（海洋化学专业论文）基于纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备.pdf

z 曹： 青岛科技人学研究生学何论文 基于纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 摘要 本论文的研究工作中引入壳聚糖和纳米粒子复合材料等修饰电极，构建新型 电化学! l 物传感器。主要研究工作如f 1 提出了一种新颖的免疫传感器的制备方法，用于检测人血清中甲胎蛋白 ( a f p ) 的含量。采用一步合成法制备了g n p c n t ，与壳聚糖掺杂，用于吸附甲 胎蛋白抗原。g n p c n t c h 复合膜作为a f p 的固定载体，由于复合材料不同组分 之l 日j 的协同效应，为a l p 标记抗体和底物1 - n p 提供了非常好的电子传递路径。 基于竞争免疫反应机制，该免疫传感器测定的结果与放射性免疫法得到的结果 相对比，具有较高的准确性。在优化实验条件下，免疫传感器检测到甲胎蛋白在 浓度范围1 5 5n g m l 一呈线性，检出限为0 6n g m l 。该方法还可以进一步用于临 床检测甲胎蛋白及其它重要的肿瘤标记物。该生物传感器能保持良好的生物活 性，具有较好的检出限、线性范围及存储稳定性。 2 本文提出了一步法合成纳米金离子液体壳聚糖膜( g n p i l c h ) ，其作为 一种新颖的固定载体来制备免疫传感器。纳米会离子液体壳聚糖膜不但能防止离 子液体的泄露，而且由于离子液体和纳米会的作用，能产生很好的电信号。 将碱性磷酸酶标记的抗体固定于纳米金离子液体壳聚糖膜，提出了一种新颖的 p s a 免疫传感器的制备方法。在最佳优化条件下，免疫传感器检测到p s a 在浓度 范围1 0 8 0n gm l 1 呈线性。该生物传感器能保持良好的生物活性，具有较好的检 出限、线性范围及存储稳定性。这种灵活性良好的生物传感器也可以应用于其他 抗原或其他生物活性分子。 3 本文研制了一种基于介孔硅负载碱性磷酸酶的电化学免疫传感器。这种方 法是基于层层组装技术和一步法测定a f p 的免疫分析测定原理。把碱性磷酸酶标 记的抗体包埋在s b a 1 5 的大介孔中，来制备新型的免疫通道传感器，用于检测 甲胎蛋白( a f p ) 的含量。包裹在s b a 一1 5 介孔中的a l p 标记的抗体仍然保留着 它的催化和免疫生物活性。随着a f p 抗原浓度的增加，由于形成的免疫复合物的 影响而导致的空间位阻和阻抗的增加，从而引起了d p v 峰电流的降低。在最佳 优化条件下，免疫传感器检测到a f p 在浓度范围1 0 1 5 0n gm l 1 呈线性，检出限 基丁纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 为0 8n gm 一。另外，我们还做了干扰实验，结果表明免疫通道具有良好的生物 特异性和生物选择性。 4 本文通过一步法合成纳米银碳纳米管壳聚糖膜，将其作为一种新颖的酶 固定载体束制备商灵敏度的葡萄糖生物传感器。应用层层自组装方法将辣根过氧 化物酶和葡萄糖氧化酶包埋在纳米银碳纳米管壳聚糖膜中来制备厂l i 物传感器。 将电子媒介物邻苯二胺和h r p 共同固定于掺铟氧化锡( i t o ) 电极内层。在h r p 的存在下，通过o p d 检测出葡萄糖过氧化物酶催化氧化葡萄糖产生的过氧化氢 的含量。在优化的实验条件下，制备的传感器能够检测线性范围为o 5i t m 到5 0 g m ，在信噪比为3 时的最低检测限0 1o m 。计算出的灵敏度为1 3 5 9g a m m 。 这种新颖的基于纳米银碳纳米管壳聚糖膜的生物传感器有灵敏的安培响应信 号。 关键词：免疫传感器纳米粒子c 【甲胎蛋白介孔s b a 1 5 碱性磷酸酶离子液体 青岛科技人学研究生学何论文 p r e p a r a r l 0 na n da p p l i c a t i o n o ft h ee l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o rb a s e do nc h i t o s a n n a n o h y b r i d sm o d i f i e de l e c t r o d e a bs t r a c t 1 an o v e ls t r a t e g yf o rt h ef a b r i c a t i o no fs e n s i t i v ei m m u n o s e n s o rt o d e t e c t c l f e t o p r o t e i n ( a f p ) i nh u m a ns e r u mh a sb e e np r o p o s e d g n p c n th y b r i d sw e r e p r o d u c e db yo n e s t e ps y n t h e s i sb a s e do nt h ed i r e c t r e d o xr e a c t i o n t h ep r o p o s e d i m m u n o s e n s o rb yu s i n gg n p c n t c hh y b r i df i l ma st h ei m m o b i l i z a t i o nm a t r i xo f a f po f f e r sa ne x c e l l e n ta m p e r o m e t r i cr e s p o n s eo fa l p a n t i - a f pt o l n p t h e a c c u r a c yo ft h ea f pd e t e r m i n a t i o nw a se x a m i n e db yc o m p a r i n g t h er e s u l t so b t a i n e d w i t ht h i se l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ( e i a lw i t ht h o s eo b t a i n e dw i t hc l a s s i c a li r m a t h er e s u l t ss h o wt h a tt h et w om e t h o d sw e r ei na c c e p t a b l ea g r e e m e n t u n d e rt h e o p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h er e s u l t i n gi m m u n o s e n s o rc o u l dd e t e c ta f p i na l i n e a rr a n g ef r o mlt o5 5n gm l w i t had e t e c t i o nl i m i to f0 6n gm l t h i sm e t h o d c o u l db ef u r t h e rd e v e l o p e df o rp r a c t i c a lc l i n i c a ld e t e c t i o no fs e r u ma f pl e v e la n d o t h e rt u m o rm a r k e r s t h eb i o s e n s o rp o s s e s s e sg o o db i o a c t i v i t y ，c o m p a r a b l ed e t e c t i o n l i m i ta n dl i n e a rr a n g e ，a n da c c e p t a b l es t o r a g es t a b i l i t y 2 t h eh y b r i df i l mo fg o l dn a n o p a r t i c l e s i o n i cl i q u i d - c h i t o s a n ( g n p i l c h ) w a s f i r s t l yp r e p a r e db yas i m p l eo n e s t e ps y n t h e s i sa n du s e da sa l le 任c i e n ti m m o b i l i z a t i o n m a t r i xt of a b r i c a t ea ni m m u n o s e n s o r t h eg n p i l c hf i l mn o to n l yp r e v e n t st h e l e a k a g eo ft h ei lu n i t s ，b u ta l s op r o d u c e saw e l l d e f i n e dv o l t a m m e t r i cs i g n a ld u et ot h e s y n e r g i s t i ce f f e c t so ft h ei lu n i t sa n dg n p s b yi m m o b i l i z i n ga l la l k a l i n ep h o s p h a t a s e f a l p ) 1 a b e l e da n t i b o d yi ng n p i l c hf i l m ，as e n s i t i v ea m p e r o m e t r i c1 m m u n o s e n s o r h a sb e e nd e v e l o p e df o rp r o s t a t es p e c i f i ca n t i g e n ( p s a ) u n d e rt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s ，t h ei r n m u n o s e n s o re x h i b i t sal i n e a rr a n g ef r o m1 0t o8 0n gm l o f p s a 3 i nt h i sw o r k ，an e ws t r a t e g yw a sp r e s e n t e dt o c o n s t r u c ta l li m m u n o a s s a y c h a n n e l i n gs e n s o rb yi n c o r p o r a t i n gb i o - r e c o g n i t i o n e l e m e n t si nt h em e s o p o r e so f s b a 15 t h ea p p r o a c hw a sb a s e do n al b la s s e m b l yt e c h n i q u ea n do n e s t e p i m m u n o a s s a yf o ra f pd e t e c t i o n a n o v e li m m u n o a s s a yc h a n n e l i n gs e n s o rf o r q f e t o p r o t e i n ( a f p ) w a sp r o p o s e db yi n c o r p o r a t i n gb i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l e si n t ot h e m e s o p o r e s o fw e l l o r d e r e d h e x a g o n a l s b a 一15 t h ee n c a p s u l a t e da l p l a b e l e d 基丁纳米粒f 壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 a n t i b o d yr e t a i n e di t sc a t a l y t i ca n di m m u n o l o g i c a lb i o a c t i v i t i e si ns b a 15m e s o p o r e s t h ed p vp e a kc u r r e n t sd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e da f pc o n c e n t r a t i o nd u et o i n c r e a s i n gs p a t i a lb l o c k i n ga n di m p e d a n c ef r o mt h ef o r m e di m m u n o c o n j u g a t e s u n d e r t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ec o n s t r u c t e di m m u n o s e n s o rc o u l dd e t e c ta f pi nal i n e a r r a n g ef r o m 1 0t o15 0 n gm l 叫w i t h ad e t e c t i o nl i m i to f0 8n gm l - i i na d d i t i o n i n t e r f e r e n c ee x p e r i m e n t ss u g g e s t e dt h a tt h ei m m u n o a s s a yc h a n n e l sd i s p l a y e dg o o d b i o s p e c i f i c i t ya n db i o - s e l e c t i v i t y 4 o n e s t e ps y n t h e s i so fs i l v e rn a n o p a r t i c l e s c a r b o nn a n o t u b e s c h i t o s a nf i l m ( a g c n t c h ) w a sf i r s t l yp r o p o s e da san o v e li m m o b i l i z a t i o nm a t r i xf o rt h ee n z y m e s t of a b r i c a t es e n s i t i v eg l u c o s eb i o s e n s o r t h eb i o s e n s o rw a sp r e p a r e db ye m b e d d i n g h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i na g , c n t c hh y b r i df i l m s b a s e do nl a y e rb yl a y e rt e c h n i q u e t h ee l e c t r o nm e d i a t o r , o - p h e n y l e n e d i a m i n e ( o p d ) ， w a sa l s oc o i m m o b i l i z e dw i t hh r pi nt h ei n n e rl a y e ro nt h es u r f a c eo fa ni n d i u mt i n o x i d e ( i t o ) e l e c t r o d e h y d r o g e np e r o x i d ep r o d u c e db yt h eg o dc a t a l y t i co x i d a t i o no f g l u c o s ew a st h e n d e t e c t e db yo p di n t h ep r e s e n c eo f h r p u n d e rt h eo p t i m i z e d e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h er e s u l t i n gb i o s e n s o rc o u l dd e t e c tg l u c o s ei nal i n e a rr a n g e f r o m0 5t o5 0p mw i t had e t e c t i o nl i m i to fo 1p ma ta s i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f3 t h e s e n s i t i v i t yw a sc a l c u l a t e da s13 5 9l a a m m t h ep r o p o s e db i o s e n s o ro f f e r e ds e n s i t i v e a m p e r o m e t r i cr e s p o n s e st og l u c o s eb a s e do nt h ea g c n t c hf i l m s k e yw o r d s ：i m m u n o s e n s o r ，n a n o p a r t i c l e s ，a - f e t o p r o t e i n ，p r o s t a t es p e c i f i ca n t i g e n ， m e s o p o r o u ss b a - 15 ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，i o n i cl i q u i d i v 青岛科技人学研究生学f i ：i ：论文 目录 第章绪论l 1 1 免疫传感器的基本原理l 1 2 免疫传感器的主要类型1 1 2 1 微重量免疫传感器2 1 2 2 光学免疫传感器2 1 2 3 电化学免疫传感器3 1 3 免疫活性单元的固定4 1 3 1 基于非共价作用的固定方法5 1 3 2 基于非共价作用的固定方法5 1 4 壳聚糖在生物传感器中的应用：5 1 5 纳米材料在生物传感器中的应用6 1 5 1 用会纳米粒子构建生物传感器7 1 5 2 用碳纳米管构建生物传感器7 1 5 3 介孔材料7 1 6 离子液体在生物传感器中的应用9 1 7 本论文基本思路及目的1 0 参考文献1 1 第二章基于纳米金碳纳米管杂化材料的电化学甲胎蛋白免疫传感器 的制备1 6 2 1 实验部分1 7 2 1 1 试剂1 7 2 1 2 仪器1 7 2 1 3 甲胎蛋白免疫传感器各1 7 2 2 结果与讨论。1 8 2 2 1 电化学阻抗表征1 8 2 2 2 修饰电极的循环伏安行为1 9 2 2 3a f p 免疫传感器的循坏伏安行为表征2 0 2 2 4a f p 免疫传感器的条件优化2 2 摹丁纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 2 2 5a f p 测定的标准曲线2 2 2 2 6a f p 免疫传感器的稳定性和再现性2 4 2 2 7 准确性和临床验证2 4 2 3 小结2 5 参考文献2 6 第三章离子液体纳米金壳聚糖制备p s a 免疫传感器2 9 3 1 实验部分3 0 3 1 1 试剂3 0 3 1 2 仪器，3 1 3 1 3 一步法合成g n p i l c h 杂化膜3 1 3 1 4p s a 免疫传感器的制备3 1 3 2 结果与讨论3 l 3 2 1 红外光谱分析3 1 3 2 2g n p i l c h 杂化膜的表征3 3 3 2 3a l p a b g n p i l c h 免疫传感器的电化学阻抗表征3 3 3 2 4a l p a b g n p 1 l c h 免疫传感器的循环伏安行为表征3 4 3 2 5p s a 免疫传感器的条件优化3 6 3 2 6p s a 免疫传感器的校准曲线3 6 3 2 7p s a 免疫传感器的稳定性和再现性3 7 3 2 8 精确性和临床应用3 8 3 2 9p s a 检测的特异性3 8 3 3 小结3 8 参考文献3 9 第四章基于介孔硅负载碱性磷酸酶的a f p 电化学免疫传感器的制备 4 2 4 1 实验部分4 3 4 1 1 试剂4 3 4 1 2 仪器4 3 4 1 3 介孔s b a 1 5 的制备4 3 4 1 4a f p 免疫传感器的制备4 3 4 2 结果与讨论4 4 4 2 1 介孔材料s b a 1 5 的表征4 4 青岛科技人学研究生学何论文 4 2 2a f p 免疫传感器的电化学阻抗4 6 4 2 3 修饰电极的循环伏安行为表征4 7 4 2 4 免疫测定条件的优化4 8 4 2 5a f p 免疫传感器的校准曲线4 9 4 2 6a f p 免疫传感器的稳定性和再现性5 0 4 2 7 准确性和临床应用5 0 4 2 8a f p 检测的特异性5 1 4 3 小结5 1 参考文献5 2 第五章基于一步法合成纳米银碳纳米管壳聚糖膜及其在葡萄糖生 物传感器中的应用5 5 5 1 实验部分5 5 5 1 1 试剂：5 5 5 1 2 仪器5 6 5 1 3 一步法合成纳米银碳纳米管壳聚糖膜5 6 5 1 4 双酶传感器的制备5 6 5 2 结果与讨论5 6 5 2 1a g c n t c h 复合膜的表征5 6 5 2 2 酶传感器的循环伏安行为表征5 8 5 2 3 峰电流与扫速关系的研究5 9 5 2 4 实验条件优化6 0 5 2 5 葡萄糖的测定6 1 5 2 6 免疫传感器的稳定性和重现性6 2 5 2 7 精确性和临床验证6 2 5 2 8 葡萄糖检测的特异性6 2 5 3 j 、结6 3 参考文献6 4 结论j ! 6 9 致谢7 0 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录7 1 基丁纳米粒f 壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 声明7 2 青岛科技人学研究生学位论文 第一章绪论 免疫传感器足基j i 亲和作用，将特异性免疫反应与适宜的信号转换技术结合 起来，用以j 监测抗原抗体反应的生物传感器，目f i 订不仅广泛应用于临床医学，在 环境分析、生化分析、食品检验及药物分析中郁得到了广泛应用【卜6 1 。 作为免疫分析技术的一个重要分支，免疫传感器具有高选择性、高灵敏性、 i i j + 逆性和试剂利川的高效率性等优点，并且免疫传感器大都制备简单，便于实现 自动化、数字化和微型化，因此可以避免传统免疫分析方法所附带的一系列问题， 从而在临床分析、坏境分析中显示了巨大的应用潜力。 1 1 免疫传感器的基本原理 免疫传感器的一般二i ：作原理是：固定在换能器上的抗体( 抗原) 对样品介质 中的抗原( 抗体) 进行特异性免疫识别，并且产生随分析物浓度的变化而变化的 分析信号。免疫传感设计主要包括三个独立印密切相关的部分：生物识别要素部 分，换能器部分，和电子线路部分。抗体或抗体衍生物( 抗原或半抗原) 通常被 作为牛物识别要素，直接固定在换能器上或是与其紧密相连，用以识别生物分子。 这种识别反应决定了换能器装置的高选择性和灵敏性。电子线路用来放大或数字 化由换能器装置输出的物理化学信号，如电化学( 电势、电导、电容、阻抗、安 培) 、光学( 荧光、发光、折射率) 和微重量分析等。 抗原抗体问的反应具有高度的特异性，两者的结合只局限于一些大分子的 特定部位，即抗原簇与抗体结合位点之i 日j ，以亲和力作用方式结合在一起，而不 是共价键形成。这些特定部位之间的吸引力只有在极短的距离内有效，因而抗原 簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状念，j 能够产生足够的结合力。 这种分子问的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。由于抗原和抗体的特异 性反应，较其它生物和化学传感器有更高的专一性和选择性。免疫传感器具有能 将输出结果数字化的精密换能器，不但能达到定量检测的效果，而且由于传感与 换能同步进行，能实时监测到传感器表面的抗原抗体反应，有利于对免疫反应进 行动力学分析因此，它可促使免疫诊断方法向定量化、操作自动化方向发展。 1 2 免疫传感器的主要类型 根据换能器类型的不同，免疫传感器主要分为以下三种类型：微重量免疫传 基r 纳米粒子壳聚糖朵化膜的电化学免疫传感器的制备 感器、光学免疫传感器和电化学免疫传感器。根据操作方式不同，免疫传感器还 可以分为直接型免疫传感器和非直接型免疫传感器。直接型免疫传感器足指没有 外加标记物时，换能器能直接检测免疫复合物在界而形成时的物理或者化学效 应。直接型免疫传感器能实现被分析物质的实时检测。对于非直接型免疫传感器， 通常在检测过程中使用一种或者多种标记物，换能器需要通过问接检n h , 记物的 信号来检测被分析物质。非直接型免疫传感器需要多次沈涤和分离步骤，有时被 称作是免疫分析。与直接型免疫传感器相比，非直接型免疫传感器具有灵敏度高、 耐干扰性强( 避免由于非特异性吸附引起的交叉干扰) 的优点。 1 2 1 微重量免疫传感器 微重量免疫传感器，结合了压电响应的高灵敏度和抗体抗原反应的高特异 性。其检测基本原理是：在吸附识别区域发生的选择性结合，引起传感器表面质 量和界面特性( 粘弹性和表面硬度) 的改变，这些改变可以通过振荡频率的位移 来识别。该类传感器的突出特点是成本低、操作简单、灵敏度高，实时输出。 石英晶体微天平( q c m ) 技术是一种具有高度灵敏性的质量变化检测器，检测 灵敏度可达l o 固g 数量级。石英晶体微天平在化学、生物等领域有广泛的应用前 景。在电极表面修饰生物活性膜，即可得到生物传感器。目前多通道的石英晶体 微天平( m q c m ) 已有报道。多通道石英晶体微天平相当于将几个q c m 集成在同一 晶片上，符合分析技术微型化、阵列化的发展趋势。与q c m 相比，m q c m 可以实 现对气体或液体的多种化学成分同时检测的优点，应用前景更加广阔。 1 2 2 光学免疫传感器 几乎所有的光学现象( 例如吸附、荧光、发光、散射或折射等) 都能用作生 物化学传感设计，因此相对于传统的免疫测定方法而言，光学免疫传感器被认为 是临床诊断和环境分析的一种有利方法。近年来，光学传导技术由于具有使用可 见光，不破坏操作模板，产生和读取信号迅速等优势在免疫传感技术的应用方面 呈逐渐上升的趋势。早期光学系统是以分光光度法测定，固定在柱上的酶和待测 产物的吸光度为基础的。后来，酶被固定在尼龙圈上，系统与流动注射分析仪相 连用于肿瘤标志物检测的有：荧光免疫传感器和化学发光免疫传感器等。其中化 学发光传感器是光学传感器中的一个重要分支。自1 9 7 8 年f r e e m a n 等1 7 峙艮道第一个 化学发光h 2 0 2 传感器以来，引起了分析化学家们极大的兴趣，有关这一领域的综 述性文章也有多篇。 免疫荧光技术是以荧光素标记抗体( 或抗原) ，利用被检测物质在反应体系 2 青岛科技人学研究生学位论文 中特异结合位点荧光的强弱，由荧光显微镜、流式细胞分析仪和自动化电子成像 计算机进行定性、定量分析的技术。通常用荧光素标记抗体，称为荧光抗体技术： 其次是用荧光素标记抗原，称为荧光抗原技术。荧光素足具有共轭双键体系结构 的化合物，当接受紫外光等照射时，l h 低能最级的基念向高能级跃迂，形成电子 能量较高的激发态。当电子从激发念恢复至基念时，发出荧光。 化学发光是指在没有任何光、电、热的作用下，由于反应体系中某种物质分 子吸收了反应所释放的能量由基念跃迁至激发态，然后再从激发念返回翠念，同 时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光的现象。化学发光免疫分析法 是将化学发光试剂、酶( 催化剂) 或荧光物质标记到抗原( 抗体) 上：，用化学发 光法测定标记物的化学发光强度，以确定被标记的抗原( 抗体) 的量。 丈j 此，它 既具有化学发光分析的高灵敏度，又具有免疫分析的高选择性、专一性以及无污 染等特点，是替代放射免疫分析的重要分析工具，近年束发展迅速i 舡眩】。化学发 光反应参与的免疫测定分为两种类型：第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底 物，通过测定发光反应光强度的敏感性检测标本中抗原或抗体的含量；第一：种是 以发光剂作为抗原或抗体的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的 含量。化学发光免疫分析分为三大类型，即标记化学发光物质的化学发光免疫分 析，标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析和标记酶的化学发光酶联免疫分析。 现在有人也把电化学发光免疫分析作为另外种，其主要内容也己包括在一些评 论之中【1 3 _ 16 1 。 常见的化学发光体系包括酰肼类化学发光体系、高锰酸钾化学发光体系、过 氧化草酸酯类化学发光体系、吖啶类化学发光体系和1 ，2 一二氧杂环丁烷类化学 发光体系。 酰肼类如鲁米诺( 3 氨基邻苯二甲酰肼) 、异鲁米诺( 4 一氨基邻苯二甲酰肼) 、 萘2 ，3 二羧基酸酰肼等都有化学发光性能。人们已经对鲁米诺的化学发光反应 进行了详细的研究【1 7 l8 1 。高锰酸钾是化学发光反应中常用的氧化剂，能氧化大部 分有机化合物产生化学发光，已用于生物碱及药物等的分析测定【1 9 2 0 1 。1 9 6 3 年， c h a n d r o s s 2 1 1 在实验中首次发现并报道了过氧化草酸酯的化学发光现象。过氧草酸 酯化学发光反应指芳基草酸酯、氧化剂( 通常为过氧化氢) 和某些荧光化合物的 化学发光反应( 如图1 2 所示) ，是已知的最有效的非酶化学发光反应，量子产率 高达2 5 一2 7 。1 9 3 5 年发现光泽精具有化学发光性质，后来又发现很多吖啶 类化合物具有这样的特性。研究最多的是吖啶酯类化合物。这类化合物只要在过 氧化氢和碱存在下就能迅速产生化学发光，且具有很高的发光效率。 1 2 3 电化学免疫传感器 3 基丁纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化学免疫传感器的制备 电化学免疫分析法足将免疫技术与电化学检测相结合的一种分析方法，具有 快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点。根击i ：! ：标记方法的不同，电化学免疫方 法i 叮分为酶标址法和非酶标记法。酶标记法将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏 性融为一体，在对低含量物质的枪测中发挥着晕要作用。标记酶通常为辣根过氧 化物酶( h r p ) ，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶( g o x ) ，d d 半乳糖苷酶等，这些酶 或结合生敏感膜j 二，或标记在抗原( 抗体) ：，通过酶的催化作用，产生一种电 化学活件物质，然后再进行电化学测量。由于酶的催化作用，可将待测抗原( 或 抗体) 的浓度放大刽1 0 3 1 0 4 倍，所以酶标记法具有很高的灵敏度。非酶标记法是 通过利用抗体或抗原本身的电活性：或者通过适当的化学反应进行标记，使其产 生电活性，再用电化学方法进行测定。非酶标记常用的电化学活性物质为具有电 化学氧化还原性质的会属离子和电活性的有机功能团。金属离子通过鳌合n o u 2 亚乙基三胺血乙酸与抗原结合，经过酸化再释放出来，可由电化学方法测定。许 多有机电活性功能幽如二茂铁等可以通过有机反应引入抗原或抗体，从而进行电 化学测定。 电化学免疫传感器的基本工作原理是：采用电化学检测方法来检测标记的免 疫试剂或者一些由酶、会属离子和其他电活性物质标记的标记物，从而对疾病诊 断或病人状态监测中复杂体系的多组分混合物进行分析，提供有力数据。近年来， 由于电流型免疫传感器的高选择性、高灵敏度等特点，免疫传感器在医疗、环境检 测和食品分析上应用越来越广泛。若将其与液相色谱、f i a 联用，可提高灵敏度， 减少样品和试剂的用量。电极阵列化，多通道实时监测足未来电化学免疫传感器的 发展方向。 电化学免疫传感器主要分为以下几种：电流、电位、电导和场效应传感器1 2 2 1 。 电流型传感器是在电极上加上恒定电压作为溶液中电活性成分进行电子传递反 应的外加动力，而流过电化学池的电流大小与溶液中电活性成分的浓度具有一定 相关性，从而通过检测电流大小来分析相应被测物的浓度大小及变化。该法操作简 单，且与电活性物质浓度关系的线性度较好。电位型传感器是根据电极平衡时，通 过侧定指示电极和参比电极的电位差值与响应离子活度的对数呈线性关系来确 定物质活度的一类电化学传感器。电位型传感器在某种程度上可以看成电流法当 其工作电流趋向无穷小的一种极限情况。电导型传感器是将被测物氧化或还原后 电解质溶液的电导变化作为信号输出，从而实现离子检测的电化学传感器。场效应 传感器是将溶液中电解质的离子活度转换成电信号输出的场效应晶体管传感器。 1 3 免疫活性单元的固定 4 青岛科技人学研究生z 侮论文 因为免疫传感器常用来测餐源于分析物和匝| 定的抗体抗原之f h j 的特异性免 疫反应而产生的信号，所以将抗体( 抗原) 吲定在原始换能器表面的固定化过程 在免疫传感器制备中起着重要作用。大鼙的同定方法已用十各种免疫传感器，如 静电吸附、包埋法、交联法、共价键结合法等。总体水晚，呵以被分为非共价作 用和共价作用一：种圈定方法。 1 3 1 基于非共价作用的固定方法 该类型免疫活性单元的固定化方法足基于抗体或抗原分子与换能器基底之 问的非共价作用，通常指疏水作用、静电作用、范德华力和氧键。除了纯粹的物 理i i 及附，还常常涉及到一些弱的化学键作用力。非共价键作用随着换能器基底的 不同而不同。对于非极性的敏化皋底，抗体或抗原分子可通过疏水作用和范德华 力被吸附。 近年来，具有物理和化学特性的纳米材料( 例如：贵会属、磁性氧化物和碳 。纳米颗粒或碳纳米管) 已被成功地用来修饰换能器的表面，以提高抗体或抗原分 子的固定效率。 1 3 2 基于共价键作用的固定方法 共价键作用方法通常用交联法，它足制备免疫传感器中最常用的阎定方法。 由于一些换能器基底上缺少相应的共价键结合位点( 例如，会属、半导体或光纤) ， 因此需要在换能器基底上预涂一层薄膜，然后使用一些功能试剂( 如：戊二二醛、 碳二酰亚胺琥珀酰亚胺酯，n 羟基丁二酰酯和高碘酸盐) 进行活化，以有效地共 价结合抗体或抗原。经常用许多传统的涂层材料作固定免疫活性分子的载体，如： 聚乙烯亚胺，y 氨丙基三乙氧基硅烷，羟乙基和甲基丙烯酸盐。近年来，一些新 的涂层和功能膜技术( 材料) 已经逐渐被引入到传感器固定化技术的领域中来。 总体来说，理想的固定方法需要具备以下特点：( 1 ) 在传感器表面具有足够 多的活性抗原或抗体；( 2 ) 被固定的抗原或抗体在测量过程中仍然保持活性；( 3 ) 固定过程对传感器的敏感性没有影响；( 4 ) 传感器具有再生能力。通过使用甘氨 酸盐酸缓冲液( p h2 3 ) 能有效的解离抗原，使抗体得到再生，这是免疫传感器 在实际应用的基本前提条件。 1 4 壳聚糖在生物传感器中的应用 壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 是甲壳素的脱乙酰基产物，它的化学名为p ，( 1 ，4 ) 2 基丁纳米粒子壳聚糖杂化膜的电化z 免疫传感器的制备 氨基一2 脱氧d 葡聚糖。壳聚糖具有良好的成膜性和吸湿性，在p h 6 5 的酸性 溶液中，能够形成高电荷密度的阳离子聚电解质，显示出较好的螯合性和吸附性。 壳聚糖具有许多重要的，生物学性质，如生物相容性、生物降解性、抗菌等生物活 性，足种具有广泛应用价值的生物高分子材料。由于壳聚糖分子结构中存在氨 基易于使酶| 直：l 定，且来源丰富、机械性能好、化学性质稳定等，可以满足作为大 部分酶同定化的载体的要求。 壳聚糖作为载体制备生物传感器可分为两种形式：一是纯壳聚糖膜为载体， 即将壳聚糖溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数的有机酸，溶剂挥发后成膜， 最常见的足溶于稀醋酸溶液；另一种形式为壳聚糖与其它物质组成的复合膜。壳 聚糖可以与聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚醚、海藻酸钠、醋酸纤维、尼龙、聚丙烯酞 胺、纤维素等有机高分子物质组成复合膜，也可与四甲氧基硅烷( t m o s ) 、四乙氧 基硅烷( t e o s ) 、甲基三甲氧基硅烷( m t o s ，m t m o s ) ，a p d m o s 等无机硅烷材料组 成复合膜。壳聚糖作为载体，一般需交联剂的存在。交联剂通常为为双功能团物 质，有戊：二醛、环氧氯丙烷等，其中最常用的交联剂为戊二醛溶液。 。 作为一种资源丰富的天然高分子化合物，壳聚糖在医疗、环保、生化、同用 化学品及功能膜的制备等方面均得到广泛应用，而作为酶等生物活性物质的载体 的研究在近年来也逐渐兴起，得到了人们的重视。 1 5 纳米材料在生物传感器中的应用 纳米粒子由于其优良的光学、电学性质和生物亲和性，在生物分子的分析检 测方面越来越受到人们的关注，现在己经成为分析化学的一个研究热点。纳米材 料的尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区域。这样的 系统既非典型的微观系统也非典型的宏观系统，存在表面效应、体积效应、量子 效应和宏观量子隧道效应等四大突出效应，在催化、光学、磁学、电学、热学和 力学等方面表现出很多独特性能，并且已经在很多行业得到了很好的应用。 纳米粒子具有高比表面积，与普通生物分子载体相比，可以增加固定的分子 数量，从而增强响应信号。s i n g h 等【2 3 】用s 0 1 g e l ( 溶胶凝胶) 方法合成硅纳米颗 粒，其直径为2 0n n l 或2 0 0n l t i 。构建有机磷农药生物传感器，该纳米颗粒用于固 定乙酰胆碱脂酶，具有较高的比表活性，结合离子敏场效应管检测，响应迅速( i l - c o o h o fc m i m b f 4 f