（基础兽医学专业论文）小鼠乳腺中fgf7、fgf10及其受体的表达与作用.pdf

摘要 摘要 在哺乳动物的生殖周期中，乳腺上皮经历了反复生长、分化以及退化的循环。乳腺的发 育和泌乳受多种激素和细胞因子调节。与刺激乳腺发育直接有关的全身激素主要有三种：雌 激素、孕酮以及催乳素。这些全身性的激素可能是通过影响成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s t g r o w t hf a c t o r s ，f g f s ) 这样的局部组织调节物来调节细胞功能。全部的f g f s 都是广谱的有 丝分裂原，作用于外胚层、内胚层和间充质来源的细胞。在乳腺发育过程中，k g f r 以及它 的基质配体一f g f 7 和f g f l0 对于乳腺上皮细胞的增殖和形态发生起着重要作用。 本研究主要以小鼠为实验材料，通过体外和体内实验，系统研究f g f 7 、f g f l 0 及k g f r 在哺乳动物乳腺发育、泌乳及退化过程中表达定位的动态变化，揭示f g f 7 、f g f l 0 及k g f r 表达变化与乳腺发育及泌乳功能间的对应关系，阐明f g f 7 、f g f l 0 在乳腺发育、泌乳及退 化过程中的功能以及乳腺发育激素对不同时期乳腺f g f 7 、f g f l 0 及k g f r 表达的影响。 结果如下：( 1 ) f g f 7 有几个显著高表达的点，分别是青春期2 0 d 、青春期4 0 d 、妊娠 初期、妊娠中期、泌乳初期、退化期初期以及退化末期。其中f g f 7 在退化期4 d 升高达到最 高值。f g f l 0 显著高表达的时点，分别是青春期2 0 d 、青春期3 5 d 、妊娠4 d 。在泌乳期 泌乳4 d 后，表达量一直较高，其中显著高表达的点是泌乳1 0 d 。进入退化期后，在退化4 d 和退化7 d 时f g f l 0 显著下降，然后f g f l 0 水平上升并一直维持高水平表达。k g f r 在青 春期显著高表达的点是青春期2 0 d 、青春期6 0 d 。进入妊娠期后，k g f r 水平先略微下降， 在妊娠1 0 d 后开始显著上升，上升到妊娠1 6 d 后略有下降。进入泌乳期后，在泌乳4 d 时 k g f r 表达达到最高值，在泌乳1 0 d 后k g f r 一直下降，直至进入退化期。k g f r 在退化期 1 9 d 开始显著上升。偏相关分析结果表明，在泌乳期f g f 7 以及f g f l 0 均与k g f r 的表达 有相关性。( 2 ) f g f 7 主要定位于乳腺导管上皮细胞与乳腺腺泡上皮细胞基质。f g f l 0 体现 了一种与f g f 7 相同的定位模式。k g f r 主要定位于乳腺导管上皮细胞以及乳腺腺泡上皮细 胞，在乳腺发育的个别时期在细胞外基质中有弱表达。( 3 ) f g f 7 能促进小鼠乳腺腺泡上皮 细胞的增殖。f g f l 0 除了能促进小鼠乳腺腺泡上皮细胞的增殖，还与乳腺脂肪组织的形成有 关。( 4 ) 除青春期和妊娠期外，添加f g f 7 和f g f l 0 的处理均能显著诱导乳腺腺泡上皮细胞 产生k g f r 。( 5 ) f g f 7 与f g f l 0 均能降低乳腺腺泡上皮细胞的凋亡。( 6 ) 1 7b 雌二醇能 引起小鼠乳腺中f g f 7 表达上调；孕酮对小鼠乳腺中的f g f 7 表达没有影响：在小鼠乳腺发 育的妊娠期与泌乳期，催乳素能引起f g f 7 表达显著上调。1 71 3 雌二醇能引起小鼠乳腺中的 f g f l 0 表达上调；在小鼠乳腺发育的青春期，孕酮和催乳素能显著减少f g f l 0 的表达：在 小鼠乳腺发育的妊娠期，催乳素能显著增加f g f l 0 的表达。当雌激素在体内所占比例比较 高的时候，会减少k g f r 的表达；而雌激素在体内所占比例比较低的时候，反而会增加k g f r 的表达。低浓度孕酮使k g f r 的表达增加，高浓度孕酮对于k g f r 的表达没有影响。在小 鼠乳腺发育的妊娠期以及泌乳期，催乳素能显著升高k g f r 的表达。 关键词：f g f 7 ；f g f l 0 ；k g f r ；细胞凋亡；激素；乳腺发育 a b s t r a c t e x p r e s s i o na n df u n c t i o no f f g f 7 、f g f10a n di t s r e c e p t o ri nm a m m a r y g l a n do fm o u s e a b s t r a c t i nm a m m a l i a nr e p r o d u c t i v ec y c l e ，m a m m a r ye p i t h e l i a l se x p e r i e n c et h ep r o c e s so fr e p e a t e d g r o w t h ，d i f f e r e n t i a t i o na n dd e g r a d a t i o n t h el a c t a t i o na n dt h ed e v e l o p m e n to fm a m m 哪g l a n dw a s r e g u l a t e db yav a r i e t yo fh o r m o n e sa n dc y t o k i n e s t h et h r e em a j o rs y s t e m i ch o r m o n e sd i r e c t l y s t i m u l a t e dt h ed e v e l o p m e n to fm a m m 咧g l a n d ：e s t r o g e n ，p r o g e s t e r o n e ，a n dp r o l a c t i n t h e s e s y s t e m i ch o r m o n ei sp r o b a b l yt h r o u g ht h et i s s u er e g u l a t o r ，s u c ha sf g f st or e g u l a t ec e l lf u n c t i o n a l lo ft h ef g f sf a m i l ya r et h em i t o g e n , a f f e c t i n gt h ee c t o d e r m ，e n t o d e r ma n dt h em e s e n c h y m a l c e l l s i nm a m m 哪g l a n d d e v e l o p m e n tp r o c e s s ，k g f ra n di t sm a t r i xl i g a n d - f g f 7a n df g f 10p l a y a ni m p o r t a n tr o l ef o rm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o na n dm o r p h o g e n e s i s t h em i c ew e r eu s e da se x p e r i m e n t a la n i m a l si nt h i ss t u d y ，t h r o u g ht h ee x p e r i m e n ti nv i t r oa n d i nv i v o ，s y s t e m i ci n v e s t e dt h ed y n a m i cc h a n g e si ne x p r e s s i o na n dl o c a l i z a t i o no ff g f 7 ，f g f10a n d i t sr e c e p t o ri nm a m m a l sd e v e l o p m e n t ，l a c t a t i o na n di n v o l u t i o n ；r e v e a l e dt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e n t h ee x p r e s s i o no ff g f 7 ，f g f l0a n di t sr e c e p t o ra n dt h ef u n c t i o n ；c l a r i f i e dt h ef u n c t i o no ff g f 7 a n df g f10i n m a m m a r yg l a n dd e v e l o p m e n t ，l a c t a t i o na n di n v o l u t i o n , a n dt h ee f f e c to f m a m m o g e n i ch o r m o n e so ne x p r e s s i o no ff g f 7a n df g f - 10a n di t sr e c e p t o ri nd i f f e r e n tp e r i o d s 加 v i t r o t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：( 1 ) t h ee x p r e s s i o no ff g f 7h a daf e wn o t a b l eh i g hp o i n t s ：v i r g i n 2 0 d ，v i r g i n4 0 d ，t h ee a r l ya n dm i d d l ep r e g n a n c y ，e a r l yl a c t a t i o n ，a n dt h ei n i t i a la n dt h el a t e i n v o l u t i o n t h ee x p r e s s i o no ff g f 7i n c r e a s e dt ot h eh i g h e s tv a l u ei ni n v o l u t i o n4 da m o n gt h e s e p e r i o d s t h es i g n i f i c a n t l yh i g h e re x p r e s s i o np o i n t so ff g f 10w e r e ：v i r g i n2 0 d a n d3 5 d ，p r e g n a n c y 4 d i nl a c t a t i o n4 d ，t h ee x p r e s s i o no ff g f10h a db e e nr e l a t i v e l yh i g h , a n dt h es i g n i f i c a n t l yh i g h e r e x p r e s s i o np o i n tw a sl a c t a t i o n10 d a f t e re n t e r i n gi n v o l u t i o n , f g f l0w a ss i g n i f i c a n td e c l i n e di n i n v o l u t i o n4 da n d7 da n dt h e ni n c r e a s e da n dm a i n t a i n e dah i 曲l e v e le x p r e s s i o n t h eh i g h e r e x p r e s s i o no fk g f ri nv i r g i nw a s2 0 d ，6 0 d ；i np r e g n a n c y ，t h ek g f rl e v e lc u t t e dd o w ns l i g h t l y f i r s t , a n di n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rp r e g n a n c y10 d ，t h e nd e c l i n e ds l i g h t l ya f t e ru pt op r e g n a n c y 16 d i nl a c t a t i o n ，t h ee x p r e s s i o no fk g f rw a sh i g h e s ti n4 da n dt h e nf a l l e nu n t i l li n v o l u t i o n t h e e x p r e s s i o no fk g f ri n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yf r o m i n v o l u t i o n19 d p a r t i a l c o r r e l a t i o na n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no ff g f 7 ，f g f10a n dk g f rw e r er e l e v a n ti nl a c t a t i o n ( 2 ) f g f 7 m a i n l yl o c a l i z e di nt h em a t r i xo fm a m m a r yg l a n dd u c t a le p i t h e l i a lc e l l sa n da c i n a rc e l l s f g f l0 s h o w e das i m i l a rl o c a t i o np a t t e r na sf g f 7 k g f ro c c u r r e dm a i n l yi nt h em a m m 叫g l a n dd u c t a l e p i t h e l i a lc e l l sa n da c i n a rc e l l s ，a n daw e a ke x p r e s s i o ni nm a t r i xi nt h ei n d i v i d u a lt i m e ( 3 ) f g f 7 i i i 东北农业人学农学博 学位论文 p r o m o t e de p i t h e l i a lp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fm o m em a m m a r y f g f l 0w a st h es a m ea s f g f 7 ，a n dr e l a t e dw i t hf a tt i s s u ef o r m a t i o n 。( 4 ) e x c e p tv i r g i na n dp r e g n a n c y ，f g f 7a n df g f 10 t r e a t m e n tc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n d u c e dm a m m a r y e p i t h e l i a lt op r o d u c ek g f r ( 5 ) f g f 7a n df g f 10 c a nr e d u c et h e a p o p t o s i si nm a m m a r ya c i n a rc e l l s ( 6 ) i nm a m m a r yg l a n d s o fm o u s e ，17 b e t a - e s t r a d i o li n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no ff g f 7 ；p r o g e s t e r o n ed i d n ta f f e c tt h ee x p r e s s i o no ff g f 7 ； i n p r e g n a n c ya n dl a c t a t i o n ，p r o l a c t i nu p r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no ff g f 7s i g n i f i c a n t l y i n m a m m a r yg l a n do fm o u s e ，17b e t a - e s t r a d i o li n c r e a s e de x p r e s s i o no f f g f10 ；i nv i r g i nm a m m a 叮 g l a n d ，p r o g e s t e r o n e a n dp r o l a c t i nr e d u c e dt h ee x p r e s s i o no ff g f l0s i g n i f i c a n t l y ；i np r e g n a n c y m a m m a r yg l a n d ，p r o l a c t i ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df g f 10e x p r e s s i o n w h e ne s t r o g e ni nt h eb o d y w a sr e l a t i v e l yh i g hp r o p o r t i o n ，i tw o u l dl o w e rk g f re x p r e s s i o n ；w h i l ee s t r o g e ni nt h eb o d yw a s r e l a t i v e l yl o wp r o p o r t i o n ，i tw o u l di n c r e a s ek g f re x p r e s s i o n l o wc o n c e n t r a t i o no fp r o g e s t e r o n e i n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fk g f r ，a n dh i g hp r o g e s t e r o n ed i d n ta f f e c tt h ee x p r e s s i o no fk g f r i n p r e g n a n c ya n dl a c t a t i o no fm a m m a r yg l a n do fm o u s e p r o l a c t i ni n c r e a s e dk g f re x p r e s s i o n s i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：f g f 7 ；f g f l 0 ；k g f r ；a p o p t o s i s ；h o r m o n e s ；d e v e l o p m e n to f m a m m a r yg l a n d d o c t o rd e g r e ec a n d i d a t e ：c u iy i n g i u n s p e c i a l i t y ：a n i m a lb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f l iq i n g z h a n g 研究生学位论文独刨声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 洼! 翅遗直基丝盂墓挂型直明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：惶辕1 爱 日期：神1 年f 口月g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：程袭俊日期：抽_ 年f 口月g 日 导师 签名： 比牟 日期：j 一7 年，月彦日 i、 引言 ii 1 引言 1 1 小鼠的乳腺发育和泌乳 1 1 1 小鼠乳腺的发育 小鼠乳腺的发育通常被认为发生在胚胎、出生后和青春期后3 个独立阶段。胚胎发育是到 出生为止未发展的分支状导管结构，它出现在上皮下面，上皮处于假定的乳腺脂肪垫附近。 在出生后6 - 7 周过程中，未发育的导管扩充、分枝，并在的乳房垫中形成简单的树形结构。 青春期小鼠乳腺伴随着小鼠发情周期的激素波动刺激可能经历了小的变化。然而，乳腺 发育主要发生在成熟雌性青春期后，可以分为4 个阶段：第一阶段，从妊娠早期到妊娠中期， 上皮细胞增殖，导管树进一步分枝，腺泡出现；第二阶段，从妊娠中期到妊娠晚期，腺泡在 密度上增大形成小叶，在催乳素作用下功能分化形成泌乳的单位；第三阶段，分娩期，孕酮 浓度的迅速下降使乳的合成和分泌达到最高水平；第四阶段，幼仔断奶后，乳腺分支结构消 失。当乳腺重新恢复为静止状态时，结构上类似于青春期小鼠乳腺。 乳腺组织显示一种非凡的再生能力，利用基因标记的上皮细胞和一系列的移植实验，表 明一个乳腺细胞最终能产生一个完整的乳腺( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 乳腺上皮细胞与泌乳的关系 一个持久性的泌乳期依赖于与提高分泌乳汁有关的乳分泌细胞的数量和活性。以牛为 例，当奶牛场奶牛一天产乳两次时，从分娩到泌乳峰值的乳产量的提高是由于每个细胞分泌 活力的提高，而不是额外的上皮细胞的增加。在泌乳峰值之后，乳产量的下降是由于细胞凋 亡乳腺上皮细胞的减少。在泌乳期一个2 4 小时的周期里，只有o 3 的乳腺上皮细胞增殖。 然而在泌乳期结束之前，这种增殖足能代替多数乳腺上皮细胞。 管理的水平能影响泌乳的持久性。牛生长激素的给予能通过提高细胞增殖，或通过降低 凋亡率来增加泌乳的持久性。延长光周期也可能通过还未确定的机制增强泌乳的持久性。在 泌乳的第一周，增加挤乳频率可提高乳产量。甚至恢复到不经常挤乳后，乳产量在整个泌乳 期间大概还有约8 的增加。 在早期泌乳过程中，经常挤乳可引起乳房细胞增殖反应。相反，妊娠早期、不经常挤乳， 以及乳房炎因细胞凋亡导致了上皮细胞减少。研究表明，乳房细胞更新的调节是提高持久性 的关键。在乳房发育和泌乳的所有阶段，组织切片中上皮细胞容易染色，并且贯穿于青春期 前乳腺中几乎所有的细胞增殖( a vc a p u c o 等，2 0 0 3 ) 。 东北农业大学农学博十学位论文 1 1 3 乳腺发育中的细胞凋亡 细胞凋亡在乳腺的正常生长和发育中有规律地进行( ce d w a r d 等，1 9 9 9 ) 。妊娠期乳腺 腺泡结构大量发育，这种发育使在出生时分化了的分泌上皮趋于成熟，这些分泌上皮是乳生 产必需的( rs t r a n g e 等，1 9 9 2 ；rj a g g i 等，1 9 9 6 ) 。泌乳停止后，在自然断乳的泌乳小鼠、 幼仔移除或者乳汁淤积的小鼠中，都刺激乳腺细胞凋亡的产生，暗示乳腺细胞凋亡是乳房组 织退化的一个完整部分( hl y n d a 等，1 9 9 8 ) 。 乳腺退化是一个组织重建的过程( p af u r t h 等，1 9 9 7 ) ，乳腺的退化过程与腺体的重塑 平行( rs t r a n g e 等，1 9 9 2 ；rj a g g i 等，1 9 9 6 ) 。上皮细胞凋亡是组织重建的唯一因素，组 织重建时细胞凋亡最明显。基本的退化过程首先发生，与乳汁蓄积有关的局部因子启动了这 个阶段，此时细胞周期控制基因和b c l 2 家族成员基因的表达模式发生了变化( p af u r t h 等， 1 9 9 7 ) ，小叶腺泡结构的萎陷出现，大量乳腺上皮细胞死亡并被吸收( rs t r a n g e 等，1 9 9 2 ) ， 被脂肪细胞取代，乳腺重建被抑制并且凋亡细胞在腺泡腔可见( c jw a t s o n ，2 0 0 6 a ) 。以小 叶腺泡的崩解为特征的是乳腺退化的第二个阶段，这是由全身性激素刺激支配着的，此时蛋 白激酶基因活化( p af u r t h 等，1 9 9 7 ) ，细胞凋亡伴随着周围间质的重建以及脂肪细胞的再 分化( c jw a g o n ，2 0 0 6 a ) ，乳腺被适当的重建成妊娠之前的状态，这样在后来的妊娠之后 才能有成功的泌乳。不被需要的泌乳腺泡在断乳过程中没有被成功转变，能够导致炎症以及 组织损伤( c jw a t s o n ，2 0 0 6 b ) 。 1 2f g f s 对乳腺的作用 成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r s ，f g f s ) 是个肝素结合蛋白家族( b c a n c i l l a 等，2 0 0 0 ) ，至少有2 3 个成员( ty a m a s h i t a 等，2 0 0 0 ；mf o r d p e r r i s s 等，2 0 0 1 ) ， 能通过激活跨膜受体的酪氨酸激酶来转换信号。全部f g f s 都是广谱有丝分裂原，作用于外 胚层、内胚层和间充质米源的细胞，它们也能作为细胞的存活因子和运动因子( b s p e n c e r _ d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 f g f s 调节早期发育和器官发生，一个f g f s 亚科对上皮组织和器官的分化是必需的，最近 的研究显示这些f g f s 在皮肤、肠和肝的修复中也起作用。另外，研究提示f g f s 在体内应急条 件下对上皮细胞有保护作用( hs t e i l i n g 等，2 0 0 3 ) 。f g f s 的异常表达或细胞表面受体的不适当 激活与肿瘤发生有关( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 1 2 1f g f s 及其受体 在脊椎动物中，f g f 家族成员的分子质量分布从1 7 到3 4 k u ，并且有1 3 - - 7 1 的氨基 酸相同。在脊椎动物种间，f g f s 在基因结构和氨基酸序列上高度保守。多数f g f s 都有一个 2 相似的内核区，有2 8 个高度保守的以及6 个相同的氨基酸残基。这些高度保守的残基中1 0 个与f g f r 相互作用( d m o m i t z 等，2 0 0 1 ) 。 f g f s 受体有f g f r l 4 四种基因型，都是跨膜蛋白质，主要由3 部分组成：胞外段、 跨膜区和胞内段。胞外段为配体结合区，包括2 个或3 个免疫球蛋白样功能区( 图1 1 ) ( f u e m a t s u 等，2 0 0 0 ；cd i c k s o n 等，2 0 0 0 ) 。这四种受体基因通过选择性拼接编码许多不同的 同工型受体。例如，魄胆，愿征2 和f g c r 3 ，每一个编码两种同工型系统，一共形成了7 种典型的受体( cd i c k s o n 等，2 0 0 0 ；bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。每一种典型的受体都有不 同的配体结合能力以及不同的组织分布( cd i c k s o n 等，2 0 0 0 ) 。胞外段的选择性剪接是成纤 维细胞生长因子受体家族成员的一个独有特点，它显示了f g f 的独特结合特性( b s p e n c e r - d e n e 等2 0 0 1 ；hz h a n g 等，2 0 0 4 ) 。在同工型独特的外显子编码后，这些同工型系 统中的每一个被指定为l i l ba n di l l e ( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) ，这些变异体具有不同的配 体亲和力( h db e e r 等，2 0 0 0 ) 。比如，f g t r 2 可产生f g f r 2 1 i ib 和f g f r 2 i i i c 两种受体 亚型。f g f r 2 i i ib 特异性表达于上皮细胞内，f g f r 2 一i i i c 则主要在间质细胞中表达。间质细 胞表达的f g f 7 和f g f l0 能特异性地激活f g f r 2 i i i b ，而f g f 2 ，f g f 4 ，f g f 6 ，f g f 8 和 f g f 9 则特异性激活f g f r 2 i i i c ( fu e m a t s u 等，2 0 0 0 ) 。到目前为止，仅有一个单一全长跨 膜f g f r l 变异体( f g f r l 1 l l c ) 被鉴定( h db e e r 等，2 0 0 0 ) 。 免疫球蛋白样功能区工 跨膜区 酪氨酸激酶区 配体结合区 图1 1f g f 受体结构图 f i g 1 - 1 s t r u c t u r eo f a nf g fr e c e p t o l 3 _ 一 区 区 能 能 功 功 样 样 白 白 蛋 蛋 球 球 疫 疫 免 免 东北农业大学农学博士学位论文 1 2 2 与乳腺发育有关的f g f 关于乳腺中f g f s 的研究表明，它们在胚胎和成年妊娠期具有功能。然而，在乳腺发育的 这两个时期，f g f 功能的调节相当不同。胚胎的乳腺发育依赖全身的激素作用。在胚胎形成 过程中，f g f s 信号对妊娠期小鼠乳腺小叶腺泡的理想发育是必需的。与之相比，在妊娠期发 生的组织改变是被雌激素和孕酮控制的，还有其他肽类激素。这些全身性激素大概是通过局 部组织调节物来调节细胞功能，比女f i f g f s 。可是它也能作为一种细胞存活的刺激物行使功能 ( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 乳腺中f g f s 的主要功能之一，可能是防止乳腺上皮细胞增殖过程中的凋亡，凋亡主要 是由类固醇和多肽激素决定的，暗示f g f 信号传输极可能直接或间接被这些全身性的因子调 节( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 在青春期后乳腺发育过程中，将两种f g f r s ( f g f r i 1 l i c 与f g f r 2 i i i b ) 的突变体分别 转入小鼠中。由于突变体缺乏编码酪氨酸激酶区的序列，因此不表现生物学功能。而野生型 的f g f r i 1 i i c 能被f g f l 、f g f 2 、f g f 4 、f g f 6 和f g f 8 激活：野生型的f g f r 2 i l l b 能被 f g f i 、f g f 3 、f g f 7 和f g f l 0 激活( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。对f g f r l 1 i l c 阴性表达 的小鼠乳腺检查表明，与对照鼠相比，没有可辨认的形态学变化。与之不同的是，f g f r 2 i i i b 在乳腺上皮中的阴性表达，导致了妊娠期乳腺小叶腺泡发育的抑制。能观察到很多稀疏发育 的导管树，以及较少的腺泡。这些小鼠乳腺发育不良的形态学变化预示着总乳的产量显著下 降，这些都归咎于乳腺组织中腺泡的缺乏( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。分析f g f r 2 i i i b 阴 性表达从而抑制妊娠期乳腺小叶腺泡发育的原因，要从与之结合的f g f s 谈起。野生型的 f g f r 2 1 l i b 能被f g f l 、f g f 3 、f g f 7 和f g f l 0 这四种f g f s 激活。 由于f g f i 也结合在f g f r i i i i c 上，并且f g f r i i i i c 阴性表达不抑制乳腺小叶腺泡发育； f g f 3 在乳腺中不表达；小鼠缺失f g f 7 时不引起乳腺变化( 小鼠在缺失f g f 7 时乳腺形态不 发生变化，可能是由于其它f g f s 在乳腺中对f g f 7 有代偿作用) ；因此乳腺小叶腺泡发育 抑制只能是和f g f l 0 与f g f r 2 i i l b 突变体结合后功能受阻有关( bs p e n c e r - d e n e 等，2 0 0 1 ) 。 为了研究f g f r 2 一l l i b 信号传输在乳腺发育早期的可能作用，对一种f g l r 2 - 1 i l b 钝化鼠种系 进行分析，发现鼠缺失f d m i i i b 就不能发育成可辨别的乳腺原始细胞。对艘一i i i b 基因表达 的分析表明，它出现在外胚层，后来是皮肤表皮的基底层，像乳腺的原始细胞。在表皮基底 细胞中和后来发育中的毛状小囊中，受体的表达被维持贯穿于胎儿发育的全过程。间叶细胞 围绕着乳芽聚集，表达f g f 7 ，一种对f g f r 2 一i l l b 活化的配基。因此，受体和配基的分布为从 问质细胞至t j s l 腺原始细胞的有益旁分泌提供了依据。就像前面指出的，缺失咫汐的鼠不表现 任何乳腺畸形，因此通过这种配基进行的信号传输对于乳腺发育很明显不是基本的。最近发 现，缺失f g l o 的鼠具有一种复杂的表型，这种表型类似于聊，i i i b - - 鼠。此外，在这两种 突变鼠中，许多由芽或者分枝进行形态发生发育的器官都受到了影响。因而，尽管没有最初 方面的报道，很可能阳f ，0 - _ 鼠也显示了一种乳腺缺陷，类似于在局g 皿2 i i i b - - 鼠中看到的。 因此，在乳腺发育过程中，f g f 7 与f g f l 0 是很重要的( bs p e n c e r d e n e 等，2 0 0 1 ) 。并且在 已知的f g f s 中，f g f 7 与f g f l 0 由基质起源，并且似乎特异性地作用于上皮细胞，因此是专 4 引言 有的旁分泌生长因子( j sr u b i n 等，1 9 9 5 ：he m o t o 等，1 9 9 7 ) 。 f g f 7 和f g f l 0 都在间质组织中正常表达，因此这两个生长因子都有可能对乳腺上皮以 旁分泌的方式发出信号。可是，这样的信号传输在妊娠期成熟的乳腺中起到什么作用还不清 楚，这种信号传输是如何被调节的也不清楚。 1 2 2 1f g f 7 对乳腺发育的作用 f g f 7 也叫做角质细胞生长因子( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ，k g f ) ，是1 9 8 9 年r u b i n 等 人从人胚胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化的，同时发现这种细胞因子具有促进小鼠 角质细胞有丝分裂的作用( j sr u b i n 等，1 9 8 9 ) 。 人类f g f 7 的基因，包括三个外显子( e x t r o n ) 和两个内含子( i n t r o n ) ，定位于1 5 号染色 体( m jk e l l y 等，1 9 9 2 ) 。其编码产物为一分子质量2 6 2 8 k u 的单链多肽( j sr u b i n 等，1 9 8 9 ) 。 k g f 基因在体内的转录物极为丰富，但前体r n a 的性质极不稳定( p wf i n c h 等，1 9 8 9 ) 。 人f g f 7 的c d n a 编码一条1 9 4 个氨基酸残基的单链多肽，包括一段2 1 个氨基酸残基的信 号肽。成熟f g f 7 为一条1 6 3 个氨基酸残基的单链多肽，蛋白的氨基端有一个糖基化位点。重 组f g f 7 在细菌中表达时，重组蛋白为一约2 1 k u 的单链多肽，它与天然f g f 7 在分子质量上 的差异直接证明了这种细胞因子在哺乳动物细胞中的成熟表达是需要进行糖基化的( j a p a r r o t t 等，1 9 9 4 ) 。蛋白质的结构与功能分析表明，肽链的前2 3 个氨基酸残基的缺失并不降低 f g f 7 的促有丝分裂活性。但随后的6 氨基酸残基缺失则极大地降低f g f 7 的生物学活性。成 熟肽的第1 2 2 1 3 2 个氨基酸残基之间是f g f 7 的受体特异性结合位点( dr o n 等，1 9 9 3 ) 。 人、牛、小鼠和大鼠f g f 7 的c d n a 呈现高度的保守性，同源性高达8 6 9 5 ( t d o s s l u n d 等，1 9 9 8 ) 。 在上皮组织中，f g f 7 由关联的基质细胞产生，目标仅是上皮细胞，那里表达k g f r ，一 种跨膜的酪氨酸激酶，也就是前文出现过的f g f r 2 i i i b 。f g f 7 是f g f s 家族中唯一一个只与一 种受体结合的生长因子( ml g a r a s h i 等，1 9 9 8 ) 。 f g f 7 在体外是一种广泛的针对不同器官的促有丝分裂原，包括皮肤、角膜、胃、肝、前 列腺、卵巢、肺和乳腺。在胚胎发育中，包括乳腺中f g f 7 和k g f r 表达的分析，提供了f g f 7 是一种重要的间质细胞促进上皮细胞生长和分化的调节物的依据。来自基质的f g f 7 能作为一 种上皮生长和形态发生的间充质基质的媒介，在乳腺发育中起到重要的作用( v kp e d c h e n k o 等，1 9 9 8 ) 。 1 2 2 2f g f l 0 对乳腺发育的作用 y a r n a s a k im 等1 9 9 6 年由大鼠胚胎中首次分离出f g f l 0 的c d n a ，并对f g f l 0 进行命名。 f g f l 0 也叫做角质细胞生长因子2 ( k g f 2 ) ，能特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移， 对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用，对临床上多种疾病的治疗也有很好的应 用前景( 王金凤等，2 0 0 3 ) 。 类似于大鼠，小鼠的f g f l 0m r n a ( 4 5k u ) 在胚胎和肺中相当丰富地表达，在脑和心表 5 东北农业大学农学博士学位论文 达水平很低( st a g a s h i r a 等，1 9 9 7 ) 。在皮肤中，f g f 7 和m f g f i o 都在真皮表达，而不是在 表皮层( h db e e r 等，1 9 9 7 ) 。另外，一个短的转录物( 1 3k u ) 仅在睾丸中表达。小鼠f g f l 0 m r n a 在发育阶段不同组织中的表达通过n o r t h e m 杂交显示了基因表达的组织和发育阶段特 异性( st a g a s h i r a 等，1 9 9 7 ) 。 小鼠f g f l 0 已知的分子质量是2 3 6k u ( st a g a s h i r a 等，1 9 9 7 ) ，小鼠f g f l 0 与人f g f l 0 有 9 2 同源性，与大鼠f g f l 0 有9 l 同源性。除了留在细胞内的以及与细胞外基质联结的部分， 小鼠f g f 1 0 蛋白是糖基化的( h db e e r 等，1 9 9 7 ) 。 t a g a s h i r as 等( 1 9 9 7 ) 用小鼠模型检验了f g f l 0 在伤口愈合过程中的基因表达。f g f l 0 m r n a 在受伤l 天后被高效诱导，并且在3 天的时候快速降低。这暗示了f g f l 0 在伤口愈合过 程中是一种最初的因子，类似于其他的生长因子比如a t g f 和f g f7 。 p i r v o l au 等( 2 0 0 0 ) 发现通过f g f r - 2 ( i l l b ) 的信号转导对于内耳的形态发育是关键的。 因此说明f g f l 0 和f g f r 2 的l i l b 亚型之间的相互作用对于一些器官的诱导和生长是决定性 的，尤其是那些涉及到芽状形态发生的。 f g f l 0 在靠近上皮末端的基质中表达( b ah y a t t 等，2 0 0 4 ) ，有两种细胞膜表面受体： f g f r l 一i i i b 和f g f r 2 1 l l b 。f g f r 2 i l i b 仅在上皮细胞中表达，f g f l 0 与f g f r 2 1 l l b 的亲和 力很高，是其特异性配体( 王金风等，2 0 0 3 ) ，f g f l 0 特异的促上皮细胞增殖作用主要是通 过f g f r 2 一i i i b 介导的；而与f g f r i 1 l l b 的亲和力很低，只有在高浓度f g f l 0 存在时才与 f g f r l 1 l l b 结合( f g f r i i i i b 还以较低的亲和力与f g f 2 、f g f 7 结合) ( h db e e r 等，2 0 0 0 ； 王金凤等，2 0 0 3 ) 。f g f r i i i i b 在许多类型的细胞中都表达，但对其介导的f g f l 0 的生物学 作用仍不清楚( 王金风等，2 0 0 3 ) 。 f g f l 0 与受体结合后，促使受体胞内的c 端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有了酪 氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能( 王 金风等，2 0 0 3 ) 。 小鼠发育的5 对乳腺产生于妊娠中期，来自于外胚层起源的5 对基板。f g f 信号与乳芽4 的 维持有关，并且f g f l 0 缺乏的上皮会经历分支性形态分化形成乳房脂肪垫前体( a am a i l l e u x 等，2 0 0 2 ) 。 另外，为了方便叙述，也为了体现f g f r 2 i l l b 对于f g f 7 的专一性结合，后文将