（微生物学专业论文）维生素c高产菌株的选育.pdf

摘 要 i 摘 要 本文首先采用离子注入技术对二步发酵法生产维生素 c 中的伴生菌- 苏云 金芽孢杆菌b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s 进行处理筛选维生素 c 的前体 2 - 酮基 - l - 古龙酸( 简称 2 - k l g ) 的高效伴生菌菌株以提高发酵生产水平以生产菌株为 对照菌株经过初筛复筛在筛选的 6 0 0 株菌中菌株 b . i 与小菌伴生2 - k l g 转化率从 7 1 . 5 0 提高到 7 6 . 8 4 紫外线- 氯化锂复合诱变小菌( g l u c o n o b a c t e r o x y d a n s ) 以 b . i 伴生以生 产菌株为对照菌株经过初筛复筛获得小菌 g . u 1 5 8 g . u 1 5 8 - b . i 由b . i 伴生, 2 - k l g 转化率提高到 8 2 . 7 5较对照菌株提高了 5 . 8 1 % 通过对 g . u 1 5 8 b . i 组合菌系发酵条件的优化2 - k l g 转化率达 9 1 . 6 3平 均周期为 6 2 h 较出发生产菌株转化率提高了 2 0 . 1 3周期缩短了 1 0 h 关键词 2 - k l g 诱变高产菌株发酵条件优化 abstract ii abstract this study firstly adopted the ion implantation technique on the bacillus thuringiensis, the companion species in “two step” fermentation of vitmine c, to screen high efficient strains. by initial screening and the continuous one,among 600 strains, we acquired bacillus thuringiensis strain b.i whose capability of producing 2-klg was improved. the 2-klg conversion rate increased from 71.50% to 76.84%. we adopted ultraviolet ray-licl on the gluconobacter oxydans. through initial screening and the continuous one, we acquired strain g.u158. g.u158 was companioned with b.i in the fermentation, and the 2-klg conversion rate arrived to 82.75% which increased 5.81% than the control. through optimization of fermentation condition of g.u158-b.i, the fermentation conversion rate arrived to 91.63%, which increased 20.13% than the initial one . the average fermentation period was 62 hours, and shortened 10 hours than the original one. key words: 2-klg; mutagensis; high-yielding strain; optimization design of fermentation conditions 第 1 章 研究概述 - 1 - 第 1 章 研究概述 1 . 维生素 c 特性及功能 维生素 c v i t m i n e c 简称 v c又称 l - 抗坏血酸( l - a s c o r b i c a c i d ) 化学 名称为l - 2 , 3 , 4 , 5 - 四羟基- 2 - 己烯酸- - 内酯(c6h8o6) mw=176.12维生素 c 在常态下呈白色的片状结晶或结晶性粉末无臭味酸久置色渐变微黄易溶 于水微溶于乙醇和甘油不溶于有机溶剂 1 . 1 维生素 c 的生物学功能 维生素c 的化学结构独特既有易还原的羰基又有易氧化的羟基羰基其 在生物体内以还原型的l - 抗坏血酸和氧化型的l - 脱氢抗坏血酸两种行式存在这 两种形态对生命体都具用生物活性且无毒副作用因而它即可作药用也可作 其它多种用途其具体作用如下 ( 1 ) 维生素c 参与体内的氧化还原反应 维生素c 既可作为氢的受体又可作为氢的供作可在体内极其重要的氧化 还原反应中发挥作用如维持巯基蛋白酶活性解毒作用促进抗体的合成 促进造血作用成年人会因缺乏维生素c 宜患坏血病婴儿和儿童则会由此引起出 血性骨骼病 1 ( 2 ) 维生素c 参与体内的羟化作用 体内物质代谢的很多过程均需羟化而维生素c 在羟化反应中起着必不可少的 辅助因子的作用其辅助因子的作用如下 促进胶原蛋白的合成如果v c 缺乏将导致毛细血管破裂牙齿易松动骨骼 脆弱易骨折以及创伤时伤口不易愈合 参与胆固醇的转化 维生素c 缺乏直接影响胆固醇的羟化 进而影响脂类代谢 参与芳香族氨基酸的代谢在调节神经活动方面起重要作用的儿茶酚胺5 - 羟色胺分别由酪氨酸色氨酸各自经羟化而生成的 ( 3 ) 维生素c 在抗病毒抗肿瘤方面的作用 目前维生素c 作为重要的医药产品已广泛应用于临床除治疗因其缺乏而导 河北大学理学硕士学位论文 - 2 - 致的坏血症和儿童的出血性骨骼病外还可作为预防感染和支持性治疗大剂量 服用维生素c 对治疗感冒心血管缺陷高胆固醇糖尿病精神抑郁症等都有一 定的效果 2 1 . 2 维生素 c 在食品工业及其他行业中的用途 维生素 c应用领域已跨越医药行业涉足于饲料食品造纸饮料等轻工 业行业近年来维生素 c常用于啤洒和葡萄酒等酒类和饮料的抗氧化剂使酒 类饮料以及食品的味道和颜色保持稳定防止褐变的发生另外维生素 c还 可用作面包点心的烘焙剂在腌制食品时加入少量抗坏血酸钠可加速腌制过 程并减少亚硝酸的用量保护食物不被氧化颜色不变维生素 c还用作多种饲 料添加剂某些作物的催熟剂农产品保鲜剂化妆品工业防锈剂等在冶金工 业摄影工业中也大量使用 2 此外水产养殖行业中直接用维生素 c 作抗氧化 剂营养强化剂质量改良剂等实用添加 3 为了防止维生素 c氧化降解更好地保持和发挥其功效目前已开发出多种 维生素 c 新品和剂型如维生素 c 钠盐( v c - n a ) 维生素 c 钙盐维生素 c 磷酸酯 镁维生素 c 棕榈酸酯等2 - o - - d - 吡喃葡萄糖基- l - 抗坏血酸 l - 抗坏血酸基 - 2 - 聚磷酸酯 2 此外还开发了可压片的维生素 c钠盐微胞囊以及多种维生素 c的复方制剂如烟酰胺- v c 降血脂的维生素复合制剂适用于手足麻木外周 血液循环障碍和其他外周血管病的维生素胶囊久维他制剂抗噪音复合剂等 2 . 维生素 c 的生产概况 在全世界的维生素生产行业中维生素 c的生产占重要的位置从它被作为 还原性因子r e d u c i n g f a c t o r由动植物器官组织中浓缩分离开始及迅速进 入商品化生产世界市场需求量愈来愈大产量也稳步增长6 0年代中期全世 界维生素 c的年生产量已达 0 . 5 万吨1 9 7 9 年美国的维生素 c产量突破万吨而 全世界总产量为 3 . 2 7 5 万吨1 9 8 9 年全世界生产维生素 c 7万吨1 9 9 4 年前世界 的维生素 c 的生产能力近 8 . 5 万吨/ 年1 9 9 6 年产量为 8 万吨 2 0 0 0 年产量达到 1 0 万吨以上随着产量的增加供不应求的局面被打破国际维生素 c市场的竞争日 趋激烈加强对维生素 c工业的研究提高转化率改进工艺降低成本已成 第 1 章 研究概述 - 3 - 为维生素 c生产所面临的重大问题由于维生素 c的合成涉及一系列具有不同特 点的微生物多种酶和己糖化合物的代谢和作用并与电子传递链相偶联具有 一定的代表性 4 因而研究维生素 c生产工业将加深对其生物化学基础理论的理 解同时对微生物资源的进一步开发利用也有重要的指导意义 维生素c 的工业生产从历史发展进程看可分为浓缩提取化学合成和生物发酵 三个阶段 2 . 1 浓缩提取c o n c e n t r a t i o n a n d i s o l a t i o n 阶段 上世纪的二三十年代人们对于维生素c 的结构性质还不了解获得其产 品的途径只是经验性地由富含还原性因子的生物组织如柠檬胡桃辣椒 肾上腺等提取获得 5 此法生产成本高产量低远远不能满足人们的需求 2 . 2 化学合成c h e m i c a l s y n t h e s i s 阶段 二十世纪三十年代 德国化学家 r e i c h s t e i n 6 和 a u l t 7 两个研究小组分别 独立地发表了维生素 c 的合成方法其产量 5 0 k g / 年开创了维生素 c 化学合成的 先列从 1 9 3 7年开始以 r e i c h s t e i n和 g r u s s n e r的发明为基础建立起从 d - 葡萄糖出发 利用化学方法和一步发酵方法合成维生素 c 的 莱氏法r e i c h s t e i n p r o c e d u r e莱氏法生产的工艺流程主要包括如下五个步骤 图 1 - 1 1 , 2 1 起始原料 d - 葡萄糖在镍的催化作用下通过高压加氢还原成 d - 山梨醇 ( d - s o r b i t o l ) 2 d - 山梨醇经微生物如生黑葡萄糖酸杆菌g l u c o n o b a c t e r m e l a n o g e n u s 或弱氧化醋酸杆菌a c e t o b a c t e r s u b o x y d a n s发酵转化生成 l - 山梨糖 l - s o r b o s e 3 l - 山梨糖在丙酮和硫酸的作用下经酮化生成双丙酮- l - 山梨糖 d i a c e t o n e - l - s o r b o s e 4双丙酮- l - 山梨糖在铂催化下 经双丙酮- 2 - 酮基- l - 古龙酸生成 2 - 酮基- l - 古龙酸2 - k e t o - l - g u l o n i c a c i d 5 2 - 酮基- l - 古龙酸经烯醇化和内酯化合成维生素 c 河北大学理学硕士学位论文 - 4 - 这一方法经不断改进和完善在世界上得以广泛应用是目前国外生产维生 素c的主要方法主要生产公司为瑞士hoffmann-la-roch德国basf和e.merk等 公司总转化率已达60%但其尚存有许多缺点如工艺路线长难以连续化操 作且需耗费大量有毒易燃易爆的化学药品既危险又造成严重的环境污染等 因而莱氏法已越来越不能适应日益扩大的维生素c工业的要求 8 2 . 3 生物发酵b i o l o g i c a l f e r m e n t a t i o n 阶段 自二十世纪六十年代以来各国科学家们开始探索以微生物转化法取代莱 氏法他们筛选出许多具有反应特性的菌种提出了许多反应路线见图1 - 2 并在此基础上对有关反应工艺的问题进行了探索但从工业的角度来看只有三 种方法比较切实可行即从d - 山梨醇开始的二步发酵法 9 , 1 0 从d - 葡萄糖开 始的新二步发酵法 1 1 , 1 2 , 1 3 和一步发酵法 1 4 , 1 5 , 1 6 图 1-1 reichstein-grussner 化学合成维生素 c 反应途径莱氏法老工艺 figure 1-1 chemical synthesis pathway of vitamin c by reichstein-grussner (“reichstein procedure” old process) 第 1 章 研究概述 - 5 - 2 . 3 . 1 二步发酵法l - 山梨糖途径 二步发酵法经过的是 l-山梨糖途径即由 d-葡萄糖加氢生成 d-山梨醇 d-山梨醇先经细菌转化为 l-山梨糖l-山梨糖再经过细菌发酵生成维生素 c 前体 物质2-酮基-l-古龙酸2-keto-l-gulonic-acid2-klg这两步反应是由不同细 菌发酵产生的目前生产用的二步发酵法即属此途径这一途径是由美国的 tengerdy 1 7 和 huang 1 7 等首先发现的但最初发现的菌种转化率很低日本的望月 一男18等人采用诱变处理使转化率提高到 46% 我国维生素c二步发酵法属l-山梨糖途径其特点为第二步发酵是混合菌发 酵其代谢l-山梨糖生成2-酮基-l-古龙酸的方式和机制尚不清楚仍处于研究阶 段 图1-2 由d-葡萄糖生物转化2-酮基-l-古龙酸的主要途径 figure 1-2 diagram representing the different pathways for the conversion of 2-keto-l-gulonic acid from d-glucose by bacteria 河北大学理学硕士学位论文 - 6 - 2 . 3 . 2 新二步发酵法2 , 5 二酮基- d - 葡萄糖酸途径 新二步发酵法最先是由日本盐野义制药公司园山高康等人 1 9 研究发明的也 称2,5-二酮基-d-葡萄糖酸途径又叫葡萄糖串联发酵法即将能够氧化d-葡萄糖 积累2,5二酮基-d-葡萄糖酸和还原2,5-二酮基-d-葡萄糖酸生成2-酮基-l-古龙酸 的菌株进行串联发酵图1-3首先葡萄糖第一步反应氧化制得2,5-二酮基-d- 葡萄糖酸盐2,5-diketo-d-gluconate简称2,5-dkg然后2,5-dkg再经第二 步反应还原成为2-酮基-l-古龙酸 目前已发现能完成由葡萄糖氧化制得2,5-二酮基-d-葡萄糖酸的菌株包括葡萄 糖酸杆菌属gluconobacter 2 0 , 2 1 , 2 2 , 2 3 假单胞菌属pseudomonas 2 4 杆菌属 bacterium 2 1 醋酸杆菌属acetobacter 2 5 , 2 3 , 2 6 , 2 7 醋酸单胞菌属acetomonas 图 1-3 由 d-葡萄糖到 2-酮基-l-古龙酸的串联发酵途径新二步发酵法 虚线表示用重组菌株或单一菌株可望实现的一步发酵法 figure 1-3 tandem fermentation pathway from d-glucose to 2-keto-l-gulonic acid (“new two step fermentation”) (dash arrow shows “one-step fermentation” would be realized by recombinant strains) 第 1 章 研究概述 - 7 - 28,29 欧文氏菌属erwinia 19,30,31等中的某些菌株 可以完成从2,5-二酮基-d-葡萄糖酸到2-酮基-l-古龙酸的转化一系列的菌株 有短杆菌brevibacterium节杆菌arthrobacter spp.微球菌(micrococcus spp.)葡萄球菌staphylcoccus spp.假单胞菌pseudomonas spp.和芽孢杆 菌bacillus spp. 2 8 , 2 9 1981年kita和hall报道柠檬杆菌citrobacter spp.也可 还原2,5-二酮基-d-葡萄糖酸生成2-酮基-l-古龙酸 2 5 棒杆菌属 corynebacterium中的许多菌株也具有此步还原能力 1 9 虽然有多种菌株能够还原2,5-二酮基-d-葡萄糖酸生成2-酮基-l-古龙酸但是 详细研究只在棒杆菌corynebacterium spp.中进行过1982年sonoyama等报道 棒杆菌的一个突变株以92.5%的摩尔转化率转化2,5-二酮基-d-葡萄糖酸生成2-酮基 -l-古龙酸 1 9 1987年他们研究了2,5-二酮基-d-葡萄糖酸在棒杆菌 corynebacterium spp.中的代谢 3 2 结果表明该菌代谢2,5-二酮基-d-葡萄糖酸同时生成2-酮基-l- 古龙酸和2-酮基-d-葡萄糖酸两种产物2-酮基-l-古龙酸和2-酮基-d-葡萄糖酸进一 步代谢成d-葡萄糖酸后者进入双磷酸己糖途径和戊糖途径代谢氧化 3 3 经过多 级诱变后获得的突变株 不能代谢2,5-二酮基-d-葡萄糖酸生成2-酮基-d-葡萄糖酸 同时也不能继续还原2-酮基-l-古龙酸生成d-葡萄糖酸 3 2 此突变株不能以2,5-二酮 基-d-葡萄糖酸为唯一碳源生长必须补充其他碳源如d-葡萄糖d-葡萄糖的氧 化同时也为2,5-二酮基-d-葡萄糖酸还原为2-酮基-l-古龙酸提供供氢体 nadph 冯树等发现2 , 5 - 二酮基- d - 葡萄糖酸还原酶可被分离纯化 1 4 , 3 4 该酶存在于细胞 质中分子量为35,000d单组分酶以nadph为辅助因子 对新二步发酵法的研究已取得重要进展1982年sonoyama等用10吨罐进行 了新二步发酵法的中间实验 1 9 第一步使用欧文氏菌erwinia spp.shs2006 的一株突变株第二步使用棒杆菌corynebacterium spp.shs0007的突变株先 以欧文氏菌erwinia spp.转化d-葡萄糖积累2,5二酮基-d-葡萄糖酸的钙盐发 酵结束后加入sds十二烷基磺酸钠并在低温条件下存放在稳定2,5-二酮基-d- 葡萄糖酸钙的情况下降低菌体数然后与供氢体d-葡萄糖混合直接加入到第二级 发酵液中第二步发酵即棒杆菌corynebacterium spp.转化2,5-二酮基-d-葡萄糖 酸生成2-酮基-l-古龙酸实验平均总转化率为84.6% 河北大学理学硕士学位论文 - 8 - 我国对新二步发酵法的研究从上世纪80年代后期开始尹光琳等对筛选 到的两株产2,5-二酮基-d-葡萄糖酸的菌株葡萄糖酸杆菌gluconobacter sp. scb611和欧文氏菌erwinia spp.scb247以及还原2,5-二酮基-d-葡萄糖酸的棒 杆菌corynebacterium spp.scb3035进行诱变育种并获可有效转化的突变株 其中第一步发酵突变菌株转化率已达40%含量为4050g/l第二步获得摩尔转化 率约7 0 % 含量2 0 g / l 发酵周期6 8 - 7 2 小时 3 0 , 3 1 , 3 5 , 3 6 新二步发酵法省掉了从d-葡萄糖加氢生成d-山梨醇的步骤大大简化了 莱氏法的工艺程序原料方面也比我国的二步发酵法有所简化转化率 也很高很有应用前途但是该方法如用于工业化生产还存在诸多问题如中间 产物2,5-二酮基-d-葡萄糖酸不稳定且效率较低成本高即在反应条件菌体 处理工艺设备等方面与工业化生产还具有一定的距离 2 . 3 . 3 一步发酵法2 - 酮基- l - 古龙酸途径 anderson等在新二步发酵法 1 9 的基础上通过基因工程方法将一株棒杆菌 corynebacterium spp.中的2,5-二酮基-d-葡萄糖酸还原酶基因重组到能转化d- 葡萄糖积累2,5-二酮基-d-葡萄糖酸的草生欧文氏菌b. herbicola中并成功表 达从而获得了只有一步转化的菌株 3 7 该菌株可直接氧化葡萄糖生成2-酮基-l- 古龙酸该方法称为一步发酵法又被叫做2-酮基-l-古龙酸途径见图1-5 该菌在1升自控发酵罐中转化d-葡萄糖到2-酮基-l-古龙酸的转化率可达 33.3%此项成果于1988年申请了专利 3 8 另外日本科学家sonoyama等通过两步 法42,434和混合培养法 3 2 , 4 4 实现了从d-葡萄糖到2-酮基-l-古龙酸的直接转化但转 化率一直未获突破 中国科学院上海生物工程研究中心也在研究此项技术马志方等 4 0 已分离纯 化了棒状杆菌染色体dna构建了载体pba16, 以ncol-sal双酶切的质粒pba16 片段作载体对同样酶切的染色体dna克隆已筛选了阳性克隆菌株建立在葡 萄糖串联发酵基础上构建直接利用葡萄糖产生维生素c前体2-klg实现一步发酵 的工程菌其关键酶是2,5-dkg还原酶陈策实等 4 1 将能够在大肠杆菌内高效 表达的棒状杆菌2,5-dkg还原酶基因的质粒pbl4改造成为具有链霉素抗性的质 粒pbls并将pbls导入能够利用葡萄糖高产2,5-dkg的感受态欧文氏菌scb125 中因为质粒pbls能够表达一个温度敏感的ci蛋白因此需要通过提高温度42 第 1 章 研究概述 - 9 - 诱导来实现2,5-dkg还原酶的高效表达尽管表达出的酶占菌体总蛋白的 22%并且表达的酶具有较高的活力但欧文氏菌最佳生长温度为30左右42 诱导培养对菌体生长不利可见作为代谢工程菌的基因表达如果单纯地追求 高效表达 则可能对菌体形成一种负担和浪费 此外还发现了宿主欧文氏菌scb125 中存在一个活力较强的2-酮基醛糖还原酶该酶不利于从葡萄糖发酵产生2-klg 因此构建一个2-酮基醛糖还原酶缺陷型菌株为2,5-dkg还原酶表达宿主将大大提 高基因工程菌的实际应用价值 目前陈策实等已经克隆得到编码2-酮基醛糖还原 酶的基因并正在利用基因敲除技术灭活这个酶的基因 4 5 一步发酵法是建立在基因工程基础上获得重组菌株达到一步发酵完成 二步生物合成的目的不过有报道说 8 , 1 7 这一重组成欧文氏菌并不理想因为细 胞内的情况非常复杂对 d-葡萄糖进行一系列连续氧化为 2,5-dkg 的多种脱氢酶 是结合在胞膜上的周质酶是与电子运输相连接的而 2,5-dkg 的还原酶则是可 溶性的与 nadph 结合的存在于细胞浆中的酶因此要完成两步反应必须先 进行小分子溶质的迁移即需要酶作用的底物2,5-dkg 先通过细胞内膜运输 进入细胞质中还原为产物 2-klg 后再分泌排出细胞外膜以得到积累这势必大 大降低了工程菌的转化率 应用重组 dna 克隆技术构建代谢工程菌 的成功为今后维生素 c 生产 菌的选育和深入研究开辟了新途径另外河北大学微生物研究所已从土壤中分 离出几株利用葡萄糖直接产 2-klg 的菌株只是转化率有待提高如果一步发酵 法这项研究成果能用于商品化生产则不仅大大简化了莱氏法维生素 c 生产 的复杂工艺路线也比 70 年代我国首创的两步发酵法从原料方面有所改进这必 将使目前全世界都采用山梨醇生产维生素 c 的传统工艺大大缩短可谓维生素 c 生产工业的一次革命 3 . 我国维生素c 二步发酵法的研究现状及进展 维生素c二步发酵途径是由美国的tengerdy 1 7 和h u a n g 1 7 等首先发现的我国 尹光琳领导的科研小组同中国科学院微生物所和北京制药厂共同协作于上世 纪70年代初研究创立了目前唯一成功应用于维生素c工业生产的微生物发酵法 1 3 , 6 8 维生素c 二步发酵法其特点是在莱氏法第一步发酵的基础上 河北大学理学硕士学位论文 - 10 - 采用混合菌系进行第二步发酵使l-山梨糖转化为维生素c前体2-酮基-l-古龙 酸故该方法又叫我国的维生素c二步发酵法.其工艺流程见图1-4 图1-4 我国维生素c二步发酵法生产工艺流程图 figure 1-4 diagram of vitamin c production by two-step fermentation in china 尹光琳等从5327株细菌中筛选到能利用l-山梨糖产生2-酮基-l-古龙酸的优良 菌株 n1197a 1 0 , 4 6 他们在用n1197a菌株进行发酵条件实验过程中发现大小 明显不同而颜色与外观较为接近的两种菌株且只有两种菌在一起混合培养时 才能正常产酸n1197a大菌落细菌为杆状端圆革兰氏染色阳性无芽孢单 个或成对排列0.41.01.8m根据其生理生化特征按照bergey细菌鉴定手 册第七版被鉴定为条纹假单胞杆菌pseudomonas striata简称大菌小菌落细 菌为椭圆至短棒状革兰氏染色阴性无芽孢0.3070.61.8m单个或成对 排列菌落呈圆点状表面微突起边缘整齐无色透明进一步对其进行了生 理生化特征研究 根据bergey细菌鉴定手册第八版 小菌落菌株被鉴定为氧化葡萄 糖酸杆菌gluconobacter oxydans简称小菌1988年宁文珠尹光琳等 4 7 成 功地以巨大芽孢杆菌bacillus megaterium代替了条纹假单胞杆菌作为氧化葡萄 糖酸杆菌的伴生菌从最初l-山梨糖到2-酮基-l-古龙酸的转化率39.7%发酵6天 4 6 经过多方面的改进发酵时间已缩短到48小时左右转化率达79.5% 7 现在 国内所有维生素c生产厂家都已采用二步发酵法该法不仅大大简化了莱 氏法省去了有毒化学药品而且该工艺大都采用液体物料反应为实现工业 生产过程的机械化连续化自动化创造了有利条件 目前唯一成功应用于维生素c工业生产的二步发酵法的第二步混菌发酵是 第 1 章 研究概述 - 11 - 我国发明的之后该技术被瑞士 hoffmann-la-roche公司买走因此对工业生产 中的混菌发酵的研究仅局限于我国和roche公司roche公司获得此项专利后并 未投入生产而是加紧研究但因为没有正式的文献报道我们对他们的研究进 展知之甚少我国科学家从70年代发现混菌发酵并应用于生产后也没有间断对 其优化改造的研究 3 . 1 维生素c 二步发酵法菌种的研究 在维生素c生产中高产菌株的筛选是实现工业化的关键目前就菌种分离 筛选的研究多数仍采用常规方法进行研究中发现具有第一步转化d-山梨醇为 l-山梨糖能力的微生物有许多如生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus弱氧化 醋酸杆菌 a. suboxydans恶臭醋酸杆菌 a. rancens醋化醋酸杆菌 a. aceti 木质醋酸杆菌a. xylinum拟胶杆菌bacterium xylinoides 4 8 , 4 9 等在莱氏 法 或二步发酵法 中广泛使用的生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus生 黑醋酸杆菌a. melanogenus或弱氧化醋酸杆菌a. suboxydans转化d-山梨醇 转化到l-山梨糖的转化率可高达 98%以上 5 0 , 5 1 在研究第二步转化即l-山梨糖转化到2-酮基-l-古龙酸的过程中也发现了许 多具有这种转化能力的种属如十二个属的菌醋酸杆菌属acetobater葡萄 糖酸杆菌 gluconobacter假单胞菌属 pseudomonas固氮菌属 azotobater 芽孢杆菌属bacillus埃希氏菌属escherichia微球菌属micrococcus 气杆菌属aerobacter产碱菌属alcaligenes克雷伯氏菌属klbsiella 黄单胞菌属xanthomonas沙雷氏菌属serratia此外还有顶生球杆菌 acromobacter sp. 5 2 自尹光琳等52,53确立工业生产维生素c二步发酵法以来不断有学者从事 大小菌混合菌系发酵过程的菌种选育研究工作尹光琳任双喜宋祺等 5 5 , 5 6 , 4 4 采用紫外线照射化学诱变和原生质体融合方法选育到一株性状更优良的突变 株scb329 并与新筛选的一株芽孢杆菌scb933搭配组成新的组合菌系产酸小菌 scb329与其亲本株氧化葡萄糖酸杆菌性状相似 伴生大菌scb329属苏芸金芽孢杆 菌bacillus thuringiensis该新组合菌系具有产酸能力强发酵稳定不易污染 等特点在山梨糖最终浓度达140 g/l时产酸120-135g/l转化率90%左右发酵 河北大学理学硕士学位论文 - 12 - 周期4065小时易在工业化生产中应用推广为了更充分发挥新组合菌系的潜 力尹光琳等课题组正在探索利用计算机自动控制技术将l-山梨糖的浓度控制在 对产酸和菌系生产都达到最佳状态的新工艺期望总糖浓度和产酸水平都达到一 个更高水平许安等44,58利用离子注入技术分别处理巨大芽孢杆菌大菌和氧 化葡萄糖酸杆菌小菌经筛选和重新组合而获得2-klg高产菌系ippm-1028 并就营养条件和环境因子对ippm-1028发酵水平的影响进行系统研究 为该菌系的 扩大生产提供实验依据其实验结果为菌系ippm-1028适于酸性环境中生长发 酵周期6064小时2-klg浓度可达70g/l左右转化率为95%金属离子mn2+ ce3+ce2+la2+及有机溶剂二甲苯乙酸乙酯促进产酸张舟等57用紫外线诱变 法处理巨大芽孢杆菌获得了两株耐低ph值抗2-klg的菌株bn和b5bn和b5 分别与产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌搭配混合发酵在ph6.2发酵培养基中明显提高糖 酸转化率其平均糖酸转化率提高11.4%和12.3%仲崇斌59等从酵母菌中选出一 株掷孢酵母sporoblomyces roseus和氧化葡萄糖酸杆菌g. oxydans混合搭配 组成一新混合菌系利用该混合菌系进行二步发酵其产酸量增加57g/l发酵 周期缩短68小时转化率85产酸的适应温度明显拓宽最佳产酸温度为28 初始ph值为6.06.5时产酸量最高产酸最适初始ph降低0.40.5个单位显 示对环境因子较大的适应性周丽娜等 7 2 选用蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)枯草 芽孢杆菌(bacillus subtilis)地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)和类脱发假丝酵母 菌(candida parapsilosis)与氧化葡萄糖酸杆菌进行搭配组合发酵结果为选用的 各芽孢杆菌及分类地位上亲缘关系较远的酵母菌都能不同程度促进产酸但比原 始的巨大芽孢杆菌b2980作为伴生菌的效果要逊色因此目前还代替不了生产上 用的b2980但必竟会为探索混合菌系大小菌间相互作用关系揭示伴生菌促进 产酸菌生长与产酸机制提供线索焦鹏马成新等应用sma探针技术及hb-hg影 印技术从103个试样中分离出三株产2-klg的蛭弧菌j2691-291-4并对其中 优良产酸菌株蛭弧菌j26的主要生物学特征及其发酵条件进行研究通过10批次发 酵表明j26产酸稳定产酸量高可达到5060g/l的2-klg的发酵产量当采用 sma探针技术流加山梨糖发酵摇瓶产2-klg可提高到83.9-91.7%mg/ml可见新 菌株j26实现了维生素c两步发酵中第二步单菌发酵 这将成为维生素c生产拓展出 第 1 章 研究概述 - 13 - 一个新领域有可能成为第三代维生素c发酵技术吕群燕在对维生素c两步发酵 法生产工艺的进一步研究中进行一不同组合的生产菌系生产2-酮基-l-古龙酸的 能力测定新筛选出一个最佳组合生产菌系h19s19并利用单亲灭活方法通过原生 质体的融合选育出两组产生2-klg产量高且稳定性好的重组子其一为h19和s19原 生质体以h19为背景进行融合产生的其二为由132和s19原生质体以s19为背景进行 融合重组而产生的如果这种融合重组子能直接应用于工业生产将可省去大 小菌的分离搭配等操作简化工艺并可使产酸稳定甚至可以尝试以得到 的融合子作为背景再与生黑醋酸杆菌进行原生质体融合实现从d-山梨醇到2- 酮基-l-古龙酸的一步转化李越中采用含pub110质粒的小菌转化子kmrsts与 q132大菌(kmsstr)进行原生质体融合获得可连续传代10代以上的小菌这将为实 现小菌的单独培养以及对小菌的遗传学研究打下基础尹光琳马志方董文玲 等人11,40,41用紫外线 硝基胍理化处理方法获得实现由d-葡萄糖经两种微生物串联 直接发酵产生维生素c前体2-klg的新二步发酵法近年来重组dna技术也 应用于到菌种选育上 2 , 1 4 , 1 6 , 4 4 , 5 8 在新二步发酵法基础上实现葡萄糖直接发酵产生 维生素c的一步发酵法就是靠构建基因工程菌的成功得以实现的 赵巍等 6 0 用转座 子tn5诱变技术以e.coliw3110(p1:tn5)对维生素c生产菌系2980进行转导得到 了能在含卡那霉素的分离平板上单独生长的氧化葡萄糖酸杆菌(g.oxydans)的突变 子 该突变子用于维生素c生产中可提高产酸率3% 3 . 2 发酵工艺的研究 该维生素c二步发酵法技术路线成熟工人操作熟练发酵产率和产品质量 均已达到国际水平但维生素c二步发酵法过程十分复杂干扰因素多再加 之生产自动化连续化程度差因而造成生产稳定性不够劳动生产率较低此 外由于发酵基质浓度低设备利用率差导致工厂的生产成本偏高为解决以上 诸问题对该发酵工艺的动力学研究是非常必要的邵军等 6 1 和魏东芝等 6 2 分别 于1990年和1992年报道了对维生素c二步发酵过程动力学的研究 他们通过测定发 酵体系中大小菌生长规律以及基质和产物的变化利用数学方法建立了简化的动 力学模型 不仅从一定程度上揭示了2-klg发酵系统的本质特征 而且可用于分析 发酵过程并指导生产同时动力学模型的建立也为维生素c二步发酵生产实现连 河北大学理学硕士学位论文 - 14 - 续自动化奠定了理论基础 针对基质浓度不高的问题上海医药工业研究院采用流加糖及调控等手段来 增加基质浓度提高了设备利用率 6 3 华东化工学院生物工程系也对基质浓度 发酵罐氧浓度介质ph值等发酵行为之间的协调定量关进行了研究并在此基础 上进行了发酵罐的放大设计工作东北制药总厂也曾和北京医药工业研究院进行 协作研究采用在发酵体系中加入抑制剂的方法在30立升自控发酵罐中连续5批 发酵转化率超过82%清华大学化工系康学真等 8 0 通过对维生素c二步发酵种子 培养进行的系统研究测定和分析了零级一级二级种子的生长曲线得出了 各级种子的最适培养时间并得出了零级种子培养的最初始接种量和大小两种菌 的接种比例对生产实践具有指导作用受日本科学家takeda和nogami等研究的 启发1993年中科院沈阳应用生态研究所蒋宇扬等证实添加稀土元素和路易斯 酸组成的化合物采用在发酵体系中加入抑制剂的方法可缩短维生素c发酵时间 提 高2-klg转化率1998年中科院沈阳应用生态研究所孙传宝张忠泽等首次应用 现代生态学原理通过对维生素c二步发酵种子培养进行微生态调节成功地协调 了发酵中混菌间的相互关系在300m3发酵罐中连续十批次发酵醇酸平均转化率 达87%的最高水平该技术已通过国家鉴定并应用于生产中 3 . 3 酶学研究 有关l-山梨糖途径的反应机制和酶学特征已研究得比较清楚 1972年 tsukada和perlman分析了生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus的代谢过程认为 菌体内的l-山梨糖是在1位碳原子上氧化再进一步转化为2-酮基-l-古龙酸的 54,69 1975年makover等 6 5 的研究表明在生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus 和恶臭假单胞菌p. putida该步转化遵循l-山梨酮途径即l-山梨糖首 先被l-山梨糖脱氢酶在c-l位上氧化生成l-山梨酮再在l-山梨酮氧化酶的作用下 氧化生成2-酮基-l-古龙酸 如 下 菌 属 的 某 些 种 均 有 氧 化 l-山 梨 酮 的 能 力葡 萄 糖 酸 杆 菌 属 gluconobacter假单胞菌属pseudomonas气杆菌属aerobacter分 枝杆菌属mycobacterium以及丝胞真菌中的瓶梗青霉属pacilomyces 6 6 关于l-山梨糖途径的酶学研究国内外学者做了大量工作第一步转化d-山 第 1 章 研究概述 - 15 - 梨醇l-山梨糖在催化此步反应的弱氧化醋酸杆菌asuboxydans的细胞提 取物中存在着三种氧化d-山梨醇的脱氢酶两种存在于细胞质中分别以nad+ 和nadp+为辅酶 依赖于nad+的d-山梨醇脱氢酶催化底物形成d-果糖 而nadp+ 依赖性脱氢酶则氧化d-山梨醇为l-山梨糖第三种d-山梨醇脱氢酶与膜相连 6 6 , 6 7 由于l-山梨糖发酵菌所生成的l-山梨糖在胞外可迅速积累因此与细胞膜相连的 l-山梨糖脱氢酶可能真正参与了l-山梨糖发酵shinagawa等于1982年成功地从弱 氧化醋酸杆菌a. suboxydans的细胞膜上分离并纯化了d-山梨醇脱氢酶 6 8 第二步转化 l-山梨糖2-酮基-l-古龙酸 1975年在恶臭假单胞菌 p. putida 中发现的l-山梨糖脱氢酶存在于细胞质中 6 5 而在生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus中则在膜上发现此酶801991年sugisawa等从生黑葡萄糖酸杆菌 g. melanogenus的一株突变株uv40中分离纯化了膜结合的l-山梨糖脱氢酶 7 3 此酶有四个分子量为58kda的相同亚基组成属黄素蛋白对l-山梨糖有很高专一 性可被l-山梨糖或d-山梨酮诱导合成 makover等发现的l-山梨酮氧化酶存在于生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus 和恶臭假单胞菌p. putida的细胞膜部位 7 2 而kitamura和perlman则在相同的菌 株的细胞质和细胞膜上均测得该酶活 7 4 1 9 91年hoshino等从生黑葡萄糖酸杆菌 g. melanogenus 的突变株uv40中分离纯化了l-山梨酮脱氢酶 他们发现生黑葡 萄糖酸杆菌g. melanogenus的l-山梨酮脱氢酶主要存在于细胞质中l-山梨酮 是其最适底物酶活为nad+或nadp + 所加强 7 5 在l-山梨糖途径中还发现了一系列的逆向转化1990年sinjoh等研究了14c 标记的l-山梨糖在生黑葡萄糖酸杆菌 g. melanogenus的一株突变株uv40中的代 谢情况 7 6 发现仅有30%的14c转移到了2-酮基-l-古龙酸中而40%的14c主要由磷 酸戊糖途径氧化成了14co2少部分的14c来自2-酮基-l-古龙酸形成过程中的中间代 谢产物如l-山梨酮或其他副产物2-酮基-l-古龙酸不能转化产生co21991年 sugisawa等从生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus中分离纯化到了l-山梨糖还原 酶 7 7 生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus的突变林uv40代谢14c标记的l-山梨 糖时有少部分约8% 14c进入了l-艾杜糖酸 8 3 根据m a k o v e r 等的发现 7 2 14c l- 艾杜糖酸应来自14c 2-酮基-l-古龙酸此反应由2-酮基-l-古龙酸还原酶所催化 在 河北大学理学硕士学位论文 - 16 - hoshino的研究中发现生黑葡萄糖酸杆菌g. melanogenus细胞质中的2-酮基-l- 古龙酸还原酶的作用可被膜结合的l-艾杜糖酸脱氢酸所逆转从而在终止发酵时 l-艾杜糖酸并没有大量积累 不积累或极少积累l-艾杜糖酸的突变株已从l-艾杜糖 酸中获得 7 4 在以山梨糖进行发酵时获得了更高的2-酮基-l-古龙酸的产量 我国维生素c二步发酵中l-山梨糖代谢途径的关键酶学研究也在深入开展郝 林等 7 9 对该途径中的l-山梨糖脱氢酶进行了研究结果表明从氧化葡萄糖酸杆 菌细胞质中分离纯化出的l-山梨糖脱氢酶 分子量约为190kd 由四个相同的亚基 组成其酶促反应最适ph和最适温度分别为7.4和55最稳定的ph是中性在30 以下较稳定超过35酶活显著下降该酶为典型的michaelis-menten氏酶以 l-山梨糖为底物时其米氏常数为100mm有关的酶学研究还涉及2-酮基-l-古龙酸 还原酶1992年1993年中国科学院郭振勇蒋宇扬78对我国维生素c二步发酵 生产菌2980菌系中的2-酮基-l-古龙酸还原酶kgr进行了较深入的研究研究 发现该菌系中2-酮基-l-古龙酸还原酶存在于氧化葡萄糖酸杆菌中而巨大芽孢杆 菌中无该酶存在他们以deae纤维素柱层析sephadexg-200凝胶层析等对2980 菌系中的kgr进行了分离和纯化并研究了其酶学性质凝胶层析法测得kgr分 子量为90kda 通过sds-聚丙烯酸胺凝胶电泳发现其由两个分别为53kda和32kda 的亚基组成等电点为3.6酸性氨基酸占22kgr为典型的米-孟氏酶其以 2-klg为底物的米氏常数km为3.4210-3m其最适ph和最适温度分别为6.5和30 对该酶的稳定性研究表明在35时其活性保持稳定 40加热15分钟开始 失活45加热立即全部失活说明其对温度特别敏感该酶在整个发酵过程中 活性和比活与生产菌的生长保持同步在发酵12小时后其活性和比活均保持恒定 与发酵液中l-山梨糖的浓度和2-klg的积累无相关性 说明产酸菌氧化葡萄糖酸杆 菌中2-klg的合成不受l-山梨糖和2-klg的诱导 kgr为氧化葡萄糖酸杆菌的组成 酶刘耀平. 张丹等67在对前人kgr分离纯化方法进行简化和改进的基础上得到 kgr对其n末端氨基酸序列进行了测定通过genebank检索发现2-klg在 肽段序列上是全新的他们利用kgr肽段序列合成简并寡核苷酸进行了杂交筛 选和mopacmixed oligonucleotides primed amplification of cdna得到了kgr 的基因片段并对其进行了克隆和测序为进一步对kgr进行遗传改造打下了良好 第 1 章 研究概述 - 17 - 的基础同时为生产菌系中产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程工作开辟了道路 3 . 4 混合菌系相互关系和生理生化的研究 我国维生素c二步发酵法的特点为第二步发酵为混合菌系发酵 涉及氧化葡萄 糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌两个菌株二者关系复杂一直 是国内外学者研究的热点 魏东芝等 6 8 通过静息细胞实验发现我国维生素c二步发酵系统中的氧化葡萄 糖酸杆菌具有转化l-山梨糖生成2-klg的细胞酶活力产酸细胞酶活力而大菌 没有产酸细胞酶活力巨大芽孢杆菌等大菌为伴生菌他们研究发现小菌单独