（微生物学专业论文）耐药结核分枝杆菌的多维分析.pdf

复旦大学博士学位论文 耐药结核分枝杆菌的多维分析 研究生乐军 导师王洪海教授 复旦大学微生物学系上海 摘要 结核病仍然是威胁人类健康的主要杀手。耐药结核分枝杆菌数量的日益增 加和结核合并h i v 感染是造成近年来结核病死灰复燃，卷土重来的主要原因。我 国不仅是全球结核病的第二大重灾区，也是w h o 确定耐多药结核病的高发瘸率地 区。研究结核分枝杆菌耐药机制对于抗结核新药的开发和耐多药结核诊断试剂研 制具有重大的意义。 为了解中国耐多药结核杆菌的利福平耐药基因r p o b 突变特征，我们应用 d n a 测序技术分析8 6 株结核分枝杆菌临床分离株r o p b 基因利福平抗药性决定区 域( r i f a m p i nr e s i s t a n c ed e t e r m i n i n gr e g i o n ，r r d r ) 和v 1 7 6 f 突变特征，7 2 个 耐药分离株中的6 5 个菌株中的r p o b 基因的r r d r 内发现2 2 种不同类型突变，2 1 种点突变和个插入突变。最常见突变位点5 3 1 ( 4 1 ) ，5 2 6 ( 4 0 ) ，和5 1 6 ( 4 ) 。 l o 耐药分离株末发现突变。新发现r r d r 内六个新的等位基因，以及r r d r 外部 五个新的突变。所有分离菌株均不包含v 1 7 5 突变。其结果有助于发展耐多药结 核病快速分子诊断方法和确定我国的耐多药结核病高发热点地区，从而采取有效 结核病控制策略。 d n a 微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序发展方向。由于高密度微阵列 价格昂贵，分析操作复杂，和结果难予锵释、限制其临床实验室垦广泛地运用。 我们试图建立一种中等的密度阵列方法，可快速地鉴定结核分枝杆菌利福平耐药 菌株。这种方法根据r p o b 基因利福平抗药性决定区域内点突变及其他重排的检 ； j 。和福平抗药性通过便荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定。研究检测 5 3 株利福平耐药结核分支杆菌和1 5 株利福平敏感结核分枝杆菌。结果与药物敏 感性试验和d n a 测序结果一致。p c r 扩增仅仅1 5 小时可硷出刹福平耐药临床分 离株。寡核苷酸微微阵列是高效方法，可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥 复旦大学博士学位论文 补标准培养物方法不足。 我们首次应用高效液相色谱结合m a l d i m s 质谱分析i n h 而 药和敏感菌株的 分泌蛋白的差异，通过d e a e 亲和色谱去除培养基上清液牛血清白蛋白后，从异烟 肼耐药结核杆菌培养上清液中鉴定一种特征性分泌蛋白，海藻糖磷酸磷酸酶 ( t r e h a l o s e p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ，t p p ) ，分子量4 6 k d a ，p 1 5 3 。这是首次 报道从结核分枝杆菌的分泌蛋白发现存在t p p 。由于海藻糖是分枝杆菌细胞壁的 结构完整性所必需的分子，涉及海藻糖糖脂生物合成酶t p p 代表潜在抗结核药物 靶位。在一般生物体内，t p p 一般存在细胞胞浆中，而且t p p 与异烟肼耐药相关。 从而为血清学水平上快速诊断异烟肼耐药结核病提供一种新的途径。 为了鉴定异烟肼耐药结核分枝杆菌特异的蛋白，我们应用双向电泳和 m a l d i m s 质谱蛋白质组学技术比较分析2 株异烟肼耐药结核分枝杆菌, 1 1 2 株敏感 结核分枝杆菌。发现异烟肼耐药结核分枝杆菌有2 6 个特征斑点，对其中6 个蛋白 斑点进行鉴定，6 个蛋白分别是海藻糖磷酸磷酸酶( p u t a t i v e t r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ) ，铁钼蛋6 m o a a ，s h i k i m a t e5 - 脱氢酶 ( p u t a t i v es h i k i m a t e5 - d e h y d r o g e n a s e ) ，葡萄糖胺果糖一6 一磷酸氨基转移酶 ( g l u c o s a m i n e f r u c t o s e 一6 p h o s p h a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ) ，吲哚3 一甘油磷酸 合成酶( i n d o l e 一3 一g l y c e r o lp h o s p h a t es y n t h a s e ) ，t e t r 家族转录调节因子 ( p u t a t i v et e t r f a m i l yt r a n s o r i p t i o n a lr e g u l a t o r ) 。这些酶及调控因子多数 为放线菌科关键性的代谢酶和调控因子。研究结果为进一步探索抗分枝杆菌药物 和耐药结核病的快速诊断试剂提供线索。 应用高密度e d n a 微阵列研究结核杆菌异烟肼耐药菌株与h 3 7 r v 异烟肼敏 感菌株感染巨噬细胞后差异表达的基因。两者诱导巨噬细胞的差异表达基因有 5 3 条，异烟肼耐药菌株比敏感菌株菌株诱导多种趋化因子和细胞免疫增强的细 胞因子表达上调和免疫抑制细胞因子i l 10 等表达下调。说明异烟肼耐药对细菌 毒力有明显的影响，异烟肼耐药菌株的致病力下降，异烟肼耐药菌株容易被宿主 免疫系统清除。结果为耐多药结核病控制提供依据。 关键词：结核分枝杆菌耐药性微阵列蛋白质组学巨噬细胞 异烟肼利福平 复旦大学博士学位论文 m u l t i - - d i m e n s i o n a l a n a l y s i so fd r u g - r e s i s t a n t m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s p h dc a n d i d a t e ：y u ej u n s u p e r v i s o r ：w a n gh o n g h a i ( p r o f e s s o r ) d e p a r t m e n to f m i c r o b i o l o g y f u d a n u n i v e r s i t y , 2 0 0 4 3 3 ，s h a n g h a i a b s t r a c t i u b e r c u l o s i sr e m m n so n eo f t h em a i nt h r e a t st om a n k i n d c a u s i n g8m i l l i o n n e w c a s e sa n d2m i l l i o nd e a t h sa y e a r 1 1 1 ep r o b l e m i sb e c o m i n gm o r ec r i t i c a lw i t ht h e e m e r g e n c e a n d s p r e a do f m u l t i d r u gr e s i s t a n t ( m d r ) s t r a i n so f m t u b e r c u l o s i s ，d e f i n e d a sr e s i s t a n tt oa tl e a s ti s o n i a z i d ( i n h ) a n dr i f a m p i n ( r i f ) ，c h i n ai sn o t o n l yo n eo f t h e 2 2h i g h - b u r d e nc o u n t r i e sf h b c s ) t h a tc o l l e c t i v e l ya c c o u n tf o ra p p r o x i m a t e l y8 0 o f t h ew o r l d st u b e r c u l o s i sc a s e s ，b u ta l s ot h eh o t s p o ta r e ao f v e r y h i g hp r e v a l e n c eo f m d rt bi d e n t i f i e db yw h o ( 4 ，5 ) t h ei n c r e a s i n gp r e v a l e n c eo f t u b e r c u l o s i sm a k e s t h i sd i s e a s eam a j o rf o c u sf o r d r u gr e s e a r c ha n d f o rt h ed e v e l o p m e n to f n o v e l d i a g n o s t i ct o o l s m u t a t i o n si nt h e8 1 - b pr i f a m p i nr e s i s t a n c ed e t e r m i n i n gr e g i o n ( r r d r la n d m u t a t i o n v l 7 6 f l o c a t i n g i n t h e b e g i n n i n g o f t h er o p bg e n e w e r e a n a l y z e d b y d n a s e q u e n c i n go f 8 6 m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sc l i n i c a li s o l a t e s ( 7 2r e s i s t a n ta n d1 4 s e n s i t i v e ) f r o md i f f e r e n tp a r t so fc h i n a ，s i x t y - f i v em u t a t i o n so f2 2d i s t i n c tk i n d s ，2 1 p o i n t m u t a t i o n sa n do n ei n s e r t i o n ，w e r ef o u n di n6 5o f7 2r e s i s t a n ti s o l a t e s t h em o s t f r e q u e n t n m t a t i o n s w e r e i nc o d o n5 3 1 ( 4 1 ) ，5 2 6 ( 4 0 ) ，a n d5 1 6 ( 4 ) m u t a t i o n s w e r en o tf o u n di ns e v e n ( 1 0 ) o f t h er e s i s t a n ti s o l a t e s s i xn e wa l l e l e sw i t h i nt h e r r d r ，a l o n g w i t hf i v en o v e lm u t a t i o n so u t s i d et h er r d r ，a r e r e p o r t e d n o n eo f i s o l a t e sc o n t a i n e dt h ev 17 6m u t a t i o n t h ei n f o r m m i o no b t a i n e df r o mt h i ss t u d vw i l l a s s i s tn o to n l yi nd e s i g no f as u i t a b l ed i a g n o s t i cm e t h o df o r r a p i dd e t e c t i o no f m d r t bb u ta l s oi nt h ei d e n t i f i c a t i o no f a n yh o t - s p o tr e g i o n si nt h ec o u n t r yf o rp r o p e r i m p l e m e n t a t i o no f t b c o n t r o ls t r a t e g y b a s e do ni n f o r m a t i o na b o u tr o p bg e n em e n t i o n e da b o v e am o d e r a t e d e n s i t y 5 复旦大学博士学位论文 a r r a ym e t h o dt h a tr a p i d l yi d e n t i f i e dm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sr i f a m p i nr e s i s t a n t s t r a i n sw a sd e v e l o p e d t h em e m o di sb a s e do nd e t e c t i o no f p o i n tm u t a t i o n sa n d o t h e r r e a r r a n g e m e n t si n t h er p o bg e n er e g i o nd e t e r m i n i n gr i f a m p i nr e s i s t a n c e r i f a r n p i n r e s i s t a n c ew a sd e t e r m i n e db yh y b r i d i z i n gf l u o r e s c e n t l yl a b e l e d ，a m p l i f i e dg e n e t i c m a t e r i a lg e n e r a t e df r o mb a c t e r i a lc o l o n i e st ot h ea r r a y ，f i f t y t h r e er i f a m p i n - r e s i s t a n t m ( t u b e r c u l o s i sa n df i f t e e nr i f a m p i n s e n s i t i v em t u b e r c u l o s i sw e r et e s t e d ，r e s u l t sw e r e c o n c o r d a n tw i t ht h o s eb a s e do nc u l t u r ed r u gs u s c e p t i b i l i t yt e s t i n ga n ds e q u e n c i n g r i f a m p i nr e s i s t a n tc l i n i c a l i s o l a t e sw e r ed e t e c t e di na sl i t t l ea s1 5h o u ra f t e rp e r a m p l i c a t i o nw i m v i s u a lr e s u l t s i ti sd e m o n s t r a t e dt h a to l i g o n u c l e o t i d em i c r o c h i pi s e f f i c i e n t ，s p e c i a l i z e dt e c h n i q u e t oi m p l e m e n ta n dc o u l db eu s e da sar a p i dm e t h o df o r d e t e c t i n gr i f a m p i n r e s i s t a n c et oc o m p l e m e n ts t a n d a r dc u l t u r e b a s e dm e t h o d as e c r e t e dp r o t e i nf r o mc u l t u r es u p e m a t a n t so f i n h , r e s i s t a n tm t u b e r c u l o s i sw e r e p u r i f i e db yh p l c ，a n d i d e n t i f i e db ym a l d i m s t h e p r o t e i nw a s t r e h a l o s e p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e i n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so f t r e h a l o s e b e c a u s e t r e h a l o s ei sn e i t h e rs y n t h e s i z e db y ，n o ru t i l i z e di n ，m a m m a l i a nc e l l s ，b u ti sp r o b a b l y a ne s s e n t i a lm o l e c u l ef o rt h es t r u c t u r a li n t e g r i t yo f t h em y c o b a c t e r i a lc e l lw a l l ， t r e h a l o s e - p h o s p h a t ep h o s p h a t a s er e p r e s e n te x c e l l e n tp o t e n t i a lt a r g e ts i t e sf o r c h e m o t h e r a p ya g a i n s tm y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s w eu s e da p r o t e o m ea p p r o a c h ，c o m b i n i n gh i g h - r e s o l u t i o nt w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - d e ) w i t hm a s ss p e c t r o m e t r y t oc o m p a r et h ec e l l u l a rp r o t e i n c o m p o s i t i o no f t w o i n hr e s i s t a n ts t r a i n so f m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sw i t ht w o i n hs e n s i t i v es t r a i n so f m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ，i no r d e rt oi d e n t i f yu n i q u e p r o t e i n so f t h e s es t r a i n s e m p h a s i sw a sg i v e n t ot h ei d e n t i f i c a t i o no f i n hr e s i s t a n t s t r a i n ss p e c i f i cp r o t e i n s ，b e c a u s ew ec o n s i d e rt h e s e p r o t e i n s t or e p r e s e n tp u t a t i v e c a n d i d a t e sf o rd e v e l o p m e n to f d r a ga n dd i a g n o s i so f t u b e r c u l o s i s 2 6s p o t sw e r e e x c l u s i v e l yd e t e c t e di nt h ei n h r e s i s t a n tm t u b e r c u l o s i s s i xs p o t so ft h o s ew e r e i d e n t i f i e db ym a l d i m s t h er e s u l t si nt h i ss t u d y p r o v i d e ab a s i sf o rf u r t h e r d e v e l o p n o v e la n t i m y c o b a c t e r i a la g e n t sa n d d i a g n o s t i ca p p r o a c ho f d r u g - r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s t h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si nm a c r o p h a g e si n r e s p o n s et oi n f e c t i o n w i t hi n h r e s i s t a n tmt u b e r c u l o s i sa n di n h s e n s i t i v eh 3 7 r vs t r a i nw e r ea n a l y s e db y e d n a m i c r o a r r a y ，t h e r ea r ee x i s t i n gr e m a r k a b l ed i f f e r e n c eb e t w e e ni n h r e s i s t a n t m t u b e r c u l o s i sa n dh 3 7 r vs t r a i ni n d u c e d g e n ee x p r e s s i o n i nh o s t c e l l s ，a n d i n h - r e s i s t a n t l t u b e r c u l o s i si n d u c e dm o r e e x p r e s s i o n o fs o m ec h e m o k i n e sa n d 6 墨呈查堂堕主兰垡堡兰 c y t o k i n st h a tc a ne n h a n c e t h lc e l l m e d i a t ei m m u n er e s p o n s e t h er e s u l t si m p l yt h a t i n h r e s i s t a n c e a f f e c t sv i r u l e n c e o f1 n h r e s i s t a n tmt u b e r c u l o s i sa n d p r o v i d e i m p o r t a n ti n f o r m a t i o n f o rc o n s t i t u t em d r t bc o n t r o lp r o g r a m - k e y w o r d s ：m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ；d r u g - r e s i s t a n c e ；p r o t e o m i c s ；m a c r o p h a g e u 9 3 7 ；r i f a m p i n ；m i c r o a r r a y ；i s o n i a z i d ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 7 复旦大学博士学位论文 第一章综述 第一节分枝杆菌的分子诊断 分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合菌群的各菌种以及8 0 多种致病型，机 会致病型和非致病型非结核分枝杆菌。最重要是结核分枝杆菌，结核是世界上主 要的传染性疾病，每年结核病死亡人数超过2 0 0 万，新发病例8 0 0 万。鸟分枝杆 菌是临床的标本中最常见的非结核分枝杆菌。其和a i d s 密切相关，因此鸟分枝 杆菌导致的感染临床意义重大。结核杆菌和其他分枝杆菌的主要差别是结核分枝 杆菌可在人群中相互传播。因此，快速诊断结核病尤显重要。此外，根据分枝杆 菌的菌种不同，抗生素治疗方案是不同的。依据临床资料可初步诊断分枝杆菌病。 但是明确诊断经常需要实验室中分离鉴定感染的细菌。一般的实验室检测过程包 括标本去污染和消化，抗酸杆菌镜检，培养分离鉴定，以及药物敏感试验。由于 分枝杆菌生长速度缓慢，分离、鉴定和药物敏感试验需要几星期或更长的时间。 近年来，已建立多种分子方法用于分枝杆菌的直接检测，鉴定和药物敏感试验。 这些方法把诊断的时间从数星期减少至数天。本文简述这些方法对结核病诊断和 治疗的价值。 1 标本中分枝杆菌的直接检测 包括结核分枝杆菌在内的多数的分枝杆菌，在实验室中生长极端缓慢，固体 培养基需要培养3 8 周或放射测量液体培养系统b a c t e c 需要培养2 周。缓慢的 生长特性通常延误结核病诊断。核酸扩增方法( n u c l e i ca c i d a m p l i f i c a t i o n ，n a a ) 可在培养结果出来之前直接检测标本中分枝杆菌的d n a 或 r n a 。美国食品和药物管理局f d a 已经批准两种n a a 试验用于检测临床标本中的 结核分枝杆菌。这两种试验是改良型结核分枝杆菌直接试验( e n h a n c e d m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sd i r e c tt e s t ，e - m t d ) 和a m p l i c a r 结核分枝杆菌 试验( a m p l i c o rm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i st e s t ，a m p l i c o r ) 。 1 1 a m p l i c o r a m p l i c o r 试验根据p c r 原理。采用根据分枝杆菌1 6sr r n a 基因设计的属 特异性引物扩增分枝杆菌d n a 。扩增后，扩增子变性形成单链并加到包被结核杆 菌复合菌群特异性寡核苷酸探针的微量滴定板内。亲和素过氧化物酶结合物与生 物索标记的扩增子结合。结合物与二甲基甲酰胺溶液中的过氧化物和3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺起化学反应形成有色的复合物。结果用光度计测量。通过采用d u t p 偶联尿嘧啶- - n - - 糖苷酶限制的方法防止交叉污染产生的假阳性结果。临床标本 采用标准n 一乙酰一l 一半胱氨酸一n a o h 去污染方法处理后，可在6 5 小时内得到结 果。在欧洲，已有这种试验的自动化的仪器( c o b a sa m p l i c o r ) 。 复旦大学博士学位论文 与培养方法相比，a m p l i c o r 试验对呼吸道标本检测的总敏感度为7 9 4 9 1 9 ，特异性为9 9 6 9 9 8 ，阳性预测值为9 2 6 9 6 6 ，阴性预测值为9 8 7 一9 8 6 。但是，痰涂片阴性标本敏感度稍低，4 0 o 7 3 1 。因此，f d a 仅批 准a m p l i c o r 试验用于a f b 痰涂片阳性呼吸道标本中结核分枝杆菌的直接检测。 c h i n 等“报道将临床确诊的结核病例作为参照标准，a m p l i c o r 试验对呼吸道标 本结核分枝杆菌检测的敏感度与培养法相似，5 8 比5 6 。a lz a h r a n i 等 。a m p l i c o r 试验特异性非常好( 1 0 0 ) ，但是它对细微型活动肺结核病( 指可疑 为结核病，但没有自发的痰液或a f b 涂片阴性的病人) 诊断的敏感性不如培养法， 分别为4 2 ，7 3 。 1 2e m t d e - m t d 试验根据转录介导扩增系统原理。超声破碎靶细菌释放r r n a ，启动子 引物结合到r r n a 靶。然后，逆转录酶用来复制r r n a 到c d n a - r n a 杂种分子上。 最初的r n a 链被降解，并且，第二种引物结合到c d n a 上并被扩增，导致双链c d n a 的形成，然后，双链c d n a 被d n a 指导r n a 聚合酶转录产生更多的r r n a 分子。 新转录产物可作为逆转录的模板和进一步的扩增。r n a 扩增子用a c r i d i n i u m 酯 标记d n a 探针在液相杂交方法中检测。重要地，扩增过程是等温过程，而且，反 应可在单一的管子中进行，其有助于减少交叉污染。 现有商品化的f d a 批准检测结核杆菌复合菌群的n a a 试验的比较。 试验pdnpl i c o re - m t d 制造商r o c h eg e n p r o b e 扩增技术pcrt m a 靶分子 1 6 sr d n a r r n a 分析敏感度 = 2 0 细菌反应无 临床敏感度 7 9 4 - 9 1 9 9 0 9 - 9 5 2 临床特异度9 9 6 9 9 8 9 8 8 - 1 0 0 a f b 涂片阴性标本的敏感度4 0 0 - 7 3 1 8 3 1 0 0 阳性预测值 9 2 6 9 66 8 33 - 1 0 0 阴性预测值 9 8 6 9 8 7 9 8 4 9 96 扩增抑制物的质控有 无 交叉污染的防止有 无 标本去污染后分析时间6 5 h3 5 h 需要的设备 热循环仪，光度计发光计 f d a 批准的应用范围a f b 涂片阳性的呼吸道标本 a f b 涂片阳性和涂片阴性 的呼吸道标本 临床标本标准的去污染后，e - m t d 的试验可在3 5h 内完成。e - m t d 的试验对a f b 复旦大学博士学位论文 涂片阳性和阴性标本检测效果一致。与培养法相比，对呼吸道标本总的敏感度 为9 0 9 - - 9 5 2 ，特异度为9 8 8 1 0 0 ，阳性预测值为8 3 3 1 0 0 ，阴性预测 值为9 9 6 一9 8 4 。”在一项根据临床怀疑结核病程度评价e - m t d 试验效果的研 究中，e - m t d 最适用于临床中度怀疑有结核的病人”。e - m t d 的试验被f d a 批准 可用于a f b 涂片阳性和阴性标本中结核分枝杆菌的检测。s c a r p a r o 等“1 用从3 2 3 个患者得到4 8 6 份呼吸道和非呼吸道标本比较了e - m t d 和c o b a sa m p l i c o f 试验 的检测效果。方法结果之间未发现显著差异、不过，值得注意是尽管e - m t d 试验 时间较短，但是a m p l i c o r 试验可完全自动化，而且有内部质控监测扩增抑制剂。 1 3 临床应用 建议收集3 天痰标本进行a f b 痰涂片和培养。应对收集的第一个标本进行 n a a 试验，如果第一个为痰涂片阳性的标本，还需要检测另外标本。如果第一个 标本是a f b 痰涂片阳性和n a a 阳性，患者可假定患结核病，但是，如果标本痰涂 片阳性而n a a 阴性，应进行抑制剂检测试验。a m p l i c o r 试验中可选择使用抑制 剂检测试验，但是，如果使用e - m t d 试验，必须对加入结核杆菌d n a 的标本进行 分析。如果未检出抑制剂，并且另外的标本依然为n a a 阴性，患者可假定有非结 核分枝杆菌感染。不过，如果抑制剂被检出，n a a 试验对诊断无任何帮助。如果 标本为涂片阴性，n a a 阳性，而且用另外标本也获得相同的结果，患者可假定有 结核感染。所有的痰标本都为痰涂片阴性和n a a 阴性，患者可假定没有传染性。 然而，这不排除活动性结核的可能性。对肺外结核病来说，临床的诊断经常无法 确定，因此，n a a 试验能为临床医师提供重要信息。尽管当前可以利用的n a a 试 验仅仅批准用于呼吸道标本，n a a 试验也用于检测各种类型的菲呼吸道标本。一 般来说，两个试验用非呼吸道标本检测效果与用呼吸道标本效果相似。n a a 试验 用于除血液外的所有标本液体培养物中结核分枝杆菌复合菌群的早期鉴定。n a a 试验在用于非呼吸道标本前必须在实验室中进行验证。总之，n a a 试验能加快诊 断速度，但是，不能代替a f b 涂片或培养。这些试验仅能检测结核分枝杆菌，非 结核分枝杆菌的鉴定和药物敏感试验仍然需要培养。由于这些试验不能区别活着 还是死的分枝杆菌，n a a 试验不能用于结核病治疗监测。临床医师应该根据临床 表现解释n a a 试验的结果。“” 2 培养物分枝杆菌菌种的鉴定 经典分枝杆菌分离株可依据他们在一系列表型和生物化学试验反应鉴定到 种的水平。但是，同一种分枝杆菌分离株之间生物化学反应不同，而且可随时间 而变化。在大多数情况下，无法获得明确的鉴定。由于生物化学试验缓慢，麻烦， 可能产生歧义的结果，愈来愈多的实验室应用分子方法进行菌种鉴定。 2 1 d n a 探针 复旦大学博士学位论文 商品化的d n a 探针( a c c u p r o b e ；g e n p r o b e 公司) 可用于临床上重要的分 枝杆菌菌种的鉴定。临床上重要的分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合菌群，鸟分枝 杆菌m a v i u m ，胞内分枝杆菌m i n t r a c e l l u l a r e ，鸟分枝杆菌复合菌群m a v i u m c o m p l e x ，堪萨斯分枝杆菌m k a n s a s i i ，哥特氏分枝杆菌m g o r d o n a e 。试验根据 细菌中释放出来的r r n a 与种特异性的d n a 探针杂交原理。探针用吖啶氮葸酯标 记，结果用发光计测定。对培养阳性标本，该方法的检测时间在2h 之内。这种 方法操作非常容易，无需特殊的仪器。探针方法经临床的评价证实其快速，敏感， 特异。探针方法可和b a c t e c 或其他的液体培养系统组合在一起，将极大降低 菌种鉴定所需的时间。但是，探针不能用于所有致病分枝杆菌菌种，因此，有 些分离株还必须通过其它方法鉴定。此外，结核分枝杆菌复合菌群探针不能区分 菌群内的结核分枝杆菌m t u b e r c u l o s i s ，牛分枝杆菌 i f b o v i s ，牛分枝杆菌b c g 菌株m b o v i sb c g ，非洲分技杆菌m a f r i c a n u m ，和田鼠分枝杆菌m m i c r o t i 各菌种。 2 ，2p c r 测序法 p c r 测序法已成为鉴定分枝杆菌菌种的黄金标准。该方法由属特异引物p c r 扩增分枝杆菌d n a 和扩增产物的测序组成。通过与参照核苷酸序列比较鉴定分枝 杆菌菌种。仅需1 次测序反应就可得到确定的鉴定结果。这种方法也对传统的实 验室培养基不能生长和一些尚未认识的分枝杆菌菌种进行直接检测“。最常使用 的靶分子是编码1 6sr r n a 的基因。这种基因存在所有的细菌种类中，而且它包 含保守区和可变区，使它成为分类学研究的理想靶分子。大量的分枝杆菌菌种的 1 6sr r n a 基因已经测序，而且，根据这种基因的鉴定方法已经在诊断实验室中 广泛地进行了评价。1 6sr r n a 基因的2 个高变区测序可鉴定大多数的分枝杆菌 菌种。但是，不能区分结核分枝杆菌复合菌群的各菌种。同样地，重要的病原体 堪萨斯分枝杆菌m k a n s a s i i 序列与一种非致病菌种胃分枝杆菌m g a s t r i 完全 样。而且需要对另外的1 6 sr r n a 基因区测序从溃疡分枝杆菌m u l c e r a n s 中区 分海分枝杆菌m m a r i n u m “”。为此目的，已经研究其它几个靶基因的特征。编 码3 2 k d a 蛋白质基因，6 5 k d a 热休克蛋白质基因和和1 6 s - 2 b sr r n a 内部翻译间 隔区包含足够序列多样性可鉴别除结核分枝杆菌复合菌群的各菌种外全部临床 上重要的分枝杆菌“”。这些靶基因还可区分堪萨斯分枝杆菌m k a n s a s ii 和胃分 枝杆菌mg a s t r i 。此外，由于6 5 k d a 蛋白质基因中观察到菌种内的变异，这个 靶基因也可用于鉴别某种分枝杆菌的克隆o 。 2 。3d n a 微阵列 高通量寡核苷酸阵列即d n a 微阵列采用单一杂交步骤为快速检测大量d n a 序列提供可能性。这种方法最近已用于分枝杆菌菌种鉴定和利副平耐药基因突变 复旦大学博士学位论文 的检测。这技术根据从细菌克隆中产生荧光标记p c r 产物杂交到包括核苷酸探针 的d n a 阵列。结合到微阵列上的扩增产物发出扫描仪能检测的荧光的信号。阵列 中使用的探针是根据可辨别5 4 种分枝杆菌的8 2 个特有1 6 8r r n a 序列和包括独 特的r p o b 基因突变的5 1 个序列。该方法准确地鉴定2 7 种分枝杆菌代表菌种的 7 8 个分离株中的6 7 个。由于探针序列的一个错误，全部株m s z u g a i 都鉴定为 m m a l m o e n s e 。培养阳性标本分析时间仅4h 。分子方法在鉴定分枝杆菌菌种方 面比经典方法拥有较多的优势。快速，结果可靠，重复性好，甚至能分析混合的 或者污染的培养物。l 临床的实验室已经广泛地应用探针鉴定大部分常见分枝杆菌 菌种。由于全自动的d n a 测序仪和分析序列数据程序发展使该技术简单化，多数 分枝杆菌参考试验室都把p c r 测序法作为菌种分类鉴定的常规方法。d n a 微阵列 方法操作简单，易于自动化，并且，可在1 个反应中鉴定多种分枝杆菌。所以它 是未来发展的方向“”。 3 抗生素抗性相关突变的鉴定 由于只有极少有效的药物可用于结核病治疗，因此，耐药性结核分枝杆菌分 离株是对结核病控制的严重威胁。结核分枝杆菌通过染色体位点随机地发生突变 的抗生素选择而获得耐药性。这个过程不牵涉质粒或水平基因转移的转座元件。 单一核苷酸变化( 点突变) 产生对单一药物的抗性，这些突变逐步累积导致耐多 药结核病。化疗中断或者不妥当使用，就出现耐药菌株。初次培养结果出来后， 固体培养基上的经典药物敏感试验需要2 4 周。使用放射测量b a c t e c 药物敏 感检测系统时，需要几周获得结果。分子生物学的进步使研究结核分枝杆菌耐药 的遗传机制和开发快速检测耐药有关突变成为可能。现有方法主要是为检测利副 平耐药性而发展起来的，因为结核杆菌利副平( r i f a m p i n ，r i f ) 耐药的遗传基础 非常简单而且清楚。而其它一线结核药物耐药的分子基础非常复杂。而且，对 r i f 的耐药性通常可作为耐多药结核的标志物。 3 1 耐药的遗传基础 5 种一线结核病药物耐药的遗传基础。r i f 是利副霉素的半合成衍生物，它 可为一线结核药物。r i f 与r p o b 基因编码r na 聚合酶的0 亚单位结合，从而 抑制翻译的起始。事实上，所有( 9 6 ) r i f 耐药分离株在这个基因的8 1 b p 区 域内有点突变，而且敏感分离株缺少这些突变，使r p o b 基因成为建立分子药物 敏感检测方法的理想靶分子。和r i f 对比，耐其它结核药物的遗传基础更复杂。 异烟胼( i s o n i a z i d ，i n h ) 是一种合成的杀菌剂，由于其它所有的细菌基本上对 i n h 有天然抗性，所以i n h 仅用于治疗结核病。相当数目基因改变与i n h 的耐药 有关，但是7 5 - - 8 5 结核分枝杆菌分离株发现有两个基因k a t g 和i n h a 的突变。 链霉素是一种抑制蛋白质合成的氨基糖甙类抗生素。大约6 5 7 5 结核分枝杆菌 1 2 复旦大学博士学位论文 分离株的1 6sr r n a 基因或编码核糖体蛋白s 1 2 的r p s l 基因有突变。7 0 以上 吡嗪酰胺耐药的结核杆菌分离株的p n e a 基因有突变，p n c a 基因编码吡嗪酰胺酶。 其负责转化毗嗪酰胺成为活性形式。乙胺丁醇抑制必需的分枝菌酸整合到分枝杆 菌细胞壁上。e m b b 基因突变与7 0 的耐药分离株中乙胺丁醇耐药性有关“”。 3 2p c r 测序法 p c r 测序法是用于阐明结核分枝杆菌耐药遗传机制的主要技术。它是研究突 变最直接，而且可靠的方法，它既可检测过去已知突变，又可检测未知的突变。 与分枝杆菌菌种鉴定不同，这种方法不易作为常规鉴定耐药突变地的方法应用。 因为正如i n h 突变情况类似，分枝杆菌的耐药涉及很多的不同的基因或突变散在 分布基因的大片段内。这意味着每个分离株需要进行几个测序反应。然而，对于 象r p o b 的靶分子，与r i f 耐药有关突变集中于非常短的基因片段内，p c r 测序 是一种有用技术“”。 3 3 线性探针方法 线性探针方法( t h el in ep r o b ea s s a y ，l ip a ) 可快速检测r i f 耐药性。根据 反相杂交方法的原理，p c r 扩增r p o b 基因片段，变性和结合到硝化纤维素条上 的捕获探针与结合生物素p c r 扩增产物杂交。然后用结合抗生物素蛋白链霉素的 碱性磷酸酶b c i p n b t 色原检测，可产生有色反应。l i p a 测试条包含野生型r p o b 序列的5 种探针和4 种特异r p o b 突变探针，以及结合物质控和结核分枝杆菌质 控探针。测试条结