（水产养殖专业论文）车前黄酮的提取工艺及其对凡纳滨对虾的生长免疫调节作用.pdf

s t u d yo ne x t r a c t i o nt e c hn o l o g ya n d i m m u n o m o d u l a t i o ne f f e c to ft o t a if l a v o n o i d sf r o m p l a n t a g oa s i a t i c al z h e n gy i n g s p e c i a l t y ：a q u a c u l t u r e c o l l e g e ：c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gw e i 。n a s u b m i t t e dd a t e ：2 5 ，m a y5 ，2 0 1 0 摘要 摘要 车前黄酮的提取工艺及其对凡纳滨对 虾的生长免疫调节作用 专业：水产养殖 申请人：郑莹 导师：王维娜教授 随着水产养殖业的集约化发展，养殖水体污染日益严重，环境胁迫对养殖 对虾生长、免疫的影响也越来越严重。筛选新型的绿色环保水产抗应激免疫增 强剂已成为研究的热点。本论文研究了中草药车前( p l a n t a g oa s i a t i c al ) 黄酮的提 取工艺，及饲料中添加车前黄酮提取物( f l a v o n o i d se x t r a c t i v eo f p l a n t a g oa s i a t i c a l f e p ) 对凡纳滨对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 生长与免疫的影响。结果显示如下： 1 车前总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度一b ，料液比c ，提取时间d 、提 取温度e ，总黄酮得率5 1 2 7 。较适分离的条件为：树脂类型x 5 ；上柱条件： 上柱液总黄酮浓度2 m g m l ，上柱液体积3 b v ，流速1 b v h ；洗脱条件：洗脱液 为6 0 乙醇，洗脱液流速1 b v h ，收集第b - eb v 部分的洗脱液。总黄酮得率 7 2 5 ，纯度8 3 5 ； 2 酸碱应激均可激发离体虾血细胞呼吸爆发的增高，酸应激的效果尤为剧 烈；车前黄酮对酸碱应激条件下虾血细胞内的呼吸爆发具有抑制作用； 3 在正常养殖状态下，饲料中添加车前黄酮可以促进儿纳滨对虾的生长与 摘要 免疫；较适添加范围为0 0 0 5 - 0 0 5 0g l ( g 饲料： 4 车前黄酮可以有效清除凡纳滨对虾机体内由镉应激彦生的大量自由基。 关键词：车前黄酮提取物( f e p )氧化应激呼吸爆发生长免疫 a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d yo ne x t r a c tl0 nt e c h n o l o g ya n d 1m m u n o m o d u l a t10 ne f f e c to ft o t a l f u w o n o id sf r o m 戌删御a s i a t i 翻厶 m a j o r ：a q u a c u l t u r e n a m e ：z h e n gy i n g s u p e r v i s o r ：p r o w a n gw e i - n a w i t ht h ei n t e n s i v ed e v e l o p m e n to fa q u a c u l t u r ec o u p l e dw i t hw o r s e n i n gw a t e r p o l l u t i o n , t h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n t a ls t r e s so nt h eg r o w t ha n di m m u n i t yo f c u l t u r e d s h r i m p a r e g e t t i n g m o r ea n dm o r e s e r i o u s s c r e e n i n g o fn e wa n t i - s t r e s s i m m u n o s t i m u l a n t sh a sb e c o m eah o tr e s e a r c h i nt h i sp a p e r ，w es t u d i e dt h ee x t r a c t i o n a n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo ft o t a lf l a v o n o i d sf r o mac h i n e s em e d i c i n eh e r b p l a n t a g oa s i a t i c al a n dt h ei m m u n o m o d u l a t i o ne f f e c t so f f l a v o n o i d se x t r a c t i v eo f p l a n t a g oa s i a t i c al ( f e p ) o nw h i t es h r i m pl i t o p e n a e u s v a n n a m e i t h er e s u l t s s h o w e da sf 0 1 l o w s ： i t h eb e s tf l a v o n o i d se x t r a c t i o nt e c h n o l o g yi s ：e t h a n o lc o n c e n t r a t i o nb ， 。 s o l i dt ol i q u i dr a t i oc ，t h ee x t r a c t i o nt i m eda n de x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ee t h e e x t r a c t i o n y i e l d i s5 1 2 7 m o r es u i t a b l e p u r i f i c a t i o n c o n d i t i o n sa l e ：x - 5 m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ，t h ec o n d i t i o no fa d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nw a s t oe l u t e i i i a b s r a c t w i t h3 b vw a t e rs o l u t i o nb y1b y h , d e s o r bw i t h6 0 e t h a n o lb y1b v ha n dc o l l e c t t h ee t h a n o ls o h t i o na tb - eb v ； 2 t h er e s p i r a t o r yb u r s tl e v e li nt h eh a e m o c y t e so fs h r i m pw a ss t i m u l a t e da n d i n c r e a s e db yp hs t r e s si nv i t r oa n dt h ee f f e c to fa c i ds t r e s si sp a r t i c u l a r l ys e v e r e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ff l a v o n o i d se x t r a c t i v ef r o mp l a n t a g oa s i a t i c al ( f e p ) i s p r e d o m i n a n c e i tc a nd e c r e a s et h er e s p i r a t o r yb u r s ti nh a e m o l y m p ho f l v a n n a m e i e x p o s e dt ol o wp hs t r e s si nv i t r o ； 3 i nt h en o r m a lc u l t u r ec o n d i t i o n , t h ed i e t a r ya d m i n i s t r a t i o no ff e pc a l l i m p r o v et h eg r o w t ha n di m m u n i t yo flv a n n a m e i t h e m o r es u i t a b l ea d d i t i v e a m o u n ti sr a n g eo f o 0 0 5 0 0 5 0g k gd i e t ； 4 f e pc a ne f f e c t i v e l ys c a v e n g et h er o si n d u c e db yh e a v ym e t a lc a d m i u ma n d p hs t r e s s e s 一 k e yw o r d s ：f l a v o n o i d se x t r a c t i v e o x i d a t i v es t r e s s r e s p i r a t o r yb u r s t i m m u n o m o d u l a t i o i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目录v 第一章绪论1 1 1 水产动物的免疫机制与氧化应激1 1 2 中草药抗应激免疫添加剂在水产饲料中的应用2 1 2 1 水产养殖用中草药的有效成分及其作用机理3 1 2 2 中草药添加剂对水产动物生长的影响啊3 1 2 3 中草药添加剂对非特异性免疫力的影响4 1 3 车前的研究进展5 1 3 1 车前的化学成分研究5 1 3 2 车前的应用研究：6 1 3 3 车前黄酮及其苷。7 1 4 黄酮类化合物简介及其研究进展7 1 4 1 黄酮类化合物在动物机体内的抗氧化及抗应激作用8 1 5 本课题研究的目的及主要内容8 第二章车前抗氧化、抗应激有效成分的筛选1 0 2 1 实验材料及仪器设备工二10 2 1 1 实验材料1 0 2 1 3 主要仪器设备l l 2 2 实验方法1 1 2 2 1 车前的预处理1 1 2 2 2 车前各萃取成分制备1 1 2 2 3 样品总黄酮含量测定浦。1 2 2 2 4 总酚含量的测定1 3 2 2 5d p p h 清除能力1 3 2 2 6 羟自由基清除能力1 4 v 目录 2 2 7 样品对凡纳滨对虾离体血细胞呼吸爆发的影响1 4 2 2 8 数据处理和统计学分析1 6 2 3 结果与分析1 6 2 3 1 芦丁标准曲线1 6 2 3 2 没食子酸标准曲线1 6 2 3 3 车前各提取、萃取部分总黄酮、总酚含量1 7 2 3 4 车前各提取、萃取部分的d p p h 清除率与总黄酮含量的关系。1 9 2 3 5 车前各提取、萃取部分的羟自由基清除率与总黄酮含量的关系 ：1 1 2 3 6 车前各提取、萃取部分对凡纳滨对虾离体血细胞呼吸爆发的影响 ：2 1 2 4 讨论2 4 第三章车前黄酮提取工艺的研究2 6 3 1 实验材料与仪器设备2 6 3 1 1 实验材料矗一2 6 3 1 2 主要仪器设备2 6 3 2 实验方法2 6 3 2 1 单因素实验2 6 3 2 2 正交实验2 7 3 2 3 最佳工艺条件验证2 8 3 2 4 数据处理和统计学分析2 8 3 3 实验结果与分析2 8 3 3 1 不同乙醇浓度对车前总黄酮提取率的影响2 8 3 3 2 不同料液比对车前总黄酮提取率的影响2 9 3 3 3 不同提取温度对车前总黄酮提取率的影响3 0 3 3 4 不同提取时间对车前总黄酮提取率的影响3 l 3 3 5 正交试验结果：3 l 3 3 6 最佳工艺条件验证结果3 2 3 4 讨论3 3 第四章车前黄酮的富集分离3 5 v i 目录 4 1 实验材料与仪器设备3 5 4 1 1 实验材料_ 3 5 4 1 2 实验试剂3 5 4 2 实验方法3 6 4 2 1 上样液的制备3 6 4 2 2 大孔树脂的筛选3 6 4 2 3x 一5 大孔树脂对车前总黄酮的动态吸附试验3 7 4 2 4x 5 大孔树脂对车前总黄酮的动态解吸附试验3 7 4 2 5 车前黄酮的富集分离3 7 4 2 6 总黄酮含量测定及产品得率、纯度计算方法3 7 4 2 7 产品( f e p ) d p p h 清除率测定3 8 4 2 8 羟自由基清除率测定3 8 4 2 9 超氧阴离子清除率测定3 8 4 2 1 0f e p 对p h 应激条件下离体虾血细胞呼吸爆发活性的影响3 8 4 3 实验结果与分析一3 8 4 3 1 大孔树脂吸附量和解析率3 8 4 3 2x 一5 大孔树脂对车前黄酮的动态吸附实验结果4 0 4 3 3x 5 大孔树脂对车前黄酮的动态解吸附试验结果4 0 4 3 4 车前总黄酮富集分离实验结果4 3 4 4 讨论4 7 4 4 1 大孔树脂对车前黄酮的富集、分离4 7 一。 4 4 2 车前黄酮的抗氧化特性4 8 4 4 3 酸碱应激对离体凡纳滨对虾血细胞呼吸爆发的影响。4 8 4 4 4f e p 对酸碱应激条件下离体凡纳滨对虾血细胞呼吸爆发的影响4 9 4 5 小结5 0 一一 第五章饲料中添加车前黄酮对凡纳滨对虾生长、免疫的影响。5 3 5 1 实验材料与仪器设备5 3 5 1 1 实验用虾的生物学特性5 3 5 1 2 实验用虾5 3 5 ：1 3 实验试剂5 3 5 2 实验方法5 4 v i i 目录 5 2 1 饲料的制作5 4 5 实验用凡纳滨对虾的养殖5 5 5 2 3 实验取样5 5 5 2 4 凡纳滨对虾血淋巴细胞呼吸爆发的测定5 6 5 2 5 凡纳滨对虾血淋巴和组织中总抗氧化能力测定5 6 5 2 6 凡纳滨对虾血淋巴和肝胰腺组织中抗氧化酶活性测定5 6 5 2 7 数据处理和统计学分析5 7 5 3 实验结果与分析5 7 5 3 1 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾体重增长率的影响5 7 5 3 2 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾体长增长率的影响5 8 5 3 3 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾特殊生长率及饲料系数的影响6 0 5 3 4 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾存活率的影响6 0 5 3 5 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾呼吸爆发及总抗氧化能力的影响6 1 5 3 6 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾抗氧化酶活性的影响6 3 5 4 讨论j 6 7 5 4 1 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾生长的影响6 7 5 4 2 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾存活率的影响6 9 5 4 3 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾呼吸爆发和总抗氧化能力的影响 7 ( ) 5 4 4 饲料中添加f e p 对凡纳滨对虾抗氧化酶活性的影响7 1 5 5 小结7 4 第六章饲料中添加车前黄酮对镉应激条件下凡纳滨对虾抗应激能力的影响一7 5 6 1 实验材料与仪器设备7 5 6 1 1 实验用虾7 5 6 1 2 实验试剂7 5 6 1 3 实验设备和仪器：7 5 6 2 实验方法7 6 6 2 1 取样7 6 6 2 2 呼吸爆发测定7 6 6 2 3 总抗氧化能力( t a o c ) 测定7 6 6 2 4 抗氧化酶活性测定7 7 目录 6 2 5 数据处理和统计学分析7 7 6 3 实验结果与分析7 7 6 3 1 镉应激条件下，各实验组的死亡率7 7 6 3 2 饲料中添加f e p 对镉应激条件下凡纳滨对虾呼吸爆发的影响7 7 6 3 3 饲料中添加f e p 对镉应激条件下凡纳滨对虾总抗氧化能力 ( t a o c ) 的影响7 9 6 3 4 饲料中添加f e p 对镉应激条件下凡纳滨对虾抗氧化酶活性的影响 ；：； 血淋巴s o d 8 3 6 4 讨论9 l 6 4 1 对呼吸爆发的影响9 l 6 4 2 对抗氧化系统的影响：- 9 2 6 5 小结9 4 全文小结9 5 参考文献“9 6 j l i 谢10 3 i x 第一章绪论 第一章绪论 1 1 水产动物的免疫机制与氧化应激( o x id a tiv es t r e s s ) 近年来的研究表明，甲壳动物的免疫机制以非特异性免疫反应为主。循环血 细胞在甲壳动物的非特异性免疫系统中发挥着中心作用，是重要的细胞免疫因 子。它们构成抵御外物入侵的第一道防线，在甲壳动物的防御反应中起决定性 作用。而甲壳动物的另一道免疫防线为体液免疫系统，其中包括：酚氧化酶原 系统、抗氧化酶系统、凝集素、溶菌酶、抗菌肽和其它免疫因子。 生物经常受到生存环境中各种环境因子的刺激，而且这些刺激与生物系统 总是处在相互作用的动态过程中，在一定的环境条件下，由于各种因素的负面影 响，使动物无法维持正常的生理状态，这就叫环境胁迫，也叫环境应激。当机体在 遭受有害应激时，体内高活性分子，如活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， i 的s ) 和活性氮自由基会大量产生，当自由基产生速度超过机体的清除能力时， 过多的自由基将会对机体造成损伤，如造成细胞中蛋白质修饰，脂质过氧化 ( l i p i dp e r o x i d a t i o n ，l p x ) 和d n a 链断裂，最终会引起一些包括细胞凋亡在内 的病理状态( h a l l i w e l l ，1 9 8 9 ：w i n s t o na n dd ig i u l i o ，1 9 9 1 ；l i v i n g s t o n e ，2 0 0 1 ； 一： m a n d u z i oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。这一现象被称为氧化应激。近年来在水产领域，氧化 应激状态已被作为监控水产动物生理状态的重要指标。 生物机体内的抗氧化系统在清除自由基，抵御氧化应激方面起着极其重要 的作用( v e l i o g l ue ta 1 ，1 9 9 8 ；l ih y e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。生物体系的抗氧化防御系统 包括：需痕量金属离子( c u 、z n 、m n ) 的酶类氧化剂，即抗氧化酶系统；由 饵料中获得的外源非酶抗氧化剂( 维生素e 、维生素c 、类胡萝卜素) ；生物体 合成的内源抗氧化剂( 谷胱甘肽、清蛋白) 。抗氧化剂通过结合氧化还原反应过 程中的金属离子( 铁传递蛋白) 或者通过酶反应或化学反应直接消除自由基而发 华南师范人学硕十学位论文 挥抗氧化作用。抗氧化剂按其化学本质可以分为抗氧化酶类和小分子抗氧化剂。 抗氧化系统中的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) ， 谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) ，过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 等，它们分别催化与活性氧有关的不同的化学反应。小分子抗氧化剂包括：维生 素e 、抗坏血酸、1 3 一胡萝卜素、还原型谷胱甘肽( g s h ) 、尿酸、胆绿素和黄 酮类化合物等( d ig i u l i o ，1 9 8 9 ) 。 1 2 中草药抗应激免疫添加剂在水产饲料中的应用 随着水产养殖业集约化程度越来越高，养殖水体污染越来越严重，养殖动 物受越来越多的应激因素的影响，如水质污染、冷热、惊吓、饲料营养不良、 运输、有害物质的侵袭、饲养管理不当等等。这些不同程度的应激，可直接影 响动物体的正常生长发育，严重的可导致鱼虾的机体免疫力下降，诱发患病甚 至死亡。因此，减少或消除养殖鱼虾的应激因素，除了实行科学饲养管理外， 还可以根据具体情况，在饲料中添加有关的抗氧化应激饲料添加剂。 比较常见的抗氧化剂有维生素e 、抗坏血酸、b 一胡萝卜素。维生素e 和多 不饱和脂肪酸( p u f a ) 的比例对于保护脂质免受过氧化来说都是重要的。水溶 性的维生素c 可起到胞外防御作用，而且维生素e 和维生素c 在抗氧化功能上具 有协同作用。随着对这些抗氧化剂研究的越来越透彻，人们开始转向寻找新的、 更加高效、适用于绿色环保养殖业的抗氧化饲料添加剂。我国传统的中草药具 有成本低、加工方便、无抗药性和药物残留、副作用小、资源丰富等优点，部 分研究表明，中草药在预防疾病、加速生长、提高生产性能和改善水产品品质 等方面具有显著效果。因而近年来，关于中草药抗应激免疫添加剂在水产养殖 上的应用已成为研究的热点之一。 2 第一章绪论 1 2 1 水产养殖用中草药的有效成分及其作用机理 目前，用作饲料添加剂的中草药药方大多为大组方，成分极为复杂，其中 富含有蛋白质、氨基酸、维生素、油脂、树脂、糖类、植物色素、常量元素、 微量元素以及一些未知的促生长活性物质等多种成分起营养作用，之外还有丰 富的调节水产动物免疫表达的有效成分如有机酸类、生物碱、聚糖类、挥发油、 蜡、甙、鞣质物质及一些未知免疫活性因子等( j i a n ，2 0 0 3 ；2 0 0 4 ) 。中草药中的 营养活性因子可以促进水产动物机体内蛋白质和各种酶的合成，促进糖代谢， 促进机体的生长发育；而免疫活性因子则主要通过影响非特异性免疫系统，激 活和诱生多种细胞因子等途径提高水产动物机体免疫力。但另一方面，由于中 一 草药成分复杂，因而在使用种草要添加剂时须着重考虑有效物质之间的协同与 拮抗作用，并根据水产动物不同生长阶段、生理状态、生长环境以及养殖条件 等当加以斟酌( w a n g ，2 0 0 4 ；r a o ，2 0 0 4 ；苏永腾，2 0 0 7 ) 1 2 2 中草药添加剂对水产动物生长的影响 ： 在生物体健康生长过程中，营养与免疫具有重要的协同作用。日粮充分是 保证水产动物机体正常发挥免疫功能的前提，而健康良好的免疫机制亦可促进。 水产动物对营养的充分吸收，提高饵料效率和水产动物的生长性能。中草药添 加剂不仅含有丰富的营养物质，而且其中的一些活性成分能够改善饲料适口性， 一一 提高水产动物摄食率，提高饲料利用率。 有研究表明，饲料中添加中草药和杆状菌复合剂，凡纳滨对虾的特殊生长 一 率、蛋白利用率和饲料转化率均随着复合剂剂量的增加而提高；肝胰腺和肠道 中的蛋白酶活力和淀粉酶活力亦显著提高( y u e ，a l ，2 0 0 9 ) 。在凡纳滨对虾幼 苗饲料中添加印度草药制剂，可以显著提高幼苗的存活率( 4 3 3 2 5 8 8 8 帅和特 殊生长率( 1 4 6 2 1 5 ) ( i m m a n u e le ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在饲料中添加绞股蓝制剂， 可以提高草鱼的增重率、饲料转换率和特殊生长率( w ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 华南师范大学硕士学位论文 饲料中添加大黄葱醒提取物可以提高罗氏沼虾的增重率、增长率以及特定 生长率，降低饵料系数( 比对照组显著下降1 5 7 2 ) ，提高肝体比指数( 苏永 腾，2 0 0 7 ) 。王广军( 2 0 0 4 ) 将自行研制的中草药制剂添加到凡纳滨对虾饵料 中，发现试验组增重率比对照组显著提高了2 1 5 ，而饵料系数则显著降低了 1 2 4 4 。藤召云等( 2 0 0 4 ) 加以黄莲、甘草、黄茂等为原料制备萃取物并添加 到凡纳滨对虾饵料中，结果发现中草药组的干物质消化率、蛋白质效率均比对 照组提高。 1 2 3 中草药添加剂对非特异性免疫力的影响 狗牙根、樟脑树嫩芽和细基江蓠的水提取物可以显著提高凡纳滨对虾血细 胞酚氧化酶活性、呼吸爆发活性、血细胞吞噬活性、全血细胞数及清蛋白球蛋 白比率( b a l a s u b r a m a n i a n ，2 0 0 8 ；y e he ta 1 ，2 0 0 9 ；p u n i t h ae ta 1 ，2 0 0 8 ) 。香 椿的芦丁提取物可以提高南美白对虾血细胞的酚氧化酶活性和呼吸爆发活性， 但对全血细胞数和s o d 酶活性没有显著影响( h s i e he ta l ，2 0 0 8 ) 。将黄芪、 党参、大黄、板蓝根等十余味中草药粉碎过筛后制成复方添加剂按不同的比例 添加于基础饲料中制成颗粒药饵投喂罗氏沼虾，可以显著提高罗氏沼虾血细胞 吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力( 李义，2 0 0 2 ) 。在 罗非鱼饲料中添加不同剂量的紫云英提取物( 含紫云英多糖4 0 ) ：可以激活 罗非鱼吞噬细胞的吞噬活性，但是对吞噬细胞的呼吸爆发活性没有影响。而在 饲料中添加中浓度和高浓度黄岑提取物( 含黄岑苷2 0 ) 时反而会抑制吞噬细胞 的呼吸爆发活性( y i i lp fa ，2 0 0 6 ) 。 一 关于中草药添加剂在水产养殖中的应用研究仍以中草药大组方添加剂为 主，而关于中草药某单一提取物对水产动物生长、免疫及抗应激能力的影响的 研究报道还比较少。作为目前研究比较热的强抗氧化剂和免疫增强剂，黄酮类 化合物在水产养殖中的研究、应用还鲜少有报道。因而，本论文将以中国传统 4 第一章绪论 中草药车前为材料，提取车前总黄酮，研究其作为饲料添加剂对凡纳滨对虾生 长、免疫及抗应激能力的影响。 1 3 车前的研究进展 车前( p l a n t a g oa s i a t i c al ) 是车前$ 4 ( p l a n t a g i n a c e a e ) 多年生草本植物。叶 片通常基生，基部鞘状，呈莲花座状。花序穗状；花一般比较整齐；花萼常常4 裂，外侧2 片常异形；花冠干膜质，呈线管状，4 裂居多；雄蕊个数通常4 ， 有时1 或者2 枚不发育，花丝细长状，常常伸出冠外；子房居上位，通常含 有1 4 室。蒴果，盖裂；种子一般1 至多颗( 赵可夫，1 9 9 9 ) 。车前在我国各 地均有分布，生长于田间、路旁、草地、河岸两边。 干燥的车前全株长5 c m - - 3 0 e m 。直根圆柱状，具扭曲纵沟纹，稍弯曲，长 3 c m - 7 c m ，具数条支根及多数须根；表面棕褐色，粗糙。叶灰绿色或污绿色， 皱缩，展平后呈长椭圆形、椭圆状披针形或卵状披针形，具明显弧行5 条7 条； 顶端钝尖或渐尖，有不规则锯齿或远离小齿，两面多少具白色柔毛。穗状花序 数条，顶端有残留蒴果和盖裂后的蒴瓣及宿萼，有时可见小花。气微，味苦而 带粘液性。以叶多、灰绿色、具果穗者为佳。 性味甘，寒。归太阳、阳明经。利水，清热，明日，祛痰。用于小便不通， 淋浊，带下，尿血，黄疸；。水肿，热痢，泄泻，鼻衄，目赤肿痛，喉痛，咳嗽， 皮肤溃疡。常用量9 1 5 9 。外用适量捣汁或捣烂敷( 罗献瑞，2 0 0 0 ) 。 1 3 1 车前的化学成分研究 车前成分复杂，含有多糖( s a m u e l s e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ，酚类( n a k a o k ie ta 1 ， 1 9 6 1 ；r a v ne ta 1 ，1 9 9 0 ；n i s h i b e ，2 0 0 2 ) ，苯乙醇苷类( m i y a s e ，1 9 9 1 ) ，环 烯醚萜类( t a s k o v ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，黄酮类( k a w a s h t ye ta 1 ，1 9 9 4 ) ，糖蛋白和脂 肪酸等成分。 华南师范人学硕士学位论文 张振秋( 2 0 0 1 ) 用原子吸收法对车前中2 2 种微量元素的含量进行了研究， 研究结果表明2 2 中元素中k 元素含量最高；z n 、m n 、c u 、s r 、m o 是其中含 量较高的5 种微量元素。 1 3 2 车前的应用研究 车前为一味传统中草药，始见于诗经，药用始载于神农本草经， 列为上品。历代本草均有记载。食用记载较早，是我国人民最早认识并使用的 药用植物之一。车前以种子和全草入药，车前子有利水通淋，清肝明目的功效， 用于治疗小便不利、水肿等；全草有清热解毒、利尿的功效，用于治疗尿路感 染、热毒痛肿等( 季大洪，肖振宇，2 0 0 1 ) 。随着研究的深入，车前被用来治 疗越来越多的疾病，包括伤口溃烂、支气管炎、胆固醇血症、慢性便秘和腹泻 ( m a r l e t ta n df i s c h e r ，2 0 0 3 ； r a m k u m a ra n dr a o ，2 0 0 5 ；s i n g h ，2 0 0 7 ) 。此外， 车前还具有抗白血病、抗龋和抗病毒活性( c h i a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 研究表明，车前主要有如下药理活性： 1 ) 车前多糖具有祛痰、止泻、利尿，抗高血压等作用( s a m u e l s e n ，2 0 0 0 ； n e w a l l ，1 9 9 6 ) ； 2 ) 环烯醚萜类有利尿，抑菌，抗四氧化碳引起的肝中毒，利胆作用( h i n o v y e ， 1 9 7 4 ) ；_ ； 3 ) 黄酮类可作用于呼吸中枢，缓解呼吸运动而镇咳，兴奋分泌神经使气管 分泌增加而祛痰( 三桥博监修，1 9 8 8 ；t o d a ，1 9 8 5 ) ；车前提取液具有抗菌消炎 作用，国外早期的报道车前的抗菌消炎作用与其含有的黄酮类和酚酸类物质有 关。体外抑菌试验表明车前草水浸剂对同心性毛癣菌、羊毛状小芽抱癣茵、星 形奴卡菌、淋球菌等有不同程度的抑制作用，且金黄色葡萄球菌对本品高度敏 感醇提取物可杀灭钩端螺旋体，对强毒株嗜水气单胞菌、温和气单胞菌有抑制 作用( 宋学宏，2 0 0 1 ；李敏，2 0 0 5 ) ；另外还有研究表明，车前镇咳祛痰的有 6 第一章绪论 效成分主要为黄酮类物质( 赵以乔，2 0 0 4 ) 。 4 ) 苯乙基苷类有消炎，抑菌，抑制c o m p 磷酸二酯酶酶，醛糖还原酶的活 性； 5 ) 酚酸类具有杀菌，升白，利胆，抑制血小板聚集等功能( 柯铭清，1 9 7 9 ) 。 1 3 3 车前黄酮及其苷 经报道，已从4 3 种车前属植物中分离3 1 种黄酮类物质( y o s h i n o r i ，2 0 0 8 ) ， 如5 , 7 ，4 三羟基黄酮、毛地黄黄酮、黄芩素、高车前素等( k a w a s h t y ，19 9 4 ) 。 王莉等用微波技术提取了车前各部位中的黄酮，用比色法法对总黄酮含量进行 测定，得出车前根、叶、穗中总黄酮含量分别为3 5 6 、3 7 8 、5 2 1 ( 王莉， 2 0 0 2 ) 。 已有研究从车前p a s i a t i c a 中分离了9 类黄酮类化合物，如芹菜素、芹菜 甙元7 o 葡萄糖甙、。木犀草素、木犀草素7 o 葡萄糖苷、高黄芩素、车前苷、 6 羟基本犀草素、6 羟基木犀草素7 一o 葡萄糖甙、高车前素7 o 葡萄糖甙；和 六类苯乙醇类化合物，如大车前甙、阿克替甙、i s o p l a n t a m a j o s i d e 、车前酯甙、3 ， 4 二羟基苯乙醇6o 咖啡酰葡萄糖甙和p l a n t a s i o s i d e ( r a v ne ta 1 ，19 9 0 ；m u r a i ， 2 0 0 9 ) 。 大多数的黄酮类物质具有抗氧化性( r i c ee v a n se ta 1 ，1 9 9 6 ；b o h me ta 1 ， 19 9 8 ) 和自由基清除活性( k a n d a s w a m ia n dm i d d l e t o n ，19 9 4 ) ，有研究表明，黄 酮类化合物是自由基猝灭剂( l a n d r ye ta 1 ，1 9 9 5 ；r y a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。黄岑素、 高车前素、和车前甙元可有效清除自由基并抑制脂质过氧化( s a m u e l s e n ，2 0 0 0 ) 。 1 4 黄酮类化合物简介及其研究进展 黄酮类化合物系色原烷或色原酮的2 或3 苯基衍生物，泛指两个苯环通过中 央三碳链相互连接而成的一系列化合物，一般具有c 6 c 3 c 6 的基本骨架结构， 7 华南师范大学硕十学位论文 是自然界中存在的酚类物质。黄酮类化合物大多呈黄色或淡黄色，广泛存在于 植物界中，多数以甙的形式存在，少数以游离的甙元形式存在。这类化合物的 种类较多，包括黄酮( f l a v o n e ) 、黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 、异黄酮( i s o f l a v o n e s ) 、黄烷 酮( f l a v a n o n e ) 、黄烷醇( f l a v a n o l s ) 、查耳酮( c h a l c o n c ) 、双苯毗酮( x a n t h o n e ) 、花 色素( a n t h o u y n i d i n ) 、色原酮( c h r o m a r n e ) 等( r o s sa n dk a s u r n ，2 0 0 2 ) 。 1 4 1 黄酮类化合物在动物机体内的抗氧化及抗应激作用 自由基与人类的大部分常见疾病都有关系，如对人类健康和生命威胁甚大 的心血管疾病、癌症、艾滋病，都与氧自由基有密切关系( t o t h ，1 9 9 3 ) 。而人 类的神经系统疾病( 早老性痴呆症、震颤麻痹症等) ( g u i l f o r d ，1 9 9 4 ) ，循环 一 系统疾病( 动脉粥样硬化，血栓等) ，以及肝炎、糖尿病、眼病等( w i n k l h o f e r ， 1 9 9 7 ) 疾病的发生，均有自由基的参与。实验表明，黄酮类化合物具有的扩张 冠状血管、抗心律失常、抗衰老等作用都与其抗氧化活性有关。 黄酮类化合物具有显著的自由基清除能力( h u s a i n ，1 9 8 7 ：j a g e t i a ，2 0 0 3 ； a f a n a s e v ，1 9 9 5 ) 。作为抗氧化剂具有高效、低毒、廉价、易得的优点，已成为 合成抗氧化剂如叔丁基茴香醚( b h a ) 和2 ，6 二叔丁基对甲酚( b h t ) 等的代 用品。其作用机理包括：通过向自由基转移电子，清除自由基；与金属离 子螫合阻断自由基的生成( f e r r a l ie ta 1 ，1 9 9 7 ) ；活化抗氧化酶活性( e l l i o t te ta 1 ， ： 1 9 9 2 ) ；抑制酶氧化作用( c o s e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 5 本课题研究的目的及主要内容 。 我国是对虾养殖大国，近几年来发展势头日趋迅猛。仅2 0 0 3 年全国养殖对 虾总产量就达到7 8 万吨，为我国的出口创汇创造了巨大的经济效益。但随着养 殖集约化程度的提高，病害也越来越严重，并随着抗生素的禁用，越来越多的 专业人士重视于无污染、无残留、促生长、增强水产动物免疫力的绿色环保免 8 第一章绪论 疫增强剂的研发应用。 车前在我国分布广泛，生境普遍，含有多种有效活性物质，是味常用的 中草药。但关于车前总黄酮的抗氧化活性、车前总黄酮对水产动物的生长免疫 作用尚未见报道。本论文将从生长形态和细胞水平全面研究车前总黄酮提取物 对凡纳滨对虾生长免疫及抗应激能力的影响，为筛选出新的绿色环保水产抗应 激免疫增强剂作初步研究。 9 华南师范大学硕十学位论文 第二章车前抗氧化、抗应激有效成分的筛选 2 1 实验材料及仪器设备 2 1 1 实验材料 车前( p l a n t a g oa s i a t i c al ) 由购自广东省东莞市药材公司 2 1 2 实验试剂 l o 第二章车前抗氧化、抗应激有效成分的筛选 2 1 3 主要仪器设备 名称型号 f a c s c a l i b u r 流式细胞仪 s i g m a z 1 6 k 型台式高速冷冻离心机 奥立龙8 6 8 型酸度计 p b 2 0 3 - n 型电子天平 c p 2 2 5 d 型精密分析天平 a u t e r r e x c 4 0 0 型电热恒温水浴锅 紫外分光光度计 旋转蒸发仪 v i r