（内科学专业论文）益生菌vsl3对大鼠实验性结肠炎疗效及作用机制的研究.pdf

独创性声明 导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有 论文作者签名： 一切相关责任。 出! ! ：姜! 芍 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 ， 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： ”。l 7 ”l6 炎动物模型的建立 1 前言“17 2 实验材料与方法18 3 实验结果j ”2 2 4 讨论”2 5 5 结论“2 7 第二部分益生菌v s l # 3 对急性实验性结肠炎大鼠模型疗效及其机制 1 前言”：。2 8 2 实验材料与方法3 0 3 实验结果4 0 4 讨论一5 7 5 结论“6 0 第三部分益生菌v s l # 3 对慢性实验性结肠炎大鼠模型疗效及其机制 1 前言”6 2 2 实验材料与方法6 2 3 实验结果：6 4 4 讨论8 2 5 结论一8 5 第四部分益生菌对溃疡性结肠炎诱导缓解、维持治疗作用：荟萃分析 1 前言一“8 6i 刖舌“8 6 2 材料与方法8 6 3 结果8 8 4 讨论j 9 5 个人简介11 6 炎模型 炎症性肠病( i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e ，i b d ) 是一种病因尚不十分清楚的 慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec o l i t i s ，u c ) 和克 罗恩病( c r o h n sd i s e a s e ，c d ) ，本病在西方国家相当常见，近年来我国i b d 的患 病人数呈明显上升趋势，主要是u c 患病人数剧增。u c 病变主要累及大肠粘膜及 粘膜下层，多于直肠起始，可逆行发展，呈连续性分布，表现为腹痛、腹泻、粘 液脓血便，本病往往病程较长，且易反复发作，严重影响患者的生活质量，该病 已经被世界卫生组织列为难治疾病之一。因此，阐明该病的病因及发病机制，并 寻求有效的治疗方法成为近年研究的热点之一。 动物模型对于研究其病因、发病机制、治疗手段以及新药的研发均具有重要 意义；正确选择适合研究目的的实验动物模型至关重要。本研究主要探讨几种化 学药物诱导结肠炎模型的造模效果，包括葡聚糖硫酸钠( d e x t r a ns u l p h a t es o d i u m ， d s s ) 造模法、三硝基苯磺酸( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d ，t n b s ) 造模 法、恶唑酮( o x a z o l o n e ，o x z ) 造模法。本研究旨在对比常见的几种化学诱导结肠 炎的方法，选择最佳的造模方法继续发病机制及治疗方面的研究。 目的 通过外源性化学药物诱导结肠炎的方法建立大鼠实验性结肠炎模型，选择最 佳的造模方法继续发病机制及治疗方面的研究。比较益生菌v s l # 3 与传统治疗药 物美沙拉嗪治疗大鼠急、慢性实验性结肠炎的疗效，检测与实验性结肠炎发病密 切相关的i l 6 、i l 2 3 、t g f 1 3 、s t a t 3 、p s t a t 3 细胞因子与信号因子的表达，研 究其治疗的作用机制，评价益生菌v s l # 3 治疗实验性结肠炎的疗效。检索文献后 ( b ) 、1 - n b s 组( c ) 、 ，活动等一般情况，监 测体重，观察粪便性状及有无隐血，通过疾病活动指数( d i s e a s ea c t i v i t yi n d e x ， d a i ) 以及大鼠大肠粘膜组织损伤评估大鼠结肠炎严重程度，选择最佳造模方法 进行下一步实验。通过第一部分的实验研究，选择葡聚糖硫酸钠造模方法进行下 一步实验。5 6 只s d 大鼠采用随机抽签的方法分为7 组，每组8 只，分别为e 组k 组。 文献中依据大鼠的体表面积给药剂量分别为v s l # 3 ：0 6 9 ( k g d ) 、美沙拉嗪：o 4 ( k g d ) ，于实验第八天开始给药，每同灌胃1 次，连续灌胃1 周。e 组：正常组； f 组：模型组；g 组：生理盐水组：造模+ n s ( 0 2 m l 1 0 9 ) 灌胃；h 组：造模+ 0 4 9 ( k g d ) 美沙拉嗪灌胃；i 组：造模+ 0 6 9 ( k g d ) v s l # 3 灌胃；j 组：造模+ 0 6 9 ( k g d ) 热灭活v s l # 3 灌胃；k 组：造模+ 0 6 9 ( k g d ) v s l # 3 + 0 4 9 ( k g d ) 美沙 拉嗪灌胃；实验期间观察指标以及标本采集、处理与第一部分基本相同。实验动 ， 物大肠标本行r e a l t i m ep c r 、w e s t e r nb l o t t i n g 、免疫组化技术检测细胞因子。葡 聚糖硫酸钠造模法进行大鼠慢性实验性结肠炎方面的研究。5 6 只s d 大鼠采用随机 抽签的方法分为7 组，每组8 只进行造模，分别为l 组r 组，干预方式分别与e 组k 组相同。实验期间观察指标以及标本采集、处理、检测指标等与第一部分基本相 同。检索m e d l i n e 、e m b a s e 、t h ec o c h r a n ec o n t r o l l e dt r i a l sr e g i s t e r 。评价益 生菌治疗与非益生菌治疗在溃疡性结肠炎诱导缓解、维持治疗方面的疗效。 键里 ：口木 b 组、c 组及d 组大鼠先后出现不同程度的毛色干枯、精神欠活跃、反应欠灵 活、食量减少，倦怠懒动、拱背、拖尾、腹泻、粘液血便、体重减轻等症状。a 组d a i 评分无明显变化，b 组、c 组及d 组大鼠d a i 评分进行性升高，且第五、 六、七天d a i 评分升高幅度较快。第七天时d a i 评分由高到低依次为d 组 c 组 组织学 异。 d s s 组 现死亡。 态最差， 部分大鼠出现粘液脓血便或血便，正常组大鼠无异常表现，其余单药治疗组大鼠 一般状态介于正常组与模型组之间，联合治疗组大鼠一般状态与正常组大鼠无明 显差异。 大鼠造模成功后，予以药物治疗七天，结果示：正常组大鼠在实验过程中体重 逐渐增加，其余各组大鼠体重均呈现逐渐下降的趋势，体重下降程度由轻到重依 次为联合治疗组、益生茵组、美沙拉嗪组、热灭活组、模型组、n s 组。益生菌组、 美沙拉嗪组、热灭活益生菌组无明显差异，联合治疗组与各单药治疗组比较有显 著性差异。 大鼠大肠外观及长度变化比较：正常组大鼠结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成 形，模型组及n s 组大鼠结肠外观充血，肠腔内大便多为不成形稀便，饮用d s s 溶 液的大鼠大肠肠壁不同程度变薄，大肠长度不同程度缩短，各组大鼠大肠缩短程 度由重到轻依次为n s 组、模型组、热灭活v s l # 3 组、v s l # 3 组、美沙拉嗪组、联 合治疗组。热灭活v s l # 3 组、v s l # 3 组、美沙拉嗪组之间无显著性差异，联合治 疗组疗效最佳，与单药治疗组比较有显著性差异。d a i 评分：在给予治疗药物干 预的七天期间，第一天至第四天各组的d a i 评分均缓慢降低，各组之间的评分均 无显著性差异。自第五天起，各组之间的d a i 评分逐渐出现显著性差异。第七天 时d a i 评分由高到低依次为模型组、n s 组、v s l # 3 组、灭活v s l # 3 组、美沙拉嗪 组、联合治疗组。v s l # 3 组、灭活v s l # 3 组、美沙拉嗪组评分明显低于模型组， 但三种药物治疗组之间的d a i 评分并无显著性差异，联合治疗组d a i 评分最低，明 显低于单药治疗组，有显著性差异。 大鼠组织学损伤评分：组织学损伤评分由高到低依次为n s 组、模型组、v s l # 3 组、美沙拉嗪组、灭活v s l # 3 组、联合治疗组、正常组。联合治疗组大肠组织学 3 损伤最轻，疗效优于单药治疗，有显著性差异。 应用r e a l t i m ep c r 及w e s t e mb l o t t i n g 两种方法检f l t j l l 2 3 、i l 6 、t g f1 3 三种细 胞因子，m r n a 水平与蛋白质水平均为模型组表达量最高，n s 组表达量次之，但 两者之间无显著性差异。美沙拉嗪组较模型组有明显降低，v s l # 3 组与热灭活 v s l # 3 组三种细胞因子的表达量与美沙拉嗪组比较均无显著性差异。联合治疗组 的表达量明显低于单药治疗组。、 细胞分化相关的信号因子：s t a t 3 与p s t a t 3 以上两项指标的m r n a 水平、蛋白质水平及免疫组化i o d 显示：模型组表达量 最高，n s 组表达量次之，但两者之间无显著性差异。美沙拉嗪组较模型组有明显 降低，v s l # 3 组、热灭活v s l # 3 治疗组s t a t 3 与p s t a t 3 的表达量与美沙拉嗪组比 较均无显著性差异，联合治疗组的表达量最低，显著低于单药治疗组。 益生菌对大鼠慢性实验性结肠炎疗效：结果示在造模过程中各组大鼠一般状态 逐渐变差。造模成功后予以干预治疗一周，联合治疗组大鼠一般状态好于单药治 疗组，但仍不及正常组大鼠。 大鼠慢性结肠炎造模成功后，予以药物治疗的七天内，结果示：正常组大鼠在 实验过程中体重逐渐增加，其余各组大鼠体重均呈现逐渐下降的趋势，体重下降 程度由轻到重依次为联合治疗组、益生菌组、美沙拉嗪组、热灭活益生菌组、模 型组、n s 组。联合治疗组体重下降最少，与单药治疗组比较有显著性差异。 大鼠大肠外观及长度变化比较：正常组大鼠结肠颜色呈淡红色，肠腔内粪便成 形，模型组及n s 组大鼠结肠外观充血，肠腔内大便多为不成形稀便，饮用d s s 溶液的大鼠肠壁不同程度变薄，大肠长度不同程度缩短，各组大鼠大肠缩短程度 由重到轻依次为n s 组、模型组、灭活v s l # 3 组与v s l # 3 组、美沙拉嗪组、联合 治疗组。灭活v s l # 3 组、v s l # 3 组、美沙拉嗪组对大鼠大肠缩短有明显的改善， 各组之间无明显差异，联合治疗组大肠缩短最少，与单药治疗组比较有显著性差 异。 d a i 评分t 第一天至第四天各组的d a i 评分均缓慢降低，但各组之间的评分均 无显著性差异。自第五天起，各组之间的d a i 评分逐渐出现显著性差异。第七天 时d a i 评分由高到低依次为模型组、n s 组、v s l # 3 组、灭活v s l # 3 组、美沙拉嗪 4 组比较有显著性差异。 细胞因子：i l - 2 3 、i l 6 、t g fb 。 应用r e a l t i m ep c r 及w e s t e r n b l o t t i n g 两种方法检测的以上三种细胞因子， m r n a 水平与蛋白质水平均为模型组表达量最高，n s 组表达量次之，但两者之间 无显著性差异。美沙拉嗪组较模型组有明显降低，v s l # 3 组、热灭活v s l # 3 治疗 组三种细胞因子的表达量与美沙拉嗪组比较均无显著性差异。美沙拉嗪与v s l # 3 联合治疗组的表达量明显低于单药治疗组。 细胞分化相关的信号因子：s t a t 3 与p s t a t 3 以上两项指标的m r n a 水平、蛋白质水平及免疫组化i o d 显示：模型组表达量 最高，n s 组表达量次之，但两者之间无显著性差异。美沙拉嗪治疗组较模型组表 达量有明显降低，v s l # 3 组、热灭活v s l # 3 治疗组s t a t 3 、p s t a t 3 的表达量与美 沙拉嗪组比较均无显著性差异，美沙拉嗪与v s l # 3 联合治疗组的表达量最低，显 著低于单药治疗组。 。 1 3 项随机对照试验符合入选标准，7 项研究评价了缓解率，8 项研究评价了复发 率，2 项研究同时评价了缓解率和复发率。溃疡性结肠炎总体缓解率r r 为1 3 5 ，9 5 c i ：【o 9 8 ，1 8 5 】；益生菌治疗组与安慰剂组相比溃疡性结肠炎缓解率r r 为2 0 0 ( 9 5 c i = i 3 5 2 9 6 ) ；疗程为1 2 个月以下组中，益生菌治疗组与非益生菌治疗组相比溃 疡性结肠炎缓解率r r 为1 3 6 ( 9 5 c i - - - 1 0 7 1 7 3 ) ；溃疡性结肠炎总体复发率r r 为 0 6 9 ，9 5 c i - o 4 7 1 0 1 ：轻中度组益生菌治疗与非益生菌治疗相比复发率r r 为0 3 1 ( 9 5 c i = 0 1 4 - 0 6 1 ) ；益生菌治疗组与安慰剂组相比复发率r r 为0 2 5 ( 9 5 c i = o 1 2 0 5 1 ) ；双岐杆菌治疗组与非益生菌治疗组相比复发率r r 为0 2 5 ( 9 5 5 结论 验性结肠炎模型，d s s 造模方法死亡率低， 选择d s s 诱导的急性实验性结肠炎动物模 益生菌合剂v s l # 3 与热灭活v s i a 3 对急、慢性实验性结肠炎有一定的疗效， 其治疗作用与传统治疗药物美沙拉嗪相当，三者之间无显著性差异，益生菌v s l # 3 与美沙拉嗪联合治疗急性实验性结肠炎的疗效最佳。益生菌合剂v s l # 3 组、热灭 活v s l # 3 组、美沙拉嗪组、v s l # 3 与美沙拉嗪联合治疗组s t a t 信号转导系统的 细胞因子( i l 2 3 、i l 6 、t g f p ) 与细胞分化相关的信号因子( s t a t 3 、p s t a t 3 ) 表达量明显下降，与大鼠结肠炎缓解程度相符，v s i a 3 与美沙拉嗪联合治疗组表 达量最低。 益生菌的使用在溃疡性结肠炎诱导缓解过程中优于安慰剂组，疗程为1 2 个月 以下亚组中，益生菌治疗组缓解率明显高于非益生菌治疗组。在维持治疗过程中 益生菌治疗组明显优于非益生菌治疗组；在轻中度亚组、安慰剂亚组及双岐杆菌 亚组中益生菌维持治疗效果显著优于非益生菌治疗组。 关键词 实验性结肠炎；益生菌；v s l # 3 ；美莎拉嗪；治疗 6 e f f i c a c ya n d m e c h a n i s mo fa c t i o no f b a c t e r i av s l 躬o nt h em o d e lo f e x p e r i m e n t a lc o l i t i so f r a t s i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e ( i b d ) ，i n c l u d i n gu l c e r a t i v ec o l i t i s ( u c ) a n dc r o h n s d i s e a s e ( c d ) ，i sac h r o n i cn o n - s p e c i f i ci n f l a m m a t o r yd i s o r d e rw i t hu n k n o w l le t i o l o g y t h ed i s e a s ei sq u i t ec o m m o ni nw e s t e r nc o u n t r i e s i nr e c e n ty e a r s ，t h e r ei sa nu p w a r d t r e n di i lt h en u m b e ro fp a t i e n t 诵mi b di no u rc o u n t r y , m a i n l yi n c r e a s es h a r p l yo l l p a t i e n tw i t hu c l e s i o no fu cm a i n l yi n v o l v e st h em u c o s aa n ds u b m u c o s ao fl a r g e i n t e s t i n et h a tr e c t u mo r i g i n a l l ym o r e ，r e t r o g r e s s i v ed e v d o p m e n ta n dc o n t i n u o u s d i s t r i b u t i o n t h em a i ns y m p t o m sa lea b d o m i n a lp a i n , d i a r r h e aa n dm u c o p u r u l e n t b l o o d ys t 0 0 1 t h i sd i s e a s eo f t e nh a sal o n gc o u r s e ，a n di se a s yt or e p e a t e da t t a c kt h a t s e r i o u s l ya f f e c t st h el i f eq u a l i t yo fp a t i e n t s ，w h i c hh a sb e e nc l a s s i f i e d a so n eo f r e f r a c t o r yd i s e a s e sb yw o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ( w h o ) t h e r e f o r e ，c l a r i f y i n gt h e e t i o l o g ya n dp a t h o g e n e s i so ft h ed i s e a s e ，a n ds e a r c h i n gf o rt h ee f f e c t i v et h e r a p yh a s b e e no n eo ft h er e s e a r c hh o t s p o ti nr e c e n ty e a r s a n i m a lm o d e lh a sa l li m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rs t u d y i n gi t se t i o l o g y , p a t h o g e n e s i s ， t h e r a p ym e t h o d ，r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn e wd r u g c h o o s i n gt h er i g h ta n i m a l m o d e lf o rr e s e a r c hp u r p o s e si se s s e n t i a l t h i ss t u d ym a i n l yd i s c u s st h em o d e le f f e c to f s e v e r a lc h e m i c a ld r u g - i n d u c e dm o d e l s ，i n c l u d i n gd e x t r a ns u l p h a t es o d i u m ( d s s ) ，2 ，4 ， 6 - t r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d ( t n b s ) ，o x a z o l o n e ( o x z ) e t c t h i ss t u d ya i m e dt o c o m p a r et h ec o m m o nm e t h o d so fc h e m i c a l l yi n d u c e dc o l i t i s b e s tm o d e lm e t h o df o r t h es t u d yo i lp a t h o g e n e s i sa n dt r e a t m e n tc o n t i n u a l l yw i l lb ec h o s e n 7 o b j e c t i v e l i f t so fr a t sw i l lb ee s t a b l i s h e db ye x o g e n o u sc h e m i c a l e lm e t h o df o rt h es t u d yo np a t h o g e n e s i sa n dt r e a t m e n t m p a r ct h ee f f i c a c yo fp r o b i o t i cv s l # 3a n dt r a d i t i o n a l m e d i c i n em e s a l a z i n eo na c u t ea n dc h r o n i ce x p e r i m e n t a lc o l i t i so fr a t s e x p r e s s i o no f c y t o k i n e so l 6 ，i l 一2 3 ，t g f - p ，s t a t 3 ，p s t a t 3 ) a n ds i g n a l i n gf a c t o r st h a tc l o s e l y r e l a t e dt ou cw i l lb ed e t e c t e d t h em e c h a n i s mo fp r o b i o t i cv s l # 3f o rt r e a t m e n tw i l l b es t u d i e d a n di t se f f i c a c yo ne x p e r i m e n t a lc o l i t i sw i l lb ee v a l u a t e d t oe v a l u a t et h e i n d u c t i o no f r e m i s s i o na n dm a i n t e n a n c ee f f e c t so fp r o b i o t i c sf o ru l c e r a t i v ec o l i t i s m e t h o d s 3 2s dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d s s g r o u p ( b ) ，t n b sg r o u p ( c ) a n d o x a z o l o n eg r o u p ( d ) ；8r a t si ne a c hg r o u p d u r i n gt h e e x p e r i m e n t ，g e n e r a lc o n d i t i o n so fd a i l yd i e ta n da c t i v i t i e se t c f o rt h er a t sw e r eo b s e r - v e d b o d yw e i g h t so fr a t sw e r em o n i t o r e d t r a i tc h a r a c t e ro ft h er a t s s t o o l w a s o b s e r v e d ，w i t l lo rw i t h o u to c c u l tb l o o d t h es e v e r i t yo fc o l i t i sw a se v a l u a t e db yd i s e a s e a c t i v i t yi n d e x ( d a i ) e x p e r i m e n t a la n i m a l sw e r ea n e s t h e t i z e da n ds a c r i f i c e dt oa s s e s s t h ei n j u r yo fm u c o s al a r g ei n t e s t i n eo ft h er a t si ne a c hg r o u p t h r o u g hp a r tio ft h ee x p e r i m e n t a ls t u d y , t h em o d e l o f d e x t r a ns u l f a t es o d i u mw a s s e l e c t e df o rt h en e x ts t e p 5 6r a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o7g r o u p s ( i n c l u d i n g8s d r a t sf r o mn o r m a lc o n t r o lg r o u p ；8r a t si ne a c hg r o u p ) ：e kg r o u p b a s e do nb o d y s u r f a c ea r e a ，a d m i n i s t r a t i o nd o s a g ew a s0 6 9 ( k g d ) v s l # 3a n d0 4 9 ( k g d ) m e s a l a z i n e o nd a y8 ，t h er a t sw e r eg i v e nt h em e d i c i n e9 0d a y sc o n t i n u o u s l yt h r o u g hs t o m a c h f e e d i n go n c ead a y g r o u p i n gf o re x p e r i m e n t ：eg r o u pa sn o r m a lg r o u p ；fg r o u pa s m o d e lg r o u p ；gg r o u pa sn o r m a ls a l i n eg r o u p ( m o d e l + n s ；0 2 m l lo g ) t h r o u g h s t o m a c hf e e d i n g ；hg r o u p ：m o d e l + 0 4 e g ( k g d ) m e s a l a z i n et h r o u g hs t o m a c hf e e d i n g ；i 8 d e x t r a ns u l f a t es o d i u m 5 6r a t sw e r er a n d o m l yd i y i d e di n t o7g r o u p s ( i n c l u d i n g8s d r a t sf r o mn o r m a lc o n t r o lg r o u p ；8r a t si ne a c hg r o u p ) ：l rg r o u p i n t e r v e n t i o nm e t h o d s w e r et h es a m ea se - k g r o u pr e s p e c t i v e l y o b s e r v e di n d e x e d ，c o l l e c t i o na n dp r o c e s s i n g o fs p e c i m e n s a n di n d e x e st e s t e dd u r i n gt h ee x p e r i m e n t 、) i r e 他t h es a m e 弱p a r ti i n f o r m a t i o nw a sr e t r i e v e df r o mm e d l i n e ，e m b a s e ，a n dt h ec o c h r a n e c o n t r o l l e dt r i a l sr e g i s t e r t h ei n d u c t i o no fr e m i s s i o na n dp r o m o t i o no fm a i n t e n a n c e w e r ec o m p a r e db e t w e e np r o b i o t i e st r e a t m e n ta n dn o n - p r o b i o t i c st r e a t m e n ti nu l c e r a t i v e c o l i t i s r e s u l t s 1 1 l er a t si nb ，ca n ddg r o u ps u c c e s s i v e l ya p p e a r e dv a r y i n gd e g r e e so fl a c ko f g l o s s yh a i rc o l o r , a c t i v em i n da n dr a p i dr e a c t i o n ，r e d u c e df o o di n t a k e ，l a z yt om o v e ， a r c h i n go fb a c k ，s t r i n g i n gp h e n o m e n o n ，d i a r r h e a ，m u c o b sb l o o d ys t o o l ，l o s so fw e i g h t a n do t h e rs y m p t o m s t h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc h a n g eo nd a is c o r e so ft h er a t si na g r o u p t h e r ew a sap r o g r e s s i v e l yi n c r e a s e do i ld a is c o r e so ft h er a t si nb ，ca n dd g r o u p ，a n dt h em o r er a p i d l yo fd a is c o r e so nd a y5 ，6a n d7 o nd a y7 ，t h eo r d e ro f s c o r e sf r o mh i g ht ol o ww a sd ，c ，b ，a n da g r o u p t h e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e nb ，c ，dg r o u pa n da g r o u p t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nc a n ddg r o u p t h e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nba n dc ，dg r o u p h i s t o l o g y i n j u r yo ft h er a t si nb ca n ddg r o u pa l lw e r em o r eo b v i o u s t h es e v e r i t yo fh i s t o l o g y i n j u r yf r o ms e v e r et om i l dw a sc ，da n dbg r o u p t h e r ew a s as i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 9 r a t sa p p e a r e dm u c o p u r u l e n tb l o o d ys t o o la n db l o o ds t 0 0 1 t h er a t si nn o r m a lg r o u ph a d n oa b n o r m a lp e r f o r m a n c e g e n e r a ls t a t eo ft h er e m a i n i n gr a t si ns i n g l e - 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a g e n tt r e a t m e n tg r o u p ，w h i c hh a das i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s c o r eo fh i s t o l o g yi n j u r y ：t h es e q u e n c eo fs c o r eo fh i s t o l o