酶和蛋白的合成和代谢。 关键词：碘缺乏；碘过量；碘化钾；生长发育；大脑皮质；小脑；海马：n s e ； g f a p ；m b p ；子二代小鼠 i i 天沣医科大学硕士学位论文 o b j e c t i v e ： a b s t r a c t t os t u d yt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n ti o d i n ei n t a k eu p o nt h eg r o w t ho ft h es e c o n d f i l i a l g e n e r a t i o n b a l b cm i c ei n 2 0 一d a y ，4 0 一d a y a n dt h e d e v e l o p m e n t o f c e r e b r a l ，c e r e b e l l u mc o r t e xa n dh i p p o c a m p u s m o r p h o u s ，f u r t h e rt oa p p r o a c ht h e i n f l u e n c eo fi o d i n ed e f i c i e n c ya n di o d i n ee x c e s so nt h ed e v e l o p m e n to ft h es e c o n d f i l i a lg e n e r a t i o nm i c ec e r e b r a l ，c e r e b e l l u ma n dt h e i rf u n c t i o n m e t h o d s ： o n em o n t hb a l b cm i c ew e i g h t e d16 2 0g r a m ，h a l fo fm a l ea n df e m a l e , w e r e d i v i d e di n t of i v eg r o u p sr a n d o m l ya n dg i v e nb yd i f f e r e n td o s a g eo fk 1w h i c hw e r e l o wi o d i n e ( l i ) ，n o r m a li o d i n e ( n i ) ，5f o l dh i g hi o d i n e ( 5 h i ) ，10f o l dh i g hi o d i n e ( 10 h i ) ， 5 0f o l dh i 曲i o d i n e ( 5 0 h i ) g r o u pl 1w e r er a i s e dl o wi o d i n ef o r a g e ( c o n t a i n i n gi o d i n e o fl e s st h a n5 0p k g ) ，t h eo t h e rf o u rg r o u p sw e r er a i s e ds t a n d a r dd i e tc o n t a i n i n g i o d i n eo f3 0 0 1 t g k g t h et w of o r a g e sw e r ec o n t a i n i n gt h es a m em a t c hf a r ej u s t d i f f e r e n ti o d i n e g r o u pl id r a n kd e i o n i z e dw a t e r , a n dt h eo t h e rg r o u p sd r a n k d e i o n i z e dw a t e r c o n t a i n i n g d i f f e r e n t k ic o n c e n t r a t i o n r e s p e c t i v e l y t h e c o n c e n t r a t i o n so fk 1w e r e10 i | t g l ( n i ) ，12 0 0 1 t g l ( 5 h i ) ，2 7 0 0 1 - t g loo h i ) a n d 1 4 7 0 0 p g l ( 5 0 h i ) i nt h ew a t e r a c c o r d i n gt ot h ei n t a k eo f w a t e ra n dt h ed i e te v e r y d a y , t h em i c e si o d i n ei n t a k eo ft h ew h o l ed a yw e r ee s t i m a t e da sf o l l o w s ： 1l a g d ( l i ) ， 1 5 “g d ( n i ) ，7 5 1 t g d ( 5 h i ) ，1 5 1 a g d ( 1 0 h i ) ，7 5 t x g d ( 5 0 h i ) a f t e rt h r e em o n t h s ，t h e m i c em a t e da n dt h e i rs e c o n df i l i a lg e n e r a i o n so f2 0 d a ya n d4 0 一d a yw e r eo b s e r v e d t h ew h o l eb r a i n sw e r ew e i g h e d a f t e rf i x a t i o ni nf o r m a l i na n de m b e d d i n g ，t h e c e r e b r u mw e r es t a i n e dw i t hc r e s y lv i o l l e ta n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( n s e ，g f a f , m b p ) t h em o r p h o l o g yo fc e r e b r a lc o r t e xa n dt h en e u r o n ，a s t r o c y t e ，l i g o d e n d r o c y t e i nh i p p o c a m pw e r eo b s e r v e d t h ee x p r e s s i o no fn s ei nt h en e u r o no fh i p p o c a m p u s c a 3r e g i o n ，t h ee x p r e s s i o no fg f a pi nt h eh i p p o c a m p u sc a lr e g i o na n dt h e e x p r e s s i o no fm b pi nh i p p o c a m p u sw e r ee x a m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , a n d n u m e r i c a ld e n s i t yo na r e a ( n a ) a n da v e r a g eo p t i c a lw e r em e a s u r e d t h ee x p r e s s i o n so f n s ei nt h en e u r o n so ft h ep u r k i n j el a y e r ，t h ee x p r e s s i o n so fg f a pa n dm b pi nt h e 天津医科大学硕+ 学位论文 g l i a lc e l li nt h ec e r e b e l l u mm e d u l l aw e r ee x a m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , a n d v o l u m ed e n s i t y ( v v ) ，n u m e r i c a ld e n s i t yo na r e a ( n a ) a n da v e r a g eo p t i c a ld e n s i t y w e r em e a s u r e d r e s u l t s ： 1g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft h es e c o n df i l i a lg e n e r a t i o n ：i nt h es e c o n df i l i a l g e n e r a t i o no f2 0 一d a y ，c o m p a r e dw i t hg r o u pn i ，t h ew e i g h t ，b r a i nw e i g h t ，b o d yl e n g t h ， h i n d l i m bl e n g t hf e l lb e h i n di n g r o u pl ia n dg r o u p5 0 h i i nt h es e c o n df i l i a l g e n e r a t i o n4 0 d a y , c o n d i t i o nw a sm o r es e r i o u s 2c e r e b r a lc o r t e xa n dh i p p o c a m p u s ：i nt h es e c o n df i l i a lg e n e r a t i o n so f2 0 d a y , 4 0 - d a y ，c o m p a r e dw i t hg r o u pn i ，t h ee x p r e s s i o no fn s e ，g f a p ，m b p ，n u m e r i c a l d e n s i t yo na r e aa n dt h ea v e r a g eo p t i c a ld e n s i t yw e r ed e c r e a s e di ng r o u pl ia n dg r o u p 5 0 h i t h ec o n t r a s tw a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n t 3c e r e b e l l u m ：i nt h es e c o n df i l i a lg e n e r a t i o n so f 2 0 - d a y , 4 0 - d a y , c o m p a r e dw i t h g r o u pn i ，t h ee x p r e s s i o no f n s e ，g f a p ，m b p ，v v ，n a ，a o dw e r ed e c r e a s e di n g r o u pl ia n dg r o u p5 0 h i t h ec o n t r a s tw a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n s ： 1i nm i c e ，i o d i n ed e f i c i e n c ya n de x c e s sc a nc a u s eh y p o t h y r o i d i s m ，t h e na f f e c t e dt h e p h y s i c a ld e v e l o p m e n t ，a n dc o n d i t i o nw a sm o r es e r i o u si ni o d i n ed e f i c i e n c yg r o u p 2i nc r i t i c a lp e r i o do fm i c e ，i o d i n ed e f i c i e n c ya n ds e v e r ei o d i n ee x c e s sc a nb o t h i n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to fc e r e b r a l 、c e r e b e l l u mc o r t e xa n d h i p p o c a m p u s k e y w o r d s ： i o d i n ed e f i c i e n c y ；i o d i n ee x c e s s ；p o t a s s i u mi o d i d e ；g r o w t h ；c e r e b r a lc o r t e x ； c e r e b e l l u m ：h i p p o c a m p u s ；n s e ；g f a p ：m b p ：t h es e c o n df i l i a lg e n e r a t i o n i v 天滓医科大学硕七学位论文 缩写 t 3 t 4 f t 3 f t 4 l i n i 5 h i 10 h i 5 0 h i i d d i e d u s i c n s n s e g f a p m b p v v n a a o d d a b t h 符号说明 英文全称 t r i i o d o t h y r o n i n e t h y r o x i n e f r e e t r i i o d o t h y r o n i n e f r e e t e t r a i o d o t h y r o n i n e l o wi o d i n e n o r m a li o d i n e f i v ef o l dh i g h - i o d i n e t e nf o l dh i 曲- i o d i n e f i f t yf o l dh i 曲一i o d i n e p o t a s s i u mi o d i d e i o d i n ed e f i c i e n c yd i s o r d e r s i o d i n ee x c e s sd i s o r d e r s u n i v e r s a ls a l ti o d i z a t i o n c e n t r a ln e r v es y s t e m n e u r o n a l s p e c i f i ce n o l a s e g l i a lf i b f i l l a r ya c i d i cp r o t e i n m y e l i nb a s i cp r o t e i n v o l u m ed e n s i t y n u m e r i c a ld e n s i t yo na r e a a v e r a g eo p t i c a ld e n s i t y d i a m i n o b e n z i d i n e t h y r o i dh o r m o n e v i 中文译名 三碘甲状腺原氨酸 四碘甲状腺原氨酸 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺索 低碘 适碘 5 倍高碘 l0 倍高碘 5 0 倍高碘 碘化钾 碘缺乏病 碘过多病 全民食盐加碘 中枢神经系统 神经元特异性烯醇化酶 神经胶质纤维酸性蛋白 髓鞘碱性蛋白 体积密度 面数密度 平均光密度 二氨基联苯胺 甲状腺激素 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行 研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致 谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：么缸日期诱年，月拥 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论 文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以 供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入 有关数据库。 保密v 1 ，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密囤。 ( 请在以上方框内打“4 ) 作者签名：应盘辜日期：口彦年j 月墙 导师签名：立槛日期：彳) 年，月编 天津医科大学硕士学位论文 月i j 吾 碘是人体必不可少的微量元素之一，在血液中以碘化物的形式存在。碘是 人体合成甲状腺激素必不可少的微量元素，甲状腺是维持生命活动的重要内分泌 腺。碘在人体内的生理作用是通过合成的甲状腺激素实现的，甲状腺激素包括 四碘甲状腺原氨酸( t 4 ) 和三碘甲状腺原氨酸( t 3 ) 。 甲状腺激素对机体体格发育的影响表现为：甲状腺激素刺激骨化中心发育、 软骨骨化，促进长骨和牙齿的生长。 甲状腺激素对中枢神经系统的影响表现为：甲状腺激素影响神经细胞的增 殖、迁移和分化；胶质细胞的增殖以及髓鞘的形成与发育。其中对神经细胞的 分化和髓鞘的发育有至关重要的作用，特别是神经细胞的迁移、分化，树突的 分支，树突棘和突触的发育及神经联系的建立和功能化都离不开甲状腺激素， 而这些结构和功能的发育和建立被认为是生后智力发育的物质基础。 从甲状腺激素对脑发育影响的角度考虑，可将脑发育分为三个阶段：第一 阶段是胎儿合成t h 之前，相当于人妊娠的头1 2 周( 早期妊娠) ；在小鼠是妊娠1 8 2 0 天。脑干大部分和大脑主要部分的神经发生都是在此阶段内完成的，而且开始 有神经元的移行行为。此时只有来自母体的t h ( 甲状腺激素) 起作用。第二阶 段是出生前的中晚期妊娠。在这个时期内，重要的神经元都发育成熟轴突延 伸和突触形成旺盛。此时的脑发育既受胎儿自身甲状腺产生的t h 又受来自母体 的t h 的影响。第三阶段是生后的神经发育阶段。在此阶段内完成神经胶质的发 育，轴突的髓销化，小脑神经元继续增殖、迁移和分化，直到脑发育成熟，在 小鼠是生后2 5 天以内。发育旺盛时期中更重要的是第一个时期，如果大脑皮层 与基底核的神经母细胞没有很好的增殖或迁移，以后的发育必然受到限制。在 脑发育的临界期内甲状腺激素的异常可影响子代中枢神经系统的发育。脑发育 i 临界期( c r i t i c a lp e r i o d ) 是中枢神经系统分化发育最旺盛的时期，是脑发育的关 键期。 机体在碘摄入不足或过量时都会影响甲状腺激素的合成水平，从而影响机 体正常的生长发育或导致一系列甲状腺疾病。缺碘地区出生的儿童，由于其胎 儿及新生儿时期碘摄入不足，甲状腺合成t h 不足造成甲状腺功能减退症( 甲减) ， 由于大脑和骨骼的发育受阻，可致身材矮小和智力低下，严重的就是克汀病( 呆 小病) ，较轻的只是表现轻度智力落后( 智商为5 0 6 9 ) ，称之为亚临床性克汀病( 亚 天津医科大学硕士学位论文 克汀) 。在脑发育过程中，神经元与胶质细胞都是t h 作用的靶细胞，t h 通过对 细胞分化和基因表达的特殊调节来协调细胞不同发育阶段的顺序发生，因此在 神经网络构建关键时期保证t h 于正常水平很重要。如果机体处于甲状腺激素合 成不足状态，c n s 中多种基因不能按照正常的时间顺序表达，造成c n s 髓鞘化等 一系列重要事件的延迟发生，从而造成c n s 功能不可逆性损伤。一系列由于缺碘 造成的障碍统称为碘缺乏病( i o d i n ed e f i c i e n c yd i s o i d e r s ) 或简称i d d 【。而及时尽 早补充碘和( 或) 甲状腺激素，可防止该情况的发生。科学补碘，合理实施全 民食盐加碘( u s i ) ，正是预防碘缺乏病的有效措施。 而全民食盐加碘的普及在预防碘缺乏病的同时也使我国部分高碘地区居民 碘摄入过量，并且由于地质构造的原因，我国存在大量的高饮水碘地区，近年的流 行病学调查统计，全国大约有近4 0 0 0 万人生活在这种高碘环境中【引。一次摄入大 剂量碘或长期持续性摄入较高剂量的碘所引起的一系列功能、形态和代谢障碍 称之为碘过多病( i e d ) ，过量碘摄入可导致高碘性甲状腺肿、碘甲亢、甲状腺功 能减退症等发生。碘过多病的发生与摄入碘的剂量、途径和持续时间以及机体 的耐受性有关。动物实验表明：高碘状态使大脑i i 型脱碘酶活性、胆碱酯酶含 量增加，使海马n s e 含量降低，可使大脑皮质及海马组织中一氧化氮合酶( n o s ) 活性降低，一氧化氮洲o ) 生成减少进而引起b c l 2 ( b 细胞淋巴瘤基因) 表达下调 导致脑细胞凋亡的发生，最终对神经组织造成损伤。高碘可使仔鼠大脑重量减 轻，脑蛋白质含量、r n a 含量降低；使鸡小脑脑沟变浅，小叶变矮，蒲氏细胞 总数减少，小脑蚓部矢状切面面积、皮质颗粒层和分子层面积均减少【3 刮。李英 华等对多代仔鼠的实验表明：随着传代次数增多：子三代仔鼠大脑锥体细胞损 伤程度比子一代严重，锥体细胞发育落后程度加重，高碘对小鼠脑发育和智力 有一定损伤作用，这种损伤随传代次数增加而增加【7 】。但钱明等峭j 应用3 0 篇文献 的高碘地区与碘正常地区的儿童智力m e t a 分析对比研究，认为尚不能肯定高碘 对儿童智力有影响。高碘对脑发育和智力的影响，尤其是对后代及人类健康的 远期影响，其机理有待于进一步实验研究。 本实验以b a l b c 小鼠为实验对象，成功复制了碘缺乏和不同剂量碘过量动 物模型，成功繁殖子二代小鼠，以适碘组作为对照，对不同日龄b a l b c 小鼠进 行如下实验研究： 1 观察不同碘摄入量对子二代小鼠生长发育的影响。 2 探讨不同碘摄入量对子二代小鼠大脑皮质和海马发育的形态学影响。 2 天津医科大学硕士学位论文 3 探讨不同碘摄入量对子二代小鼠小脑皮质和髓质形态和功能的影响。 天津医科大学硕士学位论文 第一部分碘缺乏或碘过量对小鼠子二代生长发育的影响 1 对象和方法 1 1 实验动物分组与饲养方法 选用断乳后一个月，体重在1 6 - 2 0g 的s p f v a f 级的b a l b e 小鼠，雌雄 各半，随机分为5 组：低碘组( l i ) ，适碘组( n i ) ，5 倍碘组( 5 h i ) ，1 0 倍碘组( 1 0 h i ) ，5 0 倍碘组( 5 0 h i ) 。l i 组动物饲以低碘饲料( 平均碘含量 5 0 i - t e d k g ) ，其余各组饲以正 常饲料( 平均碘含量3 0 0 i t g k g ) ，上述两种饲料中各种粮食的配比相同，只是碘 含量不同。l i ，n i 组饮用碘含量为0 i t g l 的去离子水，其余各组饮用含不同碘化 钾的去离子水，其饮水中碘含量分别为1 2 0 0 i - , g l ( 5 h i ) ，2 7 9 0 9 9 l ( 1 0 h i ) ， 1 5 1 9 0 0 9 l ( 5 0 h i ) 。小鼠每日的碘摄入量估计如下：小鼠每日进食5 9 ，进水5 m l ， 各组动物每日碘摄入量分别为 1 p g d ( l 1 ) ，1 5 i t g d ( n i ) ，7 5j t g d ( 5 h i ) ， 5 t g d ( 1 0 h i ) ，7 5 9 9 d ( 5 0 h i ) 。上述组大鼠的碘摄入量达到了本次碘缺乏和碘过量动物 模型的预期设计：即低碘动物的碘摄入量是适碘组的1 1 0 左右，3 个碘过量组分 别是适碘组的的5 倍、l o 倍、5 0 倍。 喂养三个月后，雌雄随机1 ：l 合笼，繁殖出的子一代鼠断乳后与母鼠同样的喂 养方法至7 0 - - - , 8 5 日龄时，各组随机取体重在1 6 , - 2 0 9 的雌雄仔鼠各6 只，按1 ：l 合笼，繁殖出的子二代鼠与子一代鼠喂养方法相同，仔鼠与母鼠同笼饲养，并使 每窝仔鼠数量大致相同，同时保证每组仔鼠分别来自至少5 只母鼠所生。分别取 2 0 ，4 0 日龄子二代鼠作为研究对象。 1 2 动物饲料配制 低碘饲料来自河北省兴隆山区重度缺碘地区粮食。每公斤饲料含黄豆4 0 ， 玉米3 0 ，小麦3 0 ，甲硫氨酸3 9 ，赖氨酸l g ，含无机盐合剂、水溶性维生素、 脂溶性维生素成分等( 表1 ) ，饲料含碘量为2 0 4 0 0 9 k g 。其余5 组饲以正常饲料 ( 由北京科澳饲料有限公司生产，但粮食组成及配比同低碘饲料，以保证主要营 养素相同) 平均含碘量为3 0 0 9 9 k g 。 4 天津医科大学硕士学位论文 表1 一次配制2 0 0 公斤( 4 0 0 斤) 大鼠饲料所需下列试剂 氨基酸、无机盐、水溶性维生素及脂溶性维生素 序号试剂名称 剂量 1 甲硫氨酸 6 0 0 9 2 赖氨酸2 0 0 9 3n a c l1 1 1 4 4g 4 k 。h p o 。3 h ：0 3 1 2 2g 5 m g s o 一 4 5 8 4g 6 f e s o 。7h 2 0 2 1 6g 7m n s 0 4 5h 2 03 2 0 8g 8 z n s o 。7h ：04 3 8 4g 9 c u s 0 4 7h 2 0 3 8 1 6g 1 0 c a c o ：， 3 0 5 1 2g 1l c o c l 。6h ：0 0 1 8 4g 1 2 v - b l2 0 1 4g 1 3v - b 22 0 7 6g 1 4v - b 62 0 1 6g 1 5v b 1 2。4 0m g 宰 1 6v c4 0g 1 7 肌醇2 0 0g 1 8 氨基水扬酸( p a b a ) 5 1 1 g 1 9 生物素 0 4g 2 0 叶酸0 4g 2 1 烟酸 1 0 。0g 2 2 泛酸钙 8 0 1 0g 2 3 蔗糖 4 0 0 0g 2 4v - a 1 6 0m g * 2 5v - e2 3 7 6g 2 6v - d 3bm g * 2 7v - k1 0m g * 注意事项： 1 2 1 先将上述脂溶性维生素试剂( v a 、v - e 、v - d 3 、v - k ) 溶于1 0 0 0g 低 碘豆油( 或色拉植物油) 中。 1 2 2 再将上述所有试剂混匀于一定量饲料粉中，然后再均匀的加到4 0 0 斤饲料中。 1 2 3 带有宰标记者单位为m g 。 天津医科大学硕士学位论文 1 2 4 上述试剂均为分析纯，n a c i 为优级纯( 减少碘污染) 。 1 3 动物饲养方法 雌雄小鼠分开置于不锈钢笼内，每笼5 - 6 只左右。饲养于恒温动物室内，室 内平均温度2 3 ，平均湿度5 0 ，为避免各组之间碘污染，采取了专人负责配 制不同剂量碘化钾的饮水，专人给小鼠添加饮水，每组动物使用固定饮水瓶，l i 组和其余各组置于不同房间内饲养，定期清洗和消毒处理。 2 实验指标 2 1 血清甲状腺激素水平：采用放射免疫法测定( 由天津医科大学内分泌研究所 测定) 2 2 小鼠身长( 顶骨到骶骨) 、尾长( 骶骨到尾尖) 及后肢长( 髂骨到趾骨) 2 3 小鼠体重、全脑重、脑相对重量( 全脑湿重除以其体重) 、胸腺重量、脾重量、 肾上腺重量 3 主要实验仪器 3 1a b l 0 仁s 型电子分析天平( 瑞士m o n ob l o c 公司生产) 3 2 毫米皮尺 4 取材称重 各组子二代鼠2 0 ，4 0r 龄时于处死前随机取1 2 只仔鼠称重，量身长，尾长和 后腿长，处死动物取血测定2 0 ，4 0 日龄仔鼠血清甲状腺激素水平，迅速取出脑，胸腺， 脾，肾上腺等脏器，每种脏器取1 2 个后1 1 0 0 0 0 分析天平称新鲜湿重后放入1 0 中 性福尔马林溶液中固定。 5 数据统计 。 用s p s s l1 5 统计软件包，计量资料均以i 士s 表示，各实验组分别与对照比较采 用l s d 分析，t 检验。 。 6 天津医科大学硕士学位论文 挂甲 宝口木 1 实验结果 1 1 血清甲状腺激素水平 与n i 组相比，l i 组2 0 日龄，4 0r 龄时，血清t 4 明显降低妒 0 0 1 ) ；5 0 h i 组，2 0 日龄时，t 4 明显降低( p 0 0 1 ) 。 表2 各组不同日龄子二代鼠t 3 、t 4 的含量( i 士s ) 各碘组与n i 组相比，幸：p 0 0 5 ，掌幸：p 0 0 1 1 2 子二代鼠的一般情况比较 2 0 日龄时，各组与n i 组相比，l i 组的体重，尾长明显降低( p o 0 5 或 p 0 0 1 ) ；5 0 h i 组的体重，身长，尾长明显降低( 火0 0 1 ) 。4 0 日龄时，l i 组与n i 组相 比，体重，身长明显降低( p o 0 1 ) ；5 0 h i 组的体重，身长，尾长，后腿长均明显降低 ( p o 0 5 或p 0 0 1 ) 。 表3 各组2 0 同龄子二代鼠一般情况( 2 - 4 - s ) 各碘组与n i 组相比，：p 0 0 5 ，母木：p 0 0 1 天津医科大学硕七学位论文 表4 各组4 0r 龄子二代鼠一般情况( 可士s ) 各碘组与n i 组相比，牛：p o 0 5 ，木木：p o 0 1 1 人 5 h i 1 0 h i5 0 h i l 一2 0 口龄 j + 4 0 u 龄 图表1 1 不同同龄各碘组子二代小鼠体重 8 0 8 6 4 2 0 8 6 4 2 o o 1 1 1 l 1 圳。v 栅母 天津医科大学硕士学位论文 9 8 7 6 皇 05 业4 篮3 2 1 0 1 ： 暑6 半4 亦 9 | - 如叶一一l _ 冒篱 n i5 h i1 0 h i5 0 h i 图表1 2 不同同龄各碘组子二代小鼠身长 卜如+ 7 一l 1 卜、一一，k 、 l + 2 0 日龄： i + 4 0 日龄； 【，l一一j一一j、，【，。一j 5 h i1 0 h i5 0 1 1 1 l 一3 表不同日龄各碘组子二代小鼠尾长( c m ) 9 天沣医科大学硕士学位论文 e o 逝 型 崾 奠5 3 ：+ 2 0f 1 龄 + 4 0 日龄 图表1 4 不同同龄各碘组子二代小鼠后腿长 1 3 子二代鼠脑的绝对重量和相对重量 2 0 日龄时，各组与n i 组相比，5 0 h i 组脑绝对重量降低、相对重量升高 ( p 0 0 1 或p 0 0 5 ) 。4 0 日龄时，各组与n i 组相比，l i ，5 0 h i 组脑绝对重量均降 低( p 0 0 1 ) ；l i 组的脑相对重量明显升高。 表5 各组不同日龄子二代鼠脑绝对重量和相对重量( 孑士s ) 各碘组与n i 组相比，宰：p o 0 5 ，幸：p o o l 1 0 天津医科大学硕士学位论文 0 5厂 仓叫 匕：= 之 二o 3 f i - 再- - 1 3j 爵 恻l 下z 口唰! 翅 一 + 4 0 日龄02 姜 ! 一幽雌。 黑 0 1 0l 一，- 。- - 一- - - - j - - - - - - - - 一- - - - - - - j - - - - - - - 一- - - - - - 【- - - - - - - - - - - - - - ，- - - j 7 0 厂 6 0 5 0 警4 0 1 母| 3 0 ： 接 茎2 0 * 1 0 ： o l 图表l 一5 各组不同同龄子二代鼠脑绝对重量 1 母2 0l 龄 ；口4 0 u 龄 l in l5 h ll u h l5 0 i - t l 图表1 - 6 各组不同同龄子二代鼠脑相对重量 各碘组与n i 组相比，宰：p 0 0 5 ，宰 ：p 0 0 1 1 4 子二代鼠部分脏器的重量比较 2 0 日龄时，各组与n i 组相比，5 h i 组的胸腺，脾的重量略有降低( p 0 0 5 ) ；10 h i 组脾的重量明显降低( 尸 0 0 1 ) ；5 0 h i 组的胸腺与脾的重量明显降低( p 0 0 5 或 p 0 0 1 ) 。4 0 日龄时，各组与n i 组相比，l i 组的胸腺，脾，肾上腺的重量均明显降低 ( p 0 0 1 ) ；各高碘组稍有降低，但无统计学意义。 天津医科大学硕士学位论文 表6 各组2 0 日龄子二代鼠主要脏器的重量( i 士s ) 各碘组与n i 组相比，木：p o 0 5 ，i ：p o 0 1 表7 各组4 0 日龄主要脏器的重量比较( 2 - 士s ) 各碘组与n i 组相比，牛：p o 0 5 ，枣木：p o 0 1 1 2 天津医科大学硕士学位论文 讨论 动物的选择是否恰当，动物模型复制的成功与否，是实验成功的关键所在。 本世纪初以来，人类、大鼠和小鼠基因组学的研究发现1 9 j ，小鼠的基因较接近于 人类，尤其在研究人类某些疾病或器官功能方面小鼠有定的优越性。近年来 对动物模型的研究结果肯定了缺碘对脑发育和胎儿发育有影响，并肯定了这些影 响是通过甲状腺分泌甲状腺激素而实现的1 1 0 】，碘过量是否也和碘缺乏一样通过 影响机体甲状腺激素的水平从而影响子代的生长发育，目前尚无定论。 有关碘的动物实验的传统观念认为，大鼠对低碘十分敏感；当碘缺乏时几乎 全部动物都会发生甲状腺肿，而对高碘摄入不十分敏感，小鼠对低碘不十分敏感， 当碘缺乏时只有部分动物会发生甲状腺肿，但对高碘摄入敏感，可发生甲状腺 肿i l 。并且b a l b c , j , 鼠价格低廉，易于饲养和管理，繁殖能力强。因此本文采用 对高碘比较敏感的b a l b c d , 鼠复制碘缺乏、碘过量动物模型。 动物模型复制成功的另一个关键所在是科学的控制实验条件。本实验选用 断乳后一个月，体重在1 6 - - 2 0g 的s p f v a f 级的b a l b c 小鼠，雌雄各半，随机 分为5 组：低碘组( l i ) ，适碘组( n i ) ，5 倍碘组( 5 h i ) ，1 0 倍碘组( 1 0 h i ) ，5 0 倍碘组( 5 0 h i ) 。l i 组动物饲以低碘饲料( 平均碘含量 5 0 r t g k g ) ，其余各组饲以 正常饲料( 平均碘含量3 0 0 p g k g ) ，上述两种饲料中各种粮食的配比相同，只是 碘含量不同。l i ，n i 组饮用碘含量为0 “l 的去离子水，其余各组饮用含不同碘 化钾的去离子水，其饮水中碘含量分别为1 2 0 0 i ，t g l ( 5 h i ) ，2 7 9 0 “g l ( 1 0 h i ) ， 1 5 1 9 0 1 工g l ( 5 0 h i ) 。小鼠每日的碘摄入量估计如下：小鼠每日进食5 9 ，进水5 m l ， 各组动物每日碘摄入量分别为o 1 5 t g ( l i ) ，1 5 5 , g ( h i ) ，7 7 5 , g ( 1 0 h i ) ，1 5 5 p , g ( 1 0 h i ) ，7 7 5 1 t g ( 5 0 h i ) 。上述组小鼠的碘摄入量达到了本次碘缺乏和碘过量动物模 型的预期设计：即低碘动物的碘摄入量是适碘组的1 1 0 左右，3 个碘过量组分 别是适碘组的的5 倍、1 0 倍、5 0 倍。同时，在动物饲养过程中，严格控制饲养 环境，杜绝碘污染的可能性。 鼠类的甲状腺是在胚胎第1 7 天分泌甲状腺激素的，因此从妊娠前3 个月给 母鼠低碘饮食可降低母鼠及仔鼠的甲状腺功能，从而造成类似人类甲状腺功能 低下的改变。因此小鼠成鼠于喂养3 个月时合笼，所生子代小鼠与母鼠同笼饲养 以保证子二代小鼠在整个生命过程中均处于建模条件下，限定每只母鼠所生仔 鼠只数大致相同，多余仔鼠在生后第一天处死，饲养方法同前。小鼠大脑发育 天津医科大学硕十学位论文 的临界期是在小鼠妊娠1 8 2 0 天和生后2 5 天以内，且小鼠断乳是生后1 个月，所以 选择在其脑发育基本完全即生后2 0 天和脑发育完全成熟的生后4 0 天的子二代小 鼠为实验对象，观察子二代小鼠生长发育和脑发育的情况。 机体明显处于碘缺乏状态或碘饥饿状态，机体从饮食中摄入的碘以及甲状腺 激素代谢脱下的碘几乎全部用于甲状腺激素的合成，但仍不能提供足够的碘原 料。碘缺乏时，甲状腺激素的合成不足，使机体处于甲状腺功能低下状态。我国大 部分人生活在缺碘地区，但仍有近4 0 0 0 万人生活在碘过量的环境中。长期摄碘 过多，同样会影响机体的健康，对人群的主要危害为碘致性甲亢( i h h ) ，甲减， 自身免疫性甲状腺疾病( a i t d ) ，高碘性甲状腺肿等。研究表明，长期碘摄入不足 会导致机体呈现严重的碘缺乏状态，并造成甲状腺功能低下。而与大鼠对碘缺乏 耐受性低相对应的是，它对过量碘的摄入，呈现出较强的自我保护和代偿能力。即 使大鼠碘摄入量达生理需要量几十倍以上，甲状腺也不再过多的摄取碘，而是将摄 入过多的碘从尿液中排泄并不在体内潴留，从而使甲状腺含碘量维持在一个相对 稳定的水平1 12 1 。但由于长期摄入碘过多，过量碘抑制或改变了甲状腺过氧化酶的 活性，使甲状腺激素合成减少，反馈性引起t s h 升高，甲状腺增生肿大i l 引，导致甲状 腺功能低下。本实验对不同同龄子二代小鼠生长发育观察发现，碘缺乏和碘过量 均引起甲状腺激素降低，与n i 组相比，l i 组2 0 日龄，4 0 日龄时，血清t 4 明显降 低；5 0 h i 组，2 0 日龄时，t 4 明显降低，表明明