（园林植物与观赏园艺专业论文）冬青属植物issr分子标记及枸骨组织培养体系的建立.pdf

冬青属植物i s s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立 摘要 摘要 中国是冬青属植物资源大国，但冬青属植物资源在观赏方面的开发利用仍处于起步阶段，因此 开展分子标记辅助杂交亲本选择，促进园艺品种的选育，以加快冬青属资源的开发利用，变得越 来越重要。利用i s s r 分子标记对3 6 种冬青属植物的种间关系进行了研究，从1 0 0 条引物中筛选 出1 2 条能扩增出清晰带型并具多态性的引物，共扩增出2 3 5 条d n a 片段，分子量主要集中在4 0 0 一- - 15 0 0b p 之间，其中2 3 2 条片段呈多态性，多态率为9 8 7 ，平均每条引物扩增出1 9 6 条d n a 片 段；依据扩增结果用u p m g a 类平均聚类法进行遗传相似系数分析并构建了系统树。 通过聚类分析，发现3 6 个冬青属植物的分子标记分类结果与前人的形态学分类有很大程度的 相同：3 6 种冬青属植物在遗传相似系数o 6 4 处明显聚为两大类，即落叶类和常绿类。落叶类包括 大果冬青、梅叶冬青、满树星和小果冬青，其中大果冬青与梅叶冬青亲缘关系最近；常绿类包括其 余的3 2 个种，在遗传相似系数o 6 6 处，这些种又分为两大组。一组包括枸骨、金心叶阿尔塔冬青 及枸骨叶冬青等6 个种，另一组包括美国冬青、南非冬青和铁冬青在内的2 6 个种。初步证明了利 用i s s r 分子标记对冬青属植物进行系统进化和亲缘关系分析的可行性。 枸骨以种胚外植体，研究了各种激素对该植物离体培养的影响。通过对比试验，初步确定了适 宜于枸骨组织培养与快速繁殖各个阶段的培养基，有助于该植物的推广。结果表明：适宜种胚萌发 培养基为i 2 m s + g a 31 0 m g l 1 ，壮苗培养基为m s + b a1 5m g l 。1 + n a a 0 5m g l 。1 ；不定芽诱 导培养基的最佳培养基为m s + b a2 0m g l 。1 + n a a0 1m g l 一；较好增殖与继代培养基为m s + b a 3 0m g l 1 + k t0 5m g l 1 + l b a0 5m g l - 1 ；生根适宜培养基为1 2 m s + i b a0 2m g l 以+ n a a0 2 m g l 1 。 关键词：冬青属植物；i s s r ；亲缘关系；枸骨；组织培养 冬青属植物i s s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立英文摘要 i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a tm o l e c u l a rm a r k e r si ni l e xi ni l e xa n dt h e t i s s u ec u l t u r es y s t e mo f l l e xc o r n u t al i n d le xp a x t s u p e r v i s o r ：p r o f s uj i nl e z h a n gd o n gm e i m a s t e rc a n d i d a t e ：z h o ux ij u n c h i n ai sab i gc o u n t r yi nt h eh o l l yp l a n tr e s o u r c e s ，b u tt h eo r n a m e n t a la s p e c t so f l l e xi nd e v e l o p m e n t a n du t i l i z a t i o ni ss t i l li nap r e l i m i n a r ys t a g e ，s oc a r r y i n g ro u tp a r e n t a lm o l e c u l a rm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n , p r o m o t i n gh o r t i c u l t u r a lv a r i e t a lb r e e d i n gi no r d e rt oe x p e d i t et h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no f f l e x r e s o u r c e sb e c o m em o r ea n dm o r ei m p o r t a n t i n t e rs p e c i e sr e l a t i o n s h i po f 3 6s p e c i e si ni l e xw a ss t u d i e db y i s s rm a r k e r s 12p r i m e r sw e r es c r e e n e do u tf r o m10 0r a n d o mp r i m e r s 2 3 5d n ab a n d sw e r ea m p l i f i e d r a n g i n gf r o m4 0 0 - l5 0 0b p ，t h ep o l y m o r p h i cr a t eo f 2 3 2w a sa c c o u n t e df o r9 8 7 t h ea v e r a g en u m b e ro f d n ab a n d sa m p l i f i e db ye a c hp r i m e rw a s1 9 6 g e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tw a sc a l c u l a t e db yn t s y s a n dt h ed e n d r o g r a mw e r ec o n s t r u c t e db yu p m g a m o s ts a m e n e s sb e t w e e nt h ec l a s s i f yr e s u l tb ym a r k e ra n df o r m e rm o r p h o l o g i c a lt a x o ni sd i s c o v e r e d t h r o u g hc l u s t e r i n ga n a l y s i si n3 6i l e xs p e c i e s ：3 6i l e xp l a n t sw e r ec l a s s i f i e di n t o2g r o u p st h a tw a s d e c i d u o u sp l a n ts p e c i e sa n de v e r g r e e np l a n ts p e c i e sa ts i m i l a r i t yc o f e e c i e n t0 6 4 l m a c r o c a p a r 、l a s p r e l l a 、 l a c u l e o l a t aa n di m i c r o c o c c aw e r ec l u s t e r e di n t oo n eg r o u p t h er e s to f 3 2s p e c i e sw e r ec l u s t e r e di n t o a n o t h e rg r o u p t h el a t t e rg r o w pw a sd i v i d e di n t o2s e t sa ts i m i l a r i t yc o f e e c i c e n t0 6 6 o n ec o n t a i n e d 1 【c o r n u t a 、, i l e xx a l t a c l e r e n s i s l a w s o n i a n a a n di l e xa q u i f o l i u me t c6s p e c i e s 1 l e xo p a c aa n di r o t u d ae t c2 6 s p e c i e sw e r ed i v i d e di n t ot h eo t h e rs e t t h ep r e l i m i n a r yp r o o fp r o v e dt h a ti tw a sf e a s i b l et oa n a l y s i st h e s y s t e me v o l u t i o na n dg e n e t i cr e l a t i o n s h i po f l l e xp l a n t ss p e c i e sb yu s i n gi s s r d u d n gt h ee x p e r i m e n to ft h et i s s u ec u l t u r es y s t e mo fi l e xc o r n u t ab ys e e de m b o d y ，e v r e r yf a c t e r s i n f l u e n c eo ni th a v eb e e ns t u d i e d t h es u b s t r a t u mo f e a c hs t a g ef o rt i s s u ec u l t u r ea n dr a p i dp r o p a g a t i o no f i l e xc o m u t ah a sb e e nd e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l yt h r o u g hc h e c ke x p e r i m e n t ，w h i c hw i l lb eh e l p f u lf o r s p r e a d i n gi l e xc o r n u t a i ti ss h o w nt h a tt h es u i t a b l em e d i u mf o re m b o d yg e n m i n a t i o ni s1 2 m s + g a 31 0 m g l ，s o u n ds e e d l i n gc u l t u r em e d i u mi sm s + b a1 5m g l 1 + n a a0 5m g l 。1 ：t h eb e s ta d v e n t i t i o u s b u d si n d u c e db e s tm e d i u mi sm s + b a2 0m g l “+ n a ao 1 m g l 。1 ；t h eb e u e rm u l t i p l i c a t i o na n d s u b c u l t u r em e d i u mi sm s + b a3 0m g l 。l + k t0 5m g l + i b a0 5m g l 一：t h eb e a e rg r o w t ho fr o o t si si n 1 2 m s + i b a0 2m g l 。+ n a a0 2m g l k e yw o r d s ：i l e x ；i s s r ；g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s ；f l e xc o r n u t a ；t i s s u ec u l t u r e 4 1 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 冬青属植物i s s r 分子标记亲缘关系分析及枸 骨组织培养体系的建立 差篓l 硕士 级别i ”一 学生 姓名周喜军 喜翌i 园林植物与观赏园艺 导师i苏金乐教授 姓名i张冬梅高工 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师们指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名： 日期：叩年后月心日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：闭够导师签名：芬拿孓 学院领导签名： 圈 日期溯年参月莎日日期：翮年歹月心日日期：埘年月玎日 致谢 师从苏金乐教授三年，苏老师严谨认真的治学态度，开阔敏捷的视野，渊博的学识， 宽厚待人的作风，井井有条的处事风格，使我终生受益，这将是我一生受益的精神财富。 在上海市园林科研所实习期间，张冬梅高级工程师言传身教，精心指导，使得我的视野 更加开阔。苏金乐教授和张冬梅高级工程师两位导师在学习和生活上给我无微不至的关 心和帮助，并在人生道路的重要选择上为我指点迷津，这些我将永远铭记在心。能得两 位导师的指导，是我最大的荣幸。论文的完成也得益于两位导师的精心指导和批评指正， 值此之际，向尊敬的导师表示衷心的感谢和诚挚的敬意! 试验期间，上海市园林科研所的罗玉兰老师在实验中给予我很大的指导和帮助，在 实验方案的设计及技术操作等过程中给予我无私的帮助和支持，使我深受感动和启发， 在此，致以我诚挚的感谢! 同时，我还要特别感谢上海市园林科研所张春英老师、0 4 级师姐魏华丽，0 5 级师姐李晓康、李怡乐、李雪，0 5 级师兄孙佩光，对本实验的指导， 同门赵清贺、陈伟峰对我学习及生活中的帮助! 感谢导师组的杨秋生教授、何松林教授、田国行教授、孔德政副教授、王献副教授、 李永华副教授、黎明副教授、王鹏飞副教授三年来的教诲，感谢0 6 级园林全体研究生 的三年相伴和对我的安慰鼓励! 感谢多年来为了我完成学业而含辛茹苦的父母和对我学习和生活上全力支持的叔 叔、兄长及女友。 无限的给予，汇成此文。值此论文革成之际，向所有关心、理解、支持和帮助过我 的亲人、朋友、老师和同学们致以诚挚的谢意! 最后感谢河南农业大学多年来对我的教导和栽培! 冬青属植物is s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立 文献综述 1 文献综述 1 1 冬青属( 1 l e x ) 植物研究概况 1 1 1 冬青属( i l e x ) 植物的历史起源与地理分布 冬青属在分类地位上属木兰纲卫矛目冬青科。冬青科包括3 个属，我国仅1 属即冬青属。冬青 属约4 0 0 种，现主要分布于两半球的热带、亚热带至温带地区，数种产欧洲和大洋洲。冬青属植物 现存种的主要分布区为东亚和南美，东南亚和北美也有少量分布。非洲热带地区仅有1 种，澳大利 亚北部热带地区有一种，欧洲分布有4 个相近种。夏威夷、加勒比海地区、加那利群岛、亚述尔群 岛、马德拉群岛、新喀里多尼亚群岛和斐济等地区也有少量种类分布。事实上，早在白垩纪后期冬 青属植物已经广泛分布于世界( c u e n o u de ta l ，2 0 0 0 ) 。目前冬青属植物的分离( 间断) 分布模式可能是它 们在非洲、澳洲、欧亚大陆中部灭绝的原因。冬青属植物种类侵移( 迁移) 有两种假说来解释：一种 是基于大陆漂移学说( r a v e na n da x e l r o d ，1 9 7 4 ) ，认为南美和东南亚的种群可能有相同的冈瓦纳起源。 另一种假说是基于器官进化关系理论的，认为东南亚是冬青属植物的最早移植区域( n ucy ，1 9 6 7 ) 。 现在初步确定我国有2 0 0 种以上( 约2 0 4 种) ，分布于秦岭南坡、长江流域以及以南广大地区， 而以西南和华南最多( 陈书坤等，1 9 9 9 ) 。 1 1 2 冬青属植物生物学特性和生理生态学研究 冬青属植物为乔木或灌木；叶互生，少数对生，常绿或落叶，有齿缺或有刺状锯齿；花单性异 株，有时杂性，为腋生的聚伞花序或伞形花序；花萼裂片、花瓣和雄蕊通常4 ；子房上位，3 至多 室，每室有下垂的胚珠1 2 颗，生于中轴胎座上；果为一球形、浆果状由核果。 大叶冬青( l l a t i f o l i a ) 引种栽培实验表明( 李晓储等，2 0 0 3 ) ：其种子休眠期可长达3 年，幼苗 期生长缓慢，一般3 年后进入速生阶段，速生期年生长量达5 0 - 、- 11 0 c m 以上。1 年中生长有2 个高峰， 分别出现在4 月和7 8 月，生长呈双峰型，二次抽梢明显。树高季节生长高峰一般在4 月和7 8 月出 现，绝大多数植株6 月生长趋于停滞；地径季节生长分别在5 - - 一6 月和8 月出现峰值。季节生长与月均 温、月降雨量、月均相对湿度呈正显著相关，表明生长需要较高温度和湿润的条件。较耐寒，除当 年生播种苗需防寒( - 3 - - 一4 c 低温) 外，2 年生苗木已能适应5 一7 自然低温，5 年生幼树能适应一1 0 1 l 低温。较耐水湿，在生长季7 月份遭遇田间淹水( 与地面平) 2 4h 的水涝灾害，苗木成活保存率仍 在9 5 以上。小果冬青( zm 把r o c o c c a ) 和毛枝冬青( ，b u e r g e r i ) 栽培及繁育技术表明( 杨永川 等，2 0 0 5 ) ：冬青当年采集的果实贮藏至翌年3 月，经处理后，小果冬青可直接播种，发芽率为1 2 0 。 毛枝冬青种子具有较长休眠期，处理后贮藏至1 0 月播种，发芽率为9 8 。采用1 年生小果冬青幼苗 造林后第3 年，平均树高2 5m ，胸径1 2c m ，而采用1 年生毛枝冬青幼苗造林后第6 年，平均树高4 1 m ，树干基部直径1 2 0c m 。有学者通过实验研究了不同昼夜平均温度和光量子通量密度对杂交冬青 ( b l u ep r i n c e s s s y h u ) 营养生长的生长周期的影响，结果表明气温和光量子通量密度显著影响着 生长曲线的振幅和频率，在温度2 3 9 0 c 、光强为3 7m o l m 之d - 1 萌发频率最高( k o s i b a , 2 0 0 5 ) 。对 不同光照条件下3 种冬青属植物的光合特征日变化研究( 张璐等，2 0 0 6 ) ，为3 种植物的引种驯化及 2 冬青属植物i s s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立 文献综述 栽培提供了参考依据。此外，通过对冬青叶绿素在不同光、酸碱、热、氧、金属离子条件下的稳定 性进行研究，为冬青深加工技术提供有参考价值的基础数据( 王敏等，2 0 0 3 ) 。 1 1 3 冬青属植物的观赏价值及园林应用 冬青属植物大多果色鲜艳，观赏期在秋冬季节，观赏期长，能弥补冬季园林景观单调的缺陷。 此外，冬青属的树种多常绿，叶子革质、具有光泽且浓密，可供多种园林用途。在欧美国家，由于 冬青属植物具有常绿、耐寒性好等特点，己经成为重要的露地栽培园艺植物，已选育出众多的园艺 品种，据目前统计国外选出的园艺品种和杂交种超过10 0 0 个，仅1 9 9 4 年出版的美国东南部栽培名录 就收录t s o o 多个园艺品种( f r e d e r i c k , 1 9 9 4 ) 。许多冬青己成为园林中常见的观赏树种。然而在我国 冬青的园林应用研究还没有得到足够的重视。 1 1 3 1 果实 冬青类植物的果实具有很高的观赏性，果实宿存，核果球形，至秋末转鲜红色、黄色、黑色等， 或浑圆红焰，或金黄灿烂，晶莹美观，既观叶又赏果，且观赏期长。红色果实的有大叶冬青( z t a t f f o l z a ) 、 毛冬青( z p u b e s c e n s ) 、河滩冬青( l m e t a b a p t i s t a ) 等；黑色的有猫儿刺( l p e r n y i ) 、黔灵山冬青 ( l q i a n l i n g s h a n e n s i s ) 、沙坝冬青( l c h a p e n s i s ) 等；紫红色的有刺叶珊瑚冬青( l c o r a l l i n av a r a b e r r a n s ) 、 大果珊瑚冬青( l c o r a l l i n a v a r m a c r o c a r p a ) 、珊瑚冬青( 上c o r a l l i n a ) 等。果实观赏期长，如l 、2 月有铁冬青( l r o t u n d a ) 和尾叶冬青( 1 w i l s o n i i ) ，它们的果实为红色；6 月份有黑色的满树星 ( l a c u l e o l a t a ) 、红色的显脉冬青( l e d i t i c o s t a t a ) 、皱柄冬青( l k e n g i i ) 和紫色的紫果冬青( l t s o i i ) 等；7 月有海南冬青( l h a i n a n e n s i s ) 、厚叶冬青( l e l m e r r i l l i a n a n ) 等；8 月有海南冬青( l h a i n a n e n s i s ) 及台湾冬青( l f o r m o s a n a ) 等；9 1 2 月份，陆续有厚叶冬青( 上e l m e r r i l l i a n a n ) 、冬青( l c h i n e n s i s ) 、 黔灵山冬青、沙坝冬青( zc h a p e n s i s ) 、凹叶冬青( l k h a m p i o n i i ) 、矮冬青( l l o h f a u e n s i s ) 、小果 冬青( l m i c r o c o c c a ) 、铁冬青( l r o t u n d a ) 等( 陈景艳等，2 0 0 6 ) 1 1 3 2 叶 冬青属植物的叶子按叶质可分为革质和纸质。其中革质类的叶子多带光泽，在阳光的照射下能 够反射光线，亮丽而清爽。如细刺枸骨( l h y l o n o m a ) 、黔灵山冬青等。叶子的形状多是椭圆形至 披针形。可将叶的长短分为3 大类：5 e r a 以下为小叶类如矮冬青、钝齿冬青( i c r u n a t a ) 等；6 1 0 c m 之间为中叶类，如大果冬青( l m a c r o c a r p a ) 、冬青等；1 0 c m 以上为大叶类，如大叶冬青( 陈景艳 等2 0 0 6 ) 。此外，引进的冬青属彩叶类植物的叶多数为彩叶植物中的常彩类，即整个生长季节叶片 从幼叶到衰老彩色始终存在。如金边构骨叶冬青ua q u i f o l i u m a n g u s t i f o l i a ) ，新生嫩叶为红褐 色，之后随着叶子的伸展逐渐变绿，边缘部分则变为黄色。按植物叶色颜色种类来看，主要为黄色 叶，有金黄的如金帝王冬青( i l e x a l t a c l e r e n s i s g o l d e nk i n g ) ，金宝石( 1 x a l t a c l e r e n s i s l a w s o n i a n a ) 冬青、金叶龟甲冬青 c c o n v e x a ) ，橙黄的如宽叶阿尔塔冬青( 1 x a l t a c l e r e n s i s p l a t y p h y l l a ) 等； 白色的主要为银边类，有银边阿尔塔( i x a l t a c l e r e n s i s l a w s o n i a n a ) 、银边构骨叶冬青 ( l a c q u i f o l i u m h a n d s w o r t hn e ws i l v e r ) ；还有蓝绿色的，如7 蓝天使冬青。这些彩叶类冬青叶色优 3 冬青属植物i s s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立 文献综述 美，色彩丰富，叶为革质，叶面光滑具光泽且浓密，叶片大小差异较大，椭圆形，边缘有波状刺或 刺状锯齿，具多种园林观赏用途。 1 1 3 3 园林应用 冬青属植物种类丰富，观赏功能多，一个种往往有多种观赏性，它们中有些种类除了可观果外， 还具优美的树姿，奇特的叶型，美丽芬芳的花朵等特点，具有极佳园林观赏特性。从种植形式来说， 可孤植、列植、丛植或群植。比如常绿大乔木冬青( 上p u r p u r e a ) ，高达1 5 m ，树皮灰青色平滑，树形 整齐、枝叶茂密，红若丹珠的球形果实经冬不落，分外艳丽，而且叶到了冬季变为红紫色。冬青对 二氧化硫、臭氧和抓气的抗性强，有吸收和净化汞的能力，可大量引人工厂绿化。大果冬青 ( 上m a c r o c a r p a r ) 为落叶乔木，黑色的果实明显，有宿存的柱状柱头，果柄长2 c m 左右；而长柄变种的 果柄长达3 3 c m ，黑玛瑙一样垂在枝头，熠熠生光；值得一提的是它们的花芳香，可以引人香味园成 为一道亮丽的风景。作为小乔木或灌木，可群植、丛植、列植、孤植。作下层地被观赏，背景树、 分隔绿地空间，街道两旁及分车带绿化等。高贵云南冬青( l y u n n a n e n s i sv a r g e n t i l i s ) ，树皮平滑，呈 灰色，其特殊的观赏之处为小枝、叶柄、叶、果柄都密被金黄色长绒毛。铁冬青“r o t u n d a ) 树皮为淡 红色，在观赏美丽的躯干特性上，不但可以和白桦( b e t u l ap e n d u l a ) 、白皮松( p i n u sb u n g e a n a ) 相媲 美，而且到了春季，满树黄白色的花、红色的果交相辉映，别有一番风味。凹叶冬青( l k h a m p i o n i i ) 顾名思义，叶先端凹缺，可观叶观果。冬青属硬齿冬青组树种大多叶具锯齿或刺状锯齿，为厚革质， 表面常有光泽。比如大家熟悉的枸骨化c o y ? i u t a ) ，枝叶稠密，叶形奇特，为矩圆状四方形，深绿光亮， 花色秀丽，芳香宜人，鲜红色的球形核果艳丽可爱经冬不凋( 欧静2 0 0 2 ) 。与紫叶小檗( b e r b e r 捃 t h u n b e r g i iv a r a t r o p u r p u r e a ) 、金叶女贞( l i g u s t r u m x v i c a r y o 、金叶黄杨( b u x u ss e m p e r v i v e s l a t i f o l i a m a c u l a t a ) 等耐修剪的彩叶植物相似，金叶龟甲冬青( z c c o n v e x a ) 、金叶日本冬青( l c r e n a t a ) 也是极好的彩篱植物材料，而且其对生长环境要求不严，耐干旱、贫瘠等，可与绿色植物、红色植 物相搭配可构成美丽的图案或大的色块，广泛应用在城市公共绿地、分车道、立交桥下、绿岛、小 游园、厂矿、企业、居住小区中。如将金叶龟甲冬青“c c o n v e x a ) 、紫叶小檗、小叶白蜡( f r a x i n u s b u n g e a n ad c ) 以色块的形式种植于立交桥下，将会有很好的俯视观赏效果。 1 1 3 冬青属植物抗逆性研究进展 1 1 3 1 抗低温 植物抗寒性是植物对低温环境变化长期适应而形成的一种遗传特性，植物抗寒能力的强弱也是 限制植物分布的一个重要因素。冬青属原种或栽培品种具有较强的耐寒能力，具有潜在的向高纬度 引种的能力。如枸骨在北纬3 4 n 的连云港云台山有自然分布，引种到山东生长良好( 臧德奎，等 2 0 0 1 ) 。进行该属植物抗低温能力的研究，有助于“南树北移”以及为测定该属其他植物的耐低温 能力提供借鉴。低温胁迫下的电导率( 杨家胭等，1 9 8 0 ；r o s e n , 1 9 8 3 ) 、可溶性糖含量( 王孝宣等，1 9 9 8 ) 、 游离的脯氨酸含量变化( 姚明华，2 0 0 1 ) 等生理生态测试方法被广泛用于植物抗冻性研究。国内就冬 青属植物抗寒性研究的不多。张纪林等( 2 0 0 5 ) 选取了1 1 种国内外的冬青园艺品种或种，以离体叶 4 冬青属植物i s s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立 文献综述 片为材料，采用低温循环仪自动降温程序模拟冰冻处理技术测定了其相对电导率，计算出了各自的 半致死温度。其后又对9 种植物的离体叶片做了低温处理，测定可溶性糖和游离脯氨酸的含量，结 果表明可溶性糖和游离脯氨酸的含量仅与部分冬青的抗冻性成正相关。龟甲冬青、绿冬青、拉索丽 娜冬青、构骨抗冻能力较强。毛志滨等( 2 0 0 6 ) 采用相同的试验方法比较了七种冬青属植物的抗低 温能力，结果表明抗低温能力由高到低依次为：大叶冬青( z l a a f o t z a ) 、枸骨( l c o r n u t a ) 、冬青 ( l p u r p u r e a ) 、铁冬青u r o t u n d a ) 、浙江冬青( l z h e j i a n g e n s i s ) 、刺叶冬青( l h y l o n o m a ) 、全缘冬青( 上i n t e g r a ) ， 此后的低温处理表明，低温处理后的不饱和脂肪酸变化可以作为不同冬青树种耐低温能力强弱评价 的一个补充性验证。 1 1 3 2 光适应性 冬青属植物具有很高的观赏性，但很多植物生长缓慢、成苗周期长的这特点，成为制约其大 面积推广的一个因素，而光合作用及其光合产物的分配与植物的生长密切相关，因此开展冬青属植 物的光合生理以及光适应性研究有重要意义。( 张璐等，2 0 0 6 ) 研究了不同光照下冬青、绿冬青、 全缘枸骨光合特征的日变化，结果表明，3 种冬青在全光照下的净光合速率高于透光率4 5 下的， 透光率4 5 的高于透光率2 0 的，且全光照处理的净光合速率日变化均为双峰曲线，反映3 种冬青 均为中性树种。但从午休程度和午休后光合恢复情况来看，全缘枸骨对强光的适应能力好于绿冬青， 绿冬青好于冬青。叶片光合色素和比叶重变化进一步证明，全缘枸骨适应能力最好，绿冬青次之， 冬青相对较差。选择绿冬青( i l e xv i r i d i s ) ，浙江冬青( 1 z h e f i a n g e n s i s ) 和构骨( 1 c o f b u i a ) 等3 种植物，对 其光合作用特性进行了研究( 王利英等，2 0 0 9 ) 。结果表明，绿冬青、浙江冬青和构骨等的光补偿 点分别为2 0 9 4 ，2 9 9 1 和2 4 0 2 r t m o l m - 2 s ，无显著差异( p o 0 5 ) ；光饱和点分别为1 2 0 4 2 9 ，1 3 0 5 1 0 和1 5 1 6 6 7 1 a m o l m - 2 0 s 一，存在显著差异( p 0 0 5 ) ，其中枸骨明显高于其他2 个种；最大净光合速率分 别为3 3 3 ，5 5 3 和8 4 3 t x m o l m _ 2 s 。) ，均存在显著性差异( p 0 0 5 ) 。此外，枸骨的表观电子传递速率 ( e t a ) 为6 0 5 2 0 ，显著高于绿冬青( 4 0 2 1 7 ) 和浙江冬青( 1 9 9 0 0 ) ( p 0 0 5 ) ，分别是绿冬青和浙江冬青的 1 5 1 和3 0 4 倍；枸骨的非光化学猝灭( q n ) 为0 9 4 7 ，分别是绿冬青( 0 8 5 9 ) 和浙江冬青( o 7 3 3 ) 的1 1 0 和1 2 9 倍，其差异性达显著水平( p o 0 5 ) ，说明枸骨具有较高的电子传递活性和防御光抑制破坏的 能力。 1 1 3 3 抗旱性和抗涝性 植物旱害是由自然条件和植物本身的生理条件引起的，包括自然条件引起的大气干旱、土壤干 旱和植物自身原因引起的生理干旱。干旱使植株缺水导致内部组织、细胞等结构发生了物理或或化 学的变化。如膜的结构和透性发生变化引起植物代谢过程受阻等，最终导致植物体内水分分配异常， 使植物生长不良，甚至死亡。植物主要通过自身的形态特征以及细胞的生理生化特性来避旱或耐旱。 要想把冬青属植物更广泛地应用到平原城市，必须考虑其耐早性及耐涝性。张纪林等用生理生态的 方法，通过致死性干旱和致死性水涝处理，结果表明三种供试冬青属植物随着干旱的增加，体内的 游离脯氨酸含量呈上升趋势；水涝试验表明三种受淹冬青体内的游离脯氨酸和丙二醛含量增加，净 5 冬青属植物is s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立文献综述 光合速率下降。实验为冬青的推广提供了这三种冬青具有一定耐旱耐涝能力的依据。除此之外，陆 小清等( 2 0 0 8 ) 研究了7 种( 品种) 冬青属植物对苯气体胁迫的反应，结果表明：7 种( 品种) 冬 青树种净化苯污染的能力存在显著差异。7 种( 品种) 冬青净化苯污染能力依次是：钝齿冬青、金 宝石冬青、蓝少女冬青、全缘冬青、大别山冬青、刺叶冬青、冬青。生理指标测定表明，7 种( 品 种) 冬青树种耐苯胁迫的能力也存在显著差异，其中大别山冬青和刺叶冬青耐苯胁迫能力较强；蓝 少女冬青、钝齿冬青和全缘冬青耐苯胁迫能力一般；冬青和金宝石冬青耐苯胁迫能力相对较差。 1 1 4 冬青属植物繁殖的研究 1 1 4 1 种子休眠与萌发的研究 冬青种子具有隔年发芽的特性( 陈俊愉等，1 9 9 0 ) ，有的甚至需要三年。李晓储等( 2 0 0 3 ) 把大叶冬 青的种子用湿沙储藏l 1 5 年，再进行变温处理，用0 3 的高锰酸钾处理后置于沙床内催芽，约三 个月种子开始萌发，发芽率3 0 左右，较未处理的提前了9 1 2 个月。徐本美等( 1 9 9 7 ) 认为大果冬青 种子的强迫休眠主要是种皮透气性差所致，但在满足了透气性及低温需求后，再继续添加g a 3 及 k n o s 混合液后，出苗率仍不理想，此结果与大叶冬青相似( 徐本美等，1 9 9 7 ) 。认为其属于综合深休 眠型。以冬青种子为试验材料( 王宁等，2 0 0 6 ) ，研究冬青种壳与种皮透水性及种皮内含物对种子 休眠的影响，结果表明冬青种壳与种皮具有一定的透水性，能为冬青种子萌发提供必要的透水、透 气条件，所以种壳与种皮的透性与冬青种子深度休眠关系不大。同时通过种皮浸提液对白菜种子发 芽、苗高及根长生长影响的研究，表明冬青种皮中存在抑制冬青种子萌发的物质。这些抑制物质对 白菜种子的发芽、苗高及根长生长均存在不同程度的抑制作用。由此可见，这些抑制物质的存在是 导致冬青种子休眠的原因之一。 1 1 4 2 扦插繁殖 冬青科冬青属( i l e x ) 常绿灌木，耐寒性强，树形优美，果实红色，颜色艳丽，为极具开发利用前 景的园林绿化树种。但是有些种如大叶冬青扦插不易生根，繁殖成活率低，从而制约了这些树种的 推广、利用。研究表明，冬青属植物种子发芽十分困难，有隔年发芽的特性( 祁承经等，1 9 9 9 ) ， 扦插较难生根( 陈俊愉等，1 9 9 0 ) 。以不同浓度i b a 、n a a 处理杂交冬青b l u eg i r l 嫩枝插穗( 毛志 滨等，2 0 0 4 ) ，研究其在全光照自动喷雾条件下的生根效果及生长情况。结果表明，与对照相比， i b a50 0 0m g l 浓度速蘸5s 可极显著提高插穗生根率、根数、新梢萌发率、叶片数和新梢长度， 显著提高根长；n a a1 0 0m g l 浓度浸泡2h 可极显著提高插穗生根率、根数和根长。从生根类型 来看，芽间生根的树种最易扦插成活，且生根率较高，芽基生根次之，而愈伤组织生根的成活率一 般比前二者低，生根时间也晚一些。由此可见，在插穗剪取时，穗条的剪取部位应以树种而异。朱 国华等( 2 0 0 4 ) 对大叶冬青插条木质化程度、扦插时间及扦插基质三个因素进行了比较试验，并进行 了添加生根促进剂( a b t ) 试验，结果表明扦插时间对成活率和苗木增粗生长有极显著的影响，插条 木质化程度、扦插基质、a b t 生根粉处理对成活率有极显著影响，对苗木生长影响不显著。 6 冬青属植物is s r 分子标记及枸骨组织培养体系的建立文献综述 1 1 4 3 冬青属植物的组织培养 植物组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行的培养，包括原生质体、悬浮 细胞和植物器官的培养。因其具有生长周期短、增殖率高、培养条件可人为控制、管理方便等优点， 已被世人誉为农业发展史上的第四次绿色革命。有关冬青科冬青属植物组织培养的研究，目前国内 外的相关报道都较少。最初对于冬青属植物组织培养研究主要是对幼胚的离体培养，研究材料包括： 上l a q u l i f o l i u m 、上c r e n a t a 、zc o r n u t a h i t c h c o c k 、上c a s s i n e 、l g l a b r a 、z l o n g i p e s 、l o p a c a 、 l p e d u n c u l o s a 、i p e r n y i r e c u r v a 、上v e r t i c i l l a t a 、l s e r r a t a 、l p a r a g u a r i e n s i s ( h u c y , 1 9 7 5 ；h uc y ， 1 9 7 6 ；h uc y ，1 9 7 7 ；h uc y ，1 9 7 8 ；f e r r e f i me ta 1 1 9 9 1 ；s a n s b e r r oe ta 1 1 9 9 8 ) 。以上研究结果表明大部分 冬青的胚胎在培养后第2 3 天达到萌发大小，大部分品种离体萌发率在8 0 以上，移栽后的成活率高 于7 5 。h uc y 还研究了光照对上d p 口的幼胚离体培养的影响。国外学者对冬青属植物的组培研究 多集中在南美著名经济树种l p a r a g u a r i e n s i s ，s a n s b e r r oe ta 1 ( 1 9 9 8 ) 研究了lp a r a g u a r i e n s i s 的幼胚 对外源添加细胞分裂素的反应。还有学者主以合子胚和合子胚子叶诱导的愈伤组织为外植体，通过 细胞悬浮培养获得再生植株( k r a e m e re ta 1 ，19 9 9 o r e y ( 19 9 8 ) 通过茎段培养获得lp a r a g u a r i e n s i s 的 再生植株。对忱xd u m o s av a t d u m o s a 也同样研究了其微繁体系的建立，从6 年生的植株上取带腋芽 的节间茎段为外植体，以1 4 m s 为基本培养基，附加适宜浓度的b a ，i b a 等进行再生植株的诱导、增 殖及生根( l u n ac ，e ta l ，2 0 0 3 ) 。国内冬青属植物组培研究主要集中在苦丁茶、大叶冬青等几种冬青上， 刘根林等( 1 9 9 1 ) 通过大叶冬青腋芽再生出试管苗，适宜培养基为m s + ium o l ln a a + 8 8um o l lb a 或m s + 1 u m o l ln a a 从十9 1u m o l lz t ，b a 对大叶冬青外植体不定芽的处理能产生较好的增殖系数 与高生长；适宜生根培养基为1 4 m s + ium o l ln a a 。王桂文等( 1 9 9 5 ) 研究了苦丁茶冬青的茎段培 养，发现生根培养基中加入n a a 的诱导生根率达至1 j 7 5 ，而i b a 的诱导生根效果较差。梁珍海等( 2 0 0 3 ) 以大叶冬青的叶为外植体诱导愈伤组织与不定芽再生。发现t d z 和i a a 可以诱导出愈伤组织，并且5 pm o l l 的i a a 处理产生的愈伤组织块直径最大，诱导不定芽再生的适宜条件是5 u m o l lt d z 十3 u m o l li a a 。2 e i l l e xl a t i f o l i a 则主要研究了其组培体系的建立，以节间茎段为外植体进行离体的生长 与增殖，采用m s 的基本培养基附加适宜浓度的b a ，n a a ，z t 进行培养，以w p m 的基本培养基附加适 宜浓度的t d z 及i a a 进行芽的诱导，以1 4 ms 的基本培养基附加适宜浓度的n a a 或i b a 进行根的诱 导( 刘根林等，2 0 0 3 ) 。李玉巧等( 2 0 0 3 ) 研究了大叶冬青无根试管苗移栽技术。另外还有学者通过茎段 培养建立了金叶日本冬青( i l e xc r e n a t a ) 的组培快繁体系( 李登中，2 0 0 4 ) 。李永欣等( 2 0 0 7 ) 带腋芽的嫩 茎段研究了美洲冬青的组培快繁，陈家龙等( 2 0 0 6 年) 以顶芽和带腋芽的茎段为材料，建立了适宜 冬青组培快繁各个阶段的培养基，即芽诱导培养基为m s + 6 b a1 0 m g l ( 单位下同) + n a a0 0 5 ，适 宜增殖的培养基为m s + 6 b a0 5 + n a a0 0 ，1 2 m s ( m s 大量元素减半) + n a ao 4 的生根培养基可使生 根率达8 3 3 。 1 2is s r 分子标记技术 分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。d n a 分子标 记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的d n a 片段，它能够直接反映基因组d n a 7