（作物遗传育种专业论文）基因枪介导bt基因转化能源甘蔗的研究.pdf

摘要 甘蔗( s a c c h a r u mo f f i c e n a r u m 三。) 以高生物产量、高乙醇产率和低生产成本的优 势，入选能源植物，特别是新台糖2 2 号，含糖量高、分孽快、抗逆性强、适应性广， 成为能源甘蔗的首选。而甘蔗虫害造成甘蔗大量减产，用传统的耕作措施和化学药剂 等方法还没能有效地起到防治的作用，因此，培育抗性品种成为防治甘蔗虫害最经济、 安全和有效的根本方法。但是，甘蔗是一种具有高度杂合性的异源多倍体或非整倍体 的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，育种群体分离十分广泛，这使得通过常规的 育种手段很难将各种优良的目标性状整合为一体。 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b d 杀虫晶体蛋白基因，应用于抗虫植物 基因工程的研究日臻成熟，而基因枪介导法又为那些对农杆菌侵染不敏感的单子叶植 物提供了一个有效的转化手段。 本研究采用基因枪转化法，首先选择适龄期新台糖2 2 号的胚性愈伤组织作为转化 受体；轰击前经过预培养和高渗培养，在优化的真空度、轰击压力、轰击距离下进行 遗传转化；然后将携带b t 基因的质粒p b a r - b t 转入愈伤组织，轰击后的愈伤组织在高 渗培养基上继续培养一段时间后，转入恢复培养基进行恢复培养，接着进行继代、分 化、生根阶段的筛选培养，最后利用p c r 、r t - - p c r 和e l i s a 方法进行分子检测，获得 抗性转基因甘蔗植株。 主要研究结果如下： 1 ) 对新台糖2 2 号的再生体系进行了优化。采用正交设计法，研究了激素6 b a ， n a a ，k t 和活性炭这四种因素的不同浓度和不同组合对甘蔗愈伤组织分化的影响，试 验研究结果表明，对新台糖2 2 号的愈伤组织分化效果最佳的培养基为a 1 8 3 c 3 d 3 ，即 m s + i 5m g l6 - b a + 2 m g lk t + o 2 5 m g ln a a + 1 0 9 l 活性炭+ 3 0g l 蔗糖+ s g l 琼脂 粉。 2 ) 建立了新台糖2 2 号的筛选体系。p h o s p h i o t h r i c i n ( p p t ) 对甘蔗愈伤组织的生 长、分化、分化苗的继代、生根和生长阶段的抗性筛选质量浓度分别为1 5m g l 、1 m g l 、o 7 5m g l 、0 5m g l 、3 0m g l 。 3 ) 受基因枪轰击的愈伤组织，在含有p p t 的培养基上进行筛选，从轰击的三批 共约5 0 0 个愈伤组织块中，第一批共分化出1 0 0 株抗性转化幼苗，其中p c r 检测呈双阳 性的植株有3 9 株，最后经r t - p c r 和e l i s a 检测后，共得到5 株高表达的新台糖2 2 号甘蔗 植株。 关键词：基因枪；b t 基因；能源甘蔗 a b s t r a c t w i t hh i 曲b i o l o g i c a lp r o d u c t i v i t y , h i g he t h a n o ly i e l da n dl o wp r o d u c t i o n c o s t ， s u g a r c a n e ( s a c c h a r u mo f f i c e n a r u ml ) b e c o m e st h ef i r s t c h o i c ef o re n e r g yc r o p s t h e h 锄f u li n s e c t sc a u s eh e a v yy i e l da n ds u g a rl o s tt os u g a r c a n e p r e s e n t l y , m e a s u r e so f t r a d i t i o n a lf 锄：1 1 i n gp r a c t i c ea n dc h e m i c a lc o n t r o la r en o te f f i c i e n te n o u g ht oc o n t r o lt h e i n s e c t s p l a n tb r e e d i n gh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l e i nr e s i s t a n c et oi n s e c t sb yo f f e r i n g v a r i e t i e s 、析mm o r ei n s e c t sr e s i s t a n c e ，h i g h e ry i e l da n db e t t e rq u a l i t y h o w e v e r , s u g a r c a n e i sav e g e t a t i v ep r o p a g a t i o nc r o p ，w h i c h h a sh i g h l yh e t e r o z y g o u sa l l o p o l y p l o i do r 舡l e u p l o i d y c h r o m o s o m e s i t sg e n e t i cb a c k g r o u n d i sv e r yc o m p l e x m o r e o v e r , t h e p o p u l a t i o no fr e s i s t a n c eb r e e d i n g i s s e p a r a t e dv e r ye x t e n s i v e l y i ti sv e r yd i f f i c u l tt o a g g r e g a t et a r g e tc h a r a c t e r st o g e t h e r b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s , b oi n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i ng e n e s ， w h i c ha r eu s e di nt h es t u d yo fg e n e t i ce n g i n e e r i n g i sg e t t i n gm o r em a t u r e m i c r o p r o j e c t i l e b o m b a r d m e n t 位m s f o n n a t i o nw a sw i d e l yu s e di np l a n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，e s p e c i a l l y f o r l o s ea r en o ts e n s k i v et oa g r o b a c t e r i u mi n f e c t i o nm o n o c o t y l e d o n s ，w h i c hp r o v i d e sa n e f f e c t i v ew a yf o rt h es t u d yo ns u g a r c a n et r a n s f o r m a t i o n m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n tt r a n s f o r m a t i o nw a s u s e di nt h i ss t u d y e m b r y o g e n i c c a l l u so fr o c 2 2w a sc h o s e na s t h et r a n s f o r m a t i o n a lr e c e p t ，o r a f t e rp r e 。c u l t u r e a n d h y p e r t o l l i cc u l t u r e ，c a l l u sw a st r a n s f o r m e dw i t hp b a r - b tc o n t a i n i n g b tu n d e rt h e o p t m z a t i o no fv a c u u m ，b o m b a r d m e n tp r e s s u r ea n d b o m b a r d m e n td i s t a n c e c a l l ic u l t u r e d i nt h eh y p e r t o n i cm e d i u mf o rap e r i o dw a s t r a n s f e r r e do n t ot h er e c o v e r yc u l t u r em e a l i u m m o l e c u l a rm e 廿1 0 d s 。s u c ha sp c rr t - p c ra n de l i s aw e r eu s e dt od e t e c tt h es u g a r c a n e p l a i l t st i l a th a dt r a n s f o 咖e da n ds u f f e r e df r o mg e n e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o na sw e l l a sr o o t i n g c u l t u r ei nt h ep p ts c r e e n i n gs y s t e m s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec a l l l l sd i f f e r e n t i a t i o ns y s t e m sf o rr o c 2 2w e r ee s t a b l i s h e d t h e e f f e c t so f d i 虢r e n tc o n c e m a t i o n sa n dc o m b i n a t i o n so f6 - b a ，k t , n a aa n dc a r b o np o w d e ro n d i 虢r e n t i a t i o no ft h er o c 2 2c a l l u sh a db e e ns t u d i e db ye x p e r i m e n to fo r t h o g o n a ld e s i g n i nt h i sp a p e r , a n dt h eo p t i m u mc u l t u r em e d i aw e r es e l e c t e d t h er c s u i t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc u l t u r em e d i a w e r em s + i 5m g r l6 - b a + 2 m g l k t + 0 2 5 m g ln a a + i o g lc a r b o np o w d e rr e s p e c t i v e l y 2 t h es c r e e n i n gs y s t e m sf o rs u g a r c a n ec a l l u sw i t hp p t w e r ee s t a b l i s h e d t h er e s u l t s s h o w e dt l l a tt h em 瓶m a li n h i b i t o r ys c r e e n i n gc o n c e n t r a t i o n so fp p t i nt h es t a g e so fc a l l u s ， d i 仃e r e n t i a t i o n ，g e n e r a t i o n ，r o o t - - i n f o r m a t i o na n dg r o w t ho fs u g a r c a n ew e r e 1 5m g _ ，l ，1 i i m g l ，0 7 5m e g l ，0 5m e g l ，3 0m g lr e s p e c t i v e l y 3 o n eh u n d r e dr e s i s t a n c es e e d l i n g sw e r eo b t a i n e d ，o fw h i c ht h i r t y n i n el i n e sw e r e d o u b l ep c r p o s i t i v ea n df i v ew e r ep r o v e dt r a n s g e n i cs u g a r c a n ep l a n tb yr t - p c ra n d e l i s a k e yw o r d s ：m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ；b tg e n e ；e n e r g ys u g a r c a n e i i i 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所声交的沦丈足本人台j 导师的指导下独、 ：进行研究所取得 的研究成果。除了义中特别加以标汁引i t j 的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成粜作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方i = 标i ! j j 。本人完伞意谚! 到奉声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：商牡妻2 0 口7 年多月乃日 学位论文版权使用授权书 本学位论义作肯完伞了解学校仃天保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家f 丁关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋人学；叮以将本学1 t 论文的令部或部分内容编入有关数 据库进行榆索 l i ，以采川影印、缩印或 1 描等复制丁段保存和7 l ：编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、彳i 保密团。 ( 诟弩矗：以+ ：车 f 避方框内打“”) 作者签粥：武9 i 生莲奠 导师签躬 占月工多曰 6 月码 1 臼朋：i 7，口， p o n u n u ，、| 2 广东海洋大学硕士学位论文 一日i j 吾 1 能源甘蔗研究 1 1 能源植物研究 所谓“能源植物 ，是指那些可以直接用于生产工业用“燃料油”，或经发酵加 工可生产“燃料油”的植物的总称。 随着能源消耗量的不断增加，有限化石能源，如石油、天然气等日趋紧缺，价格 也日渐昂贵，再加上石油、煤炭和天然气等化石能源的不可再生性和环境恶化效应， 迫使人类不得不重新审视和调整化石能源发展战略。于是可再生的生物能源成为人类 2 l 世纪能源研究发展的热点。目前，世界各国都对利用秸秆、粮食、垃圾等生物质 能发电技术加强了研究开发力度。其中，以大豆、油茶籽、油粽、黄连木等“能源植 物 为原料的生物柴油技术也将出现研究高潮，这将减少人类对石油的强烈依赖。 现代工业的迅速发展导致的能源紧缺现状和环境污染问题，使得燃料乙醇作为 替代石油能源的绿色可再生能源日益受到人们的青睐。燃料乙醇是可再生能源，属于 “绿色汽油”，作为一种清洁能源，其抗爆性能好，用作车用燃料时燃烧更完全，减少 尾气排放量，降低对环境的污染【l 】。 甘蔗是热带和亚热带地区广泛种植的糖料作物，如我国的广东、广西、云南和海 南等省都大规模地种植甘蔗。广东的土地和气候资源十分适宜发展甘蔗生产。粤西和 粤北有大量的边际性土地( 滩涂地、旱坡地) 可用于发展甘蔗生产。现有制糖企业通 过糖能联产，可实现既产食糖又产燃料乙醇，形成新的经济生长点。甘蔗被认为是 中国发展生物能源最有潜力的作物，利用甘蔗生产燃料乙醇具有良好的发展前景【2 】。 1 2 甘蔗作为能源作物的优势分析 甘蔗是禾本科( g r a m i n e a e ) 甘蔗属( s a c c h a r u m ) 植物。生产上所使用的甘蔗 品种，多数是以热带种( s o f f i c e n a r u m ) 、割手密( s s p o n t a n n e u m ) 、印度种( s b a r b e r i ) 、 大茎野生种( s r o b u s t u m ) 和中国种( s s i n e n s e ) 5 个种杂交选育而来。甘蔗作为糖 料作物的产糖作用早已为人类所利用，但事实上，就甘蔗自身而言，其最为突出的 生物学特性是具有最大地把太阳能转变为化学能的能力，是光合效率很高的c 4 作 物，也是人类迄今所栽培的生物量最高的大田作物。因此，甘蔗除制糖外，还可以 基因枪介导b t 基因转化能源甘蔗的研究 作为能源作物加以利用。与其他作物相比，甘蔗具有作为能源作物的优势。 1 2 1 生物产量高 甘蔗是c 4 植物，其光饱和点高、c 0 2 补偿点低( c 0 2 浓度在5 0 x1 0 。6 时便能 进行光合作用) ，所以光合效率高( c 0 2 同化率达4 1 5 0m g ( d m 2 h ) ，比麦、稻 等c 3 植物大l 倍多) ，是太阳能利用率最高的经济作物之一，可谓化学能源的有效 贮存器。甘蔗的高光效特性决定了其高生物产量，其理论最高产量可达4 4 8 5 3 8t h m 2 ，而在实际生产中，最高产量的记录有：1 9 6 7 年美国夏威夷及澳大利亚的报道 为每年产蔗2 5 0 5t h m 2 【3 】；1 9 7 4 年在中国广东高产试验田上获得了3 2 2 3t h m 2 的产量；1 9 7 5 年海南岛现场验收6 块蔗地平均产量达3 6 6t h m 2 4 1 。 1 2 2 酒精产率高 甘蔗生物学产量高的特性决定了其单位面积上的酒精产量也高。印度国家糖业 管理联合会主席曼奴夏劳( p j m a n o h a nr a o ，1 9 9 7 ) 比较了一些作物用发酵法生 产酒精的产率，结果研究表明，甘蔗每吨原料的酒精产率并不高( 7 0k g t ) ，但其 单位面积上的酒精产量却仅次于木薯，达到4 9 0 0k g h m 2 t 5 1 。各种作物的产量虽然 与中国的未必相同，特别是南、北方与中部地域地理条件不同产量亦有差异，但甘 蔗产生的能源总量属于前茅则是肯定的 6 1 。 1 2 3 生产成本低 原料成本是燃料酒精生产成本构成的主要因素。在生物产量较高的甘蔗、玉米、 木薯等几种作物中，每吨酒精的生产成本分别为：能源甘蔗28 3 7 3 元、玉米50 3 8 5 元、木薯42 5 9 元 7 1 。可见，用能源甘蔗生产燃料酒精的成本远比用玉米和木薯的 低。但是，用甘蔗生产蔗糖和生产酒精相比，以巴西为例，1t 甘蔗( 蔗糖分1 4 ) 可生产9 6 。的酒精9 0l ，即1 3 6t 甘蔗产lt 酒精；而通常情况下，8t 甘蔗可生 产1t 蔗糖，即生产lt 酒精的甘蔗原料可生产1 7t 蔗糖，两者相比较，生产酒精 的成本较高，约为蔗糖的1 5 倍【8 1 。这也就是目前糖厂不愿意用甘蔗直接生产燃料 酒精的原因所在。 甘蔗品种新台糖2 2 号的单糖含量较高，乙醇发酵率远远高于蔗糖含量较高的 2 广东海洋大学硕士学位论文 生糖甘蔗，自1 9 9 7 年引种以来，以含糖量高、分孽快、抗逆性强、适应性广等优 点，成为能源甘蔗的首选。 1 3 甘蔗虫害和抗虫育种 1 3 1 甘蔗虫害 甘蔗是最重要的糖料作物，其产糖量约占世界糖产量的6 5 ，在我国则占到 8 5 以上，同时甘蔗也是生产糖醛、葡聚糖和绿色能源乙醇的原料此外，蔗糖生 产过程所产生的工业和农业副产物也被大量应用于造纸、燃料和动物营养等因此。 甘蔗的栽培、生理、遗传育种等方面的研究一直倍受关注。 甘蔗生长周期长，虫害常常给甘蔗生产造成重大损失。广东乃至华南蔗区甘蔗 螟虫危害造成的损失十分严重。甘蔗苗期受蔗螟为害，产量损失一般达2 7 - - 3 0 ， 伸长期受害产量损失达1 0 2 0 。蔗螟危害造成蔗糖分的损失也是巨大的。据台湾 糖业研究所报道，苗期螟害枯心率为3 3 4 、成熟期螟蛀节率为5 2 5 ，可使每公 顷甘蔗损失1 7 4 公斤的蔗糖。据广东省有关部门统计，全省因受螟害而损失的蔗糖 每年达5 0 0 0 0 吨以上，经济损失达1 9 亿元。蚜虫、飞虱、地老虎、蓟马等是甘蔗 生产上十分严重的虫害。化学防治成本高，污染环境，易造成人畜中毒，因而害虫 的无公害治理已成为当务之急。 在提高甘蔗抗虫性育种上，由于没有对螟虫高抗或免疫的优良亲本材料，同时 甘蔗无性繁殖、高度多倍体以及高度杂合遗传状态的特性，使得通过常规杂交育种 方法进行甘蔗遗传改良的预测性有较大的困难，而且甘蔗的遗传背景复杂，对抗性 遗传规律了解不多，很难在后代鉴定和筛选出抗虫品系。采用目前的常规育种技术 很难取得突破。同时，甘蔗常规育种方法所需周期比较长、遗传背景复杂、开花难， 有益性状的识别和筛选比较困难，不能采用回交等技术强化某个目标性状，在育种 后期还可能会出现某些性状的缺陷而难以在栽培上应用，要育成一个高产优质、抗 虫性好的品种十分困难。甘蔗品种的抗虫性不强已成为限制甘蔗生产进一步发展的 重要因素之一。 1 3 2 甘蔗抗虫育种 基因工程的出现为解决甘蔗育种问题提供了一个全新的途径。转基因技术可以 3 基因枪介导b t 基因转化能源甘蔗的研究 克服常规育种的局限，避免有性过程的任何杂交障碍，使基因能在生物间自由交流， 促使突破性育种进展的取得，传统的育种技术和现代生物技术方法的结合已越来越 广泛地应用于提高产量和改良品种，使品种更具有对疾病和病原体的抗性。转基因 技术可以迅速改良甘蔗品种的抗虫性状，通过导入抗虫基因能大大提高甘蔗品种的 抗虫性，从而减少产量和品质损失。转基因技术为甘蔗抗虫育种提供新的技术手段。 转基因甘蔗品种的研制及其产业化应用有其独特的优势。甘蔗为无性繁殖作物， 组织培养技术成熟，基因转导相对容易，转基因性状容易稳定遗传。甘蔗不易开花， 转基因品种有较高的生态安全性。甘蔗不直接供人食用，糖用甘蔗只作为提炼白糖 的原料，白糖中几乎不存在转基因产物，食品安全性高；能源用甘蔗用于生产燃料 乙醇，不存在食品安全问题。 甘蔗是无性繁殖的作物，其组织培养技术和离体再生系统已经很成熟，因而非 常适合于采用基因工程技术来获得转基因植株转基因甘蔗将可能为甘蔗育种和蔗 糖生产带来一场新的革命。 2 甘蔗基因工程和b t 基因工程 2 1 甘蔗基因工程研究 2 1 1 改善品质基因工程 提高甘蔗的糖分是糖料甘蔗育种的主要目标之一，到目前为止，还没有提高糖分 含量的基因工程甘蔗。 拥有器官或组织细胞专一性表达的启动子，在适当的环境和特定的发育时期表 达，是进行有效代谢操作所必需的。高等植物中编码r u b i s c o 的大小亚基的基因已被 克隆，但小亚基的表达似乎在转录水平上决定t r u b i s c o 全酶的含量，而且小亚基是由 核基因组编码，用基因工程方法对其进行改造相对容易。最近用已克隆测序了的甘蔗 小亚基r u b i s c o ( r b c s ) 启动子与报告基因相连导入甘蔗后，该启动子使外源基因在叶片 中专一性表达，并优先在维管束鞘细胞中表达。采用水稻r b c s d 、亚基启动子对甘蔗进 行转化，在转基因甘蔗上也观察到相同的表达模式。 在进一步明确对甘蔗糖分积累及代谢起关键作用的酶后，构建其反义或正义基 因，再通过遗传转化培育出具有反义或正义的基因工程甘蔗，有可能提高其含糖量， 最终实现对甘蔗品质的改良。 4 广东海洋大学硕士学位论文 另外，开展甘蔗糖代谢途径的研究，克隆出与甘蔗还原糖转化相关的基因导入甘 蔗，促进甘蔗体内还原糖提早转化，使糖厂提前开榨，这在生产上也有重要意义。 2 1 2 抗除草剂基因工程 甘蔗的除草是一项费时而艰辛的工作，如果能将抗除草剂基因导入甘蔗细胞就 可用除草剂对蔗田进行除草，从而大大节省劳动强度和生产成本。但甘蔗基因组中 缺乏除草剂抗性的特征，限制了抗除草剂基因工程在甘蔗上的应用。 但是，近几年在这一领域也取得了一些可喜的成果。1 9 9 2 年c h o w d h u r y 等用 来源于甘蔗心叶的悬浮细胞和原生质体穿孔后进行基因枪微弹轰击，将金粉与 p b a r g u s 质粒的g u s 和b a r 基因导入到两种系统受体中，均获得了转基因无性系， s o u t h e r n 杂交证实了转基因是真实的，对除草剂b 绷呈阳性抗性【9 】。抗除草剂的转 基因植物将给农业生产，特别是大面积的机械化生产带来很大的方便。 2 1 3 抗虫害基因工程 甘蔗的生长期长，其一生会受到鳞翅目、同翅目等多种害虫的危害，对甘蔗的品 质和产量都造成严重的影响。由于尚未找到适合甘蔗的抗虫资源，而与甘蔗赤腐病、 风梨病等有关的抗性基因尚未克隆出来等等。都限制了甘蔗抗病虫基因工程的进展。 目前世界各国都投入大量资金和人力进行抗病虫基因的研究，也取得了一些进 展。n u t t 等报道通过将马铃薯限制性蛋白酶i i 基因转入到甘蔗中，获得了转基因甘蔗 无性系g 8 7 和u p 8 7 ，表现对蛴螬抗性【l o l 。采用从病毒本身来源的基因的抗病毒策略已 在多种植物上得以证实，在甘蔗上也有成功的例子。j o y c e 等用基因枪法，将s c m v - c p 基因转入甘蔗胚性愈伤组织，得到了转基因植株【1 1 】。 a r e n c i b i a 分别用农杆菌法【1 2 】和电激法【1 3 l 均获得了转b t 基因植株。目前用于抗病 毒的基因包括病毒外壳蛋白基因、病毒基因组织反义序列、卫星r n a 和病毒复制酶 等，其中比较成功的是将外壳蛋白基因导入植物，而抗虫基因包括b t 基因和胰蛋白酶 抑制剂基因等。 2 2b t 杀虫基因工程的研究 随着抗虫植物基因工程研究的不断深入，尤其是应用苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ，b t ) 杀虫晶体蛋白基因进行的抗虫植物基因工程研究，目前已进入实用 化阶段14 1 。有些转b t 杀虫基因的作物正在进行田间实验，而一些表现稳定的转基因作 5 基冈枪介导b t 基冈转化能源甘蔗的研究 物已经或正在走向市场，随着新的b t 杀虫基因的分离和克隆，b t 杀虫基因转化的植物 种类正在不断扩展。 2 2 1b t 杀虫蛋白转基因植物的研究 1 9 8 1 年s c h n e p f 等成功克隆- y b t 杀虫蛋白基因【l 引，从而揭开了利用基因工程获得 抗虫植物的序幕。19 8 7 年，v a e c k 等人利用农杆菌介导法，首次成功地将完整的c r y l a b 基因和37 端缺失后仅保留57 端编码毒蛋白核心区的不同长度i 拘e r y l a b 导人烟草，生 物测定表明对烟草夜蛾1 龄幼虫有毒杀作用【1 6 1 。之后，人们利用各种转化途径在多种 植物上进行了b t 基因的转化研究。 迄今全世界共获得了近8 0 种转b t 基因植物，已在玉米、棉花等作物上实现了大规 模商业化生产，转b t 基因马铃薯也已有多个品系得到了商业化生产，美国m o n s a n t o 公司先后培育出转c r y i i a ( a ) 基因马铃薯品系b t 6 、b t l 0 、b t l 2 和s b t 0 2 等。在蔬菜 上番茄已获批准进行转b t 基因的商业化生产。1 9 9 8 年3 月，m o n s a n t o 公司转c r yi a ( c ) 基因番茄品系5 3 4 5 通过美国农业部环境保护署评价审定，获准商业化生产【i7 1 。 我国在棉花转b t 基因研究方面进展很快，成绩显著，培育的中棉2 9 和中棉3 8 等多 个抗虫棉品种，已被批准商业化生产，在全国推广种植【1 8 】。目前正在开展转三价抗虫 基因( 所c p 脚m ) 彩色棉的研究，现己得到纯化的株系【1 9 1 。 2 2 2 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的分子结构与杀虫机理 苏云金芽胞杆菌( b t ) 对害虫的毒杀作用源于在生长过程中产生的毒素。目前已 知的b t 毒素有6 内毒素、伐内毒素、p 夕 毒素等。6 内毒素是b t 毒力的主要来源。 将具有溶胞作用的毒素编为c y t ，其余毒素编为c r y ，相应基因编为c y t 和c r y 。 b t 杀虫蛋白是一种碱溶性蛋白，不同种类的b t 杀虫基因所编码的杀虫蛋白的大小 也并不一样，大致有三个区域范围：1 2 9 - - 1 3 8 k d ，6 5 7 8 k d 和2 5 - - 2 8 k d 。但基于c r y 家族在氨基酸序列上具有的同源性，说明b t 杀虫蛋白在进化上具有同源性。典型的b t 杀虫蛋白为1 3 0 k d 左右，由两个部分构成，n 端的活性片段和c 端的结构片段。一般认 为，苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的毒性片段包含3 个不同的结构域。结构域i 位于毒 性片断的n 端，由7 个两亲性g t 螺旋组成，主要参与昆虫中肠上皮细胞形成孔道；结构 域i i 由b 一折叠构成，主要决定毒素的专一性和受体结合的特异性；结构域i i i 位于c 端，也是由p 一折叠构成，主要调节毒素的活性，在不同的毒素中具有不同的功能。3 6 广东海洋大学硕士学位论文 个结构域之间在一定程度上相互作用、相互影响【2 0 埘j 。 b t 杀虫晶体蛋白本身是不具有生物活性的，称为原毒素( p r o t o x i n ) 。原毒素进入 昆虫消化道后，它溶解和毒性激活同时发生，这是因为杀虫蛋白碳端的分子间二硫键 使它不易在昆虫肠道内溶解( p h 偏低) ，只有在蛋白酶的作用下，杀虫蛋白才能完全从 晶体点阵结构中逐步释放出来而被完全溶解，使肠细胞代谢失衡，从而导致昆虫幼虫 死亡【2 2 2 3 】，在这一过程中，毒性多肽的不同结构域起着不同的作用，目前看来这种识 别与结合是一种异常复杂的过程。 蛋白酶对杀虫蛋白的水解并不是一次完成的，而是分步进行的。例如c r y l 杀虫 蛋白约1 3 0 k d ，其毒性肤约7 0 k d 。据研究，其c 端的约6 0 k d 片段是经过蛋白酶的 7 次水解消化作用后被除去的。活化毒性肤的细胞结合区可与昆虫肠道的纹缘膜上 受体( ( b b m v ) 结合。然后毒性区作用于细胞膜，使细胞膜穿孔，破坏细胞的渗透平 衡，并最终引起细胞裂解。穿孔一般是多个分子的协同作用。 2 2 3 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的分类 b t ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 基因来源于苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，由 s c l u l 印f 等人于1 9 8 1 年首次成功克斛 】。苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的伴 胞晶体被称为杀虫晶体蛋白( i c p s ，l n s e c t i c i d a l c r y s t a lp r o t e i n ) 或6 内毒素。目前所发现 的i c p 可毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅日昆虫，是日前世界上应用最为广泛的生物杀虫 剂。据粗略统计，目前己经分离克隆了6 0 多种b t 杀虫基因。将来，还会有新的b t 杀虫 基因不断被分离、鉴定。 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的分类方法很多，根据它们杀虫范围和基因序列 的同源性不同可粗分为六大类1 2 4 - 2 6 1 ) ，每一类中又可分为许多亚类( 见表1 1 ) 。如在 c r y l 基因间，氨基酸同源性在8 2 9 0 的归为c r y i a ，在5 5 一7 1 的归为c r y l b ， c r y l c 与c r y l d 之间彼此各不同，也都不同于c r y l a a 其中，前五类可以称为晶体 蛋白基因家族( c r y s t a lp r o t e i nc o d e no e n e ) ，而第六类被称为细胞外溶解性晶体蛋白 基因( c y t o l y t i cp r o t e i nc o d e ng e n e ) ，来源于b t 以色列亚种，它在基因结构及功能上 与c r y 基因不同，在毒性上，除对双翅目昆虫有毒杀作用外，还对不同的无脊椎动 物和脊椎动物有溶解细胞的毒杀作用，属细胞外毒素【2 6 1 。 7 基因枪介导b t 基因转化能源甘蔗的研究 表卜1 ：目前发现的杀虫蛋白的分类及其特性 t a b l e1 1 l i s to f8 e n d o t o x i na n dt h e i ra c t i v i t i e s 近年来，b t 基因主要有晶体蛋白基因家族( c r y s t a lp r o t e i ng e n e s ，以c r y 表示) 和 细胞外溶解性晶体蛋白基i 因( c y t o l y t i cp r o t e i ng e n e s ，以c y t 表示) 两大类群。近年来， 人们又分离出一类新型杀虫蛋白，命名为v i p s ( v e g e t a t i v ei n s e c t i c i d a lp r o t e i n s ) 2 7 1 。 迄今在植物转基因中利用的b t 基因主要为c 巧类基因。 8 广东海洋大学硕士学位论文 2 3 质粒的启动子和标记基因的研究 2 3 1 启动子的研究 启动子是决定外源基因能否在植物体内表达的关键因子。 由于甘蔗的基因组庞大，从而导致很难从甘蔗中直接发现和分离出调控外源基 因高效表达的启动子为此，人们相继将c a m v3 5 s 启动子、玉米的e m u 启动子、 玉米的u b i 1 启动子、水稻的a c t l 启动子分别与报告基因( g u s 、c a t ) 构建成嵌 合基因，转入甘蔗进行外源基因表达强度的检测，寻找适合于甘蔗细胞内表达的启 动子结果发现e m u 、u b i 1 、a e t l 的表达效率均远远高于广泛用于双子叶的强启 动子c a m v3 5 s ，。其中ub i 1 启动子的效率最耐2 8 j 。这些结果为今后甘蔗遗传转化 中启动子的选择提供了很好的依据。 2 3 2 选择标记基因的研究 植物转化的一个难点是建立一个选择培养体系，只让那些细胞核中已经整合了 外源基因并且表达的少数转化细胞生长起来。对此，一般都是通过导入一个抗生素、 药物和除草剂抗性的基因来实现。因而，选择标记是提高转化体筛选效率的关键 因子。迄今，在甘蔗上采用的选择标记有新霉素磷酸转移酶基因( n p t - i i 基因) 、潮 霉素磷酸转移酶基因( h p t 基因) 、绿色荧光蛋白基因( g f p 基因) 和b a r 基因。 甘蔗对卡那霉素有较高的抗性，且在卡那霉素的选择压力下易产生白化苗，因 而，n p t - i i 基因并非明智的选择。h p t 基因可编码抗潮霉素的产物，甘蔗对其较为 敏感，是一种较好的选择标记。 g f p 基因编码的产物呈绿色，可通过肉眼来判定，用其作为转基因细胞的筛选 标记，特别在农杆菌转化系统中，具有快速、简便筛选的效果【2 9 1 。 b a r 基因编码的产物p a t 可提供对除草剂b a s t a 或膦丝菌素( p h o s p h i o t h r i c i n ， 简称p p t ) 或b i a l a p h o s 的抗性，甘蔗对其敏感，是一种较为理想的选择标记。此 外，它具有抗除草剂的农业用途，且已建立起一种快速的用于筛选p p t 抗性的离体 叶片检测法。 3 遗传转化方法的研究 外源基因的转化的途径主要有两大类，一类是d n a 直接转法：包括基因枪转 化法、聚乙二醇法、显微镜注射法、电激转化法、花粉通道法、脂质体法、离子束 介导法、超声波介导法种子浸泡等等方法。另外一类是介导法：主要包括农杆菌介 导法和病毒介导法。在这些方法中又以农杆菌介导法和基因枪转化法最为常用。 9 基因枪介导b t 基因转化能源甘蔗的研究 置i i i i i i i i i i i i i i i i i f i i i i i i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 葛宣i i i i i i i i i i 3 1 基因枪遗传转化法 基因枪转化技术是由二十世纪9 0 年代末逐渐发展起来的一种基因转化的方法， 它的最大优点是无明显的宿主限制，几乎适用于任何受体材料，另外它只需要简单 的组织培养，不必经过复杂的原生质体的制备和培养阶段，为植物基因转化工作提 供了一种更为简化的手段。对于对农杆菌不敏感的单子叶植物来说，基因枪技术更 为一种理想的转化方法。人们利用该方法已经获得了水稻、小麦、玉米、烟草，甘 蔗等转基因植株。 基因枪转化法( p a r t i c l eg u n ) ，又称微弹轰击法( m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ) ，是 一种可不依赖植物基因型导入外源基因的方法，克服了农杆菌的寄主特异性以及与 组培相关的植株再生的许多困难。基因枪法还被称为粒子轰击技术( p a r t i c l e b o m b a r d m e n t ) 、生物发射技术( b i o l i s t i cp r o c e s s ) 或高速微粒子发射技术( h i g h v e l o c i t ym i c r o p r o j e c t i l e ) 。 基因枪转化法是近年来大量采用的单子叶植物转化的有效途径该方法将 d n a 通过c a 2 + 和s p e r m i d i n e 等试剂包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在火药爆 炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速包被有生物活性d n a 的惰性金属粒子( 微 弹) ，利用冲力将其射入植物受体细胞，并释放出外源d n a ，使d n a 在植物细胞 中整合表达，从而实现植物细胞的转化。 根据动力来源不同，基因枪可大体分为火药式( o u n p o w d e 0 、放电式( e l e c t r i c d i s c h a r g e ) 和气动式( p n e u m a t i c ) 3 种类型。火药式基因枪是最原始的基因枪类型， 是由美国康乃尔大学s a n f o r d 等( 1 9 8 7 ) 设计制造的。这种枪自使用以来已先后将外 源基因导入了玉米、小麦、水稻等多种植物材料中，并获得了瞬间或稳定表达；气 动式基因枪是s a n f o r d 等( 1 9 9 1 ) 在火药式基因枪的基础上设计的【3 0 1 ， 它更安全清 洁，通过调节气体压力可有效地控制粒子的运行速度，金属粒子分布更加均匀，每 枪之间的差异更少，且转化效率高。v a s i l 等( 1 9 9 3 ) 利用此基因枪获得了小麦转基因 植株。 基因枪介导法是近年来大量采用的单子叶植物转化的有效途径。甘蔗甘蔗遗传 转化成功事例的7 0 是通过基因枪法获得的【”】。1 9 9 0 年g o r d o n k a m m 等用基因枪 法将g u s 报道基因和p a t 选择性基因导入玉米悬浮细胞系，且再生的转基因玉米植 株能够结实，首次获得转基因玉米【3 2 j ；基因枪法也是最早运用于甘蔗育种的基因转 化方法1 9 9 0 年，美国的m a r e t z l d 等首次用基因枪把g u s 基因导入甘蔗愈伤组织， 并得到了瞬时表达【3 3 1 ，第一例转基因甘蔗植株也是通过基因枪法获得的；澳大利 亚的b o w e r 等在1 9 9 2 年用基因枪法在e m u 启动子的调控下把g u s 基因导入到甘 蔗的胚性愈伤组织中，1 6 周后获得转基因植株，经过e l i s a 检测及s o u t h e r n 杂交 1 0 广东海洋大学硕士学位论文 证实外源基因已稳定地整合到植株中了 3 4 j 。 虽然基因枪法有自身的缺点，如转化效率不高，大多在o 1 1 o 的范围内，难以 选择；外源基因序列常是多拷贝插入，易导致基因沉默；转入的基因有时是呈非孟 德尔遗传；且费用较高等1 3 5 1 。但是，微弹轰击法具有多种优点： ( 1 ) 微弹介导的直接d n a 摄入，直接选用那些易于得到的组织和细胞的材料作 为受体，可克服植物原生质体培养和再生困难的障碍。受体材料可为胚性愈伤、幼 胚、原生质体等，随许多研究者从不同的甘蔗材料中获得了原生质体再生植株 3 6 - 4 0 。 ( 2 ) 该方法操作简便，金属的喷射面广，受体材料来源受限小，无基因型专一性 4 1 】，且可同时用几个质粒进行转化； ( 3 ) 缩短了获得转基因植株的周期； ( 4 ) 获得的转基因植株变异率低，通常具有正常的育性等【4 2 j 。特别是在单子叶禾 本科植物中得到了较为广泛的应用。目前是单子叶植物首选的转化方法现在已经 初步建立起基因枪法转化甘蔗的技术。 3 2 农杆菌遗传转化法 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，主要有根癌农杆菌( a t u m e f a c i e n s ) 和发根农 杆菌似r h i z o g e n e s ) ，它们在自然情况下可以通过伤口侵染植物。根癌农杆菌含有肿 瘤诱导质粒( t i ) ，t i 质粒上包含可转移d n a ( t - d n a ) 区、毒性区( v i r 区) 、结合转移 区( c o n 区) 和复制起始区( o r i 区) 4 部分。其中t - d n a 区在农杆菌侵染植物时可以插 入植物基因组中，使其携带的基因在植物中表达【4 3 】。 农杆菌是一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于一种纯生物学的方 法，与其它转化方法相比具有明显的优点；