（森林培育专业论文）拟南芥悬浮细胞生物学及其遗传转化模式.pdf

中文摘要 本文从拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生物学特性研究入手，以期制备适合农 杆菌高效转化的受体材料，并制定科学、合理、有效的转化方案；利用所构成的 多个质粒载体，进行拟南芥悬浮细胞基因转化，以检验多种转化方案的可行性， 并优化转化条件：检测转化细胞报告基因的瞬时表达和稳定表达，以期建立有效 的转化模式，并获得可利用的转化材料。本论文所做的主要工作如下： 1 、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生长特性与培养条件 试验研究了拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的生长特性及其继代培养条件，旨 在摸索维持拟南芥悬浮细胞正常稳定生长的培养技术，并为拟南芥悬浮细胞进一 步的遗传操作提供良好的受体材料和科学依据。结果表明，在每个7 d 一次的继 代周期中，拟南芥悬浮细胞的生长表现明显的s 型生长曲线。正常培养条件下， 继代后2 - 4d 出现快速生长时期，此后生长量迅速下降，但接种量不同，其继代 后悬浮细胞生物量及快速增长发生时期不同。维持7 d 继代周期的理想接种量为 起始悬浮液按1 0 m l 5 0 m l 稀释。接种量小，生长迟缓，甚至不能增殖。培养基中 不同激素及不同蔗糖含量均会对其生长产生极明显的影响，在b 5 + 0 2 m g ln a a 条件下反复继代后的细胞，再加入外源n a a 时，反而会抑制其生长。蔗糖含量 以3 0 9 l 最好；蔗糖含量低，悬浮生物量及细胞活性明显下降。 拟南芥愈伤组织生长也呈现一定的规律性，正常条件下，需经历约各1 0 d 的诱导时期、快速生长时期和生长停滞及老化时期。愈伤组织诱导及其生长对外 界条件也特别敏感，一定的表面湿度及较低的培养温度是必须的。 2 、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对抗生素的反应 试验研究了拟南芥悬浮及其愈伤组织对潮霉素、卡那霉素、头孢霉素等3 种抗生素的反应，为拟南芥悬浮细胞转化子抗生素选择浓度和选择方案的制定提 供依据。结果表明：潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有 极明显的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。拟南芥悬浮细胞继代培养阶 段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死浓度分别为2 5 ，2 5 ， 1 5 m g l ，液体与固体培养条件下差异极大。当采用潮霉素抗性标记筛选转化子 时，应当分别采用相应阶段的临界致死浓度作为转化子选择浓度。与此同时，潮 霉素需要一定处理时间才能充分表现其抑制细胞生长或杀死细胞的效果，一般液 体培养条件下3 d 以后、固体培养条件下5 d 以后效果趋于稳定，但不同的处理浓 度有较大差异，建议选择时间在液体培养条件下不少于3 d ，在固体培养条件下 不少于5 d 。否则，假阳性率会很高，从而大大加重后续转化子检测的工作量。 卡那霉素与潮霉素有类似的影响，在愈伤组织诱导阶段，适宜的选择浓度为 5 0 m g l ，根据潮霉素作用特性推测，其在液体培养阶段和愈伤组织生长阶段的 适宜选择浓度分别在1 0 0 m g l 、2 5 m g l 左右。后续的转化试验中，若利用卡那 霉素选择，我们将采用这一选择浓度。 试验中意外发现头孢霉素能促进绿色悬浮细胞的获得，并具有逆转悬浮细胞 “白化”的稳定效果。有关悬浮细胞“白化”原因及头孢霉素逆转效应机理，有 待进一步研究。 3 、拟南芥悬浮细胞耐受性试验 选择与其遗传转化相关的常温静置、低温静置、高温振荡、蔗糖饥饿和常温 振荡( 对照) 几种不同处理方式，从其生长和细胞活性两个方面，研究其对环境 胁迫的耐受性，以更好地制定拟南芥悬浮细胞基因转化时细胞同步化或预处理及 共培养的方案和条件。结果表明：拟南芥悬浮细胞对各种胁迫处理的耐受性表现 出明显的差异，整体耐受性强弱依次为：常温振荡( 对照) 蔗糖饥饿 高温振 荡 低温静置 常温静置，常温静置最低。拟南芥悬浮细胞对胁迫处理的不适应 表现在多个方面，总生物量增长很少或不能增长，细胞相对活性及活细胞生物量 不断下降，耐受系数低。随着时间的变化，拟南芥悬浮细胞对胁迫处理的耐受性 或不适应性的表现呈现不同的变化规律，这种变化的可能机制与细胞间协同与竞 争、细胞自我适应机制的调节等有关。 4 、拟南芥悬浮细胞超低温保存试验 探索一般实验室条件下拟南芥悬浮细胞的简便保存技术，为中长期保存遗传 背景稳定一致的拟南芥悬浮细胞起始材料提供有效的方法。通过一系列试验，本 文获得了拟南芥超低温保存的适宜方法。优化方案如下：选择继代后2 d 的拟南 芥悬浮细胞，洗涤1 次，细胞沉淀重悬浮于6 蔗糖培养基，于4 0 c 低温下锻炼 6 h ；浓缩细胞使之有较高的细胞密度( 0 2 5 - 0 3 0 9 m 1 ) ，加入1 6 ( w v ) 甘油 作为冰冻保护剂，直接置于一8 0 深冷冰箱保存；使用时以3 7 快速解冻，离 心后除去保护剂，然后可用去离子水洗涤后进行活性检测，也可用基本培养基洗 涤后重新进行悬浮培养。此方法保存3 0 d 后的细胞相对活性达o 8 左右，可以满 足实验室一般研究用。如果对其保存后的活性要求不很严，还可以进一步简化， 例如，预处理前以悬浮细胞自然沉降代替离心洗涤后收集细胞沉淀：免去高渗预 处理，直接加入冰冻保护剂后在低温下锻炼6 h ；室温下解冻等。 5 、农杆菌的转化与制备 对本文拟使用的p b i b g u s 、p b m s a r s 、p b i n m g f p 5 - e r 等几种质粒载体 构建和工程菌制备及其生长特性等进行了系列试验。通过酶切和p c r 检测实验， 证明所构建的p b i b g u s 、p b i b s a r s 载体正确，含有相应的标志基因，可以用 于后续的拟南芥悬浮细胞基因转化。采用电转化法，成功地将p b i n m - g f - p 5 e r 质粒d n a 转入农杆菌细胞，转化频率为2 1 5 2 x 1 0 4 个舢g 质粒，并在一系列检测 实验中得到证明。拟用的几种不同质粒具有基本相似但不完全相同的生长特性， 而且接种量及培养条件等，对其生长量有很大影响。采用本文方法，成功地制备 了可用于植物基因转化的一系列工程菌株。 6 、转化模式与转化细胞选择 比较3 种拟南芥悬浮细胞转化方案，共培养后均获得g u s 的瞬时表达，但 仅模式成功地获得抗性愈伤组织。在模式基础上，对所获得的抗性愈伤组织 进行二次选择，发现一次选择后的转化细胞“假阳性”现象十分普遍，推测农杆 菌潜伏与爆发、悬浮细胞存在大量细胞团结构并导致嵌合体形成，是转化细胞“假 阳性”现象的主要原因。预处理方法、静置共培养时间、恢复培养与液体选择时 间、载体种类等转化条件对转化效率有重要影响，以2 0 ：m o l l 乙酰丁香酮预培 养l d 、静置共培养3 6 h 、液体选择培养2 d 、p b i b s a r s 为质粒载体，可以获得 较高的转化效率，并大大降低假阳性率。对以上条件进行综合优化后，假阳性率 从8 2 降为1 7 。研究结果表明，在模式基础上对转化条件进行适当优化， 可用于拟南芥悬浮细胞高效转化。 7 、报告基因诊断与分子检测 对所获得的抗性愈伤组织进行g u s 活性检测和p c r 分析。结果表明：具有 g u s 活性抗性愈伤组织均扩增出目的基因片段，初步证明，所选择的7 4 份抗性 愈伤组织已成功地转化。对低温、高温、高盐及对照4 种处理后的悬浮细胞进行 蛋白质抽提，表明悬浮细胞的蛋白质组与叶片的蛋白质组有很大不同；分别用 l - p s l 0 h 3 和l 。p s l 0 a c k l 4 h 3 作为第一抗体进行蛋白质免疫杂交，表明各处理 均不同程度地发生组蛋白h 3 磷酸化及乙酰化，但高温处理降低了磷酸化或乙酰 化水平。 8 、本文的所取得的重要进展及主要创新点 1 ) 系统研究了拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织有关生物学特性、对抗生素的反 应和对环境胁迫的耐受性，不仅积累了这一重要模式植物的细胞生物学资料，同 时使其遗传转化方案和条件的制定建立在细胞生物学依据之上，为实现拟南芥悬 浮细胞高效转化提供了新的途径，也为类似转化系统的建立提供了新的思路。 2 ) 摸索了拟南芥悬浮细胞维持培养的继代条件，提出“继代指数”概念， 同时建立了拟南芥悬浮细胞理论生长模型，为受体材料的制备提供了科学依据。 3 ) 摸索了拟南芥悬浮细胞在不同培养条件下和不同生长阶段对抗生素的反 应，使抗生素抗性标记选择方案更加科学，改善了抗生素选择效果。 4 ) 检测或转化了多种质粒载体系统，建立了不同质粒载体农杆菌的理论生 长模型，比较了不同质粒载体农杆菌的生长特性，制备了可用于植物基因转化的 一系列工程菌株。 5 ) 改进和优化了拟南芥悬浮细胞遗传转化方案及条件，证明所建立的优化模 式能够大幅度提高基因转化效率，促进了拟南芥悬浮细胞高效转化目标的实现。 6 ) 发现并证明了头孢霉素能显著地促进拟南芥绿色悬浮细胞的获得，成功解 决了悬浮细胞“白化”的技术难题，并且有可能发掘这一抗生素新的利用途径。 7 ) 初步建立了拟南芥悬浮细胞的简便保存技术，为中长期保存遗传背景稳 定一致的拟南芥悬浮细胞起始材料提供了有效的方法。 关键词：拟南芥；根癌农杆菌；悬浮细胞；遗传转化；生物学特性；细胞耐受性； 超低温保存；抗生素抗性选择 i a b s t r a c t t r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i st h a l i a n a s u s p e n s i o n c e l l sw a sp e r f o r m e d d i f f e r e n tp r o t o c o l sa n dp a r a m e t e r sa f f e c t i n gt h et r a n s f o r m a t i o np r o c e d u r ew e r et e s t e d a n da no p t i m i z e dp r o t o c o lw a sd e t e r m i n e d t r a n s f o r m a n t sw a ss e l e c t e dw i t l l a n t i b i o t i cr e s i s t a n tg e n es c r e e n i n ga n dc h e c k e dw i t l lh i s t o c h e r n i c a lg u sa n dp c r a s s a y p r i o rt ot r a n s f o r m a t i o ne x p e r i m e n t s ，s o m er e l a t i o n a lb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so f a r a b i d o p s i st h a l i a n as u s p e n s i o nc e l l sa n da g r o b a c t e r i ah a b o r i n gc e r t e i np l a s m i d w e r eo b s e r v e d 1 1 1 em a i nw o r k sa n dr e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w s s u b c u l t u r ec o n d i t i o n sa n dg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o n c u l t u r e t h ee x p e r i m e n t so fa r a b i d o p s i st h a l i a n as u s p e n s i o nc u l t u r ew e r ep e r f o r m e d s o m e s u b c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ，a n dt h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fs u s p e n s i o n c u l t u r ew a so b s e r v e d t h et y p i c a ls l i k eg r o w t hc u r v ei nas u b c u l t u r ec y c l ew a s o b t a i n e d i nn o r m a lc o n d i t i o n , al o g a r i t h m i cp h a s eo fg r o w t ho fs u s p e n s i o nb i o m a s s w a so c c u r r e di n2 - 4d a y sa f t e rs u b c u l t u r e t h a nt h eg r o w t ho fb i o m a s ss l o w e dd o w n q u i c k l y h o w e v e r , i t sg r o w t ha n dt i m eo fl o g a r i t h m i cp h a s ew e r ec h a n g e dw i t l l i n o c u l a t i o na m o u n t 1 0 m l 5 0 m lo fd i l u t i n gr a t i oi sa d v i s a b l et os u b c u l t u r e t h e g r o w t hw a ss l o w e dd o w ne v e nh a l t e dw i t l l1 0 m l 5 0 r a lo fd i l u t i n gr a t i o d i f f e r e n t h o r m o n e si nm e d i aa f f e c t e dg r o w t ho f s u s p e n s i o nc e l l s 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i o na n ds e l e c t i o no f t r a n s f o r m a n t s t h r e ek i n do f a r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l st r a n s f o r m a t i o np r o t o c o l sw e r ep u ti n p r a c t i c e ，a n dt h et r a n s i e n te x p r e s s i o no fg u sg e n ew a so b s e r v e di na l lo ft h et h r e e p r o t o c o l s b u tt h er e s i s t a n tc a l l iw a so b t a i n e do n l yi np r o t o c o l b a s eo np r o t o c o l ，as e c o n ds e l e c t i o no fa n t i b i o t i c sr e s i s t a n c ew a sp e r f o r m e d , a n dav e r yh i 出 f r e q u e n c yo f f a l s ep o s i t i v e i nt h ef i r s ts e l e c t i o nw a st e s t e d as t r o n ge f f e c to n e f f i c i e n c yo fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l s 旺a n s f o r m a t i o ne x e r t e db yp r e t r e a t m e n t ， c o c u l t i v a t i o nw i t h o u ts h a k i n g ，r e v i v i s c e n c ec u l t u r eo rl q u i d - s e l e c t i o na n dv e c t o r s t h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o nw o u l db ei m p r o v e dw h i l et h ef r e q u e n c yo f f a l s e p o s k i v e w o u l db er e d u c e dn o t a b l yw i t hf o l l o w i n gt r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n s ： p r e t r e a t m e n tf o r 1d a y 谢m2 mm o l lo fa c e t o s y r i n g o n e ，c o c u l t i v a t i o nf o r3 6 h w i t h o u ts h a k i n g ，s e l e c t i o nf o r2d a y si nl i q u i da n dm e d i a t i n gw i t hp b i b s a r s p u t t i n ge v e r ym e a s u r e sa b o v et o g e t h e r , t h ef r e q u e n c yo f f a l s ep o s i t i v e f a i l e dd o w n f r o m8 2 t o1 7 t h er e s u l t sw e r es h o w nt h a t ，a f t e ro p t i m i z i n gt r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n si nac e r t a i ne x t e n t ，t h ep r o t o c o lmc a nb e u s e df o ra r a b i d o p s i s s u s p e n s i o nc e l l st r a n s f o r m a t i o n d i a g n o s e sa n dm o l e c u l a rd e t e c t i o no fr e p o r t e rg e n e h i s t o c h e m i e a lg u sa n dp c ra s s a yf o rd e t e c t i o no fr e s i s t a n tc a l l iw e r ec o n d u c t e d t h er e s u l t sw e r es h o w nt h a tt h es e g m e n t so f t a r g e tg e n ew e r ea m p l i f i e db yp c rf r o m e a c hr e s i s t a n tc a l l iw h i c hw e r et e s t e da sp o s i t i v e 诚t l lg u s s t a i n i n g i tw a si n d i c a t e d a l lo f7 4p i e c e so fc a l l ih a db e e nt r a n s f e r r e ds u c c e s s f u l l y t o t a lp r o t e i nw a si s o l a t e d f r o ma r a b i d o p s 括s u s p e n s i o nc e i l sa n dl e a v e sw h i c hw e r et r e a t e dw i t hc o l d ，h e a ta n d s a l tr e s p e c t i v e l y t w od i f f e r e n tp r o t e i nm a p sw e r eo b t a i n e db e t w e e ns u s p e n s i o nc e l l s a n dl e a v e s i m m u n o b l o t t i n go fh i s t o n eh 3o na r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l sw a s p e r f o r m e d b yl - p s l 0 h 3a n dl - p s l 0 a c k l 4 h 3 t h er e s u l tw a ss h o w nt h a tt h e p h o s p h o r y l a t i o na n da c e t y l a t i o nw e r ep r e s e n t e di ne a c ht r e a t m e n t s h o w e v e r , t h e s t r e n g t ho fp h o s p h o r y l a t i o na n da c e t y l a t i o nw a sr e d u c e dw i t hh i g ht e m p e r a t u r e ( 3 7 0 c 、 k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，a g r o b a c t e r i u mt u m f a c i o n ，s u s p e n s i o nc e l l s ， b i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，t o l e r a n c eo fe e h s ，c r y o p e r s e r v a t i o n ，a n t i b i o t i c r e s i s t a n tg e n es c r e e n i n g v l i 缩略词 缩写英文名中文名 2 4 一d 6 b a a s c a t b c d n a c e f d n a e b e d l a e r g f p g m p g u s h d g s h y g i a a k a n 【a r m a t m e n a a n o s n p t i i o d p c r p d g s p e g p m b e 2 4 d i c h l o r o p h e x o x y a c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e a c e t o