（作物遗传育种专业论文）南瓜NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：雨砷年 e t l l l l ：母。6 、j 口 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书 口 不保密，本论文属于不保密。口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：商劢争 日期：x 0 7 、。j 口 指导教师亲笔签舞。2 醐：。撕7 o o o 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 南瓜( c u c u r b i t a m o s c h a t a d u c h ) 具有多种较强的抗逆性，如：抗寒、抗旱，抗病、 抗贫瘠等，特别对瓜类枯萎病具有抗性，是嫁接同科作物甜瓜等较好的砧木由尖孢镰 刀茵甜瓜专化型病( f u s a r i u mo x y s p o r u mf s p m e l o n i s ) 所引起的甜瓜枯萎病( f u s a r i u m 谢们是一种世界性的甜瓜病害目前防治甜瓜枯萎病的主要途径仍然是运用化学方法， 这对人类的健康和生活环境存在着巨大的潜在威胁采用常规育种方法选育抗病品种存 在着育种周期长、效率低等不少缺点，因此，克隆南瓜抗病基因，则是当前利用分子技 术进行甜嚆抗病育种工作的基础 本试验采用抗病基因同源序列( r e s i s t a n c e g c n e a n a l o g ，r g 舢克隆的策略。根据已克 隆植物抗病基因产物的保守结构域一核苷酸结合位点( n b s ) 设计简并引物，以植物总 d n a 为模板进行p c r 扩增，得到该植物的抗病基因同源序列( r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g ， r g a ) ，然后分析r g a 与抗病基因的关系，确定候选抗病基因并最终获得新的抗病基因 本文以抗病性好的甜瓜嫁接砧未一南瓜品种掘金龙”为研究对象，依据已克隆植物 抗病基因的保守氨基酸结构域( p - l o o p 和g l p l ) 设计合成了1 2 条简并引物，用c r a b 方法提取的南瓜基因组d n a 作为模板，通过p c r 方法及琼脂糖凝胶回收纯化技术。获 得约5 0 0 b p 的目的扩增产物，将其与p m d l 8 - t 载体连接并转化d h5 a 大肠杆茵，经过 蓝白斑初步筛选，并经茵落p c r 鉴定阳性克隆，经过限铺性酶切方法分类，测序获得 了2 0 个片段，经过在g e n b a n k 上使用b l a s t 搜索和比对同源序列，结果表明有1 3 个 阳性克隆片段具有完整开放阅读框和n b s 功能域，且与公布的甜瓜r g a 之间存在较 高的同源性，显示出两者同科的亲缘关系将其命名为s q r g a l 一s 0 r g a 6 ，s q r g a 8 一 s q r g a l 4 ，并提交g e n b a n k ，登录号分别为e f l 0 1 6 6 0 一e f l 0 1 6 6 5 ，e f l 0 1 6 6 7 。 e f l 9 9 7 5 5 一e f l 9 9 7 6 0 对这1 3 条具有完整o r f 的r g a s 进行了结构功能域分析，结果表明：1 3 条r g a s 序列都包含n b s 类抗病基因的四个保守模体：“p - b o p ，“k i n a s e 2 ”，“k i n a s e ，3 a 和“g l p l 区一系统进化树分析表明：这1 3 条南瓜r g a s 可分为t i r n b s l r r 和 n o n t i r n b s - l r r ，证实了以往报道的双子叶植物中存在两类n b s l r r 基因的结果 同源性比对结果表明。1 3 个南瓜r g a s 与已知抗病基因有较高的同源性( 1 8 4 一7 7 4 ) r g a 序列s q r g a i s q r g a 6 ，s q r g a 9 s q r g a l 2 所编码的要湛酸序列均与甜 瓜的m r g h 2 1 有较高的同源性，为7 1 9 一7 7 4 南瓜r g a 的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础，为研究南瓜 种质资源的起源与进化提供借鉴也为进一步获得他们的全长基因奠定了基础，可以利 用r a c e 技术或者从南瓜基因组文库中筛选获得全长基因，为利用优良的抗性基因进 行转基因甜瓜抗病分子育种奠定了物质基础 关犍词：南瓜保守结构域抗病基因同源序列克隆 塑堡垒苎查兰! ! 塑星堡圭兰竺丝苎 ： a b s t r a c t s q u a s h ( c u r u r b i t am o s c h a t ad u c h ) p o s s e s s e ss t r o n gr e s i s t a n c ea b i l i t i e st oc o l d n e s s , 出g h t ，m a n y d 妇e a s ep a t h o g e n s ，b - r e n = sa n de s p e c i a l l yf u s a r i u mw i l t , a n ds oi ti sg o o d 舻m i 略s t o c kf o rt h em e l o no f t h ef a w ；f l yc u c u r b i t a c e a e f i m 加w i l t ，w h c hi sc a u s e db yf r i u mo x y s p o r u m f s p m e l o n i s 。i so n ek i n d o f w o r l dm a si nm e l o n t h em a i nm e t h o dt op r e v e n tf u s a f i u mw i l ti su s i n gc h e m i c a lp e s t i c i d ew h i c h b l _ i n 铲a b o u tp o t e n t i a ld a n g e rt oh e a l t ho f p e o p l ea n de n v i r o n m 咖t ob r e e dr e , r a n tl i n e sw h i c ha mf i tf o r p l a n t i n gl a k e su pa g f i c n i t m eh a ss u c hm a n yd r a w b a c k s m yy e a i $ a n dl o we f f i d - y s od o n i n ga n d m a r k i n g t h er e s i s t a n c e g e u e o fs q u 够h a r e f a n d a m e m s f o rm s e a s er e s i s t a n c e b r e e d i n g o f m e l o n t h es t u d ya d o p t e dt h es t r a t e g y - b a s e dc l o n i n gr e s i s t a n c eg e n e = a t o g ( r o a ) t h ep r o c e d u r e s 排a 5 f o l l o w s , f i m l yt h ep o l y m e r a s ec h mr e a c t i o n ( p e r ) f o r 叫i 聊u gr o a sw e mc 删e do u tb yu s i n gt h e d e g e n e r a t ep r i m e rt h a td e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec o n s e f v e r id o n l a i mo ft h ec l o n e drg e n e s n u c l e o t i d e b i n d i n gs i t e ( n b s ) a n d t h ep l a n tg e n o m i cd n aa st e m p l a t e ；s e c o n m yt h er g a sw e i ts e q u e n c e da n d h o m o l o g o u sa n dp h y l o g e u e t i cr e l a t i o na m o n gt h er g a sa n dt h ec l o n e drg e n e sw e r ea n a l y z e d ；t h i r d l y 5 0 啦o f r g a s m s e l e c t e d a s h e c a n d i d a t e d i s e a s er e s i s t a n c e g e n e s ；a n d f i n a l l yn w p l a m t e s i s t a n t g e n e s w e r e & s c o v e r e df r o mt h e s e c a n & d a t e t h eg e n o m e d n a t e m p l a t ef r o mc u l t i v a rj u n j i n g i o n gw e x l r a c t e db yu s i n gc t a bm e t h o d , a n d t w e l v e d e g e n e r a t e p r i r e e l s w e r e d e s i g n e d b a s e d o u t h ec o n s e r v e d a m i n oa c i dd o m a i n s ( p - l o o p a n d g l p l ) t h a te x i s ti nd i s e a s e r e s i s t a n c eg e n e s ( r - g e n e s ) 。a n da m p l i f y i n gp r o d u c t s ，w h i c hs p a n n e da p p r o x i m a t e l y 5 0 0 b p , w e r ec l o n e di n t op m d l 8 一tv e c t o ra n dt r a n s f o r m e dec o i ld h5 m 腧b l u ea n dw h t ep l a q u e p r e l i m i n a r ys c r e e n i n g r e c o m b i n a n tc l o n e sw e r ei d e n t i f i e db yp c ra n dw e r ec l a s s i f i e db yr e s t r i c t i o n e n d o n u c i e a s ed i g e s t i n gm e t h o d t w e n t yd o u e sw e r e 辩q i 塘眦e da n dt h e i rh o m o l o g o u s a u e n c e sw e r e s e a r c h e do ng e n b a n kw i t hb l a s t f i n a l l y , t h i r t e e nc l o n e s 硝能a i s t i 啦h e da sr g ao fs q u 越ha n dn a n l e d s o r g a l - 6 。s q r g a 和1 4 。w h i c hw e g es u b m i t t e dt og e n b a n ka n dp r o v i d e da c c e s s i o nn u m b e r sa s e f l 0 1 6 6 0 。e f l 0 1 6 6 5 e f l 0 1 6 6 7 ，e f l 9 9 7 5 5 一e f l 9 9 7 6 0 t u e1 3s q r g a sh a do r f sa n dr e c o g n i z a b l e n b sd o m a i n s , a n ds h o w e dm 曲s i m i l a r i t i e sw i t ht h ea n n o u n c e dr g a so fm a l o , w h i c hd i s p l a y e dac l o s e r e l a t i o n s h i pa sb o t hs p e d e sa l ei nt h es a m ef a m i l y t h e 蜘j n e i i c e $ a n a l y s i so ft h e1 3r g a ss t r u e l u r e sa n dn b sd o m a l mf o u n dt h a ta i lc o n t a i n e dt h e c o n s e r v e dm o t i c s u c ha s “p - l o o p ，“k i u e s e - 2 ，“k i u s s e - 3 a a n d o l p l t h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w 1 3r g a sw e r ed i v i d e di n t ol w od i s t i n c tt y p e s , t i r n b s - l r rt y p ea n dn o n - t i r - n b s - l r rt y p e , w h i c h c o n f i r m e dt h ee a r l yr e p o r t e dt h a tn b s l r rg e n ah a st w em a j o rg r o u p si n & c o ts p e c i e s a l i g n m e n to f a m n oa c i ds e q u e n c eo ft h e s e1 3r g a sw i t ht h er e p o r t e drg e u e ss h o w e dh i g hh o m o l o g o m ( 1 8 4 - 7 7 4 ) t h ed e d u c e da m i n oa c i d so f r g as e q u e n c e ss q r g a i s q r o a 6 , s o r g a 9 - s q r g a l 2i h o m o l o g i c ( 7 1 9 ，- 7 7 4 、w i t h m r o i - 1 2 1i n m e l o n t h e s er g a si s o l a t e df r o mt h es q u a s hu s e di np r e s e n tm d yw o u l dm a k et h eb a s e 细t h ef u r t h e r 2 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 c l o n i n go fd 自s e a s e r e s i s t a n c eg e n e si ns q u a s ha n dp r o v i d e dac l u ef o rt h eo , i g i na n de v o l u t i o no fs q u a s h g e r mp l u m , b a s e dk n o w nr g a sf r o ms q u a s h ，t h ef u l ls e q t l e o frg e n ec o u l db ei s o l a t e db y r a c ea n ds c r e e n e df z o ms q u a s hg e n o m i cl i b r a r i e s k e yw o r d s ：s q u a s h ；c o n s e r v e dd o m a i n ；r g a ( r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g u e ) ；c l o n e 3 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 l 前言 南瓜( c u c u r b i t a m o s c h a t a d u c h ) 属葫芦科，是一年生草本蔓生植物，起源于美洲， 是人类最早栽培的古老作物之一( 林德佩，2 0 0 0 ) 它的种类，品种繁多果实形状、 大小、品质各异，色彩缤纷，多样化十分突出南瓜属喜温短日照植物中国南瓜的 生长期达1 2 0 天左右，成熟南瓜除作菜肴外，还可做糕点馅料，也可用作优良饲料，是 农民- 主z - 种的作物之一栽培南瓜植物的特性是：抗逆力强，耐粗放管理：适应性强，广泛 分布于全世界和中国各地，我国东西南北中，平原、丘陵、山地、高原，无处不适应： 与同科作物相比，南瓜具有多种更强的抗逆性。如：抗寒、抗旱、抗病、抗贫瘠等，特别 对瓜类枯萎病具抗性，是嫁接同科作物较好的砧木因此，南瓜属植物常被用作西瓜 甜瓜、黄瓜的砧木抗土传病害 我们在种植中通过用南瓜做砧未来嫁接舌日瓜的方法，结果发现甜瓜发病率降低3 0 左右，但是该方法费时费力，因此，十分需要针对我国南瓜品种在抗病方面存在的问题， 利用分子标记辅助选择育种以及克隆和转化目的基因等方面作更细致深入的研究甜瓜 ( c u c u r n i s m e l o l ) 又称甘瓜，果瓜，香瓜，葫芦科甜瓜属一年生草本蔓生攀缘植物 全年可以种植生产，所以一年四季都可以吃到甜瓜甜瓜营养丰富食味佳。并有解暑 的作用但甜瓜易惠枯萎病，甜瓜枯萎病( f u s a r i u mw i l t ) 由尖孢镰刀茵甜瓜专化型 ( f u s a r i u m o x y s p o r u m f s p m e l o n i s ) 所致( r i $ e r e t a l ，1 9 7 3 ) ，是一种世界性的甜瓜病害 瓜类枯萎病是典型的土传性、维管束寄生的系统病害( 孙玉宏等，2 0 0 0 ) ，从苗期到成 株期均可发病，对瓜的品质、产量影响很大应用农药虽能减缓枯萎病的发生及蔓延， 但对环境造成的污染和对人畜健康的危害却日趋严重，而且长期施用农药。病原物对农 药也产生了一定的抗药性，使防治更加困难( 王呜等，1 9 9 8 ) 实践证明防治病害的最 佳途径是选用抗病品种，培育抗枯萎病的优良品种，不仅能经济有效地减轻病害，而且 能减少农药的使用，降低环境污染、保障人民身体健康 采用常规育种方法选育抗病品种还存在着育种周期长，效率低等不少缺点，而植物 分子育种技术作为一种新的育种方法和手段，为作物的品种改良提供了新的途径抗病 基因的转基因工程一方面可以大大缩短新品种的育成时问，另外转基因途径还可以进行 跨种、属的基因转移，这也是常规育种所难以办到的( 宋从凤等，2 0 0 1 ) 但与番茄、 水稻、小麦、白菜等作物相比，目前在南瓜的分子生物学研究领域还了解较少，只有杨 明挚等( 2 0 0 5 ) 从黑子南瓜中克隆到s t k 类抗病基因同源序列克隆南瓜抗病基因。 则是当前利用分子技术进行抗病育种工作的基础，同时也为甜瓜的抗病育种打下基础 抗病基因同源序列( r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g s ，r g a s ) 是一种存在于植物基因组当中 的、使用p c r 等技术获得的与至今已分离出来的6 0 多个抗病基因的某些保守序列存 在较高同源性的d n a 片段( 丁国华等。2 0 0 6 ) 本研究就是利用已知的n b s 类抗病基 因结构中氨基酸的保守域设计并合成简并引物。扩增并克隆了南瓜的抗病基因同源序列 r g a 。并对所克隆的同源序列r g a 进行测序分析，比较其与已知抗病基因序列的同源 4 塑塞奎蔓查兰! ! 里旦堡主兰丝堡塞。 性及其序列特征尽管r g a 与植物的抗病基因仍有较大区别。但许多研究证明，一些 r g a 与抗病基因密切连锁，甚至就是抗病基因的一部分此外，r g a 标记还具有容易 获得、扩增结果稳定和使用费用低廉等优点这些r g a s 可作为候补抗性基因来定位 克隆抗病基因，也可应用于分子标记辅助选择育种同时他们对于研究抗病基因的起源 和进化关系也有重要意义因此，分离和克隆植物的r g a 成为当前人们比较认同的标 记，定位和克隆植物抗病基因策略之一当前在瓜类作物中，仅从甜瓜( c u c u m s m e l o l ) 中分离了1 4 个r g a 片4 殴( b r o t m a n e t a l 。2 0 0 2 ) 、黄瓜( c u c u m i s s a t i v u s l ) 中分离了1 5 个r g a 片段( 丁国华等，2 0 0 5 ) 和西瓜中分离了6 个r g a 片段( 郭绍贵等，2 0 0 5 ) 2 国内外研究现状 2 1 植物抗病反应的分子机理 2 1 1 基因j 基因假说 2 0 世纪4 0 年代末到5 0 年代初，植物病理学家h o t 通过研究亚麻对亚麻锈菌的小 种特异掘踟传规律，提出了基因对基因学说( g e n t f o r g e n e ) ( n o r e t a l ，1 9 7 1 ) ，用于 描述植物与病原菌素和互作和非亲和互作的遗传基础迄今已被证明至少适合于几十种 不同的植物病原互作系统，包括真菌、细菌、病毒所致病害，以及线虫和寄生种子植 物所致的病害该学说的基本内容为：病原茵与其寄主植物各自存在一对互作基因，即 病原茵中的无毒基因( a v r ) 和寄主植物的抗病基因( r e s i s t a n c eg e n t ，r ) 当二者均 为显性时，植物匆病原茵表现非亲和互作，病原茵无毒，植物抗病：当二者中任何一个 为隐性时，植物和病原菌表现亲和互作，病原菌有毒，植物感病在分子水平上，这种 假说能很好地被配体受体模式加以解释，即病原菌无毒基因直接或间接编码产物( 配 体) ，特异性地被植物互补抗病基因编码产物( 受体) 所识别，激发植物产生抗病反应 如果病原茵缺少无毒基因或植物缺少抗病基因时，这种识别作用不能完成，病原茵有毒， 植物感病如图1 - 1 图1 - 1 植物与病原茵基因对基因互作模式示意图( 羽良式，1 9 9 6 ) h g 1 1s k e t c hm a po f g e n ef o rg e n ei ni r a e r a c t i o n a lm o d e lb e l w e e np l a n ia n dp a t h o g e n s 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 病原菌内除无毒基因外。还有其它与致病有关的基因毒性基因( t 打) 和决定寄主 范围的基因毒性基因具体有致病( h r p ) 和病害专化致病基因( d s p ) ，前者具有在非 亲和寄主植物上引起过敏反应以及在亲和寄主上引起病害的双重功能；后者j e , j 确定病原 茵在寄主植物上的侵染力 2 1 2 病原的无毒基因 1 9 4 2 年f l o r 首次阐述病原的无毒基因，1 9 8 4 年克隆了第一个无毒基因a v r a 随后， 许多研究者通过类似的方法从不同的病原包括细菌、真茵和病毒) 中克隆4 0 多个无 毒基因这不仅有力地支持了基因对基因假说，而且也促进了对其本身的认识无毒基 因克隆后，发现克隆自某一病原的无毒基因可在其他病原中起作用例如，将克隆自甘 蓝黑腐黄单胞杆菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 一个、小种的无毒基因a v r r x v 转化到不 舍它的p v g l y c i n e a ，p v p h a s e o l i 、p v v i g i n c o l a ，p v a l f a l f a e ，p v h o l c i c o l a 和p v m a l v a c e a r u m 等致病变种时，它们会分别在其对应的原来感病的寄主植物大豆菜豆、豇豆、苜蓿。 玉米和棉花上诱发过敏反应这表明，无毒基因不仅具有决定病原小种特异性( 或寄主 植物的品种特异性) 的作用，而且还有更高水平上的特异性决定作用，即决定病原致病 变种( 或寄主植物种) 的特异性由此说明，在不相关的植物中可能蕴含着功能相同的 抗病基因因为根据基因对基因假说，对舍有某一无毒基因的病原表现过敏反应的不同 植物，应具有功能相同的抗病基因( 张德水等，1 9 9 7 ) 2 1 3 植物的主动防卫反应 植物的抗病能力一方面表现在植物本身的阻止病原物侵入的机制上( 如特殊的气孔、 致密的角质或蜡质等) ，另一方面表现在植物受到病原物侵染时诱导产生的防卫反应， 后者是植物抗病的主要方式这些防卫反应主要包括以下两种： 过敏性反应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) ( d a n ge ta l ，1 9 9 6 1 是植物最常见的抗病 反应，表现为受病原茵侵染的植物细胞快速死亡，被侵染的部位形成枯斑，从而限制病 原茵的进一步扩展过敏反应的内在机制是植物的程序死亡，使得病原茵被限制在侵染 点周围的坏死组织申，并因缺少营养物质而死亡事实上被侵染的植物细胞程序性死亡 的原因不是病原茵毒害作用，而是启动了植物细胞的程序死亡的基因植物与病原菌发 生非亲和性作用时出现的活性氧的迸发就被认为与过敏反应时细胞的死亡有关活性氧 是一类有高度氧化活性的含氧小分子物质的总称，具体有超氧自由基，过氧化氢和羟自 由基活性氧在过敏反应中的作用有：引起脂质过氧化，破坏植物细胞膜，导致细胞死 亡；对病原茵产生直接的毒害；加固植物细胞壁阻止病原茵进一步侵染；参与细胞程序 死亡的启动和s a r 的形成 系统获得抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e 。s a r ) 是指植物发生过敏反应后所获得 的对病原菌的广谱抗性该抗性在用非亲和性病原茵接种后数天内形成。可持续数周 塑堡查苎奎兰! ! 婴星璺主兰堡丝茎 甚至数月不等s a r 是植物防卫反应基因被系统诱导表达的馇果( r y a l s e la l 。1 9 9 6 ) ，其 分子基础主要是病程相关蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n ，p r ) 的合成因此，决定 植物s a r 的基因主要是p r 基因目前从植物体内已经鉴定出来的p r 蛋白有几丁质酶、 b - 1 ，3 - 葡聚糖酶，过氧化物酶、超氧化物歧化酶、脂氧化酶以反破坏昆虫消化系统的蛋 白酶抑制因子等 。 从反应部位上看，h r 是局部的，s a r 是整体的；从反应时间上看，s a r 是继h r 之后出现的，执行两者之间信息传递的信号分子是水杨酸和活性氧水杨酸为第一信使。 活性氧为第二信使( 王钧等，2 0 0 1 ) 多年研究结果表明，诱导防卫反应是由植物特异抗病基因介导完成的从目前来看， 至少有以下几类不同的作用机制：1 抗病基因编码产物能钝化病原茵侵染时产生的毒素， 进而抑制病原菌的繁殖往往会出现植物局部坏死的症状这种机制典型的例子就是 j o h a l 和b r i g g s 克隆的世界上第一个植物抗病基因h m l 该基因能编码依赖于n a d p h 的h c 毒素还原酶，该酶能使玉米圆斑病菌生理小种1 所产生的毒素失活，从而使玉米 获得抗性2 显性基因能编码病原菌致病性的靶标物，若植物缺乏该靶标物就会产生抗 性这方面的例子是玉米线粒体基因r - u r 7 3 ，该基因不仅能编码与雄性不育有关的蛋 白，也能编码与病原茵b i p o l a r i sm a y d i s 生理小种t 分泌毒素亲和的产物，导致玉米与 病原菌发生亲和性互作，即植株感病，而缺乏该基因的玉米品种则抗该种病原物最近。 v o g c l 等在拟南芥抗白粉病研究中也发现类似的机制3 抗病基因表达产物直接引发抗 病反应到目前为止，只在大麦中发现这种作用机制研究发现，大麦显性基因m l o 编 码5 3 4 个氨基酸残基组成的分子量为6 0 k d a 含7 个跨膜的膜锚定蛋白，它可能是植物细 胞死亡和其他防卫系统的负调控因子，而含隐性基因m i o 的植株则能抵抗病原茵 e r y s i p h eg r a m i n i s s p h o r d e i 的侵染，植物抗性基因表达产物能特异性识别病原茵中相应 无毒基因编码的产物，并产生信号分子，这些信号分子经信号传递因子传递后，开启植 物防卫基因的表达，最终对病原茵产生抗性这就是著名的基因对基因假说这种防卫 作用机制在植物中普遍存在，也是目前研究最深入的一种作用机制抗病基因编码的产 物与病原茵无毒基因表达产物直接或间接结合后会引发一系列反应，如蛋白磷酸化 c a “浓度变化、活性氧变化水杨酸变化和离子流等植物防卫基因的表这主要包括谷 胱甘肽s 转移酶、过氧化物酶、细胞壁蛋白、蛋白酶抑制荆、水解酶( 如几丁质酶和1 ， 3 b 葡聚糖等) 及涉及次级代谢的病程相关( p a t h o g e n n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n ，p r ) 蛋白和 酶等 目前所克隆的抗病基因大部分都编码n b s u t r ( 表1 ) 。而且序列同源性很高，而 病原茵的种类千变万化，植物在诱导防卫反应中如何战胜病原茵侵袭的问题已引起世界 各国科学家的普遍关注近十年来，人们对植物抗病基因表达产物与病原茵中相应的无 毒基因编码产物是否直接反应以及植物从病原茵的起始识别诱发防卫基因表达过程中 信号如何传导等问题进行了广泛地研究，并取得了明显进展据d e w i t 和b o g d a n o v c 分 7 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 别报道，目前除番茄抗细菌叶斑病基因t t o 和水稻抗稻瘟病基因a 一幻编码的产物能与 病原菌中相应的无毒基因编码产物作用最近，m a c k e y 等在拟南芥抗丁香假单胞的基 因r p m l 抗性机制研究中发现，- r 香1 l 曼- 单胞中无毒基因a v r b 和a v r r p m l 编码产物并不 直接与抗病蛋白r p m l 结合。而是首先与蛋白质r i n 4 结合形成复合体才能识别抗病基 因所编码的蛋白 人们研究发现，植物抗病基因引发防卫基因表达的信号传导途径是多种多样的，如 水杨酸途径，茉莉酸途径和乙烯途径等，涉及许多信号传导相关因子最近，英国和美 国等发达国家的几个世界著名实验室在植物抗病机制中发现两个抗病信号传导的下游 调控因子冠幔j 和跖乃在防卫反应中发挥重要作用 随着功能基因组和比较基因组学的不断发展，人r 】将会对植物细胞与病原茵之间的 相互识别机理、各种信号分子信号传导机制以及多种信号传导途径的相互关系有更深入 的了解，从而揭示植物抗病分子机制的奥秘，为植物抗病基因工程研究与应用打下坚实 的基础，同时也将极大地丰雷现代分子生物学的内涵 2 1 4 植物的防卫基因 所谓植物抗病的防卫基因就是编码参与以上所有防卫反应过程的各类抗病物质的基 因，如几丁质酶基因、b 1 ，3 - 葡聚糖酶基因、苯丙氧酸裂解酶基因、查尔酮合成酶基因 木质素合成酶基因、富含羟脯氨酸蛋白基因等，其中部分基因已被克隆事实上，防卫 基因在抗病植株和感病植株中都存在，只是在感病植株中表达得慢和微弱而已 根据基因对基因学说，植物的防卫基因的表达即植物防卫系统的激活依赖于寄主植 物与病原菌之间的相互作用，具体说就是寄主植物的抗病基因与病原菌的无毒基因的非 亲和性作用使植物表达抗病性的是防卫基因，而决定植物能否表现抗病性的是抗病基 因( 刘良式，1 9 9 6 ) 2 2 植物的抗病基因 2 2 1 植物中已克隆的抗病基因 克隆基因的途径可分为两种，即正向遗待学和反向遗传学前者也就是通常所说的 “功能性”克隆( f u n c t i o n a lc l o n i n g ) ，依赖目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定基 因的产物或某种明显的表型突变等信息合成寡核苷酸探针，从e d n a 文库或基因组文库 中筛选出编码该性状的基因。或制备相应的蛋白抗体从e d n a 表达文库中蓐选出目梧基 因利用这种方法来克隆基因在水稻( 周兆斓等，1 9 9 6 ) 烟草( 胡天华等，1 9 8 9 ) 等 植物中已有报道反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白 质，然后再去寻找有关的表型变化例如基因剔除技术或转基因研究简单地说，正向 遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学是从基因变化研究表型变化虽然目前 在植物中已克隆到了不少抗病基因，而且从其结构特征也可以将这些基因分类，然而是 3 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 否同类抗性基因在抗病过程中就一定具有类似分子机制，而不同类别的抗性基因在抗病 反应中作用的分子机制就一定不同，这个问题目前还没有得到明确的了解事实上，就 所克隆的这些抗病基因而言，他们的产物结构在具有类似性的同时也都存在不同程度的 差异，这种差异在抗病分子机制中究竟起着什么作用，也知道得不多，所以很难具体地 把握未知基因的产物再者，抗病基因的表达水平往往很低，着眼于基因编码的蛋白产 物直接克隆抗病基因难度很大随着八十年代以来分子生物学研究技术手段的不断进 步，植物遗传研究由以往的表型性状观察研究逐渐发展到目前的表型性状、基因定位和 基因克隆相结合的水平，并发展了一系列以植物表型性状为基础的基因克隆方法，其中 转座予标签克隆法( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) ，定位克隆法( p o s i t i o n a lc l o n i n g ) 是用得较 广的两种经典的基因克隆方法 。 转座子标签克隆基因是将转座子d n a 作为诱变剂插入到目的基因位点引起基因突 变实现对目的基因的标记，进一步利用转座子d n a 作为探针来克隆目的基因自从分 离到玉米a c d s 和s p m 等转座子并发现这些转座子家族在其他植物中也具有转座功能 后( l e v y e t a l ，1 9 9 0 ) 。转座子标签系统已被广泛地用于基因的鉴定及分离用转座子 标签方法成功克隆植物抗病基因的第一例报道是玉米的h m l 基因，该工作是由b r i g g s 等( 1 9 9 2 ) 所完成他们利用该技术在玉米中分离到各种类型的对玉米圃斑病菌 ( c o c h l i o b o l u sc a r b o n u m ) 隐性感病的突变株，并发现突变因子m u t a t o r ) 与突变表型 共分离，进一步对其它突变体进行吸印杂交验证了h m l 即为目标抗病基因，尽管h m l 并不是基因对基因的小种专化型的抗病基因，但它能产生稳定的抗病性，因此，h m l 的成功克隆已成为利用转座子标签克隆抗病基因的典范随后烟草抗花叶病毒基因 ， ( w h i t h a me t a l ，1 9 9 4 ) 、番茄抗叶霉病基因c f - 9 ( j o n e s e t a l 。1 9 9 4 ；r i c h a r d e t a l ，1 9 9 8 ) 、 c f - 4 ( t h o m 勰e t a l ，1 9 9 7 ) 、亚麻抗叶锈病基因, 6 ( e u i s e t a l ，1 9 9 9 ) 和m ( a n d e r s o n e t a l ，1 9 9 7 ) ，玉米的抗奈锈病基因r p l - d ( c o l l i n se ta l ，1 9 9 9 ) 等也通过这种方法克隆成 功 定位克隆又叫图位克隆( m a p - b a s e dc l o n i n g ) ，该方法先是通过遗传连锁分析将控 制目标性状的基因定位到染色体上距离很近的两个分子标记之间，并以这两个分子标记 为出发点进行染色体步移( c h r o m o s o m ew a l k i n g ) ，构建基因住点的物理图谱，如果目 标基因被界定在特别近的两个分子标记之间，也可不必构建物理图谱，而直接通过染色 体登陆( c h r o m o s o m el a n d i n g ) 来获得目标基因，然后对目标基因进行功能互补验证 从理论上讲，任何基因只要其控制的性状可以鉴定都能借助该方法实现基因的克隆该 方法最大的优点就是只要能确定基因的遗传位点。就可实现对该基因的克隆当然，定 位克隆要依赖于有高密度的分子标记图谱，因为分子图谱的标记密度越高，将目的基因 界定在染色体上的距离会越小，也就更容易实现染色体步移或染色体登陆随着分子标 记技术的不断发展，很多植物高密度分子遗传图谱和物理图谱都陆续得以构建，为克隆 植物基因奠定了坚实的基础，尤其是拟南芥、水稻等全基因组序列图的成功绘制，为定 9 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 位克隆拟南芥、水稻中的目标基因提供了十分有利的条件应用这种方法在一些植物中 已成功地克隆了许多抗病基因，如大麦的抗白粉病基因m l o ( b u s c h g e s e t a l ，1 9 9 7 ) ， 番茄的抗叶霉病基因c f - 2 ( d i x o ne t a l ，1 9 9 6 ) ，抗叶斑病基因 t o ( m a r t i ne t a l ，1 9 9 3 ) ， 抗枯萎病基因，2 ( o r ie ta l ，1 9 9 7 ) ，拟南芥的抗丁香单胞杆菌基因r p s 2 ( b e n te ta l ， 1 9 舛：m i n d r i n o se t a l ，1 9 9 4 ) ，r p m l ( g r a n te t a l ，1 9 9 5 ) 抗霜霉病基因r p p 5 ( p a r k e r e t a l ，1 9 9 7 ) ，水稻x a 2 1 s o n ge t a l ，1 9 9 5 ) x a l ( y o s b i m u r ae t a l ，1 9 9 8 ) 、抗稻瘟 病基因p b ( w a n g e t a l ，1 9 9 9 ) p 缸( b r y a n e t a l ，2 0 0 0 ) 甜菜的抗线虫基因h s i 陆 等( c a i e t a l ，1 9 9 7 ) 表1 列出了迄今从植物中克隆出的6 3 个抗病基因( r g e n e ) ，克隆这些抗病基因的 方法基本是图谱定位和转座子标签鉴于水稻、番茄等植物的遗传图谱和物理图谱完成 的比较好，而拟南芥基因组非常小，使得已克隆的抗病基因近一半属于拟南芥、水稻、 番茄等植物，而在南瓜等瓜类作物中只有甜瓜的抗病基因被克隆 表1 已克隆到的植物抗病基因 t a b l e1c l o n e dr e s i s l a n c eg e n e si np l a n t s 供体 抗病基因病原茸结构特征研究者 墅竺墨g e 竺翌! ! 矍!曼婴璺翌! 生垒! 竺 呻n s a t i v ax a - 2 1x a n t h o n w n a sl r r ，p k s o n g e ta l ，1 9 9 5 s o l a n u m i i i b e r o s l l m h o r d e u m x 口- 2 1 d 肠- j p i - b t i 一4 r x - 1 g x - 2 g p a - 2 脚 m l a c w n p e s t r i s p v o r y t a e x a n t h o m o n a $ e a m p e s t r i s p v o r y t a e x a n t h o m o n a j c a m p e a r l s p o g y z # m a g n a p o r t h e g r i s e a n b s - l r r w a n ge t 以 1 9 9 8 l z n b s u u r1 s h i m m 鼍e t a l ，1 9 9 7 n b s - l r r w a n g z x 1 9 9 9 p o t a t ov i m z p o t a t o ，i ，i ，x n a i f a i n t l r ase t a l ，1 9 9 7 l z jn b s u t r a b d e l h a r i de t a l 。1 9 9 9 l 玉n b 譬l r ra b d e i h a f i de t a l ，2 0 0 0 g i o b o d e r a p a i l