（物理化学专业论文）在泡囊水溶液中磷脂酶a2水解卵磷脂反应的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：1 缉鎏乌 日期：! q q 生垒旦 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名： 日期： 逝 2 q q 至垒旦 南京师范大学硕士论文 摘要 本文建立了一套能够适应于在泡囊水溶液中进行的磷脂酶a 2 催化水解蛋黄 卵磷脂的紫外在线检测方法。该方法具有实验误差小、使用样品少、操作简单等 优点。 在卵磷b b 十六烷基三甲基溴化胺( ( ；t a b ) 庚烷水形成的泡囊水溶液中， 通过在线检测产物与酚红的作用物在5 5 9 n m 处的吸光度变化，研究了磷脂酶 a 2 ( p l a 2 ，e c3 1 1 4 ) 催化水解蛋黄卵磷脂的行为。研究结果表明：( 1 ) 磷脂酶 a 2 催化活性受温度、底物浓度、酶浓度、表面活性剂浓度、钙离子浓度等因素 的影响， 在 e 】一1 7 9 u m o l l 一，【s = 2 0 m m o l l ， c t a b = 4 0 0 r e t o o l l ， l e a 2 + = 4 0 0 m m o l - l 。，t - - - 4 0 v 时，磷脂酶a 2 活性最大。( 2 ) 在底物浓度为7 5 2 5 r e t 0 0 1 l 1 范围内，酶催化行为符合m i c h a e l i s m e n t e n 动力学方程，并得表观米 氏常数j 0 和表观最大反应速率常数。 关键词：磷脂酶a 2 ，泡囊水溶液，卵磷脂，水解 一 堕重堕蔓茎兰塑主堡壅 a b s t r a c t a ni m p r o v e dm e t h o df o ri n v e s t i g a t i n gt h eh y d r o l y s i so fp h o s p h o l i p a s ea 2 ( p l a 2 ，p h o s p h a t i d e2 - a c y l - h y d r o l a s e ，e c3 1 1 4 ) w a se s t a b l i s h e di nt h ev e s i c l e s o l u t i o no fh 2 0 c t a b l e c i t h i n h e p t a n ei nt h i st h e s i s t h em e t h o di sp r e f e r a b l ew i t h h i g l lp r e c i s i o na n dl e s su s a g eo fs a m p l e i nt h ev e s i c l es o l u t i o n ，t h eh y d r o l y s i so fp h o s p h o l i p a s ea 2h a sb e e ni n v e s t i g a t e d b yu s i n ge g gy o l kl e c i t h i ni t st h es u b s t r a t et h r o u g hm e a s u r e m e n t so fa b s o r b e n c yo ft h e p r o d u c to fh y d r o l y s i sa tt h ew a v e l e n g t ho f5 5 9n n li nc o u r s eo fr e a c t i o n s 。t h ee n z y m e a c t i v i t i e sw e r e d e p e n d e n t o n t e m p e r a t u r e ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ，s u r f a c t a n tc o n c e n t r a t i o n , c o n c e n t r a t i o no fi o no fc 扩a n ds oo n m a x i m u me n z y m ea c t i v i t yw a so b t a i n e d a t e 1 = l 。7 9 u m o l l ，【s = 2 0m m o l - 1 ， c t a b 24 0 0m m o l l ， c a 2 + 1 = 4 0 0r n m o l l ，t = 4 0 c t h el i p a s e c a t a l y z e dr e a c t i o n o b e y sm i c h a e l i s - m e n t e nk i n e t i c si nt h ei n v e s t i g a t e ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nr a n g e ( 7 - 5 2 5m m o l 1 ) a n dt h ea p p a r e n tm i c h a e l i sc o n s t a n t 墨na n dt h ea p p a r e n tm a x i m 8 1 r e a c t i o nr a t ev mw e r ed e t e r m i n e d k e y w o r d s ：p h o s p h o l i p a s ea 2 ，v e s i c l es o l u t i o n ，e g gy o l k l e c i t h i n ，h y d r o l y s i s 2 南京师范大学硕士论文 第一章前言 磷脂酶a 2 ( p h o s p h o l i p a s ea 2 ，p l a 2 ) 是一种脂肪酶，几乎存在于所有的细胞 中，其水解产物有介导急、慢性炎症的作用。p l a 2 不仅在生物体内具有重要的 生理功能，而且在生产实践中也有很高的应用价值。磷脂酶a 2 水解卵磷脂反应 的研究涉及磷脂改性、油脂精练、食物添加剂、医疗等诸多方面【”。 1 1 泡囊水溶液 许多天然和合成表面活性剂不是简单地缔合成胶团，而是分散于水中自发形 成被称为泡囊或脂质体的封闭双层结构。泡囊和脂质体这两个术语的意义在文献 中有些含混，脂质体是一类特殊的泡囊，它特指由磷脂形成的具有多层结构的泡 囊体系，是人类最早发现的泡囊。 1 1 1 泡囊的结构与尺寸 泡囊是由两个两亲分子定向单层排列、尾部对尾部的结合、封闭的双分子 层构成外壳，壳内包藏微水相。从结构上看脂质体或泡囊可分为两类，即单层的 和多层的。前者是一个封闭双分子层包裹着水相的单室( 见图1 - 1 ( a ) ) ：后者则是 多个封闭双分子层构成的同心球，不仅中心部分，而且各个双层之问都包有水( 见 图1 - l ( b ) ) 。因此，这类泡囊又分别称为单室泡囊和多室泡囊。泡囊的线性尺寸大 约在3 0 - - 1 0 0 r i m ，也有大到1 0 p r o 左右的单层泡囊。泡囊的形状多为球形、椭球 形或扁球形，也曾观察到管状的泡囊。 o 图1 1 ( a ) 单室泡囊图1 - l ( b ) 多室泡囊 南京师范大学硕士论文 1 1 2 泡囊的形成 不是所有的两亲分子都能形成泡囊，起初人们只知道某些磷脂可以形成泡 囊，它们是类脂中具有只溶涨不溶解特性的一类化台物。从分子结构上看，其特 点是带有两条碳氢尾链和较大头基的两亲分子，例如双棕榈酰磷脂酰胆碱( 见图 1 2 ) 。随后发现合成的双尾表面活性剂，例如双烷基季胺盐和双烷基磷酸盐也可 以形成泡囊。这说明泡囊生成与表面活性剂分子的几何因素有关，般认为表面 活性剂要求满足临界排列参数p 略小于1 的条件。近来又发现混合表面活性剂体 系，特别是混合阴阳离子型表面活性剂可以自发形成泡囊，甚至在尚无胶团生成 的低浓度区已有泡囊生成。 o n c i m c o c h l l c l 坦 t c o ch 【o j + c h 3 o r _ o c h 广c h c h 加 。 图1 2 双棕榈酰磷脂酰胆碱 泡囊的形成可采用多种方法。最简单的是两亲化合物在水中溶涨，自发形成 泡囊。例如，将磷脂溶液涂于锥形瓶内壁，待溶剂挥发后形成的磷脂膜附在瓶上， 加水于瓶中，磷脂膜便自发卷曲，形成泡囊进入溶液。另一个形成泡囊的方法叫 做乙醚注射法，将两亲化合物制成乙醚溶液，然后注射到水中，除去有机溶剂即 可形成泡囊。反过来，将水溶液引入磷脂的乙醚溶液中，再除去有机溶剂，也能 制备多室泡囊。有些两亲化合物不能自发形成泡囊，但在超声的条件下可以形成， 这样制成的泡囊多为大小不一的多室泡囊。将此液加压通过孔径由大到小的系列 聚碳酸酯膜，可以得到尺寸较小和多分散性较小的多室泡囊。另外，多室泡囊经 过超声处理即可得到单室泡囊。 1 1 3 泡囊的性质 ( 1 ) 稳定性 泡囊水溶液与胶团溶液不同，它不是均匀的平衡体系，而是表面活性剂的有 序组合体在水中的分散体系，其分散掘的尺寸在胶体分散系的范围。泡囊具有暂 南京师范大学硕士论文 时的稳定性，但有的可以稳定几周甚至是几个月。这是因为形成泡囊的物质在水 中的溶解度很小，转移的速度很慢，而且相对于层状结构，泡囊结构具有熵增加 的优势。已经发现多室泡囊越大越稳定，有时也可采用可聚合的表面活性剂，在 形成泡囊后进行聚合，以增加泡囊的稳定性。 ( 2 ) 包容性 泡囊的一个重要特征是能够包容多种溶质。它可以按照溶质的极性把它们包 容在不同部位：较大的亲水溶质包容在它的中心部位，小的亲水溶质包容在它的 中心部位及极性基层之间的区域，也就是它的各个“水室”之中，疏水溶质则在 各个两亲分子双层的碳氢基夹层之中。本身就是两亲性的分子例如胆固醇之类 的化台物，可参加到定向的双层中形成混合双层。这种特殊的包容性使泡囊具有 同时运载水溶性和水不溶性药物的能力，有时这样做可以提高药效。 ( 3 ) 相变 从量热实验可清楚感知泡囊双层膜的相变。在双棕榈酰l a 卵磷脂差热图中， 存在放热过程，它主要来自双层膜中碳链构型的变化。形成泡囊的两亲分子饱和 碳氢链在温度较低时成全反式构象，这种非常有序的状态被叫凝胶态。温度升高 到一定值时，热运动使分子在保持反式构象的条件下，具有某些垂直运动的自由 度。与此相关的焓变很小，表现为第一个较小的吸热峰，此过程常被称为预变。 在温度更高时出现从凝胶态向液态转变的主过程，伴随着较大的焓变。发生此过 程的温度叫做相转变温度。经过此过程，碳氢链失去全反式构象，链节旋转更为 自由，变为流体。处于凝胶态和液态的泡囊性质不同，例如，被包容的物质进出 泡囊的速度不同。在相转变的温度以上，烷基处于似烃状态，溶质通过双层的速 度明显高于在相转变漫度以下的情况。这种特性对于生物膜是至关重要的。另外 在配制泡囊时，采用透膜法需保持体系温度在相转变温度以下，而采用超声法时 则保持体系温度在相转变温度以上较好。一般说来，相转变温度随体系组成而异， 增加碳氢链的长度会升商相转变温度，碳氢链不饱和化和支化则使之降低。 1 1 4 泡囊的应用 ( 1 ) 生物膜 生物膜是一种人们最早认识的天然的泡囊，它在诸多离子迁移、免疫识别等 南京师范大学硕士论文 过程中起重要作用。生物膜剖面由三部分组成：中间层是磷脂和蛋白质组成的混 合定向双层；双层的内表面则带有由蛋白质分子交链而成的网，它锚接在混合双 层的蛋白质分子上，使膜具有一定程度的刚性；双层的外面附有糖朊层，具有细 胞的表面识别功能。 由此可见，泡囊是研究和模拟生物膜的最佳体系，对泡囊的研究既有助于认 识生物膜的奥秘，也提供了通过仿生发展高新技术的途径。 ( 2 ) 药物载体 脂质体分散液静脉注射后可在循环系统中“周游”人体，并优先被肝和脾等 器官所吸收。此种特性启发人们利用泡囊来设计药物输送体系。 在许多方面，物理化学研究已为脂质体包裹药物做出贡献，例如：应用可聚 合两亲分予形成脂质体以增加稳定性；在相转变温度以上，多室脂质体中药物扩 散出来的速度比在相转变温度以下时快得多；以及各种制备脂质体的方法等。另 外，包裹了药物的脂质体还可以进行冷冻于燥，成为便于存放的固体粉末，使用 时加入溶剂而方便地得到泡囊分散液。这些都是当代药物科学于技术的前沿领 域。可以预见，脂质体药学在医药科学中将继续是一个非常活跃的领域。 ( 3 ) 微型反应器 泡囊可以为一些化学反应及生物化学反应提供适宜的微型反应器。一些在水 中起作用的微生物的功能常常因存在有机溶剂而受到抑止，而这些有机溶剂又是 为溶解烃类或其它不溶于水的反应成分所必须的。用泡囊作为反应介质可解此难 题，因为泡囊能溶解极性不同的成分，并且能为界面反应提供最佳的反应条件口1 。 1 2 底物与酶 本文研究磷脂酶a 2 催化水解卵磷脂反应，涉及的底物是卵磷脂，催化剂是 磷脂酶a 2 ，现简述如下： 1 2 1 卵磷脂 卵磷脂( l e c i t h i n ) 不仅是构成人体生物膜的重要组成成分，而且是胆碱和脂 肪酸的原料来源，它对维持生物膜的生理活性和机体的正常代谢起关键作用，被 誉为“细胞的保护神”、“血管的清道夫”、“开启大脑的动力”与“食用化妆品” 3 1 。 南京师范大学硕士论文 ( i ) 卵磷脂的分子结构 卵磷脂属于磷脂类物质，磷脂分为二酰基磷脂、鞘脂类、乙烯基醚磷脂和烷 基醚磷脂四类【4 】，其结构分别如图1 5 所示： 人，七z l j 一一。 。人。j l o e 人矗 ( a ) 、( b ) 、( c ) 、( d ) 分别为二酰基磷脂、鞘脂类、乙烯基醚磷脂和烷基醚磷脂 r 表示烃基，x 表示极性基头 图1 5 磷脂分子结构示意图 天然卵磷脂通常是由数种磷脂构成的混合物，这些磷脂的混合物总称为卵磷 脂。卵磷脂属于二酰基磷脂，根据极性基头x 不同，二酰基磷脂又可以分为磷 脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝胺酸五种卯，如下所 示： x 简称中文名称 hp a 磷脂酸 c h z c h z n + ( c h a ) 。 p c 磷脂酰胆碱 c h z c h z n + h 。p e 磷脂酰乙醇胺 c 羽( o h ) ； p i 磷脂酰肌醇 c h ：c h ( n + h 。) c 0 0 - p s 磷脂酰丝氨酸 ( 2 ) 卵磷脂的性质与存在形式 卵磷脂的外观为淡黄至浅棕色粉末或半透明粘稠状，具有吸湿性，在空气中 7 南京师范大学硕士论文 会被氧化。它可溶于醇、醚、苯、氯仿、石油醚等有机溶剂，难溶于丙酮，不溶 于水，在水中溶胀而形成胶体溶液。从不同原料提取的卵磷脂，各种成分含量不 同。卵磷脂作为酶催化反应的底物，分为自然底物和合成底物两类。自然底物主 要是大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂两种，大豆卵磷脂释放的脂肪酸是不饱和的，而蛋 黄卵磷脂释放的脂肪酸为饱和的。一般说来，饱和卵磷脂比不饱和卵磷脂稳定。 测定卵磷脂水解速率一般使用合成底物，合成用3 h 标记的甘油磷酸胆碱，可以 用放射性检测法来测定其水解速率。 卵磷脂在溶剂中存在形式不同，会严重影响其水解速率。其存在形式见图 1 6 1 4 】： ( 混合胶柬) 黼防 、鼯 囝占 豢崇燃 熬 单分子层) 图1 - 6 卵磷脂在溶剂中存在形式示意图 可见卵磷腊在溶剂中存在形式有单基、单分子层、胶束、反胶束、混合胶束、 单层小泡囊、单层大泡囊和多层泡囊等。通常，由于卵磷脂酰基碳链较长，更易 形成混合胶束或泡囊。 1 2 2 磷脂酶a 2 磷脂酶a 2 ( p l a z ) 是一类催化磷脂二位酰基水解的脂肪酶，广泛存在于细 菌植物、哺乳动物的组织、细胞和分泌物中，具有产生炎性介质、参与磷脂重建、 促进血液凝固等作用1 6 1 。 p 乳辩 毫 南京师范大学硕士论文 ( 1 ) 分类 磷脂酶a 2 属于脂肪酶中的磷脂酶类，磷脂酶是个庞大家族，分为磷脂酶 a ( p l a ) 、磷脂酶b ( p l b ) 、磷脂酶c ( p l c ) d ( p l d ) 四类，如下所示【7 1 ： 磷脂酶 p l a p l b p l c p l d ， l p l 暑 - - p l & 一 ，p l a f v i jp l 赴一 l p l a z _ 其中s p l a 2 、c p l a 2 和i p l a 2 分别为分泌型、胞浆型、非钙离子依赖型磷脂 酶a 2 ，这是依据其存在部位，氨基酸顺序同源性和生化特点不同来分类的。 不同磷脂酶对卵磷脂作用部位不同，见匿1 7 ： o 人a 2f 心 r _ 、o e h一。瑚一 i c h 2 0 a l 、a 2 、c 、d 分别表示磷脂酶a i 、a 2 、c 、d 图1 7 磷脂酶对卵磷脂作用部位示意图 磷脂酶a 2 ( p l a 2 ) 水解卵磷脂生成溶血性卵磷脂和游离脂肪酸| 4 j ，见图1 8 如 翊 扎 圩 厂fij。、lic 厂，(，、 蛔 一 h。叫0 童塞堕垫查堂里垡苎生! 一 o o r 八。 卵磷脂 0 儿 ( c h 2 ) t 4 c h 3 p l a 2 c a + 一 。o l + 人。 一e ：。j 一峨州托 i 溶血卵磷脂 蝣离脂肪酸 p l a 2 性质h t 6 1 、誊别 i 趣途 s p l a 2 c p l a 2i p l a 2 定位细胞外细胞内细胞内外 分子量 一1 4 k d - 8 5 k d一8 0 k d 1 0 = k 2 时，翰= 。 v o 对 s 】作图得到双曲线与许多酶促反应结果一致。 1 。6 选题背景和意义 p l a 2 广泛存在于细菌、植物、哺乳动物的组织、细胞及其分泌物中，具有 产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建、肺泡表面活性物质代谢、细胞信号传 递、宿主反应、促进血液凝固等作用【6 】。与p l a 2 作用的底物卵磷脂是细胞膜主 要组成部分，磷脂组成的变化对细胞膜流动性、膜蛋白的活性等细胞生理功能有 重要的调节作用，所以p l a 2 还是用来进行解析磷脂结构、生物膜构造及功能等 的研究的重要工具酶【1 1 。产物溶血卵磷脂与卵磷脂相比，其亲水性乳化能力和稳 定性都显著改善，在低p h 值、高温或低温条件下都能保持良好的乳化性，且不 受盐浓度的影响，是食品工业特别是烘烤工业重要的乳化剂。此外，溶血磷 脂分子的渗透能力、杀菌能力、溶血能力与药物的亲和能力已引起生理学、药理 学方面的极大兴趣【“。p l a 2 水解磷脂生成溶血卵磷脂的同时也生成长链不饱和 脂肪酸，它是进入其他脂肪酸代谢的途径，是许多脂肪酸代谢的一个限速步骤，在 脂类代谢中起重要作用。脂肪酸也是化学与制药工业重要原料。如果能在生产溶 血卵磷脂的同时，有效地分离回收这些不饱和脂肪酸产物，会产生更大的经济效 益。 研究p l a 2 的文献报道很多，大多数酶催化反应采用缓冲溶液作为反应介 质，但缓冲溶液不能很好地模拟天然生物体系。近年来的研究表明微乳液能够长 时间保持酶活性，甚至可能使酶具有超活性。我们前期工作研究了磷脂酶a 2 在 油包水型( w o ) 微乳液中的水解反应，然而，因为生物体中的介质绝大多数是 亲水的，w o 型微乳液仍然不能很好地模拟生物体内的微环境。水包油型( o w ) 型微乳液和泡囊水溶液能够很好地模拟生物体系，同时泡囊还是一个非常吸引人 的反应介质。由于其特殊的结构，它可以通过增溶个反应物来抑制化学反应， 相反地，它也可以通过把反应物浓缩在双层的界面上而催化一个反应。它们就像 一个微型反应器，其催化能力超过了胶束。研究表明，泡囊的聚集体的尺寸、形 状和结构都会影响酶催化反应。通过仔细地选择表面活性剂和反应物并增溶在泡 南京师范大学硕士论文 囊的不同部位来研究各种反应是可行的，可见泡囊作为理想的反应介质，有着广 阔的应用前景。 在泡囊水溶液中的酶催化反应未见文献报道，本文首次采用卵磷脂十六烷 基三甲基溴化胺( c t a b ) 庚烷水形成的泡囊水溶液作为p l a 2 水解反应的介质， 使用紫外分光光度一酚红在线检测法简单而又较为准确的测定p l a 2 在泡囊水溶 液中催化水解卵磷脂速率，分别考察p l a 2 浓度、钙离子浓度、温度等各种因素 对该反应的影响，并研究了酶在泡囊水溶液中催化水解卵磷脂的反应动力学。 南京师范大学硕士论文 2 1 仪器和药品 2 。1 1 仪器 紫外可见分光光度计； 恒温槽： z d b 一自动电位滴定仪： 恒控磁力搅拌器： 电子天平： 电光天平： 2 1 2 药品 第二章实验部分 日本日立u 3 4 0 0 型( h 1 1 a c h i ) ，吸光度的有效量程 为一3 - - + 3 ，感量值为o 0 0 1 a 。 5 0 1 型，上海市实验仪器厂。 可用于测量p h 值，感量值为0 o l 型号为h k c b 一3 ，转速为1 2 5 0 r m i n 型号为f a 2 0 0 4 ，晟大载荷2 0 0 9 ，分度值0 1 m g 型号为t g 3 2 8 8 ，最大载荷2 0 0 9 ，分度值o 1 i n g 猪胰脏磷脂酶a 2 f p h o s p h o l i p a s ea 2 ) ：购置于f l u k a 公司，活性5 6 1 u n a g ，分 子量1 4 0 0 0 ，4 c 可以长期保存而不会失去活性。 蛋黄卵磷脂( l e c i m i n ) ：购置于上海华东师大试剂厂公司，含量为8 5 ，分 子量7 5 2 ，冷冻保存。 三羟甲基甲烷 t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e 】、正庚烷、酚红、盐酸、 油酸和氯化钙，均为国产分析纯，二次蒸馏水。 2 2 游离脂肪酸的检测原理 酚红是种红色粉末状物质，易溶于水而难溶于有机溶剂异辛烷。作为酸 碱指示剂，其变色原理可用图2 - 1 表示【3 0 】： 南京师范大学硕士论文 + 河卜 ( d ) 图2 1 酚红变色原理示意图 在碱性条件下( p n 值为8 9 ) ，酚红带两个单位负电荷，显红色( 最大吸收 波长5 5 9 n m ) ，酚红分子结构见图2 1 中的( a ) 。降低溶液p h 值至中性或弱酸性， 酚红中心碳原子就由s p 2 杂化变为s p 3 杂化，共轭链缩短，显黄色( 最大吸收波 长4 3 0 r i m ) ，酚红分子结构变为图2 一l 中的( b ) 。继续酸化酚红溶液，酚红分子结 构变为图2 1 中的( c ) ，但是颜色不变。若在强酸性条件下，酚红分子结构变为图 2 - 1 中的( d ) ，显黄色( 最大吸收波长5 0 5 r i m ) 。在本文的磷脂酶a 2 催化水解蛋黄 卵磷脂实验中，是在p h 值为8 5 的碱性条件下进行的，卵磷脂水解产生的游离 脂肪酸与酚红作用，酚红变色，在5 5 9 n m 处用分光光度计检测吸光度的变化。 酚红分光光度法可以在线连续检测，也可以非连续检测。酚红在线分光光度 法的优点是精度高、节省药品、减少工作量等，其原理是反应前在反应液( 含酶) 与参比液( 不含酶，其它成分与反应液相同) 中加入等量指示剂酚红，在反应溶 液中，卵磷脂水解产生的游离脂肪酸持续不断地与酚红作用，酚红浓度不断降低， 反应液的吸光度也随时间持续变化，而参比液的浓度不随时间变化，通过分光光 度计可以获得吸光度随时间的变化率。根据标准曲线，可以获得水解产物游离脂 肪酸浓度随时间的变化率，由此可以获得酶催化反应的反应速率。 2 l 洲 南京师范大学硕士论文 2 3 磷脂酶a 2 催化水解卵磷脂反应动力学 通常脂肪酶水解通过检测反应产物游离脂肪酸的浓度变化来研究酶活性和 研究水解动力学。本文用紫外分光光度一酚红在线检测法测定泡囊中p l a 2 催化 水解卵磷脂速率。 2 3 1 实验方法的建立 本实验室前期的研究工作已经建立了在线分光光度法一酚红在线检测来测 定磷脂酶a 2 活性的方法，该方法适用于在油包水型微乳液中进行的酶催化反应。 在前期研究工作的基础上，我们将该方法拓展使用于在泡囊水溶液中的磷脂酶催 化水解卵磷脂反应。 ( 1 ) 基本原理： 磷脂酶a ：水解卵磷脂生成游离脂肪酸，该脂肪酸与酚红的作用物可以在波 长为5 9 9 n m 处有吸收，采用紫外分光光度计可以定量在线进行检测。 ( 2 ) 影响因素及其最佳参数的确定 影响该在线检测精度的因素较多，主要包括：温度、p h 值、缓冲对浓度、 酚红浓度等，我们分别考察了上述因素在泡囊溶液中对磷脂酶水解卵磷脂反应速 率的影响，获得各种因素的最佳值。 1 ) 温度的确定 在一定的条件下，每种酶都有一个最适宜的作用温度，在这个温度下酶的活 力最高，作用效果最好，而且酶也较稳定。当酶促反应的速度增加和酶活力的热 变性损失达到平衡时，这个温度便是酶作用的最适温度。最适温度是在一定条件 下( 时间、p h 等等) 所测得的酶活力最高的温度，条件变化会影响最适温度参 数。酶反应时间越长，酶的活力损失越多，因此最适温度可能低一些，可以减少 热变性的影响，使酶充分发挥作用。此外，反应的缓冲液种类、抑制剂、底物浓 度、酶的纯度等因素，也可能使最适温度有所变化。就大多数酶来说，最适温度 都在4 0 c 左右( 这是生物体生理所需的温度) 1 3 ”。本实验的实验温度设定在4 0 下进行反应和测量。 2 ) p h 值的确定 酸碱度( p 1 1 ) 对酶的活性影响很大。每种酶只有在一定的较小的p h 值范 南京师范大学硕士论文 围内才表现出最高的活力，这个p h 值就是酶最适p h 值。一般来说，酶在最适 p h 值表现最稳定，因此酶作用的最适p h 值也就是其稳定p h 值( 胰酶蛋白胃、 蛋白酶例外) 。如果超过这个p h 值，酶会受到不可逆的破坏，稳定性下降，活 性受影响，甚至完全失活。不同酶的最适p h 范围不同，有的在中性，有的偏酸 或偏碱性。 酸碱度对酶活性的影响，也和结构有关。酶活性中心的氨基酸的侧链往往 带有一些能离解的酸性或碱性基团，所以环境的p h 值影响酶分子的离解，特别 是活性中心的必需基团的离解。另一方面，p h 值也影响底物分子的离解，这些 都会影响酶和底物的结合，因此影响它们反应的速度。在最适p h 值，离解的酶 分子和底物分子最适合相互结合，所以反应速度最大【3 l l 。对p l a 2 而言，较合适 的p h 值在8 0 9 0 ，所以实验p h 值设定在8 5 。 3 ) 缓冲对浓度的确定 t r i s h c l 在p h 值8 1 0 时，有良好的缓冲效果，本文的水解反应p h 值为8 5 ， 选择t r i s h c i 作为泡囊水溶液的缓冲对是可行的。缓冲对浓度大小对酶催化速率 和催化活性有何影响呢? 有的文献认为当t r i s - h c l 浓度较小时，缓冲能力低，水 解产物自由脂肪酸使水相p h 值降低，从而影响了酶的催化活性1 2 3 1 。本文认为三 羟甲基氨基甲烷的浓度提高，会更充分的中和生成的游离脂肪酸，从而有利于这 个可逆反应向水解方向进行。因为卵磷脂的浓度很低，产生的游离脂肪酸浓度更 低，除非缓冲对浓度极低，不然水相p h 值变化应该很小。当然，缓冲对浓度太高， 会阻碍酶与卵磷脂的结合，从而使反应变慢，酶活性降低。 选择合适的缓冲对浓度对于酚红在线检测来说极为重要，假如缓冲对浓度太 低，水解反应生成的游离脂肪酸会使酚红很快由红色变为黄色，水相p h 值变化 也大( p h 值变化会引起酶催化活性变化，带来实验误差) ；假如缓冲对浓度太大， 缓冲能力也就大，水解反应生成的游离脂肪酸不足以使酚红变色，吸光度变化很 小，误差大。综合考虑酶活性、缓冲对的缓冲能力和水相p h 值稳定性三个因素， t r i s h c l 浓度选择为2 0 r e t o o l l 。 4 ) 酚红浓度确定 为了确定该水解反应的酚红浓度，考虑到实验误差因素，酚红浓度太低，吸 光度小，误差大；酚红浓度太高，比如7 5 b t m o l l 一，在某些条件下吸光度太大， 南京师范大学硕士论文 超出了仪器的量程。所以本文选择酚红浓度为5 0 m o l l 1 。 通过考察上述各种因素，确定在泡囊水溶液中进行磷脂酶a 2 水解卵磷脂的 最佳条件，建立了用紫外分光光度计作为检测手段的酚红在线检测法。运用这种 酚红在线分光光度法测定在泡囊水溶液中p l a 2 催化速率，将大大提高准确性， 误差一般小于3 ，药品用量也只有酚红非在线分光光度法的1 1 0 1 1 0 0 ，分光 光度计与计算机联接，实现数据自动记录与处理，实验操作简单。 2 3 2 实验过程 ( 1 ) 溶液配制 分别配制下列溶液：氯化钙水溶液( 2 5 m ) ，酚红水溶液( 1 2 5 r a m ) ，磷脂 酶a 2 溶液( 1 ，5 m g m l ) ，t r i s h c i 溶液( 2 0 r a m ) 。上述溶液都是用浓度为2 0 r a m 嘣s _ h c l 溶液配制。 ( 2 ) 酶催化速率与活性测定 由于p l a 2 的活性受外界条件的影响，酶的水溶液失活速度远远大于固态的 酶，特别是实验对p l a 2 的水溶液常常是放在室温下，实验发现一个月后酶活性 降低约5 0 。为了消除酶逐渐失活带来的误差，本实验建立一个标准体系用于检 验酶的活性，所配置的酶溶液在使用之后，用标准体系对酶的活性进行校准。校 准后的酶活性称为相对活性，校准后的酶活性计算得到的反应速率称为折合速 率。因此本文中所说的活性实际上就是相对活性，反应速率是折合速率。因此， 在研究酶催化反应之后，我们采用一个标准体系校准酶的活性。 1 ) 标准体系 反应液中各个物质总浓度分别为：c h i i = 2 0 m m o l l ，c c t a b = 0 4 m o l - l ， o h p t 蛐c = o 2 m o l l ，t e